5. Bölüm Sütteki Enzimler Doç. Dr. Ebru ŞENEL Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Süt Teknolojisi Bölümü
Enzim Canlı hücreler tarafından sentezlenen organik ve katalitik bileşiklerdir. Biyokatalizör olarak adlandırılmaktadır. Diğer katalizörlerden kolloidal protein yapılarından dolayı duyarlılıkları ile ayrılmaktadır. Bu nedenle şöyle tanımlanabilir; Enzim; organizma tarafından protein yapısında üretilen ve çok düşük miktarları bile, gerek hücre içinde ve gerekse hücre dışındaki biyokimyasal reaksiyonları gerçekleştiren spesifik organik maddelerdir.
Enzimlerin Sınıflandırılması Hidrolazlar Oksi-redüktazlar Transferazlar Liyazlar İzomerazlar Ligazlar
Hidrolazlar Bu grup süt endüstrisi açısından önemli enzimlerdir. Bu enzimler substrata su vererek hidrolitik bölünmeyi katalizlemektedir. Hidrolazlar grubunda; -ester bağlarına etki yapan ve dolayısıyla oluşumunu ve parçalanma olayını katalizleyen esterazlar (lipazlar, fosfatazlar, ve sülfatazlar), -proteinlere etki ederek peptit bağlarının çözünmesini sağlayan proteazlar - Glukozid bağlara etki eden karbohidralazlar (heksosidazlar, poliazlar) yer almaktadır.
Oksi-redüktazlar Bu grup, bir maddeden diğer maddeye elektron ve hidrojen iyonlarını taşıyarak biyolojik oksidasyonu katalizleyen enzimlerdir. Oksidasyon ve redüksiyon substratın parçalanma işlemi ile bağlantılıdır. Bu ana gruba süt enzimlerinden peroksidaz, katalaz, ve ksantioksidaz enzimleri girmektedir.
Transferazlar Grup transferlerini gerçekleştiren molekülün bazı gruplarını diğer bir substrata taşıyan enzimlere transferaz veya transfer enzimleri denilmektedir. Bunlarda taşıdıkları gruplara göre; Fosfor grubu taşıyan Dezaminleşme ve aminleşmeyi yapan Metil grubu taşıyan Açil grubunu akseptöre taşıyan transfosforilazlar transmetilazlar transaminazlar transaçilazlar
Liyazlar Çift bağlara grup ekleyen veya bunlardan grup ayıran enzimlerdir. İki bileşiği yeni bir madde verecek şekilde bağlar veya bölerler. Alkol fermentasyonunda ; prüvik asidi asetaldehit + CO 2 (karboksilazlar) Aminoasitlerin Hekzodifosfat aminler (dekarboksilazlar) 2 (triyofosfat) (aldolazlar)
İzomerazlar Molekül içi değişmeleri katalizlerler. Örneğin; Heksofosfataz, Glukoz -6-fosfat katalize eder. fruktoz-6-fosfat
Ligazlar ATP nin veya diğer fosfatların prifosfat bağlarını parçalayıp iki molekül arasında yeni bağların oluşumunu kataliz eden enzimlerdir. Örneğin; pirüvat karboksilaz, asetil ko-a sentetaz gibi. Süt teknolojisi açısından önem taşıyan enzimler oksiredüktazlar ve hidrolazlar sınıfında yer almaktadır. Diğer grupta yer alan enzimler süt bileşiminde bulunan maddelerin biyosentezinde veya mikroorganizmaların yer aldığı metabolizmalarda katalitik görev yaparlar.
Enzimlerin yapısı Enzimler protein yapısındadırlar. Bu kısmına apoenzim denir. Fakat aktif hale gelebilmeleri için protein unsurlarının yanı sıra, bunlarla bağ yapabilecek yardımcı maddelere gereksinim duymaktadır. Protein yapısında olmayan bu maddelere koenzim veya prostetik grup olarak isimlendirilmektedir. Apoenzim + koenzim Holoenzim (aktif enzim)
Apoenzim; hücre tarafından yapılan çok karışık protein yapısında ve sıcağa duyarlı bir maddedir. Aktif olmayan polipeptid zincirlerine sahiptir. Bu kısım enzimin hangi maddeye yani hangi substrata etki edeceğini tayin etmektedir. Koenzim; basit yapıda olup, küçük moleküllü ve inaktif bir kısımdır. Apoenzimi aktif yapar ve enzimin substrat üzerine nasıl etki edeceğini gösterir. Sıcağa ve dış etkilere karşı dayanıklı olup organik ve inorganik yapıda olabilmektedir. Mineraller ve vitaminler koenzim olarak görev yaparlar.
