KATI-SUBSTRAT FERMANTASYONU KULLANARAK SHIPWORM BAKTERİ (Teredinobacter turnirae) İLE PROTEAZ ÜRETİMİNİN İNCELENMESİ M. ELİBOL, Ş. BULUT, M.Ş. TANYILDIZI, D. ÖZER Fırat Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 23119, Elazığ ÖZET Bu çalışmada, substrat olarak soya fasulyesinin kullanıldığı katı-substrat fermantasyonu ile Teredinobacter turnirae den proteaz üretimi gerekli sistem parametreleri optimize edilmeye çalışılmıştır. En yüksek proteolitik aktivite, 2 mm tanecik boyutu, % 1 (w/v) soya konsantrasyonu, ayarlanmamış çeşme suyu ph sı (7.34), % 2.5 (v/v) inokulum oranı ve 12 rpm karıştırma hızında 195 U/ml olarak elde edilmiştir. Ortama glikoz ve sakaroz ilavesi proteolitik aktivitede azalmaya neden olurken, ortamda çeşme suyu yerine sentetik ortamdaki tuzların kullanımı enzim aktivitesinde %8 lik bir artışa neden olmuştur Anahtar Kelimeler: Katı-Substrat Fermantasyonu; Proteaz; Soya; Teredinobacter turnirae GİRİŞ Geçen yıllarda, katı-substrat fermantasyonunun (KSF) birçok biyolojik prosesin ve ürünün gelişiminde etkili olduğu görülmüştür. KSF çok eskiden beri bilinen ve birçok Uzakdoğu orjinli maddelerin üretiminde kullanılan bir yöntemdir. Konvansiyonel fermantasyona göre ekonomik yönden birçok avantajı olduğundan dolayı da özellikle son yıllarda mikrobiyal enzim üretiminde önem kazanmıştır. Literatürde, birçok kimyasal madde, enzim ve antibiyotik üretiminin KSF ile yapılabildiği rapor edilmektedir [1,2]. KSF özellikle, biyomas ve agroendüstriyel atıkların veya kalıntıların çok olduğu ülkelerde alternatif fermantasyon metodu olarak kullanılmaktadır. KSF proseslerinin gelişiminde rol oynayan en önemli parametre substrat olarak kullanılacak maddenin maliyeti ve bulunabilirliğidir. KSF genellikle basit bir proses olup klasik fermantasyona göre daha az enerji sarfiyatı sağlar. Ancak, KSF bir takım difüzyon dirençlerinden dolayı daha yavaş gerçekleşir. Ayrıca, KSF nin bir diğer dezavantajı da, mikrobiyal biomas ve substrat tüketimi gibi bazı fermantasyon parametrelerinin ölçülmesinde rastlanan zorluklardır [3]. Alkalin proteazlar, deterjan, dericilik, gıda ve kimya gibi birçok endüstriyel alanda yaygın olarak kullanılan enzimlerdir. Proteaz üretimi için birçok mikrobiyal kaynak olmasına rağmen, ticari açıdan sadece birkaçı önem taşır. Endüstriyel birçok firma, sürekli olarak katalitik aktiviteyi artıracak yeni enzimleri bulmaya, onları tanımlamaya ve büyük ölçekli proseslerde elde etmeye çalışmaktadırlar. Bunlardan bir tanesi de bir shipworm (marinal) bakteri olan Teredinobacter turnirae tarafından üretilen oldukça aktif proteaz enzimidir. Alkaline proteaz enzim piyasasının oldukça önemli bir kısmını oluşturmaktadır. Detarjana eklenen proteaz, proteinli maddelerin kirden uzaklaştırılmasını sağlar. Alkaline proteazın deterjan endüstrisindeki artan kullanımı, bu tür enzimin temizleme yeteneğinin çevre kirliliği açısından (non-fosfat) kabul edilebilir düzeyde olmasından kaynaklanmaktadır. Proteaz ve lipaz enzimlerinin birlikte kullanılarak, protein ve yağ lekelerini uzaklaştırma prosesinin de oldukça faydalı olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, deniz bakterisinden elde edilen alkaline proteazın, kontak lens temizleme çözeltilerinde düşük sıcaklıklarda etkili olduğu bulunmuştur [4]. Bu çalışmada, katı substrat olarak soya fasulyesinin kullanıldığı ortamda, proteaz üretimi üzerine bazı fermantasyon parametrelerinin etkisi incelenmiştir.
