ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ GAZİANTEP İLİ ASMA GEN POTANSİYELİNİN SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS) MARKÖRLERLE MOLEKÜLER ANALİZİ EDA KARAAĞAÇ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ANKARA 2006 Her hakkı saklıdır
Prof. Dr. Y. Sabit AĞAOĞLU danışmanlığında, Ziraat Yüksek Mühendisi Eda KARAAĞAÇ tarafından hazırlanan bu çalışma 12.06.2006 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı nda Doktora tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan : Prof. Dr. Y. Sabit AĞAOĞLU İmza: Üye : Prof. Dr. Sebahattin ÖZCAN İmza: Üye : Prof. Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU İmza: Üye : Prof. Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU İmza: Üye : Prof. Dr. Zeki KARA İmza: Yukarıdaki sonucu onaylarım (İmza) Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU Enstitü Müdürü
ÖZET Doktora Tezi GAZİANTEP İLİ ASMA GEN POTANSİYELİNİN SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS) MARKÖRLERLE MOLEKÜLER ANALİZİ EDA KARAAĞAÇ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Y. Sabit AĞAOĞLU Bu araştırmada, Gaziantep ilinde yetiştirilen 35, bu ilden Tekirdağ Milli Koleksiyon Bağı na aktarılan 11 çeşit ile 2 referans çeşit olmak üzere toplam 48 üzüm çeşidinin (Vitis vinifera L.) 17 mikrosatelit markör (VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD24, VVMD25, VVMD27, VVMD28, VVMD31, VVMD34, VrZAG62, VrZAG79, VVIB23, VMC3B10, VMC6F1, VMC2C3, VMC2H4, VMC5A1) kullanılarak genetik düzeyde allel profilleriyle genetik tanımlamaları yapılmış ve aralarındaki genetik benzerlik araştırılmıştır. Lokuslarda gözlenen allel sayısı 13 ilâ 4 arasında (VVS2, VMC6F1) değişmiştir. Beklenen ve gözlenen heterozigotluk oranı ortalama sırasıyla 0.720 ve 0.689 olarak bulunmuştur. Kümeleme analizi için UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Means) yöntemi uygulanmıştır. Dendogramda 2 ana grup ortaya çıkmıştır. Genotiplerin büyük kısmını içeren birinci grup içinde çok sayıda alt grup gözlenmiştir. Genotipler arasında Gaziantep ilinden alınan Dusuzu ile Dımışkı çeşidi sinonim bulunmuştur. Yine Tekirdağ ve Gaziantep ilinden alınan Rumi çeşitleri dışında 5 homonim durumuna rastlanmıştır. Gaziantep ten alınan Kışüzümü ve Sergi karası, Sarı kabarcık ve Serpenekıran arasında yakın bir benzerlik oranı gözlenmiştir. Bunların aynı genotipe sahip ve muhtemel somaklonal varyant olabileceği düşünülmektedir. 2006, 89 sayfa Anahtar Kelimeler : Vitis vinifera L. cvs., Gaziantep, mikrosatelit, genetik tanımlama i
ABSTRACT Ph.D. Thesis MOLEKULER ANALYSIS OF GRAPEVINE GERMPLASM BY SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS) MARKER IN GAZIANTEP PROVINCE Eda KARAAĞAÇ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Science Department of Horticulture Supervisor: Prof. Dr. Y. Sabit AĞAOĞLU In this research, a total of 48 grape cultivars (Vitis vinifera L.) consisting of 35 local grape cultivars from Gaziantep and 11 cultivars from Tekirdağ Viticulture Research Institute in National Germplasm Repository Vineyard with 2 reference cultivars were genetically characterized using 17 SSR markers (VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD24, VVMD25, VVMD27, VVMD28, VVMD31, VVMD34, VrZAG62, VrZAG79, VVIB23, VMC3B10, VMC6F1, VMC2C3, VMC2H4, VMC5A1) and genetic relationships among them were investigated. Number of alleles per locus ranged from 4 (VMC6F1) to 13 (VVS2). Expected and observed heterozygosity values were between 0.720 and 0.689 respectively. Cluster analysis for the genotypes was conducted using UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Means) method. The dendogram was consisted 2 main groups. Group 1 was the largest and it contained many sub-groups. 2 cases of synonymy were revealed for the genotypes (Dusuzu and Dımışkı, Rumi from Gaziantep and Rumi from Tekirdağ) and 5 cases of homonymy were observed. Kış üzümü and Sergi karası, Sarı Kabarcık and Serpenekıran from Gaziantep showed close genetic relationship. Therefore, they may be regarded as the same cultivar. 2006, 89 pages Key words: Vitis vinifera L. cvs., Gaziantep, microsatellites, characterization, genotyping ii
TEŞEKKÜR Bu konuda bana çalışma olanağı veren, her konuda yardımlarını esirgemeyip tezin uygulamada çıkmaza girdiği aşamalarda çözüm önerileri sunan, danışman hocam Sayın Prof. Dr. Y. Sabit Ağaoğlu na, Tez İzleme Komitesinde olmayı kabul ettikleri için Sayın Prof. Dr. Sebahattin Özcan ve Prof. Dr. Birhan Marasalı Kunter e teşekkürlerimi sunarım. Tezimin her aşamasında bilgisine başvurduğum Sayın Doç. Dr. Ali Ergül ve laboratuvarda çalışmam ve tezimin yazım aşamasında yardımcı olan arkadaşım Dr. Zeliha Yaşa Gökbayrak a özel teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamızın ilk yıllarında projeden alamadığımız kimyasalların temininde ve her aşamadaki yardımları için Bölüm Başkanımız Sayın Prof. Dr. Gökhan Söylemezoğlu na; proje kapsamında yaptığım bu tezde materyal teminini sağlayan ve materyalin bakımını üstlenen Dr. Hüseyin Karataş a, laboratuvarda bana yardımcı olan Mehmet Türkoğlu na ve Bölümümüz Bağ Yetiştirme ve Islahı Bilim Dalı Öğretim Üyeleri başta olmak üzere tüm Bölüm Hoca larıma, Araştırma Görevlisi ve çalışanlarına bana desteklerinden dolayı teşekkür ederim. İtalya da San Michele Tarım Bilimleri Enstitüsü ndeki laboratuvarında bana çalışma olanağı veren ve laboratuvarın kaynaklarını bana sonuna kadar açan Dr. M. Stella Grando ya, yine tezimdeki tekniği öğreten Dr. Flavia Moreira ya, istatistik ve kaynak teminindeki yardımları için Dr. Laura Costantini ye, laboratuvardaki yardımlarından dolayı Jessica ya ve diğer arkadaşlarıma çok teşekkür ederim. Madrid Ulusal Biyoteknoloji Merkezi nde araştırmacı olarak çalışan bana verilerimin yorumlanmasında yardımcı olan Dr. José Miguel Martínez Zapater e ve istatistik konusunda yardımlarından dolayı Dr. José Antonio Cabezas a çok teşekkür ederim. Bu doktoranın gerçekleştirilmesindeki mali desteği (Bu çalışma Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü tarafından 2001K120-240 (2004/139) kodlu projenin bir bölümü olarak gerçekleştirilmiştir) için Üniversitemiz Biyoteknoloji Enstitüsü ne ve yurtdışında kaldığım süre boyunca bana burs veren İtalya Hükümeti ne teşekkür ederim. Ayrıca, bu çalışma boyunca ve hayatım boyunca her türlü maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen, stresli zor anlarımda bana sabırlı bir şekilde sevgilerini gösteren canım aileme, Alfonso Cuesta Marcos a ve yine aile büyüğüm olarak kabul ettiğim rahmetli hocam Prof. Dr. Yılmaz Fidan a teşekkürü bir borç bilirim. Eda KARAAĞAÇ, Ankara, Temmuz 2006 iii
İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...v ŞEKİLLER DİZİNİ...vii ÇİZELGELER DİZİNİ...viii 1. GİRİŞ...1 2. KURAMSAL TEMELLER...4 2.1 Mikrosatelitler (SSR, Simple Sequence Repeats)...6 2.2 Vitis te Mikrosatelit Markörlerin Geliştirilmesi...9 2.3 SSR İçin Uygun Analiz Yöntemleri ve Karşılaştırmaları...10 2.4 Verilerin Yorumlanması...10 2.5 SSR Profillerinin Genetik Veribankası...12 2.6 Çeşitlerin Ticari Sertifikasyonu...13 2.7 SSR Tekniğinin Bağcılıkta Kullanım Alanları...14 2.8 SSR Tekniğinin Asma (Vitis spp.) Gen Kaynaklarının Tanımlanmasında Kullanımı...15 2.9 Asma Mikrosatelit Çalışmaları...17 3. MATERYAL VE YÖNTEM...40 3.1 Materyal...40 3.2 Yöntem...44 3.2.1 DNA izolasyonu...44 3.2.2 PCR uygulaması...45 3.2.3 SSR Tekniğinin otomatik dizi analizi sistemi kullanılarak kapilar elektroforezde uygulanması...47 3.2.4 Sonuçların Değerlendirilmesi...48 4. ARAŞTIRMA BULGULARI...49 4.1 DNA İzolasyonu...49 4.2 Otomatik Dizi Analizi Sisteminden Elde Edilen Allel Büyüklükleri...50 4.3 Yazılım Programları ile Sonuçların Değerlendirilmesi...57 5. TARTIŞMA VE SONUÇ...66 KAYNAKLAR...73 EKLER...Hata! Yer işareti tanımlanmamış. ÖZGEÇMİŞ...90 iv
SİMGELER DİZİNİ AFLP bp CTAB D DNA dntp EDTA H e H o MgCl 2 mm μl M n OIV PBR PCR PI PIC PVP r RAPD RFLP RNase Amplified Fragment Length Polymorphism (Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı) Base pair (Baz çifti) Hekzadesil Trimetil-Amonyum Bromür Descrimination Power (Ayırma Gücü) Deoksiribo Nükleik Asit Deoksi-Nüklezid Trifosfat Etilen Diamine Tetra Asetik Asit Expected heterozigosity (Beklenen heterozigotluk) Observed heterozigosity (Gözlenen heterozigotluk) Magnezyum Klorür Milimol Mikrolitre Mol The number of allelles (Allel sayısı) Organisation Internationale de la Vigne et du Vin (Uluslararası Bağcılık ve Şarapçılık Organizasyonu) Plant Breeders Rights (Bitki ıslahçı hakları) Polymerase Chain Reaction (Polimeraz zincir reaksiyonu) Probability of Identity (Tespit olasılığı) Polymorhism Information Content (Polimorfik bilgi içeriği) Polyvinylpyrrolidone The estimated frequency of null allele (Tahmin edilen sessiz allel frekansı) Random Amplified Polymorphism DNA (Rastgele çoğaltılmış DNA farklılığı) Restriction Fragment Length Polymorphism (Kasilmiş parça uzunluğu farklılığı) Ribonükleaz v
ROX 500 rpm SSR TBE TE UPOV VMC Internal-line size standard (Applied Biosystems) (İçsel büyüklük standardı) Dakikadaki dönüş sayısı Simple Sequence Repeats (Basit dizi tekrarları) Tris-Borik Asit-EDTA Çözeltisi Tris-EDTA Çözeltisi The International Union for the Protection of New Varieties of Plants (Yeni Bitki Çeşitlerinin Korunmasına İlişkin Uluslararası Birlik) Vitis Microsatellite Consortium (Vitis Mikrosatelit Konsorsiyumu) Kısaltmalar G TBAE T Gaziantep ilinden alınan çeşitler Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nden (Milli Koleksiyon Bağı) alınan Gaziantep çeşitleri vi
ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 CA tekrar dizilerini gösteren 3 farklı mikrosatelit allelleri...7 Şekil 2.2 Kapilar elektroforezde analiz edilmiş örneklerin, GeneScan 3.7 yazılım programında analiz edildikten sonraki piklerin görüntüleri...7 Şekil 4.1 Bazı lokuslardaki PCR ürününün agaroz jel üzerindeki görünümü...50 Şekil 4.2 Genotyper 3.7 programında VVMD24 ve VMC2H4 SSR lokuslarına ait allel büyüklüklerinin pikler şeklindeki görünümleri...51 Şekil 4.3 Çalışılan lokuslarda tespit edilen allel frekansları...59 Şekil 4.4 Gaziantep asma genotiplerine ait dendogram...65 vii
ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Araştırmada kullanılan Gaziantep iline ait üzüm çeşitlerine ilişkin kısa ampelografik özellikler...41 Çizelge 3.2 PCR çoğaltma öğeleri konsantrasyon ve miktarları...46 Çizelge 3.3 Primerlerin PCR daki döngü koşulları...46 Çizelge 3.4 Kullanılan primerlere ait bilgiler...47 Çizelge 4.1 Araştırmada kullanılan üzüm çeşitlerine ait DNA yoğunlukları, saflık dereceleri ve 100 ml sulandırılmış DNA hazırlamada kullanılan DNA miktarları (μl)...49 Çizelge 4.2 Gaziantep çeşitlerinin 17 lokustaki allel büyüklükleri (bp)...52 Çizelge 4.3 Çalışılan lokuslardaki allel sayıları, allel aralığı, He, Ho, sessiz (null) allel frekansı ve tespit olasılığı (PI) değeri...58 Çizelge 4.4 Gaziantep iline ait üzüm çeşitlerinin genetik benzerlik değerleri...64 viii