Enzim aktivitesini etkileyen faktörler Sıcaklık ph değeri İyon bileşimi Diğer faktörler Sıcaklık; sıcaklık artışı enzimatik reaksiyonları hızlandırmaktadır. Belirli sıcaklık dereceleri arasında etkilemektedir. Çok yüksek sıcaklıklarda protein yapısında olduklarından katalitik aktiviteleri kaybolmaktadır. Hayvansal enzimler 37 C Bitkisel enzimler 20-25 C Bakteriyel enzimler 20-37 C
ph değeri; enzimler kolloidal protein yapısında olduklarından ph değişimlerinden etkilenmektedir. optimum ph değerleri enzimlerin karakterize etmektedir. Optimum ph değerlerinin altında veya üstünde enzimatik reaksiyonların hızları düşmektedir. İyon bileşimi; ortamdaki iz elementlerde anyonlar ve katyonlar aktivatör olarak önem taşımaktadır. Bunların varlığı reaksiyonların gerçekleşip gerçekleşmemesini belirler. Örneğin; rennin enzimi ile peynir pıhtısının oluşumunda enzimatik fazın ikinci aşaması Ca++ iyonlarının varlığı ile oluşmaktadır.
Diğer faktörler; Enzim konsantrasyonu, redoks potansiyeli ve substrat konsantrasyonu gibi faktörlerde enzim aktivitesine etki etmektedir. Örneğin; alkol fermantasyonu sonucu oluşan alkol miktarı belirli bir miktarın üzerine çıktığında mikroorganizmaların otolizine yol açar. Belirli bir dereceden sonra sıcaklık, soğukluk, rutubet eksikliği, ışık gibi etmenler kısmen veya tamamen enzim aktivitesini önlemektedir.
Sütte Bulunan Enzimler İnek sütü çok sayıda doğal enzim (tanımlanmış yaklaşık 70 enzim) içermektedir ve toplam süt proteinlerinin küçük bir fraksiyonu olmasına rağmen enzimlerin süt teknolojisinde önemli rolleri vardır En küçük molekül büyüklüğüne sahip enzimde 100 civarında aminoasit bulunmaktadır
Sütte bulunan enzimler 2 kaynaktan ileri gelir; Sütün doğal enzimleri, meme dokusu hücrelerinden, kan plazması ile lökositlerden ve salgı hücre stoplazmasından süte geçmektedir Süte kontamine olan mikroorganizmalar tarafından sentezlen grup ise mikrobiyel kaynaklı enzimler olarak nitelendirilmektedir. Her iki grupta yer alan enzimler süt ve ürünlerinde meydana gelen biyokimyasal reaksiyonlarda katalizör olarak rol almakta ve sütün yapısında, tat ve aromasında olumlu veya olumsuz bazı değişiklere neden olmaktadır
Bazı doğal süt enzimleri, süt ve süt ürünlerine uygulanan ısıl işlemin derecesini ve etkinliğini belirlemek için indikatör olarak kullanılmaktadır. Bazı enzimler ise mastitis gibi meme hastalıklarının belirlenmesinde kullanılmaktadır. Yeni doğan canlının bağışıklık sisteminin ve bağırsak florasının geliştirilmesi gibi bazı fonksiyonları içermektedir
Çizelge.Sütte bulunan bazı önemli enzimler ve fonksiyonları Enzim Proteaz Lipaz Alkali fostafaz gulutamiltranspeptidaz Sülfidril oksidaz Süperoksit dismutaz Ksantin oksidaz Laktoperoksidaz Laktoz sentetaz N-acetil- β-d-glukozaminidaz Fonksiyonu/kullanım alanı/etkisi UHT sütün jelleşmesi Hidrolik ransidite Pastörizasyon testi Meme bezlerine aminoasit konsantrasyonunun artırılmasında Yanmış/pişmiş tadın uzaklaştırılmasında Oksidasyonun engellenmesinde Oksidasyon katalizinde Bakteri inhibisyonunda Meme bezlerinde laktoz biyosentezinde Mastitisin belirlenmesinde
Enzimlerin süt ve ürünlerinde teknolojik olarak sağladığı yararlar ve kullanım alanları şöyle özetlenebilir; Süte koruyucu amaçla katılan maddelerin ve peroksit varlığının belirlenmesinde, Pastörizasyon kontrolünde ve ısıl işlemin derecesinin tespitinde, Meme hastalıkları başta olmak üzere patolojik ve fizyolojik rahatsızlıkların teşhisinde, Koyulaştırılmış süt, dondurma ve bazı peynirlerde görülen kristalleşme kusurlarının önlenmesinde, Süt ve süt ürünlerinin tat-aroma niteliğinin geliştirilmesinde, Krema ve peynirin olgunlaştırılmasında, Peynir üretiminde sütün pıhtılaştırılmasında
Alkali fosfataz ve Asit fosfataz Fosfataz, fosforik asidin monoesterlerini hidrolize eden bir fosfomonoesteraz dır. Sütte farklı ph larda optimum aktivite gösteren iki farklı fosfataz enzimi bulunmaktadır. Bu enzimler asit fosfataz (EC 3.1.3.2) alkali fosfataz (EC 3.1.3.1) olarak adlandırılmaktadır.