DENEYSEL Bir marinal bakteri olan mikroorganizma, simbiotik olarak yaşadığı Teredinidae familyasından ve Deshayes salgı bezlerinden izole edilmiştir. Deneylerde asıl besi ortamı çeşme suyu ve soya fasulyesi olmasına rağmen, kontrol deneyleri için aşağıda içeriği verilen sentetik ortam da kullanılmıştır. Litrede: 5 g sakkaroz, 1 g NH 4 Cl,.4 g KCl, 1.9 g MgSO 4.7H 2 O, 1.5 g MgCl 2.6H 2 O,.4 g CaCl 2.2H 2 O, 4.9 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid),.1% (v/v) Antifoam 289, 1 ml Çözelti A, 1 ml metal çözeltisi. Çözelti A (litrede) 24 g K 2 HPO 4.3H 2 O, 12 g Na 2 CO 3,.3 g Fe 2 (SO 4 ) 3. Metal çözeltisi ise 2.9 g H 3 BO 3, 7.2 g MnCl 2.4H 2 O,.2 g ZnSO 4.7H 2 O,.4 g Na 2 MoO 4.2H 2 O,.5 g CoSO 4.7H 2 O,.8 g CuSO 4.5H 2 O tuzlarından oluşmaktadır. Ayrıca, bazı deneylerde glikoz ve sakkarozun yer aldığı kombine besi ortamları da kullanılmıştır. Deneyler 5 ml besi ortamı içeren 25 ml lik erlenlerde ve 3 C, 12 rpm çalkalama hızında gerçekleştirilmiştir. Filtrasyon ve santrifüjleme işleminden sonra kalan supernatant enzim çözeltisi olarak kullanılmıştır. Proteaz aktivite ise %.8 azokazein kullanılarak belirlenmiştir [5]. SONUÇLAR Alkalin Proteaz Üretim Profili Soya fasulyesi, lokal marketlerden temin edilmiş ve Waring tipi homojenizatörde parçalanmıştır. Herhangi bir boyut analizine gidilmeden fermantasyon ortamına ilave edilmiş ve proteaz üretimi için inkübasyona bırakılmıştır. Proteaz üretimi fermantasyonun 5.saatinden sonra (39 U/ml) başlamış ve 63. saatte (115 U/ml) maksimuma ulaşmıştır (Şekil 1). 15 12 9 6 3 5 1 15 2 25 3 Zaman(saat) Şekil 1 Zamanla proteaz aktivitesinin değişimi Tanecik Boyutunun Etkisi KSF proseslerinde yer alan birçok parametre içinde, substrat tanecik boyutu oldukça önemli yer tutar. Bu yüzden parçalanmış soya fasulyesi, kalın (2. mm), orta (1 mm) ve ince (.25 mm) olmak üzere üç gruba ayrılmış ve bu taneciklerin proteaz üretimine etkileri incelenmiştir. Yapılan deney sonuçlarında 2. mm çapa sahip taneciklerin kullanıldığı ortamda maksimum proteaz aktivitesi gözlenmiştir (Şekil 2). Tanecik çapı azaldıkça, enzim aktivitesi de azalmaktadır. Küçük tanecik çaplı ortamda yüzey alanı diğerleine göre daha büyük olmasına rağmen, katı substrat üzerindeki gözenekliliğin küçük olmasından dolayı hücreler etkin bir şekilde substratı kullanamamış olabilir. Bu da enzim aktivitesinde azalmaya sebep olmuş olabilir. 2 mm katı substrat içeren ortamda ise yüzey alanının küçük ama gözenekliliğin büyük olmasından dolayı, daha etkin bir substrat tüketimi, dolayısıyla da daha fazla proteaz üretimi söz konusu olmuş olabilir.