1. GİRİŞ Bağcılık, insanoğlunun en eski tarımsal aktivitelerinden biridir. Dünya üzerinde kültürü yapılan en eski türlerden birisi olan asma, ülkemizde de, son derece eski ve köklü bir kültüre sahiptir. MÖ 2000 yıllarında Anadolu da büyük bir uygarlık kuran Hititler dönemine ait, buğday ve arpa yetiştiriciliği ile birlikte bağcılığın önemini anlatan çok sayıdaki arkeolojik kalıntıya rastlamak mümkündür (Çelik vd. 1998). Asma, yetiştirme alanı ve üretimi ile ekonomik ve kültürel açıdan bakıldığında Avrupa da da en önemli türlerden biridir. Hatta şarabın Avrupa da dini törenlerde kullanılması ve artık yaşam tarzı olması üzümün önemini daha da arttırmaktadır. Birçok botanist, tüm üzüm çeşitlerinin (Vitis vinifera L. ssp vinifera), Avrupa da ve Batı Asya da doğal ortamı boyunca yayılmış bir veya birkaç yabani asmanın (Vitis vinifera L. ssp. silvestris) kültüre alınmasıyla meydana geldiğine inanmaktadır (Üzümeri 1938, Fidan 1985, Vouillamoz et al. 2003). Asmanın en erken kültüre alınma olayının yaklaşık MÖ 4000 3000 yıllarında Kafkasya geçiş bölgesi veya Küçük Asya (Anadolu) civarında bir yerlerde olduğu düşünülmektedir. Hatta Nuh efsanesine göre ilk asmaya Ağrı Dağı nda rastlanmıştır (Fidan 1985). Negrul (1968) Vitis vinifera içinde en fazla farklılığın görüldüğü bölge olması nedeniyle Verimli Hilal yani Zagros-Toros- Kafkasya Dağları arasında kalan bölgeye Üzümün Bereketli Üç Meleği adını vermiştir. Nuh Efsanesi nin bahsettiği Ağrı Dağı nın da bu verimli bölgenin içinde yeraldığı dikkati çekmektedir (Vouillamoz et al. 2003). Rus bilginlerinden Vavilov, bitkilerin kökenlerinin saptanmasından önce, tarımının yapıldığı yerlerin de gözönünde tutulmasının gerekli olduğunu ileri sürmektedir. Bu yazara göre, herhangi bir bitkinin en çok değişim gösterdiği yer, onun orijin merkezidir. Bu nedenle bir bitkinin kökeninin tayininde, fazlaca varyasyon gösterdiği yerler önem kazanır (Fidan 1985). Yine Vavilov, sayısız üzüm varyasyonunun bulunuşundan dolayı, asmanın anavatanı olarak Güney Kafkasya ve Kuzey Doğu Anadolu yu kabul etmektedir (Fidan 1985, McGovern et al. 1996, Fatahi et al. 2003). 1
Vitis vinifera L. türünde yaklaşık 6000 çeşidin (Alleweldt and Dettweiler 1994) olduğu, bunların da 400 den daha azının ticari öneme sahip olduğu ifade edilmektedir (Galet 2000). Bu nedenle, bugün Vitis vinifera L. genetik kaynaklarının gen bankası koleksiyonunda korunması ve bu genotiplerin ampelografik özelliklerinin belirlenmesi, moleküler markör teknikleriyle genetik profillerin çıkarılması ve veri bankası oluşturulması son derece önemlidir. Çeşit belirleme ve ayrım tespiti için kullanılan geleneksel metotlar olan ampelografi ve ampelometri, çeşitler arasındaki morfolojik farklılık esasına dayanır. Ancak bu metodlar çeşitli sınırlamalara sahiptir. Tam olarak gelişmiş bitkilerde sadece vejetatif dönem boyunca uygulanabilirliği ve bitki fenotipinin, çevre şartları ile beslenme durumu ve sağlığı gibi durumlardan aşırı derecede etkilenmesi bu yöntemin kullanılabilirliğini kısıtlamaktadır. Bu sebeplerden ötürü, çeşit ayırmak için genotip düzeyinde farklılıkları daha iyi gösteren moleküler markör teknikleri kullanılmaya başlanmıştır. Bunlar RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), mikrosatelit markörler (SSR, Simple Sequence Repeats) gibi teknikleri içerir. Bunlardan SSR markörler, polimorfizm oranlarının yüksek oluşu, tekrarlanabilirliği ve kodominant karakterli oluşundan dolayı tercih edilirler. SSR markörler asma ıslahında; Vitis cinsinde evrimsel gelişimin moleküler analizi, Vitis vinifera L. çeşitlerinin ve Amerikan asma anaçlarının moleküler analizi, orijin belirleme, melezleme ıslahında hibrit bitki tanısı, pedigri analizi ve genetik haritalama ile markör yardımı ile seleksiyon gibi değişik amaçlara yönelik olarak kullanılmaktadır. Türkiye, asmanın anavatanı olmasından dolayı, sahip olduğu zengin bağcılık mirasını hâlâ korumaktadır. Genetik içeriklerini çok iyi korumuş olan eski çeşitler hâlâ yetiştirilmekte olup geniş bir farklılık ortaya çıkartmışlardır. Ülkemiz bağcılığı bölgeler 2
çapında değerlendirildiğinde; Güneydoğu Anadolu Bölgesinin diğer bölgelere ve Gaziantep ilinin de bu bölgedeki diğer illere oranla daha büyük çeşit potansiyeline sahip olması, bu ilin seçilmesinde esas nedeni oluşturmuştur. İl çeşitlerinin bir kısmının Tekirdağ daki "Milli Koleksiyon Bağına" aktarıldığı çalışmanın yanısıra, Gaziantep ilini de içeren ve Güneydoğu Anadolu Bölgesi nde yetişen üzüm çeşitlerinin ampelografik özellikleri üzerine yapılan çalışma (Gürsöz 1993), çeşit muhafazası açısından yapılan çalışmalardır. Ancak, bu ildeki asma gen potansiyeli tam olarak bilinmemekte ve yıllar itibariyle bu zengin asma gen potansiyelinde seleksiyon, yapılaşma ve göç gibi çeşitli nedenlerden dolayı önemli kayıplar olmaktadır. Bu araştırmada, Gaziantep ili ve önceki yıllarda bu ilden Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü ndeki Milli Koleksiyon Bağı na aktarılan çeşitlerin, SSR markör yardımıyla DNA düzeyinde moleküler analiziyle, gen kaynakları sayısının belirlenmesi ve korunması amaçlanmıştır. Araştırmada, Gaziantep ilinden 46 üzüm çeşidi ile 2 adet referans çeşit olmak üzere toplam 48 üzüm çeşidinin genetik tanımlamaları yapılmıştır. Bu çalışmada, dünyada gen bankası oluşturmada ve çeşitlerin bir veribankasında toplanmasında kullanılan SSR tekniği uygulanması ile ileride kurulabilecek Ulusal Gen Bankası çalışmalarına ışık tutulabilecektir. 3
2. KURAMSAL TEMELLER Vitis L. cinsi, 60 kadar Asya türünü, yaklaşık 25 Kuzey Amerika ve tek bir Avrupa türünü (Vitis vinifera L.) kapsar (Ağaoğlu 1999). Asya ve Amerika türleri, çoğunlukla anaç ve mantari hastalıklara dayanıklı çeşit ıslahı için kullanılırken, Vitis vinifera L. 5000 yıldan beri kültürü yapılan temel türdür (Zohary and Hopf 2000). Vitis vinifera L. türünde yaklaşık 6000 çeşidin (Alleweldt and Dettweiler 1994) olduğu tahmin edilmektedir ve bunun 400 den daha azı ticari öneme sahiptir (Galet 2000). Bu nedenle, bugün Vitis vinifera L. genetik kaynaklarının gen bankası koleksiyonunda korunması istenmektedir. Vejetatif çoğaltmanın kolaylığı, birçok üzüm çeşidinin dünyanın farklı bölgelerine yayılmasını sağlamıştır (Dion 1977, Fregoni 1991). Bunun sonucu olarak, bazı çeşitler şu an itibariyle 100 ün üzerinde sinonim ve çok sayıda homonime sahiptir (http://www.genres.de/idb/vitis). Gen kaynaklarının rasyonel kullanımı açısından doğru tanımlama temel bir gereklilik olması nedeniyle; sinonim, homonim ve yanlış isimlendirme dünyada bulunan 130 asma koleksiyonu için önemli bir sorun teşkil etmektedir (Dettweiller et al. 2000). Geleneksel olarak yapılan asma çeşitlerinin kimlik tespiti; yaprak, sürgün ucu, meyve salkımı ve tanelerin morfolojik özelliklerinin analizi ve karşılaştırılması olan ampelografiye dayanır (Galet 2000). Bununla beraber, ampelografi konusunda, az sayıda ve gittikçe azalan sayıda uzmanlar bulunmaktadır. Ayrıca morfolojik özelliklerin ifadesi çevre şartları, o bitkinin biyolojisi ve gelişim aşamaları tarafından etkilenmektedir. Ayrıca 4 5 yaşındaki genç bitkiler, olgun bitkilerin tipik morfolojik özelliklerini göstermediklerinden, kimliklerini saptamak neredeyse imkânsızdır. Genetik olarak benzerlik gösteren bazı çeşitler morfolojik olarak aynıdır ve gözle yapılan karşılaştırmayla belirlemek çok zordur (Aradhya et al. 2003). Diğer bir yandan, gerçekte aynı DNA profiline sahip çeşitler içindeki klonlar, fenotipte önemli ölçüde 4
ayrılırlar (Vignani et al. 1996, Franks et al. 2002, Riaz et al. 2002). Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, asma aksesyonlarını birbirinden ayırt etme, tanımlama ve kimlik tespitinde moleküler markörler kullanılmaktadır. Moleküler markör tekniklerinden, RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), asma ve anaçlarında özel DNA parmakizi analizi tespitinde başarılı bir şekilde kullanılmıştır (Striem et al. 1990, Bourquin et al. 1991, 1992, 1993, 1995, Thomas et al. 1993, Guerra and Meredith 1995). İlk yıllarda kullanılmış olan izoenzim analiziyle (Schaefer 1971, Stavrakakis and Loukas 1983, Benin et al. 1988, Eiras-Dias et al. 1989, Caló et al. 1989, Cabello and Ortíz 1995, Ağaoğlu vd. 1999) karşılaştırıldığında, RFLP tekniği farklı çevre koşullarında kuvvetli bir avantaj sağlar ve yüksek seviyede polimorfizm gösterir. Bununla birlikte, bu yöntemde karışık bant örnekleri sonuçların değerlendirilmesinde zorluklara neden olabilir (Striem et al. 1990). Bu yöntemin ayrıca, yüksek kalite ve miktarda DNA ya ihtiyaç duyması ve ayrıca probların ilk geliştirilmesinin zaman alması ve pahalı olması gibi problemleri mevcuttur (Sefc et al. 2001). PCR (Polymerase Chain Reaction) teknolojisi sayesinde, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) analizi, organizmalar arasında genetik farklılığı belirlemede ucuz, kolay ve hızlı bir metoddur. Asma ve anaç çeşitlerinde RAPD analizi yapılarak iyi bir polimorfizm seviyesi belirlenmiştir (Collins and Symons 1993, Jean-Jaques et al. 1993, Gogorcena et al. 1993, Tschammer and Zyprian 1994, Moreno et al. 1995, Xu and Bakalinsky 1996, Stavrakakis and Biniari 1998, This et al. 1997, Ye et al. 1998, Ergül vd. 2002). Bununla beraber, bu metodun en büyük dezavantajı, sonuçların katı deney koşullarına bağlılığıdır. Farklı PCR cihazı, Taq polimeraz veya DNA ve primer konsantrasyonları (Büscher et al. 1993) yanında, aynı şekilde, çalışmayı yapan kişiler de sonuçları etkileyebilir. Sonuçların stabilitesi, reaksiyon koşullarının dikkatli bir şekilde standardize edilmesiyle elde edilebilir (This et al. 1997), fakat genellikle RAPD 5
işleminin standardizasyonu ve laboratuvarlar arasındaki sonuçların karşılaştırılması çok zor bir hedeftir (Sefc et al. 2001). Polimorfik RAPD markörlerin özel PCR primerleriyle SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) markörlere çevrilmesi, RAPD polimorfizminin iyi bir şekilde tekrar edilebilirliğine izin verir (Bauer and Zyprian, 1997). Genetik kimlik tespit amaçlı RAPD markörlerden SCAR ların geliştirilmesi, mikrosatelit markörlerin geçerlilik kazanmasıyla arka planda kalmıştır. RAPD markörlerin SCAR markörlere çevrilmesi, çekirdeksizlik (Lahogue et al. 1998; This et al. 2000) olayında gösterildiği gibi fenotiple birleştirilebilecek bir genom haritalamasında kullanışlı olabilir (Sefc et al. 2001). Yukarıda açıklanan metodların hiçbiri en iyi kimlik tespiti gereksinimini karşılamadığından, daha ümit verici markörler üzerine çalışmalar devam edilmiş ve öncelikle insan ve hayvanlarda değerlendirilen aynı zamanda asmalar için kullanılabilen mikrosatelit markörler geliştirilmiştir (Sefc et al. 2001). 2.1 Mikrosatelitler (SSR, Simple Sequence Repeats) Bitki nüklear DNA sında tekrarlanan basit dizi motiflerinin (örneğin CACACA...) varlığı Delseny et al. (1983) tarafından kanıtlanmıştır. Mikrosatelit olarak da adlandırılan basit dizi tekrarlarının, sonradan bitki genomu ve organel genomu içeren çoğu organizmalarda bolca bulunduğu görülmüştür (Lagercrantz et al. 1993, Wang et al. 1994). Bu diziler, bitki genetiğinin araştırılması için uygun olan genetik varyasyonun büyük bir kaynağını oluşturmaktadır (Tautz et al. 1986). Tekrar edilen DNA nın 3 alt grubu arasında (satelit DNA, minisatelitler ve mikrosatelitler; Tautz, 1993), mikrosatelitler, tekrarın en alt derecesini yani en az tekrarı 6