Asit fosfataz, termostabil bir enzimdir ve pastörizasyon sıcaklıkları ile 88 ºC/ 30 dk ısıl işlem koşullarında aktivitesini koruyabilmektedir. Bu enzimin tamamen inaktif olabilmesi için 100 ºC /1 dk ısıl işlem uygulaması gerektiği belirtilmektedir. Asit fosfataz enzimi belirli koşullarda UHT sterilizasyonunda bile aktif kalabilmektedir. Ancak, bu enzimin ısı stabilitesi ph ya bağlıdır ve düşük ph değerlerinde ısı stabilitesi daha yüksektir
Alkali fosfataz, teknolojik açıdan asit fosfataza göre daha fazla önem taşımaktadır. Bu enzim alkali ph da çalışan bir hidrolazdır ve asit fosfataz gibi hem serum fazında serbest formda hem de ksantinoksidaz ile birlikte yağ globül membranına absorblanmış mikrozomlarda bulunmaktadır. ph 9.0-10.5 arasında optimum aktivite gösterirken, ph 5.0 de aktivitesi azalmakta ve 63 C / 30 dk, 70 C / 90 s, 72 C / 15 s, 80 C / 0.45 s ısıl işlem normlarında inaktif duruma geçmektedir. Alkali fosfataz ısıya oldukça duyarlıdır ve sütün pastörizasyon kontrolünde indikatör enzim olarak kullanılmaktadır
Laktoperoksidaz Sütte doğal olarak bulunan laktoperoksidaz ilk tanımlanan enzimler arasında yer almaktadır. Hidrojen peroksit gibi peroksitleri parçalayarak açığa çıkan oksijen atomunu okside olabilen maddelere taşımaktadır. Bu enzimin optimum çalışma ph sı 6.8 dir Isıl işleme karşı oldukça stabil olup pastörizasyon normlarının üzerinde inaktif hale geçmektedir. Klasik pastörizasyon sıcaklıklarında laktoperoksidaz enzimi önemli ölçüde aktivitesini koruyabildiğinden pastörize sütlerin raf ömrünün uzatılmasında da etkili olabilmektedir
Peroksidaz enzimi sıcaklık zaman kombinasyonlarına bağlı olarak, 72 C / 30 dk, 75 C / 2.5 dk, 80 C / 5 s -3.5 dk, 85 C / 0.13 s ısı uygulamalarında inaktif olmaktadır. Bu enzimin reaktive olmadan tamamen inaktivasyonu için 85 C / 10 s ısıl işlem uygulanması gerektiği bildirilmiştir
Ksantinoksidaz Ksantioksidaz (XO), sütte serum fazında çözünür formda ve yağ globül membran ile ilişkili halde bulunmaktadır. Büyük oranda yağ globül membranında lipoproteinlere absorlanmış mikrozomlarda alkali fosfataz ile birlikte yer almaktadır. Ksantinoksidaz; aldehitler, ksantin, hipoksantin, NADH gibi bileşenlerin oksidasyonunu katalize eden spesifik olmayan bir enzimdir
Optimum aktivite ph sı 6-9 arasındadır Ksantinoksidaz, pastörizasyon sıcaklığında (75 C / 15s) aktif iken 70 C / 4 dk ısıl işlem sonunda inaktif olmaktadır (Metin, 1996). Ancak, bu enzimin tamamen inaktivasyonu için 77 C / 15 dk ısıl işlem uygulanması gerektiği bildirilmektedir (Kitchen, 1985). Bazı araştırmacılar 80 C / 15 s ısıl işlem ile ksantioksidazın aktivitesinin %70 ni kaybettiği ifade ederken (Farkye ve Imadifon, 1995) Sharma ve ark. (2009), 85-90 C de ısı uygulaması ile ksantinoksidazın tamamen inaktif hale geçtiğini bildirmektedir.