15 12 9 6 3 2 4 6 8 1 Zaman (saat) Şekil 2 Tanecik boyutunun proteaz üretimi üzerine etkisi Kalın, 2mm; orta, 1 mm ; ince,.25 mm Substrat (Soya Fasulyesi) Konsantrasyonun Etkisi Tüm fermantasyon otamlarında olduğu gibi, burda da proteaz üretimi şüphesiz ortamda bulunan substrat miktarından önemli derecede etkilenecektir. Mikroorganizmalar mevcut substratı çoğalma, üretim, yaşamlarının devamı için bazı bazal gereksinimler vs. için kullanırlar. Ancak ortamda fazla veya az substrat bulunması her zaman için üretim mekanizması ile doğru orantılı olarak değişmez. Bunu incelemk amacıyla %.5 (w/v) ile % 5 arasında değişen 7 farklı konsantrasyonda proteaz üretimi gerçekleştirilmiş ve sonuçlar Şekil 3 de toplu olarak verilmiştir. Şekilden de görüldüğü gibi, en yüksek aktivite %1 (w/v) soya fasulyesi bulunan ortamda elde edilmiştir. Özellikle yüksek substrat konsantrasyonlarda proteaz aktivitesi önemli oranda azalmaktadır. Bu durum ortamda bulunan fazla substratın inhibisyona sebep olduğu şeklinde açıklanabilir. Ayrıca Başlangıç ph sının Etkisi Tüm fermantasyonlarda ortam ph sı zamanla değişim gösterir. Bu değişim başlangıcta ayarlanan değerle şüphesiz ilişkilidir. Mikroorganizmanın sözkonusu ürün üretimi için faaliyetlerini optimum Maksimum 2 15 1 5.5 1 2 5 1 2 3 Soya Konsantrasyonu (%,w/v) Şekil 3 Substrat konsantrasyonun proteaz üretimine etkisi
düzeyde geçekleştirebilmesi için fermantasyon öncesi belli bir ph değerine ayarlanması gerekir. Sentetik ortamda T.turnirae den proteaz üretimi için başlangıç ph değeri 8 olarak ayarlanmıştı. Ancak soya fasulyesi ortamında bunun değişebilme ihtimali göz önüne alınarak, soya fasulyesi ve çeşme suyu ortamından ibaret sistem, farklı ph değerlerine ayarlandı. Elde edilen maksimum proteaz aktiviteleri Şekil 4 de görülmektedir. Şekilden de görüldüğü gibi, T.turnirae oldukça geniş bir ph aralığında ~19±5 U/ml değerinde proteaz enzimini üretebilmektedir. Ancak en yüksek aktivite, çeşme suyunun doğal ph sı olan 7.34 değerinde elde edilmiştir. Dolayısıyla soya fasulyesinden T.turnirae bakterisi ile proteaz üretim prosesinde inokulasyon öncesinde ph ayarlamaya gerek duymaksızın fermantasyon başlatılabilir. Bu da özellikle büyük ölçekli sistemlerde zaman açısından oldukça önemli bir kazanç olarak değerlendirilebilir. Başlangıç Inokulum (Kültür) Miktarının Etkisi Fermantasyon ortamında kullanılan mikroorganizma miktarı, üretim prosesini etkilyen parametrelerden biridir. T.turnirae dan proteaz üretiminde, inokulum miktarını incelemek amacıyla toplam fermantasyon ortamına (5ml) %1 ve %2 arasında değişen 5 farklı değerde kültür ekimi gerçekleştirildi. Sonuçlar Şekil 5 de görülmektedir. Şekilden de görüldüğü gibi, %1 dışındaki değerlerde yaklaşık aynı proteaz aktivitesi ölçülmüştür. Ancak düşük inokulum oranı, maksimum proteaz miktarının görülmesinde gecikmeye sebep olmaktadır. %2.5 değerinden sonraki artışların, üretilecek olan maksimum proteaz miktarını değiştirmediği Şekil 5 den de açıkça görülmektedir. Karıştırma Hızının Etkisi Aerobik ortamda gelişen mikroorganizmalar ihtiyaç