gösterir. Tipik bir mikrosatelit dizi 1-6 nükleotitten (örneğin [(GA)n, (GATA)n] ibaret kısa basit dizilerin sayısı 5 ten yaklaşık 100 e kadar değişen tekrarını içerir. Ökaryotlarda, 10 4 ten 10 5 e kadar tahmin edilen mikrosatelit lokusları, genom boyunca rastgele bulunur. Ökaryot genomdaki mikrosatelit dizilerin bolluğu, genetik markör olarak değerlendirilebilecek polimorfik yerlerin neredeyse sınırsız bir kaynağını oluşturur. Mikrosatelitler bir kodlama bölgesi içinde veya yakınında olmadığı zaman selektif olarak nötr kabul edilirler (Sefc et al. 2001). PCR la çoğaltılmış mikrosatelit markörler, özel lokusa sahip ve yüksek miktarda polimorfik olmanın avantajına sahiptir. Allel büyüklüğünün belirlenmesi, yüksek çözünürlü elektroforez aracılığıyla elde edilir. Bu markörler kodominanttır ve bu sayede homozigot ve heterozigotların ayrımına izin verir. Mikrosatelit profili (analiz edilen lokusta belirlenen baz çifti), verilen allel büyüklüğüyle temsil edilir. Sonuçta, pratik açıdan mikrosatelit markörlerin, tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu çok kolaydır ve bu nedenle farklı laboratuvarlar arasındaki verilerin transferi ve karşılaştırılması olanağı mevcuttur (Sefc et al. 2001). Teknik, temel olarak genom boyunca tekrarlanan dizilerin iki yanına bağlanan primerlerce bu bölgelerin PCR da çoğaltılması ve agaroz jel, poliakrilamid jel (Şekil 2.1) veya otomatik dizi analizi sisteminde (kapilar elektroforez) büyüklüklerine göre sıralanması esasına dayanır. Sonuçların görüntülenmesi ise, radyoaktif işaretleme, gümüş boyama veya otomatik dizi analizi sistemi ile olur. Otomatik dizi analizi sisteminde allel büyüklükleri, fluoresan işaretli primer yardımıyla, pikler şeklinde görülür (Şekil 2.2). Her durumda da sonuçların değerlendirilmesi, SSR tekniğinin kullanılış amacına göre geliştirilmiş istatistik programları ile yapılır. 7
Alleller Alleller Genotipler Şekil 2.1 CA tekrar dizilerini gösteren 3 farklı mikrosatelit allelleri Yarım olarak gösterilen oklar çoğaltma için kullanılan lokusa özel primerleri göstermektedir. Ayrıca farklı allel kombinasyonlarını gösteren bir jel örneği görülmektedir. Şekil 2.2 Kapilar elektroforezde analiz edilmiş örneklerin, GeneScan 3.7 yazılım programında analiz edildikten sonraki piklerin görüntüleri Kırmızı pikler içsel standardın moleküler ağırlığını, yeşil ve siyah pikler ise PCR ürünlerinin üç farklı görüntüsünü göstermektedir (Costantini 2005, yayınlanmamış doktora tezi). 8
2.2 Vitis te Mikrosatelit Markörlerin Geliştirilmesi Asmalarda kimlik tespiti için, tekrarlanan DNA kullanımını ilk olarak Thomas et al. (1993) araştırmışlar ve asmada mikrosatelit dizilerin bol olduğunu ve Vitis vinifera çeşitlerinin kimlik tespiti için bilgi verici olduğunu göstermişlerdir. Ek olarak, primer dizileri diğer Vitis türleri ile Muscadinia da da korunmuştur (Thomas and Scott, 1993). Ayrıca bir başka çalışmadaki pedigri analizinde, mikrosatellit allellerin, genetik haritalama ve genetik akrabalığın araştırılmasında uygun olduklarını doğrulayan kodominant Mendel kalıtımına sahip oldukları gösterilmiştir (Thomas et al. 1994). Dünyanın her tarafında araştırıcı grupların, asmada mikrosatelit markörlerle ilgilenmeye başlaması daha fazla markörün gelişmesiyle sonuçlanmıştır. İlk izolasyon Thomas and Scott (1993) tarafından yapılmıştır. Daha sonra Bowers et al. (1996, 1999), Sefc et al. (1999), Scott et al. (2000) Di Gaspero et al. (2000, 2005), Arnold et al. (2002), Lefort et al. (2002), Merdinoğlu et al. (2005) gibi araştırıcılar tarafından izolasyon yapılmıştır. 1999 da Asma Genom Projesi-Vitis Genome Project adı altında uluslararası bir işbirliği kurulmuştur. Bu işbirliği çerçevesinde, markörlerin büyük miktarını izole etmek amacıyla kurulmuş olan Vitis Mikrosatelit Konsorsiyumu bulunmaktadır. Özel bir şirket olan Agrogene i (Fransa) içeren bu uluslararası ortaklık, dünya çapında 21 araştırma laboratuvarı, zenginleştirilmiş bir mikrosatelit genomik kütüphanesinden 333 yeni Vitis markörü geliştirmek amacıyla buluşmuştur. Bu konsorsiyum aynı zamanda, Vitis vinifera genomunun 700 adet eşsiz DNA dizisini üretmiştir. Bununla beraber, asma için yayımlanan tüm SSR primer dizileri Yunan Vitis veribankalarından elde edilebilmektedir (Lefort and Roubelakis-Angelakis, 2000a; 2000b; http://www.biology.uoc.gr/gvd) (Sefc et al. 2001). 9
2.3 SSR İçin Uygun Analiz Yöntemleri ve Karşılaştırmaları Mikrosatelit markörler analizinde, PCR sırasında 35 S datp nin eklenmesi ve denature poliakrilamid jelde ayrılması (Thomas and Scott 1993), çoğaltma reaksiyonunda 32 P sonlu primerlerin bulunması ve denature poliakrilamid jelde ayrılması, denature olmayan poliakrilamid jellerin etidium bromürle boyanması (Scott et al. 2000), ucu etiketli mikrosatelit oligonüklotid probların denature poliakrilamid jelle ayrımını takiben naylon membranlara transfer edilen parçalara hibridizasyonu (Kijas et al. 1995) ve denature poliakrilamid jellerin gümüşle boyanması (Bowers et al. 1996, 1999, Bowers and Meredith, 1997) gibi değişik metodlar kullanılmıştır (Sefc et al. 2001). Fluoresan işaretlemeli sistemlerin avantajları çoktur. İçsel büyüklük standardı kullanılarak otomatik allel büyüklüğünün belirlenmesi sayesinde tek bir analizle birçok lokus aynı anda belirlenebilir. Jeller ve jel bazlı allel belirlemeleriyle karşılaştırıldığında, otomatik sekans veya kapilar elektroforez ile allel büyüklüğünü belirleme ve yüksek derecede tekrar edilebilirlik göstermiştir (Sefc et al. 2001). 2.4 Verilerin Yorumlanması Mikrosatelit bantların yorumlanması kolaydır ve veriler, baz çifti olarak allel büyüklükleri formunda verilir. Asmalar, vejetatif olarak çoğaltılırlar; bu nedenle, somatik mutasyon dışında, bir çeşidin her bir omcası birbiriyle genetik olarak aynıdır. Prensip olarak, bir mikrosatelit veri, çeşidin mikrosatelit profilini temsil eden tek bir bireyinden elde edilir. Mikrosatelit analiz sonuçları, dikkatli bir şekilde standardizasyon sağlandığı zaman farklı laboratuvar ve farklı zamanlarda tekrar edilebilir ve karşılaştırılabilirler. Örneğin aynı asma çeşidinin DNA sı kullanılarak farklı laboratuvarlarda ve farklı yıllarda (Sefc et al. 1998a, Grando and Frisinghelli 1998, 10
Lefort et al. 2000) aynı mikrosatelit profiller elde edilmiştir. SSR analizi, otomatik sekans ve verilerin toplanması için bir yazılım programı kullanılarak yapılmaktadır (Sefc et al. 2001). Allel frekansını dikkate alan ölçümlerle lokus farklılığının tanımlanmasının daha iyi olduğunu söylenmektedir (Sefc et al. 1999, Tessier et al. 1999). Bir yazılım programı kullanılarak elde edilen iki ölçüm vardır. Bunlar, allel frekansından çıkan tespit olasılığı (PI, Probability of Identity) (Paetkau et al. 1995, asma genotipine Sefc et al. 1999, 2000 tarafından uygulandı) ile verilen bir markörde bant desenine veya genotip frekansına dayalı ayırma gücüdür (D, Discrimination Power) (Tessier et al. 1999). Bu iki ölçüm, gerçekte akraba olmayan iki çeşidi, bir markörle ayırabilme olasılığını tanımlar. Aşırı polimorfik (hyperpolymorphic) Vitis mikrosatelit lokuslarında PI değeri, akraba olmayan çeşitler arasında genotip paylaşımında % 5 olasılığa karşılık gelen 0,05 kadar düşük olabilir. Bağlı olmayan yüksek derecede polimorfik 5 mikrosatelit verilerinin birleşmesiyle, teorik olarak, farklı çeşitlerden mikrosatelit profili elde edememe olasılığı 10-5 ten düşüktür (Sefc et al. 1999). D değeri, çeşitleri karıştırma olasılığını azaltır (1- D) (Ayırma gücü ne kadar yüksekse, çeşitleri karıştırma olasılığı o kadar azdır). Bir yüksek bir de orta dereceli polimorfik mikrosatelit lokusta D değeri sırasıyla 0,895 ve 0,697 olarak hesaplanmıştır (Tessier et al. 1999) (Sefc et al. 2001). Asma gen havuzları arasında, allel frekansları değiştiğinden, verilen bir markörün bilgi içeriği farklı bölgelerden olan çeşit koleksiyonları arasında farklı olabilir. Bununla beraber, genellikle bir çeşit koleksiyonunda tanımlandığı gibi, en fazla bilgi veren markörleri içeren bir markör seti, aynı zamanda diğer gen havuzunda yüksek derecede ayırma gücünü ortaya çıkartır (Sefc et al. 1999). Asma çeşitleri için potansiyel bir tanımlayıcı olarak böyle bir markör seti önerilmiştir. This and Dettweiler (2003) tarafından GenRes 081 Avrupa projesi çerçevesinde yapılan çalışmada, VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 ve VrZAG79 markörleri standart set olarak kabul edilmiştir. 11
Mikrosatelit analizin yüksek tanımlama gücünden dolayı, iki farklı bitkide aynı genotipleri bulma, bu bitkilerin gerçekte aynı çeşide ait olduğunun güçlü bir kanıtıdır. Bundan dolayı, mikrosatelit analizi, çeşit kimliğini belirleme ve bir veri bankasında bulunan çeşitlerden alınan örneklerle genotip frekanslarını karşılaştırarak bilinmeyen orijinden gelen bir bitki materyalinin kimliğini saptamak için de kullanılabilir (Sefc et al. 2001). 2.5 SSR Profillerinin Genetik Veribankası 1994 te, 6 mikrosatelit lokusta asma genetik kimlik profillerin belirtildiği 200 den fazla çeşidi içeren bir veribankası bildirilmiştir (Thomas et al. 1994). Başlangıçta kısa bir süre genel kullanım amaçlı olan bu veri bankası, Avustralya Şarap Araştırma Enstitüsü nde (AWRI-Australian Wine Research Institute) DNA kimlik tespiti servisiyle ticari bir kimlik kazanmış ve kullanımı sınırlanmıştır (Scott et al. 1996). 1996 dan beri işlemekte olan, AWRI servisinin içerdiği bilgiler çok geniştir. İkinci veribankası servisi, Yunan Vitis Veribankası (Lefort and Roubelakis-Angelakis 2000a, 2000b) ismi adı altında ortaya çıkmıştır. Bu veribankası, çoğu Yunan orijinli 300 den fazla çeşidin çekirdek ve kloroplast mikrosatelit genetik profilleri ile 240 çeşidin görüntülerini bulunduran bir veribankasıdır. Avrupa asmalarında yapılmış bir çalışmaya göre (Sefc et al. 2000), veribankasında belirtilen allel büyüklükleri diğer laboratuvarla uyuşmaktadır. Bu durum, dünyanın farklı bölgeleri arasındaki sonuçların kullanılabilirliği ve karşılaştırılabilirliğini mümkün kılmaktadır. Diğer veribankası servisleri, yine aynı modelle Arnavutluk, Makedonya, Bulgaristan ve Balkanlar ile Kafkasya dan diğer bazı ülkelerin asma genbankası hakkında benzer bilgilere ulaşma çabasındadır. Thomas et al. (1994) in de belirttiği gibi uluslararası işbirliği ile yakın bir gelecekte, ampelografik koleksiyonun, mikrosatelit tabanlı sertifikasyon sistemi ile desteklenmesi, dünya çapında tüm koleksiyonlardan çeşitlerin SSR profillerinin bir uluslararası veribankasında toplanması gereklidir (Sefc et al. 2001). 12
2.6 Çeşitlerin Ticari Sertifikasyonu DNA profilinin belirlenmesi, yeni asma çeşitlerinin kayıt altına alınması ve korunması için giderek artan bir öneme sahiptir. Yeni çeşitler, bir patent veya Bitki Islahçıları Hakları (PBR-Plant Breeders Rights) tarafından korunabilir. PBR bitki çeşidine özel olmakla birlikte, patentler kapsamlı olabilir ve sadece özel çeşidi korumakla kalmaz aynı zamanda genel olarak bitkiyi kapsar. Yeni Bitki Çeşitlerinin Korunmasına İlişkin Uluslararası Birlik (UPOV-The International Union for the Protection of New Varieties of Plants), PBR arzı için bitkiye ait özel fenotipik tanımlamayı önermektedir. Fakat şu an bu konu yeniden incelenmektedir. Çünkü bir UPOV çalışma grubu, DNA profilini kullanarak çeşit tespiti ve PBR koruması üzerine araştırma yapmaktadır. Halihazırda, 4 yeni Avustralya şaraplık üzüm çeşidi (Cienna, Vermilion, Rubienne ve Tyrian) yeni olarak PBR ve mikrosatelit profilini içeren PBR arzın bir kısmı altında korunmaya alınmıştır. Ticari asma DNA kimlik tespiti servisinin bazı müşterileri özellikle mülkiyet hakkını korumak için bu servisi kullanmışlardır (Sefc et al. 2001). Bununla birlikte DNA profilini belirleme, temelde fidanlıklarda ve şarap yapılan yerlerde bir kalite kontrol aracı olmada önemli güce sahiptir. Şaraplar üzerine uygulanan zorlayıcı etmenler ve pazar baskısı şarap üreticilerini üzümlerin hasattan şişelenmeye kadarki dönemlerde DNA profillerini çıkarmak suretiyle etiket bilgilerinin doğruluğunu belirlemeye yöneltmiştir. DNA profili, şaraba işlenmeden önce, sıkılan üzüm suyundan DNA izolasyonuyla elde edilebilir. Deneme koşullarında, % 10 a varan çeşit karışımı tespit edilmiştir (Thomas, basılmamış). Bununla birlikte, bağlardaki asmaların heterojenitesi azaldığında, toplam üzüm şırasında değerlendirilen izoenzim polimorfizmi (Moreno-Arribas et al. 1999), hâlâ bazı yerlerde mikrosatelite karşı rakip olabilir. Ticari asma DNA kimlik tespiti servisinin bazı müşterileri, bir bağdaki çeşidi belirlemek ve şaraphaneye gidecek üzümlerin kimliklerinin tespiti için özellikle bu yöntemi kullanmışlardır. Avrupa Birliği, her üye ülkede, şarap, kurutmalık ve sofralık olarak kullanılabilecek belli çeşitlerde son 20 yılda yeni düzenlemeler getirmiştir. Kurutmalık ve sofralık üzümlerde ürünlerin doğru etiketlenmesini sağlamak, tüketici 13