Katalaz Katalaz enzimi hidrojen peroksidi su ve oksijene katalize edebilme yeteneğine sahip doğal bir süt enzimidir. Somatik hücre sayısı yüksek ve mastitisli sütlerde katalaz aktivitesi artmakta ve dolayısıyla sütte istenmeyen kalitenin bir göstergesi olarak kullanılmaktadır Bu enzimin optimum çalışma sıcaklığı 38 C, ph sı ise 7 civarındadır Katalaz enziminin ısı stabilitesi yüksektir. Tampon ortamda 70 C de 30 dakikalık ısıl işlem sonucunda katalaz aktivitesinin tamamen, 72 C de 15 s ısıl işlem sonunda ise %60 oranında kaybolduğu belirlenmiştir
Katalaz enzimi pastörizasyon yeterliliğinin test indikatörlerinden birisi olarak kabul edilmektedir. Son zamanlarda, sütte aktif katalaz enziminin varlığı, termizasyon uygulanmış sütten üretilen peynirler için bir indikatör olarak değerlendirilmektedir.
Proteinazlar Proteinazlar, proteinler üzerine etki eden bir enzim grubudur. Bazı proteazlar mikrobiyel kaynaklı iken, bazıları kandan süte geçmektedir. İnek sütünde plazmin, plazminojen, plazminojen aktivatörleri, trombin, katepsin D, asidik süt proteazları ve aminopeptidazları içeren çok sayıda proteaz bulunmaktadır
Proteinazların neden olduğu biyokimyasal değişimler bazı süt ürünlerinin kalite özellikleri üzerine olumlu veya olumsuz etkisi olmaktadır. Örneğin; peynir olgunlaşması sırasında aminoasit birikimi karakteristik tat-aromanın belirginleşmesinde etkili iken, belirli düzeyin üzerinde aminoasit birikimi tat/aroma kusurlarına yol açabilmektedir. UHT sütlerde ise, depolama süresince karşılaşılan jelasyon proteinazların varlığı ile ilişkilendirilmektedir.
Plazmin, sütün temel proteolitik enzimidir ve yaklaşık ph 7.5 da ve 37 C de optimum aktivite gösterdiği için genellikle süt alkali proteinazı olarak adlandırılmaktadır. Plazmin, sütte hem aktif enzim formunda hem de inaktif zimojen ve plazminojen formunda bulunmaktadır ve aktif enzim ile inaktif enzim arasındaki oran 1:5 dir. Plazminin spesifik aktivitesi plazmin inhibitörleri ve plazminojen aktivatörlerine bağlıdır ve bu enzim ısıya karşı oldukça stabildir. 72 C de 15 saniye süre ile gerçekleştirilen pastörizasyon sonucunda plazmin aktivitesinin sadece %10-17 si azalmaktadır
Plazmin, hem β-cn hem de α s2 -CN etki etmektedir. - CN, plazmin ile degradasyona karşı biraz daha dirençlidir. Kazeinin degragasyon ürünleri tat bozukluğu ve acı tadın oluşumuna neden olmaktadır. Plazmin aktivitesi peynir üretiminde rennet ile koagülasyon süresi, pıhtı sıkılığı ve sinerez gibi özellikleri de etkilemektedir.
Asit proteazların optimum aktivite gösterdiği ph değeri 4 dür. Asit proteazlar, alkali proteazlara oranla ısıya karşı daha duyarlıdır. Bu enzim, 60 C/10 dk ısıl işlemden sonra aktivitesinin %70 ini, 78 C/10 dk ısıl işlem sonrasında ise aktivitesinin %1 ini koruyabilmektedir. Asit proteazlar, β- ve -CN ye oranla α-cn yi daha fazla hidrolize edebilmektedir ve peynir olgunlaşmasında önemli rol oynamaktadır.
Lipoprotein Lipaz Lipoprotein lipaz (LPL) sütte trigliseridlerin hidrolizasyonundan (lipoliz) sorumlu doğal bir enzimdir. LPL, süt türüne göre değişkenlik göstermekle birlikte büyük oranda kazein miselleri ile ilişkili olarak plazmada ve yağ globül membranında yer almaktadır. Yağ globül membranı herhangi bir fiziksel nedenle hasar görmediği sürece LPL trigliseridler üzerinde etki göstermemektedir
LPL aktivitesi sonucu trigliseridlerden optimum koşullar altında her dakikada 2 μmol serbest yağ asidi oluşmaktadır. LPL, ısıya oldukça duyarlı bir enzimdir ve pastörizasyon sıcaklığında aktivitesinin büyük kısmını (~%97), 72 C de 11.8 s veya 75 C de 15 s de ise aktivitesinin tamamını kaybetmektedir