duydukları oksijeni ancak optimum şartlardaki karıştırma ile temin ederler. Özellikle küçük ölçekli Erlenmayer deneylerinde iyi bir kütle transferi için, en iyi karıştırma hızının belirlenmesi gerekir. Bunun için T.turnirae dan proteaz üretimi beş farklı karıştırma hızında gerçekleştirilmiş ve sonuçlar proteaz aktivitesinin zamanla değişimine karşı grafiği şeklinde Şekil 6 da verilmiştir. Şekilden de görüldüğü gibi, 12 rpm ve daha sonraki karıştırma hızında elde edilen maksimum proteaz aktivitesi değişmemektedir. Daha düşük değerlerde ise yetersiz kütle transferi daha düşük proteaz üretimine neden olmaktadır. Bu durumdan da 12 rpm deki karıştırma hızı T.turnirae nin belirli miktardaki proteazı üretebilmesi için yeterli olduğu anlaşılmaktadır. 25 2 15 1 5 4 5 6 7 8 9 1 11 ph Şekil 4 Başlangıç ph sının proteaz üretimi üzerine etkisi
25 Maksimum Proteaz (U/mL) 2 15 1 5 1 2,5 5 1 2 Inokulum Oranı (%,v/v) Şekil 5 Maksimum proteaz miktarının inokulum oranı ile değişimi 25 Maksimum Proteaz (U/ml) 2 15 1 5 75 1 12 175 25 Karıştırma Hızı (rpm) Şekil 6 Maksimum proteaz aktivitesinin karıştırma hızı ile değişimi Glukoz ve Sakarozun Ortama İlavesi Bazı basit yapılı karbon kaynaklarının proteaz üretimi üzerine etkisini görmek amacıyla soya+çeşme suyu içeren ortamlara ayrı ayrı olmak üzere %.5 glukoz ve %.5 sakkaroz ilave edildi. Sonuçlar Şekil 7 de verilmektedir. Ortama ilave edilen her iki karbon kaynağı da proteaz üretiminde azalmaya sepep olmaktadır. Bu durum belki de ilave edilen şekerlerin proteaz üretimindeki represif etkisinden kaynaklanabilir. Tuz Çözeltisinin Etkisi Soya fasulyesi ve sadece çeşme suyunun kullanılması yerine, soya fasulyesinin PB besi ortamına ilavesi ile proteaz fermantasyonunda olabilecek değişikleri gözlemek amacıyla, %5 (w/v) soya fasulyesi, sakkaroz (karbon kaynağı) ve NH 4 Cl ün (azot kaynağı) olmadığı PB ortamına ilave edildi. Şekil 8 den de görüldüğü gibi, soya fasulyesinin PB ortamında kullanımi proteaz aktivitesinde sadece yaklaşık %22 lik bir artışa sebep olmaktadır.
25 2 15 1 5 3 6 9 12 15 Zaman(Saat) Şekil 7. Glukoz ve sakkarozun proteaz üretimi üzerine etkisi Kontrol, %1soya; %1soya+%.5sakkaroz; %1soya+ %.5 glukoz 25 2 15 1 5 3 6 9 12 15 Zaman (saat) Şekil 8 Tuz çözeltisinin (sentetik besi ortamı) proteaz üretimi üzerine etkisi Kontrol, %1soya+çeşme suyu; %1soya+sentetik ortam KAYNAKLAR 1. Roukas, T., Citric acid production from pod by solid fermentation, Enyzme Microbiol. Biotechnol., 24,54-59 1999. 2. Selvekumar, P., Pandey, A., Solid state fermentation for the synthesis of inulinase from Staphylococcus sp. And Kluyveromyces marxianus, Process Biochem., 34:851-855,1999. 3. Hesseltine, C.W., Solid state fermentation, Biotechnol.Bioeng., 1992, 14: 517-532. 4. Greene, R.V., Cotta, M., Griffin, H.L., A novel symbiotic bacterium isolated from marine shipworm secretes proteolytic activity, Current Microbiology, 19,353-356, 1989. 5. Cotta, M.A. and Hespell, R.B. Proteolytic activity of the ruminal bacterium Butyrivibrio fibrisolvens, Appl.Environ.Microbiol, 52, 51-58, 1986.