bilgisi açısından önemli bir durum arz eder. Bu durum şaraplıklarda, özellikle şarap isimlerinde ticaret olayının da araya girmesiyle çok önemli olmaktadır ki; bu, aşılanan çeşitlerin moleküler sertifikasyonu bu düzenlemeleri uygulamak için çok önemli bir araç olacak ve böylece bağcıları kötü sonuçlanan durumlardan korumada en iyi yol olacaktır. Bunun gibi teknolojik kontroller, fidanlık ve bağdan, şaraphaneye ve paketlemeye oradan da sofralık ve kurutmalık üzümlerin dağıtılmasına kadar asma endüstrisinin her sektöründe uygulanabilir (Sefc et al. 2001). 2.7 SSR Tekniğinin Bağcılıkta Kullanım Alanları SSR markörler asma ıslahında; Vitis cinsinde evrimsel gelişimin moleküler analizi, Vitis vinifera L. çeşitlerinin ve Amerikan asma anaçlarına ait gen kaynaklarının belirlenmesi, çeşitler, ekotipler, klonlar, melezleme sonucu elde edilen çeşitlerin tanımlanması ile sinonim ve homonimlerin tespit edilmesi, orijin belirleme, melezleme ıslahında hibrit bitki tanısı, pedigri analizi ve genetik haritalama ile markör yardımı ile seleksiyon gibi değişik amaçlara yönelik olarak kullanılmaktadır. Sonuç olarak, asma çeşitlerinden mikrosatelit profillerin oluşturulmasında toplanan bilgiler, farklı perspektiflere göre değerlendirilebilir. Bunlar; a) Gen bankası yönetimi Çeşitlerin kimlik tespiti, Sinonimlerin tespiti, Pedigri oluşturulması. b) Mikrosatelit markörlerin değerlendirilmesi Polimorfizm seviyesi, Allel frekansı, Sessiz (null) allellerin frekansı. 14
c) Asmalarda gen havuzunun tanımlanması Genetik farklılık, Allelik ve genotipik bileşim, Gen havuzları arasındaki farklılık d) Kümeleme analizi Benzerliğin kurulması veya uzaklık ölçümleri Fenogram oluşturulmasıdır. 2.8 SSR Tekniğinin Asma (Vitis spp.) Gen Kaynaklarının Tanımlanmasında Kullanımı Vitis spp. türlerine ait gen kaynaklarının tanımlanması, asma gen bankasının oluşturulması, korunması, ıslah programı ve sertifika amaçlı üretimlerde çok önemlidir. Bu gen kaynaklarının tanımlanması, çeşitler, ekotipler, klonlar, melezleme sonucu elde edilen çeşitlerin tanımlanması ile sinonim ve homonimlerin tespit edilmesini kapsamaktadır. Asma genotip sayısının doğru ve kesin olarak belirlenmesi, etkin bir biçimde kullanımları açısından son derece önemlidir. Oluşturulan gen bankasının tam olarak amacına uygunluğunu sağlamak için, maksimum genetik farklılıklarla birlikte minimum sayıda aksesyonun olması önemlidir. Bu ikisi, bitki ıslahçılarına etkili bir araştırma ve tarama avantajı sağlar ve gen bankası muhafazası için sınırlı olanakların en iyi şekilde kullanımını sunar. Yüzyıllardır klonal olarak çoğaltılmış ve orijinleri hakkında çok az şey bilinen birçok asma çeşidi koleksiyonlarında bu amaca ulaşmak için çalışılmıştır. Çünkü tercih edilen asmalar, tarih içinde insanların göç etmesiyle taşınmış, genetik farklılık oluşmuş ve birçok çeşidin orijini bilinmez hale gelmiştir. Ayrıca, bilinen ve bilinmeyen sinonimler farklı dillerin konuşulduğu yerlere taşınmıştır. Bazen çeşit isimleri farklı şekillerde telafuz edilmiş, bazen de götürüldükleri yerlerde tamamen ismi değiştirilmiştir (Dangl et al. 2001). Böylelikle sinonim ve homonimlerin ortaya çıkmasıyla asma gen kaynaklarının 15
tespiti zorlaşmıştır. Bazı çeşitler şu an itibariyle 100 ün üzerinde sinonim ve çok sayıda homonime sahiptir (http://www.genres.de/idb/vitis). Gen kaynaklarının rasyonel kullanımı açısından aksesyonların doğru tanımlanması temel bir gereklilik olması nedeniyle sinonim, homonim ve yanlış isimlendirme dünyada bulunan 130 asma koleksiyonu için önemli bir sorun teşkil etmektedir (Dettweiller et al. 2000). Bugün varolan asma çeşitlerinin çoğunun, yüzlerce yaşta olduğu ve bazı aşamalardan sonra oluştukları düşünülmektedir. Bu aşamalardan biri; erken zamanlarda Ortadoğu nun güneyinde yabani asmanın kültüre alınması şeklinde olurken; diğeri, Avrupa nın üzüm yetiştirilen bölgelerinde yabani x kültür çeşidi veya çeşit x çeşit melezlemelerinin yapılmasıdır. Hem bir tarım bitkisi hem de kültürel miras olarak asma çeşitlerinin önemli olmasından dolayı, bugün çeşit zenginliğine izin veren genetik olayları anlamak oldukça önemlidir. Bununla birlikte belli bir bölge için tipik olan çeşitlerin ne kadar olduğunu, bu bölgeye özgün olduğunu veya başka yerlerde sinonimi olmadığını söylemek zordur. Buna çözüm olarak, bölgesel çeşit örneklerinden standart genetik profillerin kurulması ve karşılaştırılması yoluna gidilmesi gerekmektedir. Günümüzde, asma çeşitlerinin tipik bölgesel koleksiyonları, Avrupa nın asma yetişen bölgelerinde kurulmuştur ve bunlar asma ıslahçıları için önemli bir genetik varyasyon kaynağı sunarlar. Bu bölgesel koleksiyonların korunması asmalarda, genetik erozyonun önlenmesi açısından çok önemlidir. Ayrıca, üzüm çeşitlerinin doğru tanımlanması, çoğaltma materyali sertifikasyonunda, genç bitkilerin ismine doğruluğun değerlendirilmesinde, uluslararası gen kaynakları değişiminde yanlış isimlendirmenin önlenmesinde, fidan satın almada ve bitki isimlerinin korunmasında kritik öneme sahiptir (Montaner et al. 2004). 16
2.9 Asma Mikrosatelit Çalışmaları Asma mikrosatelit çalışmalarının ilki Thomas and Scott (1993) tarafından CSIRO Bitki Endüstrisi nde (Avustralya), 26 Vitis vinifera L. çeşidi ve 6 Vitis türü ile Vitis rotindifolia da bildirilmiştir. Sonradan anaçlar, şaraplık, sofralık ve kurutmalık üzüm için kullanılan üzümleri de içeren 80 den fazla genotip eklenmiştir (Thomas et al. 1994). Şu anda 200 genotipe yakın DNA mikrosatelit profillerinin verileri CSIRO da bulunmaktadır. Bu öncü çalışmalar, asma çeşitlerinin kesin bir kimlik tespitinde önemli sorulara yol göstererek, bu yöntemde bir avantaj sağlamıştır. Anaçlarla ilgili bir çalışma da, geçmişte, aynı anaca yanlışlıkla iki farklı isim verildiği belirtilerek, 5A Teleki ve Kober 5 BB nin aynı DNA profiline sahip olduğu gösterilmiştir (Thomas et al. 1994). Somatik mutasyon sonucunda, tek bitki orijinli eski üzüm çeşitlerinde bazı genetik varyasyonlar gözlenir. Nadir görülen bu olayda, DNA farklılığı, klonlar arasında açık bir şekilde görülebilir (Vignani et al. 1996). Vitis vinifera ya ait eski bir İtalyan şaraplık çeşit olan Sangiovese nin 12 klonunda, 7 mikrosatelit lokusunda (VVMD5, VVMD6, VVMD7, VVMD8, VVMS2, VVMS4 ve VVMS29) allelik polimorfizm analiz edilmiştir. 7 lokusta da 11 klon aynı bulunmuş fakat SG 8T klonu 4 lokusun herbirinde bir allel tarafından diğerlerinden ayrılmıştır. Bu bilgiler, 11 aynı klonun muhtemelen tek bir fidandan geldiğini ve SG 8T nin ise bir fidan, kardeş bitki, ebeveyn veya bu bitkilerin bulunduğu topluluktan alınmış bir bitki olabileceğini göstermektedir. Çeşit in dar anlamda açıklaması (monoklonal orijin) SG 8T nin Sangiovese den farklı olduğunu göstermektedir. Yakın bireylerden poliklonal orijin ihtimalini kapsayan daha geniş bir çeşit tanımlaması, şaraplık üzüm araştırma topluluğunun kabul ettiği bir görüştür. Eğer, çalışmada ileri sürüldüğü gibi ek lokustaki analiz, SG 8T ve diğer klonlar arasında yakın genetik ilişkiyi doğrularsa, bu tanımlamaya göre SG 8T, 17
Sangiovese çeşidi içinde yer alabilir. Allelik farklılıkları belirten mikrosatelit analizi, şaraplık üzümlerde çeşit ve klon un ekonomik izahının belirlenmesini sağlar (Vignani et al. 1996). USDA-ARS (Bitki Genetik Kaynakları Ünitesi, Cornell, Genova, New York) soğuğa dayanıklı asma genetik kaynak koleksiyonu, yaklaşık 1300 farklı aksesyon içermektedir. Bu aksesyonların doğru tanımlanması etkin kullanımları için gereklidir; fakat var olan tanımlama metodları (örneğin ampelografi) memnun edici değildir. Lamboy (1997), Vitis vinifera L. çeşitlerinin parmak izi analizi için diğer laboratuvarlarda kullanılan SSR primerlerini, koleksiyondaki (çoğu V. vinifera dışı) çeşitlerin tanımlanmasına yönelik ihtiyacı karşılayıp karşılamayacağını belirlemek için test etmiştir. Test edilen 23 aksesyonda 6 lokusta DNA parçaları başarılı bir şekilde çoğaltılmış ve koleksiyonda, tür farklılığı oranı ölçülmüştür. Farklı DNA parçalarının sayısı 9-26 oranında değişmiştir. Gen farklılığı değerleri 0.785 ten 0.944 e değişirken, heterozigotluk değerleri 0.565 ve 0.783 arasında ölçülmüştür. Bir lokusta ayırma gücü 0.881-0.953 arasında değişmektedir. Genetik farklılığa sahip farklı aksesyonları ayırt edememe oranı 1/5.000.000 olup, tüm lokusların ayırma gücü 1 dir. Sonuçta, 6 lokustan elde edilen SSR markörleri tüm Genova soğuğa dayanıklı asma gen kaynağı koleksiyonunun DNA parmak izine olanak vermiştir. Avusturya gen kaynağı koleksiyonundan alınan toplam 66 üzüm çeşidi ve anaçta 10 mikrosatelit lokusu kullanılarak bir fenogram hazırlanmış ve gen farklılığı değerleri hesaplanmıştır. Asmalarda genetik farklılık değerleri 0.53-0.87 arasında; anaçlarda 0.29 ila 0.96 arasında iken Sefc et al. (1998a) her ikisi için bu değeri 0.7-0.91 arasında tespit etmiştir. Yine Sefc et al. (1998b), hasattan sonra üzüm ve üzüm ürünlerinde doğru çeşit kullanılıp kullanılmadığını belirlemek için 11 mikrosatelit markör kullanmıştır. Bu amaçla ticari öneme sahip 18 sofralık üzüm çeşidi Avusturya marketlerinden toplanmış 18
ve 11 inin referansa uygun olduğu belirlenmiştir. Sofralık, şaraplık ve kurutmalık üzümlerin piyasaya çıkmadan veya işlenmeden önce ismine doğruluğu tespit etmede genetik markörlerin pratikte uygulanabilir olduğunu ve bunun da ticareti yapılan üzümleri için Avrupa Birliği kurallarına uygun bir şekilde kontrolüne izin verdiğini belirtmiştir. Aynı zamanda, yaş ve kuru üzüm DNA sından tek bir genetik lokus çoğaltma imkânı, üzüm ürünlerinde mevcut transgenik dizi durumunu belirlemede gelecekte bir potansiyel oluşturacağını ifade etmiştir. Virüs kontaminasyonunu azaltmak amacıyla yapılan bir projede sertifikalı bitki materyali üretimi için termoterapi ile muamele edilmiş materyalin çoğaltılmasında, çoğaltma aşamasından önce in vitro daki bitkiciklerin çeşit tespitinde mikrosatelit analizi uygulanmıştır. Her klondan iki örnek, 4 mikrosatelit lokusta analiz edilmiş ve bir referans veri bankasıyla karşılaştırılmıştır. Çeşitlerde yanlış isimlendirmeler tespit edildiğinden bu kalite kontrol aşamasının gerekli olduğu kanıtlanmıştır (Sefc et al. 1998c). Maletic et al. (1999) tarafından 22 Hırvat üzüm çeşidinde yapılan genetik karakterizasyon ve komşu bölgelerdeki sinonim çeşitlerin belirlenmesi çalışmasında 9 SSR lokusu incelenmiştir. İkisi de Croatian girl anlamına geldiğinden, Hrvatica olarak isimlendirilen Hırvat çeşidi ile aynı olduğu zannedilen Italyan çeşit Croatina çoğu lokusta farklılık göstermiş ve bu yüzden iki farklı çeşidi oldukları tespit edilmiştir. Ayrıca tüm çeşitlerin, 300 adet Avrupa üzüm çeşidi ile yapılan SSR karşılaştırılması sonucunda, ayrıca üç çiftin sinonim çeşit olduğu bulunmuştur. Sánchez-Escribano et al. (1999) tarafından 43 sofralık üzüm (Vitis vinifera L.) koleksiyonunda SSR markörlerle yapılan denemede, 8 lokus (VVS1, VVS2, VVS3, VVS4, VVS5, VVMD5, VVMD6 ve VVMD7) incelenmiştir. 2 den (VVS3) 8 e kadar (VVS2 ve VVMD7) değişen sayıda allel tespit edilmiş ve tahmin edilen heterozigotluk oranı %38 (VVS1) ilâ %80 (VVMD5) arasında belirlenmiştir. Sonuçta 14 çeşit, allel 19
büyüklükleri bakımından aynı bulunmuş ve ayrıca SSR metodunun farklı laboratuvarlarda tekrar edilebilir olduğu ve kullanılan 8 lokusun allelik kombinasyonlarıyla 43 asma çeşidi kimlik tespitinin net olarak yapıldığı belirtilmiştir. Şaraplık ve sofralık üzüm çeşitlerinde 9 yeni SSR lokusu (VMC6G8, VMC6D12, VMC6B11, VMC6F11, VMC6G10, VMC6A8, VMC6C7, VMC6C10 ve VMC6E10) Arroyo-Garcia ve Martinez-Zapater (2000) tarafından dizayn edilmiştir. Çoğaltılmış ürünlerin büyüklüğü 220-301 bp arasında değişmiştir. Allel sayısının her lokusta 8 den 10 a kadar değiştiği gözlenmiş ve diploid genotiplerin sayısı her lokusta 5 ten 16 ya kadar değişmiştir. Çeşitlerin en az % 70 i her lokusta heterozigottur. Şaraplık ve sofralık üzümlerde allel frekansları genellikle aynıdır. Her çeşit 9 lokus tarafından ayırt edilmiştir. Aynı araştırıcılar, çekirdek genomundan daha düşük mutasyon oranı gösteren kloroplast genomunda da polimorfik mikrosatelit bölgelerinin bu organizmaların biyolojisi hakkındaki bilgiyi arttırabileceğini söylemişlerdir. Özellikle, kloroplast mikrosatelitlerin (cpssr) sitoplazmik farklılık, plastid kalıtımı çalışmaları ve gen akışını görüntülemek için kullanışlı olabildiği ve kloroplast genomunda korunmuş dizilerin yüksek derecede olmasından dolayı, türlerde yüksek bir oranda çalışabilecek primerlerin dizaynının mümkün olabilmesine olanak sağladıkları belirtilmiştir. Faria et al. (2000), çeşit şıralarının ismine doğruluğunu kanıtlamak için DNA tabanlı mikrosatelit yöntemi kullanmışlardır. En önemli 5 porto şarabı çeşidi (Tinta Roriz, Tinto Cão, Touriga Francesa, Touriga Nacional ve Tinta Barroca) 4 mikrosatelit lokusta çalışılmış ve ayrıca bu 5 çeşit şırası ve bunların kombinasyonu olan 26 şıra karışımı da 4 mikrosatelit lokusta (VVMD5, VVMD6, VVMD7, VVS2) incelenmiştir. Yaprak ve çeşit şırası profilleri arasında bir fark bulunamamıştır. Tüm şıra kombinasyonları, çeşitsel bant profil içeriklerinin toplamını sunan bant profillerini göstermiştir. Bu çalışmada mikrosatelit tekniği, tek ve çok çeşitli şıranın ismine doğruluğunun kanıtlanmasında başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Bu metot, sadece belli bir çeşidin varlığı veya yokluğunu belirlemekle kalmamış, aynı zamanda şıranın içinde mevcut 20
olan çeşitlerin tespitini de yapmıştır. Bunun da tek çeşitli şarap üretimleri için özel bir öneme sahip olduğu belirtilmiştir. Grando et al. (2000) 7 mikrosatelit markörle Trentino Bölgesi ne (Kuzey İtalya) yayılmış olan eski asma gen bankasının yerel çeşit farklılığını değerlendirmiştir. Bu çalışmada 36 eski çeşit ile Lagrein, Lambrusco Foglia Frastagliata, Marzemino, Nosiola, Teroldego, Schiava grossa gibi hâlâ yaygın bir şekilde Trentino da yetiştirilen 12 yöresel asma çeşidi kullanılmıştır. Sonuçta 11 sinonim durumu belirlenmiştir. 4 sinonim kültüre alınmamış çeşitler arasında, 5 i lokal çeşitlerle kültüre alınmamışlar arasında ve kültüre alınmış olanlarla uluslararası asma çeşitleri arasında bulunmuştur. Son iki sinonim durumu, Vernaccia Nera ve Merlot ile Francesa Nera ve Carmenère arasında tespit edilmiştir. Diğer aynı asma genotipleri, şarap üretilen yakın coğrafik alanlarda birçok farklı adlandırmayla kabul edilmişlerdi. Bununla birlikte, Biancaccia ve Biancazza, Vernaccia ve Vernazzola da olduğu gibi yakın isimlendirmelerle veya örneğin Schiava Grigia (Schiava gray) ve Cenerina (Cinereo, Ashen) gibi benzer referansa sahiptirler. Bu araştırmada, tüm alleller Vitis vinifera nın diğer çeşitlerinde tanımlanmış, sadece Nera dei Baisi çeşidinde Vitis vinifera dışındaki Vitis cinsi türleri için karakteristik olan bazı alleller belirlenmiştir. San Michele all Adige Enstitüsü nde uzun yıllar süresince (1891-1971) yapılmış olan ıslah çalışmalarında elde edilen Incroci Rigotti (IR) melezlerinin, genotip belirlenmesi için yapılan çalışmada fluoresan tabanlı kapilar elektroforez teknolojisi ve parçaçık büyüklüğü yazılım programı kullanılmıştır. 11 farklı melez ve varsayılan 13 ebeveyn çeşitler üzerinde mikrosatelit genotip belirlenmiş ve veriler elde edilen antosiyanin sonuçları ile uyuşmuştur. Sonuçta IR 107-2 ve IR 107-3 (Rebo) melezleri aynı bulunmuştur. Tüm ebeveyn ve IR çeşitleri eşsiz genotipler olmasına rağmen aynı çeşide ait aksesyonlar arasında herhangi bir polimorfizm gözlenmemiştir. Ayrıca, IR nin tüm genotiplerinin ebeveynleri ıslahçılar tarafından belirtilen ebeveynlerle tutarlık göstermemiştir (Malossini et al. 2000). 21
Merdinoglu et al. (2000) tarafından yapılan çalışmada, üç farklı moleküler markör tekniği (RAPD, AFLP, SSR) Vitis vinifera nın 12 çeşidine ait 21 klonun testinde kullanılmıştır. Her çeşit kendine özgü bantlar ile çeşitlerin ayrımı sağlanmış ve bir dendogram oluşturulmuştur. Bu dendogramda 7 grup belirlenmiştir. Orta Avrupa daki yabani (Vitis vinifera subsp. silvestris) arasındaki genetik farklılığı belirlemek ve yine bunlar arasındaki ilişkiyi değerlendirmek amacıyla toplam 44 genotipte yapılan çalışmada (Perret et al. 2000) 10 mikrosatelit lokus analizinde 49 markör (allel) tespit edilmiş ve bu markörlerden 17 si sadece kültür, 7 si ise sadece yabani genotiplerde gözlenmiştir. Ayrıca yapılan kümeleme (cluster) analizinde yabani ve kültür genotipler açık bir şekilde ayırt edilmiştir. Yabani asmalarda özel allelerin bulunması Vitis vinifera subsp. silvestris in orijinalitesini destekler nitelikte olmuştur. Yabani ve kültür asmaları arasındaki genetik farklılıktan dolayı, denemedeki çeşitlerin, Riesling, Sylvaner ve Grüner Veltliner gibi lokal çeşitler dahil, doğal yabani asma orijinli olmadığı sonucuna varılmıştır. Bu çeşitler kültüre alındıkları sırada, tek yerli yabani asma populasyonundan çok daha geniş bir genetik temelden gelebileceği araştırıcılar tarafından ifade edilmiştir. Klonal farklılığın temelinin, genetik mutasyon olduğu uzun süreden beri bilinmektedir. Aşı ile geçen hastalıklar ile endofitlerin fark edilmesinden sonra, fitopatolojik ve ekolojik durumların, aynı çeşide ait bireylerin farklı davranışlarından sorumlu olduğu göz önüne alınmaktadır. Termoterapi (Mannini et al. 1997) yoluyla virüs temizlenmesi ve doku kültüründe çoğaltımdan sonra, eldeki klonal materyal arasında farklılıklar, yine genetiğin önemli etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bugün, yetiştiriciler, geleneksel çeşitlerin klonal materyalini yetiştirmeyi, yoğun çoğaltıma tercih ederler. Bağcılıkta bu tür farklılıklardan dolayı, aynı zamanda duyulara ait gözlemlerle de, araştırıcılar her bir klona bağlı ve çoğaltmada durağan olan markörler bulmayı denemişlerdir. Ampelografik tanımlama veya kimyasal analiz, klonlar arası farklılıkları teşhis edemediğinden dolayı, ıslahçıların yasal istemleri, klonları korumak için bu yolların uygulanmaması yönündedir. Bundan yola çıkarak Regner et al. (2000a) nin yaptığı 22
çalışmada, Beyaz Riesling çeşidinin 10 farklı klon genotipinde genetik polimorfizmini incelemek için RAPD, SSR ve ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) markörler kullanılmıştır. RAPD bantlarında, ayrımsal yaklaşım için stabilite az görülürken, SSR ve ISSR allellerinin bunu telafi edebileceği söylenmiştir. SSR ve ISSR markörler, farklı laboratuvarlardan sonuçlar karşılaştırıldığında yüksek stabilite gösterdiklerinden, klonal materyalin tanımlanmasında uygun metotlar olarak görülmüştür. Regner et al. (2000b) yaptıkları bir çalışmada, 300 den fazla farklı asma çeşidinin ve Vitis silvestris in 20 farklı genotipinin SSR analizi sonucunda, V. silvestris ve V. vinifera arasında çok açık bir farklılık olmadığı sonucunu çıkartmışlardır. Aynı zamanda, V. silvestris te bulunan allelerin çoğu V. vinifera da da bulunmuştur. Günümüzde kullanılan bazı çeşitler, V. silvestris için tipik olan allel büyüklüğünü gösterir. Eski zamanlarda büyük populasyona sahip olmalarından dolayı V. silvestris genotiplerine özgü bazı alleller, yüksek heterozigotik SSR profilleri gösterir. Sonuçta, V. silvestris tiplerinin (Oberlin, Gmelin, Dirmstein, Hoerdt vd.) genetik profilleri çok geniş olmuştur. Bu nedenle, V. silvestris in heterozigot bir populasyon olduğu doğrulanmıştır. USDA (The United States Department of Agriculture) Ulusal Gen Bankası nda 40 aksesyondan 41 asmada yapılan çalışmada yüksek allelik farklılık gösteren mikrosatelit markörleri kullanılmıştır. Çekirdeksiz sofralık üzümlerde ve sofralık üzümlerle aynı isme sahip olan çeşitlerde yapılan analizde, paylaşılan allel oranı, genetik uzaklığın en uygun istatistik ölçümü olarak seçilmiştir. Morfolojik karakterlerle birlikte yapılan bu çalışmada, bilinen sinonimler doğrulanmış, bilinmeyenler ise ortaya çıkarılmıştır. Literatürde ortaya sürülen bir sinonim DNA verileri ile çürütülmüştür ve yine bu verilerle ebeveynleri bilinen bazı çeşitlerin ebeveynleri doğrulanmıştır. USDA koleksiyonunda yanlış isimlendirilen çeşitlerin kimlik tespiti yapılmıştır. Oluşturulan UPGMA da (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Means) çeşitler; çoğunlukla Ortadoğu çeşitleri olan 9 çeşit; Thomson Seedless ile morfolojik benzerlik 23
gösteren Rusya ve Afganistan dan 22 aksesyon ve çoğunlukla Doğu Avrupa şaraplık çeşitleri de içeren 11 aksesyonlu grup olarak 3 e ayrılmıştır (Dangl et al. 2001). Çeşitler arasındaki genomik benzerliği belirlemek amacıyla yapılan bir çalışmada, Alplerin kuzey ve güney yamaçlarından alınan Schiave grubuna ait 10 üzüm çeşidi üzerinde AFLP ve SSR kombine olarak kullanılmıştır (Fossati et al. 2001). Sonuç olarak, çeşitler arasındaki genetik ilişkiyi belirlemek amacıyla yapılan bu çalışmada, AFLP ve SSR ın eşit şekilde etkili olduğu belirlenmiştir. Yine Schiave grubunda homonim ve sinonimlerin belirlenmesi amacıyla 33 çeşitte AFLP analizi yapılmış ve genomik farklılığın derecesi belirlenmiştir. Analiz edilen çeşitler spesifik coğrafik dağılımla en azından 5 taksonomik grup ve 1 grup dışı olarak ayrılmıştır. Şili de Merlot çeşidi olarak kurulmuş 5 bağdan ve bir çeşit koleksiyonundan alınan 4 çeşit ile Californiya dan 2 çeşit olmak üzere toplam 93 asma çeşidinde, kimlik tespitlerini doğrulamak amacıyla SSR DNA markörleri kullanılmıştır (Hinrichsen et al. 2001). Şili bağlarındaki asmaların Merlot veya Carmenère çeşitlerinden biriyle eşleştiği, aslında Merlot olarak dikilmesine rağmen çeşit koleksiyondaki 4 çeşidin Carmenère olduğu, Californiya daki 2 çeşidin ise Cabernet franc olarak dikilmesine rağmen aslında Carmenère çeşidi olduğu belirtilmiştir. Ayrıca kullanılan SSR markörlerden VVMD28 ve VVMD31 markörlerin Carmenère yi Merlot çeşidinden ayırt etmek için özellikle kullanışlı olduğu ve VVMD31 ile VVMD27 markörlerin de Cabernet franc çeşidini diğer iki çeşitten ayırt etmede uygun olduğu belirtilmiştir. Asmalarda yaygın olarak bulunan ve tipik misket tadından dolayı isimlendirilen Muscat ların, çok fazla sinonim ve homonimleri olduğu için tespitleri zordur. Bu amaçla Crespan and Milani (2001) tarafından yapılan çalışmada 64 aksesyon, morfolojik görünüş, tane rengi ve büyüklüğü, olgunlaşma zamanı ve sofralık ve/veya şaraplık üretim için eğilimi göz önüne alınarak Vitaceae familyasının farklılığını sunmuştur. Analizde ayrıca 2 izoenzim ve 25 mikrosatelit lokus incelenmiş, aksesyon içinden 44 ü sinonim bulunmuştur. Moscato bianco grubunda kırmızı ve pembe taneli 24
üç mutant ayırt edilmiştir. Ayrıca, Moscato bianco ve İskenderiye Misketi nin Muscat ailesinin atası olabileceği belirtilmiştir. Regner et al. (2001) tarafından çeşitli Vitis türlerinden alınan 1200 adetten fazla asmanın genotipinin belirlenmesi SSR, InterSSR, AFLP ve RAPD gibi çeşitli teknikler kullanılarak yapılmıştır. En polimorfik 6 markör lokusu ile tüm asma çeşitlerinin ayrılabildiğini belirten araştırıcılar, şu an asma fidanlıkları ve yetiştiriciler için çeşit kimlik tespitinde 10 SSR lokusunun kullanıldığını söylemektedirler. Avusturya da yetiştirilen asma çeşitleri arasındaki genetik akrabalığı daha iyi anlayabilmek için 300 den fazla çeşidin 40 tan fazla SSR markörlerle tanımlanmasını uygun görmüşlerdir. Bazı üzüm çeşitlerinin orijinini belirlemelerinin yanında, Veltliner ve Pinot ailelerinin de kimlik tespitini yapmışlardır. Oluşturulan pedigri, genetik olarak benzer ve morfolojik olarak aynı geçmişe sahip birçok çeşidin aydınlanmasına yardımcı olmuştur. Serin iklim bağcılığı için, bazı çeşitlerin gelişiminden sorumlu tutulan Traminer ve Heunisch iki anahtar çeşit olarak belirlenmiştir. SSR markörlerin kalıtımındaki sapmaların, melezleme sırasında meydana gelen genetik değişimleri tanımamıza olanak verdiğini söylemişlerdir. Şarap üreticileri şarap üretimi için geleneksel çeşitlerin tipik duyusal çeşit klonlarını tercih ederler. Bununla birlikte geçmişte, dağıtılan materyalin istenilen klondan olduğu garantisinin olmadığını, bu eksikliğin sebebinin de klonlar için kimlik tespit sisteminin yokluğu olduğunu belirtmişlerdir. Bu nedenle klon ayrımını RAPD ve InterSSR markörlerle yapmışlar ve ayrıca, klonların kimlik tespitinin SSR markörlerin çok nadir olan sessiz (null) allelleriyle de mümkün olacağını belirtmişlerdir. Şaraplık üzüm çeşitleri içindeki klonlar, çeşidin ana özelliğini barındırmasına rağmen, hastalıklara hassasiyet, ürün ve şarap kalitesi gibi özelliklerde önemli farklılık gösterdiklerinden, bu klonların doğru belirlenmesi ekonomik öneme sahiptir. Fakat bunlar morfolojik yolla kolay bir şekilde ayırt edilmezler. Riaz et al. (2001) genetik açıdan klonların farklılığını belirtmek için yaptıkları çalışmada, ekonomik önemleri ve farklı coğrafik orijinlere sahip olmalarından dolayı, 22 Pinot noir ve 22 Chardonnay klonunu kullanmışlardır. Her bir klon için toplam 92 mikrosatelit markör kullanılmış; 92 markörden 8 i Pinot noir klonları ile Chardonnay in 4 klonunda polimorfik 25
bulunmuştur. Grup içinde 7 Pinot noir ve 5 Chardonnay klonu kesin şekilde birbirinden ayrılmıştır. Araştırıcılar, bu tip bir genetik testin, bağ tesisinde önemli bir yatırımdan önce, fidanlıkta ve damızlık parselde çok genç bitkilerin klonal belirlemeleri için kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Ayrıca, polimorfik mikrosatelit markörlerin sayısı arttıkça ekonomik öneme sahip Pinot noir ve Chardonnay klonlarının saptanması mümkün olacağını belirtmişlerdir. Fransa ve İtalya nın kuzey batısından alınan ve sinonim olduğu düşünülen 31 çeşitte yapılan RAPD ve SSR analizleri sonucunda 16 tanesinin sinonim olduğu görülmüştür. Buna göre, Fransa nın Verddese çeşidinin İtalya nın Bianver ile, yine Fransa nın Chatus çeşidinin İtalya nın Neiret çeşidi ile ve Fransa nın Gouais blanc çeşidinin İtalya nın Preveiral ve Liseiret çeşitleri ile sinonim olduğu saptanmıştır (Schneider et al. 2001). Dikotiledon kloroplast genomlar için kloroplast mikrosatelit primerlerin kullanılması, Vitis cinsi içinde tür içi ve türler arası uzunluk varyasyonunun varlığını ortaya çıkarmıştır. Bu anlamda Arroyo Garcia et al. (2002) tarafından yapılan çalışmada test edilen toplam 10 primer çiftinden 3 kloroplast mikrosatelit lokusu polimorfik bulunmuştur. Akdeniz çevresinde yetişen şaraplık ve sofralık 500 den fazla çeşit ile birkaç yabani asmada kloroplast haplotiplerini belirlemek için kloroplast mikrosatelit polimorfizmi kullanılmıştır. Bu analizler, çoğu haplotip frekanslarının doğudan batıya doğru dağılımını göstermiştir. Farklı bölgelerdeki haplotip sayısı ve dağılımı, Vitis vinifera nın farklı yerlerde bağımsız olarak kültüre alındığını düşündürmektedir. Sonuç olarak, şaraplık ve sofralık üzüm çeşitleri arasındaki haplotip frekanslarının karşılaştırması, üzümün kullanımına bağlı olarak farklı dağıldığını göstermiştir. Farklı gruplarca asmalarda bazı primerler geliştirilmiş ve asmalarda genotip belirleme, sinonimleri ortaya çıkarma, çeşit kimlik tespiti ve ayırt etme ve ebeveyn çalışmaları için SSR markörlerin kullanışlılığı gösterilmiştir. Reale et al. (2002) SSR kullanarak 26
şüphenilen bir sinonim durumuna bakmıştır. Uluslararası Asma Çeşit Katoloğunda Italya nın merkezinde Molise Bölgesi nin geleneksel bir kırmızı şaraplık çeşidi Tintilia veya Tintiglia nın, Sardinia Bölgesi nin bir çeşidi olan Bovale grande nin bir sinonimi olduğu söylenmiştir. Bu çalışmanın amacı Tintilia ve Bovale arasında genetik ilişkiyi değerlendirmektir. Eğer herhangi bir farklılık bulunursa Tintilia, yeni bir çeşit olarak onaylanabilecek ve çoğaltılabilecek, tipik ürün olarak pazarlanabilir şarap olarak değerlendirilebilecektir. Bölgenin her tarafından toplanan Tintilia klonları ve Bovale nin bazı aksesyonları VVS2, VVS3, VVS4, VVS5, VVMD6, VVMD25, VVMD27, VVMD28, VVMD31, VVMD32, VVMD36, ssrvrzag62 ve ssrvrzag79 (toplam 14 adet) mikrosatelit lokusta genotip analizleri yapılmıştır. Elde edilen veriler, genetik uzaklık ölçümleri ve tahmin edilen sinonimleri doğrulamak için değerlendirilmiştir. Test edilen tüm bireyler ikili olarak karşılaştırılmış, ikili matriks uzaklıklara çevrilmiş ve bir dendogram elde edilmiştir. Buna göre, Tintilia aksesyonların çoğu kendi aralarında benzerlik göstermiş fakat Bovale aksesyonlarından ayrılmıştır. Ulanovsky et al. (2002), aralarında sinonim ve homonim olduğu düşünülen genotipleri de içeren 39 aksesyon üzerinde 66 RAPD ve 4 mikrosatelit lokusu incelemiştir. RAPD ve mikrosatelit sonuçları uyum içinde bulunmuştur. Sonuçta, Moristell ile Monastel aksesyonlarından biri; Moturana ile Ribadavia; Concejón ile Monastel aksesyonundan biri ve çalışılan Muscat çeşitlerinden çoğu sinonim olarak belirlenmiştir. Miguel de Arco, Monastel, Monastrell ve Turruntés çeşitlerinde ise homonim isimlendirme görülmüştür. Vignani et al. (2002) 25 farklı Sangiovese aksesyonunda 8 mikrosatelit lokus kullanarak genotip analizi, allel dağılımı ve pedigri analizini otomatik DNA sekansla yapmıştır. Sonuçta genetik farklılığın 3 durumu ortaya çıkarak Sangiovese nin farklı klonları ayırt edilmiştir. Ayrıca, AFLP tekniği de uygulanmış ve sonuçların mikrosatelit testle elde edilen verilerle örtüştüğü görülmüştür. 27
Arjantin de farklı misket tadına sahip ve sek şarap üretimi yapılan, aromatik bir beyaz üzüm çeşidi olan Torrontés riojano ile bu çeşide fenotipik olarak çok benzeyen Moscatel amarillo çeşidi ve Torrontés in 2 tipi, kimlik tespiti amacıyla Agüero et al. (2003) tarafından yapılan çalışmada 20 mikrosatelit lokus (VVMD5, VVMD6, VVMD7, VVMD21, VVMD24, VVMD25, VVMD26, VVMD27, VVMD28, VVMD31, VVMD32, VVMD36, VVS2, VrZAG62, VrZAG79, VrZAG83, VrZAG93, VMC2c3, VMC2h4, VMC5g6) ile analiz edilmiş ve 4 çeşit birbirinden farklı bulunmuştur. Aradhya et al. (2003) tarafından 222 kültür (Vitis vinifera) ve 22 yabani (V. vinifera ssp. sylvestris) asma aksesyonu, genetik farklılık ve ayrım için 8 mikrosatelit lokusta analiz edilmiş, aksesyonlar arası yoğun polimorfizmle toplam 94 allel tespit edilmiştir. Aksesyonlar arasında çeşitli akrabalıklar ortaya çıkmış ve occidentalis, pontica ve orientalis olarak asma çeşitlerinin klasik eko-coğrafik gruplandırmayla desteklenen 3 küme içinde 16 genetik grup açığa çıkarılmıştır. Sofralık ve şaraplık üzüm çeşitleri arasında, farkedilebilir bir farklılık bulunmuş ve Muscat tipleri, şaraplık üzümler arasında biraz farklılık göstermiştir. χ 2 testinde tüm lokuslar arasındaki allel frekanslarında heterojen durumu önemli bulunmuştur. Farklı gruplar için gözlenen heterozigotluk ortalama 0,771 olmuştur. İspanya da Garnacha, Garnacha Tintoera adıyla yetiştirilen ve diğer birçok ülkede Alicante, Roussillon, Tocai Rosso, Tinta gibi sinonimleri olan tenturiye aksesyonların 24 mikrosatelit lokusta ve AFLP makörlerle moleküler analizi yapılmıştır (Cabezas et al. 2003). Sonuçlara göre, Garnacha Tinta (kırmızı), Garnacha Gris (gri), Garnacha Blanca (beyaz) ve Garnacha Peluda (tüylü) nın aynı genotipe karşılık geldiği ve muhtemelen sürekli meydana gelen somaklonal mutasyonlar sonucunda oluştukları düşünülmektedir. Garnacha Tintoera aksesyonları ve sinonimleri 3 farklı tenturiye genotipinin varlığını ortaya çıkarmış ve aralarındaki akrabalığı göstermiştir. 28
İtalya Conegliano daki Bağcılık Araştırma Enstitüsü nde 1980 lerin sonunda asmaların tam olarak tanımlanması amacıyla bir seri çalışmalar başlatılmıştır. Yerli çeşitlerin yüksek miktarlarda olması, yabancı çeşitlerin dışarıdan getirilerek farklı isimle adlandırılmalarından dolayı problem ortaya çıkmış ve uzun yıllardan beri ampelograflar bunu çözmeye çalışmışlardır. Costacurta et al. (2003) bunu, mümkün olan kesin bir metotla belirlemek için, çeşitlerin tarihçesi, ampelografik analiz, İtalya da oluşturulan teknik tabanlı ampelometrik analiz, biyokimyasal analiz (izoenzimler), taneler üzerine yapılan kimyasal analiz ve moleküler analiz gibi farklı yöntemler denemişlerdir. Sonuçta İtalya da yetiştirilen İtalya tipi Cabernet franc çeşidinin aslında Carmenère çeşidi olduğunu, Primitivo ve Zinfandel çeşitlerinin aynı olduklarını ve Grenache çeşidinin ise Garnacha tinta, Cannonao ve Tocai rosso ile aynı olduğunu tespit etmişlerdir. Crespan et al. (2003), yerel İtalyan asma genotiplerini tanımlamışlar ve farklı coğrafik bölgelerde yetiştirilen çeşitlerin sinonimlerini ortaya çıkarmışlardır. Başlangıçta yapılan ampelografik karşılaştırmalar sonucu sinonim oldukları öne sürülen çeşitlerin ampelografik, ampelometrik, izoenzimler, mikrosatelit DNA markörler ve kimyasal analiz gibi değişik yöntemlerle analizi yapılmıştır. Sonuçta, yapılan her farklı analiz birbirini tamamlamış ve her aksesyon grupları için başlangıçta öne sürülen sinonimleri doğrulamıştır. Buna göre Prosecco lungo ve Tocai nostrano; Aleatico, Vernaccia di Pergola ve Moscatello nero; Bianchetta trevigiana, Vernassiana, Vernanziana ve Senese; Pedevenda ve Verdise; Malvasia bianca lunga ve Fresia; Ranaccio ve Grenache çeşitlerinin sinonim oldukları bulunmuştur. Fatahi et al. (2003) İran ve ABD den alınan 62 asma (Vitis spp.) aksesyonlarını, fluoresan primer kullanarak yüksek düzeyde polimorfik 9 mikrosatelit lokusta, kapilar elektroforez parçaçık büyüklüğü sistemi ile ayırt etmişlerdir. Her lokusta gözlenen allel sayıları 4 16 arasında değişmiş ve heterozigotluk oranı 0.47 0.86 arasında belirlenmiştir. Genetik benzerlik, her aksesyonun diğeriyle karşılaştırılması sonucu, 29
paylaşılan allel oranı ile değerlendirilmiştir. Genetik farklılık değerlerinden bir fenogram oluşturulmuş ve sofralık, şaraplık ve anaçlık olmak üzere 3 grup ortaya çıkmıştır. Ayrıca bu fenogram, İran sofralık üzüm çeşitleri arasında sinonim ve homonimleri ortaya çıkarttığı gibi 3 klonal grubu (Askari, Bidane ve Yaghoti) da açıkça göstermiştir. İspanya uzun bir geleneksel bağcılığa sahiptir ve iklimi, topoğrafik özellikleri, bağcılık ve şarapçılık ilgili uygulamaların zenginliği çeşitlerin ve her çeşitteki isimlerin çok sayıda olmasına neden olarak iki sonuç doğurmuştur; farklı bölgelerde farklı isimlendirilmiş fakat aynı çeşit olan sinonimlerin varlığı ve aynı isme sahip ancak farklı çeşitler olan homonimlerin varlığı. Bu sık sık görülen iki olay bazı karmaşaya yol açmaktadır. O bölgeye özel olan ismiyle Denominación de Origen, DO doğru bir şekilde isimlendirilmesi ile ilgili yasal problemlerle karşılaşılacağından bu problemi çözmek gerçekten önemlidir. Bu amaçla Ibáñez et al. (2003) yaptığı çalışmada, daha önce morfolojik ve izoenzimatik olarak ayırt edilen 111 adet İspanyol Vitis vinifera L. aksesyonunu, şüpheleri ortadan kaldırmak, mevcut olan veri bankasıyla karşılaştırmak ve kolaylıkla ulaşılabilir veribankası oluşturmak için 13 mikrosatelit lokus (VVMD5, VVMD7, VVMD27, VVMD28, VVS2, VVS5, VVS29, ssrvrzag29, ssrvrzag62, ssrvrzag67, ssrvrzag83, ssrvrzag79 ve ssrvrzag112) ile analiz etmiş ve 96 farklı genotip gözlemiştir. Her lokustaki toplam allel sayıları 4 (VVS29 ve ssrvrzag29)-16 (VVS5) arasında değişmiştir. 9,85 allel sayısı ortalamasıyla Portekiz ve Yunanistan gibi diğer ulusal koleksiyondaki ortalamalardan daha yüksek bulunmuştur. Bu çalışmada analiz edilen çeşit sayısı diğer çalışmadakilere göre fazla olmasına rağmen, allel sayısı Avrupa çeşit koleksiyonlardaki en yüksek allel sayısına sahip İtalyan örneklerinden de fazla bulunmuştur. Kullanılan 13 makrosatelit lokustan 6 sı (VVMD5, VVMD27, VVMD28, VVS2, VVS5 ve ssrvrzag67) 0,10 dan daha küçük tespit oranıyla yüksek derecede bilgi verici olarak bulunmuştur. Bu çalışmada en fazla bilgi 16 allel tespit edilen VVS5 lokusundan sağlanmıştır. Bununla birlikte, null allellerin varlığından dolayı bu lokusların kullanışlılığının sınırlı olduğu söylenmiştir. Tahmin edilen yüksek null allel frekansının (0,15) neden olduğu gözlenen heterozigotluk düşük oranda olmuştur. Çalışılan çeşit setinde gözlenen heterozigotluk, 13 lokusun 8 inde 30
beklenenden yüksek çıkmıştır. Tesadüfi eşleşmeye göre, gözlenen ortalama heterozigotluk, az miktarda daha düşük oranda olmuştur. Bu tip dizilerde meydana gelen mutasyonun yüksek oranda olması ve birçok asma çeşidinin yaşından dolayı, çeşitler arasındaki bir veya iki farklı allel gibi küçük farklılıklar, belki aynı çeşidin klonları olarak göz önüne alınabilir. İspanyol çeşitleri içinde, 96 çeşit arasında paylaşılan allel oranı %38 (toplam 38 allelden yaklaşık 10 u) olmuştur. Bu oran, Portekiz çeşit koleksiyonundakilerle aynı, Yunan ve Hırvat koleksiyonlarınkinden yüksek bulunmuştur. Vejetatif olarak çoğaltılan bitkilerde, bitki ıslahçı haklarındaki ihlali saptamak için mahkemeye ait bir süreçte mikrosatelit analizinin kullanımının değerlendirildiği bir çalışmada, lokus içindeki ve lokuslar arasındaki allellerin bağımsızlığı testinden sonra ve 5 mikrosatelit uyuşma ihtimallerinin hesaplanması için seçilmiştir. Araştırmada, asmalar için bitki ıslahçı haklarındaki ihlalin değerlendirilmesinde mikrosatelitlerin kullanımının doğru bir temel sağladığı bulunmuştur (Ibañez and Eeuwijk 2003). 6 İtalyan ve 4 İspanyol yabani asma populasyonu (Vitis vinifera ssp. silvestris) arasındaki genetik akrabalık, Imazio et al. (2003) tarafından çekirdek ve kloroplast SSR analizi ile araştırılmıştır. Güney İtalya dan toplanan populasyon, populasyon içinde ve arasında yüksek derecede farklılık göstermiş ve heterozigotluk oranı 0,8419 olarak bulunmuştur. İtalyan populasyonları arasında yüksek derecede bir gen akışının oluşu, İtalya yarımadasının, son buzul çağında yabani asmaların temel sığınma bölgesi olarak merkezi bir rol oynadığı ileri sürmektedir. Diğer yandan, İspanyol populasyonları arasında, düşük haplotip zenginliği ve yüksek derecede genetik uzaklık tespit edilmiştir. Düşük derecede gen akışı, bu populasyonların genetik erozyona maruz kaldığını göstermektedir. İtalyan ve İspanyol populasyonları arasındaki genetik akrabalık analizleri, bu yabani populasyonlar arasında çok açık bir genetik farklılığın olduğunu göstermektedir. Diğer yandan, generasyon için etkili göçün ve genetik uzaklığın, Sardinia populasyonunda diğer populasyonlarla eşit bir gen akışı göstermiştir. Sardinia populasyonunun bu genetik yapısı, buzul çağından sonraki sömürgeleştirme sürecinde 31
İtalya ve İspanya arasında genotip değişiminde bağlayıcı bir role sahip olduğu ileri sürülmektedir. Daha önce yapılan bir tanımlama çalışmasında, spesifik alleller gösteren ve yüksek derecede polimorfik olduğu düşünülen iki çekirdek mikrosatelitin (ssrvvuhc12, ssrvvuhc29) gücünün değerlendirilmesi ve diğer primerlerle karşılaştırılması amacıyla yapılan çalışmada 103 V. vinifera aksesyonu, 3 diğer Vitis cinsi ve 3 adet yakın cinste bu iki mikrosatelit lokusun 30 ar allel vererek diğer 12 lokus içinde en polimorfik lokus olduğu bulunmuştur. ssrvrzag93 ve VMC8a7 lokusları bazı bireylerde 3 bant vermiş ve bunun himeyreden dolayı olmuş olabileceği belirtilmiştir. Gözlenen heterozigotluk ssrvvuhc12- ssrvvuhc29 kombinasyonunda yüksek iken, 103 aksesyondaki benzerlik ortalaması ssrvvuhc12 ve ssrvvuhc29 da ssrvrzag93-vmc8a7 kombinasyonundan daha düşük bulunmuştur. Sonuçta, diğer kombinasyonlar çok fazla spesifik allel göstermezken, anaçlar ve Vitis türleri için ssrvvuhc12 ve ssrvvuhc29 lokuslarında çok sayıda spesifik alleller bulunmuştur. Bu özellikler, bu iki lokus kombinasyonunun yüksek derecede polimorfik mikrosatelit markörler olarak değerlendirilmelerine ek olarak Vitis türlerinin koleksiyonunun oluşturulmasında gözönüne alınabilmelerini düşünmesine izin vermiştir. Aynı zamanda, fidanlıklarda ve ticari amaçlı kontrollerde anaç materyalinin kalite kontrolünde olarak kullanışlı olabildikleri belirtilmiştir (Lefort et al. 2003). Martín et al. (2003), çoğunu yerli çeşitlerin oluşturduğu İspanya daki asma genbankası koleksiyonundan 176 genotipin 6 mikrosatelit markör ile (VVS2, VVMD5, VVMD7, ssrzag47, ssrzag62 ssrzag79) analizini yapmış ve 9 (ssrzag47) ilâ 13 (VVS2) arasında değişen oranda allel bulmuştur. Analiz sonucunda 176 genotipten 163 ünün farklı çeşitler olduğu ortaya çıkmıştır. Gözlenen heterozigotluk % 75.6 (VVMD7) ilâ % 90.09 (VVMD5) arasında bulunmuş, en çok bilgi verici lokusun VVMD5 olduğunu saptanmıştır. 32
Pavek et al. (2003) tarafından yapılan bir çalışmada ABD deki Ulusal Bitki Gen Bankası nda 7 adet Vitis rupestris Sclheele in situ olarak korumaya alınmış, bunların morfolojik ve moleküler verilerle genetik varyasyonu değerlendirilmiştir. Çalışılan 4 mikrosatelit lokusta (VVS2, VVS4, VVMD6, VVMD7) toplam allel sayısı 6 dan (VVMD6) 16 ya (VVMD7) kadar değişmiş ve populasyon için heterozigotluk seviyesi tüm lokuslarda ortalama 0,5 olmuştur. Genetik fark veya PIC ( 1- bir lokustaki tüm gen frekansının kareler toplamı) değeri 0-0,82 arasında farklılık göstermiştir. Heterozigotluk ve PIC değeri bu Vitis rupestris Scleele populasyonunda, asma genetik kaynak koleksiyonundan 25 asma çeşidi ve 5 adet Vitis rupestris aksesyonunu içeren yabani türlerle karşılaştırıldığı benzer bir çalışmada belirtilen değerlerden düşük çıkmıştır. Pinto-Carnide et al. (2003) Kuzey Portekiz den alınan 12 asma genotipini RAPD ve mikrosatelitlerle tanımlamıştır. 9 primer RAPD analizi için kullanılmış ve çeşitlerin 8 i monotipik örnek göstermiştir. 6 mikrosatelit lokusla toplam 38 allel elde edilmiştir. Sonuç olarak çalışılan çeşitler arasında akrabalık gözlenmiş ve sinonim varlığı tartışılmıştır. Buna göre, Aragonez in (Tinta Roiz) İspanyol çeşit olan Tempranillo ile aynı olduğu teyit edilmiştir. Lópes et al. (1999) un sonuçlarıyla karşılaştırıldığında Malvasia Fina nın, Boal Cachudo ve Boal da Madeira ile sinonim olduğu görülmüştür. Aynı şekilde, Moscatel Galego Branco nun Muscat à Petit Grains ile ve Amaral (Azal Tinto) ın Galicia İspanya dan Caiño Bravo ile sinonim olduğu teyit edilmiştir. Alvarinho, İspanyol Albariño ile Borraçal ise İspanyol Caiño ile aynı bulunmuştur (Martin et al. 2003). Ayrıca, iki tip moleküler markörün tanımlamada uygun olduğu kanıtlanmıştır. İtalya ve Fransa da yetişen 30 üzüm çeşidinde, morfolojik özellikler, ampelografik tanımlamalar, agronomik gözlemler ve şarap yapılarına dayanan daha önceki çalışmalarda sinonim oldukları belirtilen 22 çeşidin RAPD ve mikrosatelit markörlerle analizi yapılmış ve İtalyan ve Alp lerin batısındaki Fransız çeşitlerinin sinonim oldukları ortaya çıkmıştır (Schneider et al. 2003). 33
This and Dettweiler (2003) tarafından GenRes 081 Avrupa projesi çerçevesinde yapılan çalışmada, Avrupa Vitis veribankası (http://www.dainet.de/eccdb/vitis) oluşturulmasında laboratuvarlar arası mikrosatelit verilerin kolayca karşılaştırılması amacıyla mikrosatelit veri değerlendirilmesine yönelik bir metot geliştirilmiştir. Bu projede 6 mikrosatelit lokus seçilmiştir. Bunlar; VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 ve VrZAG79 dur. Bu lokuslar, üzüm çeşitlerinin ayrımında çok etkilidirler. Bu strateji, dünyada iyi bilinen referans çeşitlere göre allellerin kodlama esasına dayanır. 13 ten 23 e kadar değişen alleller sunan 6 lokusun her biri için, 10 ila 16 referans çeşit seçilmiştir. Gürcistan, Ermenistan ve Türkiye den toplanan kültüre alınmış ve yabani asmaları içeren toplam 268 aksesyon, başlangıç olarak 6 mikrosatelit markör (VVMD5, VVMD7, VVMD27, ssrvrzag62, ssrvrzag79 ve VVS2) ile analiz edilmiştir. Sinonimler çoğunlukla aynı coğrafik alan içinde görülmüştür. Aynı populasyon içindeki yabani asmalarda (Vitis vinifera ssp. silvestris), Türkiye de 1, Gürcistan da 3 ve Ermenistan da 9 durumda, sinonim bulunmuştur. Ayrıca, Türkiye deki çeşitler ile dünya çapında tanınmış diğer çeşitler arasında sinonim durumu belirlenmiştir. Buna göre, İridaneli ile Italia, Parmak ile Jerusalem Bleu çeşitlerinin aynı olduğu belirtilmiştir (Vouillamoz et al. 2003). Arroyo Garcia et al. (2004) tarafından yapılan çalışmada, İspanya ve Türkiye den yabani asma populasyonlarında farklı kloroplast haplotiplerini belirlemek amacıyla kloroplast mikrosatelitler kullanılmıştır. Yeni primer çifti setleri (Chung and Staub 2003) kullanarak fazladan 23 kloroplast mikrosatelit lokusta polimorfizmi araştırmışlar ve sadece 4 ü toplam 10 allel göstererek polimorfik bulunmuştur. Bu polimorfizm, bir baz çiftinin (A veya T kalıntıları) eklenmesi veya yok olmasından dolayıdır. Vitis vinifera L. da analiz edilen 53 lokus içinde toplam 8 polimorfik kloroplast lokus belirlenmiş ve bunlar örneklerde kullanılarak toplam 19 allel ve A dan H ye değişen 8 farklı haplotip belirlenmiştir. Sonuçta Türkiye nin 7 haplotiple en fazla haplotipik 34
farklılığa sahip olduğu bulunurken, doğal İspanyol populasyonunda sadece 2 haplotipe rastlanmıştır. A haplotipi, İspanya da dominant olup Türkiye de bulunmamıştır. Bu haplotip aynı zamanda İspanya şaraplık üzüm çeşitlerinde dominanttır. D haplotipi, Türkiye yabani örneklerinde dominant bulunmuş ve Yunanistan daki şaraplık çeşitlerde bu haplotipin yüksek oranda olduğu gözlenmiştir. Bu yayılma şekli, kültüre alınan üzüm çeşitlerinin doğudan batıya girdiği teorisini desteklememektedir. Çünkü şaraplık üzümlerde en yaygın bulunan haplotip A, kültüre alınma yeri olarak düşünülen Türkiye de hiç bulunmamaktadır. Bu sonuçlar, daha çok mevcut şaraplık üzüm çeşitlerinin orijininde bölgesel gen kaynaklarının önemli bir katkıda bulunması ile daha tutarlıdır. İspanyol Parraleta nın 12 ve Graciano çeşidinin 2 aksesyonunu belirlemek için Montaner et al. (2004) tarafından yapılan çalışmada, 6 farklı mikrosatelit lokus (VVS2, VVMD5, VVMD7, ssrvrzag47, ssrvrzag62 ve ssrvrzag79) kullanılmıştır. Parraleta aksesyonları arasında farklı bulunmamakla birlikte allelik profili, Ribote, Bomogastro ve Salceño Negro gibi diğer minor çeşitlerle sinonim olabileceği belirtilmiştir. Graciano nun 2 aksesyonu 6 mikrosatelit lokusta farklı çıkmıştır. Graciano 17-15 ampelografik tanımlama ile birlikte allel analizinde Rojal çeşidi ile aynı bulunmuştur. Lokus analizinde allellerin % 58 i aynı olduğundan, Parraleta ve Graciano 15-5 in birbirlerine yakın olduğu düşünülmüştür. Sonuç olarak Parraleta aksesyonlarının ismine doğruluğu ve ayrıca bu çeşidin Graciano çeşidinin sinonimi olmadığı teyit edilmiştir. Núñez et al. (2004) in çalışmasında, İspanya nın El Bierzo bölgesinde yoğun bir şekilde yetiştirilen çeşitleri de içeren asma moleküler veri bankasının oluşturulması ve kullanımı amaçlanmıştır. 5 farklı mikrosatelit lokus 24 asma çeşidinde kapilar elektroforez kullanılarak analiz edilmiştir. Çeşitler içinde farklılık bulunmamış ve çeşitler arasında yüksek derecede farklılık edilmiştir. Tüm çeşitlerin açık bir şekilde kimlik tespitleri yapılmıştır. Kimlik tespitinde bu veri bankasının kullanışlılığını test etmek için İspanya El Bierzo bölgesinden bilinmeyen 210 genotip toplanmış ve 35
mikrosatelitle analiz edilmiştir. Araştırıcılar, bu örneklerin % 98,6 sının kimlik tespitinin yapılabildiğini ve mikrosatelit markörlerin ampelografi ile birlikte kullanılarak İspanyol Vitis gen bankasının hazırlanmasında etkili bir yol olabileceğini söylemişlerdir. Alcalá de Henares teki (Madrid) İspanyol gen bankasından toplam 621 Vitis vinifera L. aksesyonu morfolojik tanımlayıcılar, izoenzim ve mikrosatelitler kullanılarak tanımlanmıştır. Sadece morfoloji ile 420, morfoloji ve izoenzimle 318, mikrosatelit ile 163, mikrosatelit ve morfoloji kombinasyonu ile değerlendirildiğinde ise 177 farklı aksesyon bulunmuştur. Garnacha Blanca, Garnacha Gris ve Garnacha Negra daki gibi tane renginde meydana gelen mutasyondan dolayı çok yakın olan çeşitlerde aynı mikrosatelit genotip elde edilmiştir. Sonuçta mevcut Vitis gen bankalarında kopyaları ve sinonimleri belirlemede ve farklı gen bankalarından aksesyonları karşılaştırmada morfolojik tanımlayıcıların yanında moleküler tekniklerin özellikle mikrosatelitlerin kullanılması önerilmiştir (Ortiz et al. 2004). This et al. (2004), farklı laboratuvarlarda elde edilmiş mikrosatelit profillerin karşılaştırılmasını yapmak amacıyla, 7 ülkeden 10 araştırıcı ile 46 üzüm çeşidini 6 lokusta (VVMD5, VVMD7, VVMD27, VVS2, VrZAG62 ve VrZAG79) incelemiştir. Hiçbir ekipman veya protokol standardize edilmeden yapılan çalışmada, bazı araştırıcılar hemen hemen aynı sonuçları bulmalarına rağmen, tamamen farklı allel büyüklükleri de elde edilmiştir. Çok iyi bilinen çeşitlerde, referans allel büyüklüklerini belirleme yoluyla verilerin karşılaştırılması stratejisi önerilmiş, her bir markör için her allel, referans çeşidin taşıdığı allel ile isim bazında kodlanarak gösterilmiştir. Her markörde 13 ten 23 e kadar değişen sayıda allel veren 33 çeşit referans olarak seçilmiştir. Farklı araştırıcılarca elde edilen ham veriler kodlanmış ve verilerin % 97 sinden fazlasının birbirini tuttuğu görülmüştür. Normal olmayan amplifikasyon ve görüntüleme, heterozigot allellerin homozigot allel olarak yanlış değerlendirilmeleri gibi önemsiz farklılıklar hatalara dağıtılmıştır. Sonuçta, farklı protokol ve şartlarda farklı laboratuvarlarda üretilmiş, kodlu mikrosatelit verilerin karşılaştırılabilir olduğu, bu da kimlik belirleme ve çeşitlerin SSR allellerinin tanımlanmasında uygun olduğunu 36
göstermiştir. Yaygın olarak ve ayrıca bu çalışmada kullanılan 6 markör, gelecekteki asma çeşit analizi için asgari standart markör seti olarak kabul edilmesi önerilmiş ve diğer çeşitlerin, burada sunulan kodlu referans allellerle tanımlanabileceği belirtilmiştir. Cezayir in, özellikle tüm Akdeniz türleri (Vitis vinifera L.) içinde hemen hemen hiç bilinmeyen büyük bir genetik kaynak sunduğunu belirten Akkak et al. (2005) burada, genetik olarak aynı bitki materyaline farklı yerel isimler verildiğini söylemiştir. Bu çalışmada Akdeniz Havzası ndan alınan kültüre alınmış üzüm çeşitleri ile 60 yöresel çeşit arasındaki akrabalık ve genetik farklılık 12 SSR (VVS2, VVS5, VVMD5, VVMD7, VVMD24, VVMD27, VVMD31, VVMD36, VrZAG21, VrZAG62, VrZAG67, VrZAG79) markörü kullanılarak belirlenmiştir. Çalışılan markörler, analiz edilen 60 çeşitte 34 farklı genotip ayırt etmişlerdir. Tüm markörler ortalama 9,1 allel vermiştir. Genetik farklılık 0,79; gözlenen heterozigotluk 0,80; polimorfik içerik 0,77 bulunmuştur. İspanyol Asma Genbankası na oranla bu verilerin yerel genbankasında yüksek genetik farklılığı gösterdiklerini belirtmişlerdir. Campania (Güney İtalya) bölgesinden 5 ayrı ilden alınan 69 yerel asma genotiplerine tekabül eden toplam 114 aksesyon genetik farklılık ve akrabalığı değerlendirmek amacıyla 8 mikrosatelit markör açısından (VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD25, VVMD27, VVMD31, VrZAG62, VrZAG79) analiz edilmiştir (Costantini et al. 2005). SSR lokuslarda farklı fenotip göstermelerinden dolayı 56 farklı çeşit tespit edilmiştir. Ayrıca homonimlerle birlikte Greco di Tufo ve Asprino ile Palumino ve Piedirosso gibi sinonimler de açığa çıkarılmıştır. Tüm çeşitler arasında ikili olarak genetik uzaklık tespit edilmiştir. Sonuçta, çeşit gruplandırmaları alındıkları yerleri (illeri) yansıtmamış ve Campania üzüm çeşitlerinin çok çeşitli coğrafik bölgelerden gelmiş olabileceği ifade edilmiştir. Eski bir çeşit olan Picolit çeşidi içindeki fenotipik ve genotipik farklılığı ortaya çıkartmak için yapılan çalışmada, 30 100 yaşları arasında değişen omcalardan 39 37
örneğin kullanıldığı çalışmada ampelografik ve moleküler markörlerden mikrosatelit ve AFLP ile analiz yapılmış ve sonucunda 2 örnek (P6 ve P7) diğerlerinden morfolojik olarak farklı bulunmuştur (Zulini et al. 2005). Bu örnekler, incelenen 21 SSR lokusun 18 inde farklılık göstermiş ve Picolit çeşidine ait olmadığı sonucu çıkarılmıştır. Kalan örneklerden 35 i tüm SSR lokuslarında aynı allellik profili göstermiş ve Picolit çeşidinde ismine doğruluk olduğu söylenmiştir. Goto-Yamamoto et al. (2006), 9 yeni mikrosatelit markör geliştirmiştir. Bu markörler ve 8 bilinen mikrosatelit markörle 2 adet Vitis labrusca çeşidi, Vitis riparia ve Vitis rotundifolia ile birlikte Japon ve Çin çeşitlerini (Vitis vinifera L.) de kapsayan 8 adet doğu çeşidini, 7 adet batı çeşidiyle karşılaştırmıştır. Hesaplanan paylaşılan allel oranı, bu asma sınıflandırmasını desteklemiştir. Genetik uzaklık tabanlı dendogram, Vitis türleriyle birlikte doğu ve batı çeşitlerini açık bir şekilde ayırmıştır. Kafkasya geçiş Bölgesi ve Anadolu dan alınan çeşitlerin mikrosatelit tanımlaması ve bu zengin ampelografik mirasın genbankası oluşturma yolundaki ilk adımı olan bir çalışmada, 12 mikrosatelit markör (VVMD5, VVMD7, VVMD24, VVMD28, VVMD31, VVMD32, VrZAG62, VrZAG79, VVS2, VMC2C3, VMC2H4, VMC5A1) kullanılmıştır (Vouillamoz et al. basımda). Araştırıcılar, diğer birçok veribankasıyla karşılaştırmaya izin veren ve Uluslararası Üzüm Birliği (International Grape Community) tarafından standart set olarak kabul edilen 6 mikrosatelit markörlerden 5 ini kullanmışlardır. Ermenistan dan 13, Gürcistan dan 41 ve Türkiye den 62 olmak üzere toplam 116 aksesyon üzerinde çalışılmıştır. Her lokustaki allel sayıları 6 dan (VVMD24) 16 ya (VVMD28 ve VVMD32) kadar değişmiş ve 11,9 ortalama göstererek aynı lokuslar için önceki çalışmalarda belirtilen değerlerden (Lopes et al. 1999, Maletic et al. 1999, Lefort and Roubelakis-Angelakis 2001, Costantini et al. 2005) daha yüksek bulunmuştur. Gözlenen heterozigotluk oranı 0,796 bulunmuş ve Aradhya et al. (2003) nın 244 Vitis vinifera aksesyonunda 8 mikrosatelit lokusla analiz sonucu elde edilen 0,771 değeri ve yine Sefc et al. (2000) ın 164 çeşitte 8 lokustaki 0,785 değeriyle karşılaştırıldığında biraz yüksek çıkmıştır. Kullanılan markörler içinde en bilgi verici lokusun VMC2H4 ve en az bilgi verenin ise VVMD24 lokusunun olduğu görülmüştür. 38
Türk çeşitlerinden Dımışkı, Luvanek, Morek, Sungurlu ve Vilki çeşitlerinde 3 allelli durum gözlenmiştir. Çalışmada 20 sinonim ve 6 homonim durum gözlenmiş ve sonuçta 89 faklı üzüm çeşidi belirlenmiştir. 39
3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışma, 2003-2006 yılları arasında Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Serası, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarımsal Biyoteknoloji Laboratuvarı Bahçe Bitkileri Birimi ve Istituto Sperimentale Agrario di San Michele all'adige İtalya da yapılmıştır. 3.1 Materyal Araştırmada kullanılan materyaller, Gaziantep ilinin merkez ve ilçelerinden ve ayrıca daha önceki yıllarda bu ilden Tekirdağ daki Milli Koleksiyon Bağı na aktarılan çeşitlerden elde edilmiştir. Araştırmada, Gaziantep ili merkez ve ilçelerinden 35, Tekirdağ dan 11 ve 2 adet referans olmak üzere toplam 48 üzüm çeşidi kullanılmıştır. Referans çeşitler Cabernet Sauvignon ve Merlot Bahçe Bitkileri Bölümü Aşağı Uygulama Bağındaki koleksiyon parselinden alınmıştır. Çalışılan 46 genotipin kısa ampelografik özellikleri Çizelge 3.1 de verilmiştir. Referans çeşitler ile 46 üzüm çeşidinin yöreden toplanmış 3 5 gözlü çelikleri, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Serası nda perlit, torf ve kum (2:2:1) karışımından hazırlanmış ortamda, polietilen tüplerde köklendirilmiş ve gözlerin sürmesi sağlanmıştır. Örnekler (yapraklar) süren genç yaz sürgünlerinden alınmıştır. 40
Çizelge 3.1 Araştırmada kullanılan Gaziantep iline ait üzüm çeşitlerine ilişkin kısa ampelografik özellikler 41 No Çeşitler Sinonimleri Salkım Şekli Tane Şekli Tane Rengi Tane Tane İçi Çekirdek Tadı Verimlilik Değerlendirme Kaynak Kabuğu Sayısı Şekli 1 G Hatunparmağı Kadınparmağı, İnekmemesi Dallı, omuzlu konik Uzun oval Yeşil-sarı İnce Dolgun etli, Az sulu 2-3 Çok tatlı Çok Sofralık, Kurutmalık Gürsöz, 1993 2 G Hönüsü Humusu, Hömüsü Omuzlu, dallı konik Uzun oval Kırmızı-siyah Orta kalın Gevrek etli, Az sulu 1-2 Tatlı Çok Sofralık Gürsöz, 993 3 G Künefi Konik omuzlu Yuvarlak Kırmızımsı Kalın Gevrek etli, Orta sulu 1-2 Tatlı Orta Sofralık Gürsöz, 1993 4 G Çilorut Seyrekazezi, Çörtükazezi Dallı konik Yumurta Yeşil-sarı Orta kalın Etli, Sulu 2-3 Orta tatlı Çok Sofralık, Şıralık Gürsöz, 1993 5 T Karaalaca Terazi karası, Yürük karası Kanatlı konik Yuvarlak Kırmızı-siyah Kalınca Dolgun etli, Az sulu 2-3 Kekremsi tatlı Az Erkenci sofralık Gürsöz, 1993 6 G Dökülgen Şirelik, Hüveydi Dallı, omuzlu Hafif oval Yeşil-sarı Orta kalın Dolgun etli 1-2 Tatlı Çok Sofralık, Şıralık Şaraplık, Gürsöz, 1993 7 T Üvezi Dallı konik Söbü Yeşil-sarı Orta Etli gevrek 3-4 Tatlı *T.B.A.E 8 T Tosbağa- Konik, Yuvarlak Yeşil-sarı Orta kalın Yumuşak etli, 2-3 Orta tatlı Çok Sofralık, Şıralık Gürsöz, omuzlu Az sulu 1993 kabarcığı 9 G Sarı-kabarcık Kanatlı konik Yuvarlak Açık sarımtırakyeşil 10 G Gülgülü Künefi Konik ve piramit 11 G Horozyüreği Konik Yumurta Morumtrak koyu siyah İnce Yumuşak etli, Çok sulu 2-3 Çok tatlı Çok Şıralık, Şaraplık Kısakürek, 1950 Yuvarlak Kırmızı Kalın Etli, Az sulu 1-2 Tatlı Orta Sofralık Kısakürek, 1950 İnce Gevrek etli 1-2 Kokulu Orta Sofralık Kısakürek, tatlı 1950 12 G Yıldız Dallı konik Yuvarlak oval Yeşil-sarı Orta kalın Yumuşak etli, 2-3 Tatlı Orta Sofralık Gürsöz, Az sulu 1993 13 G Serpenekıran Konik, Yuvarlak Yeşil-sarı İnce Yumuşak etli, 2-3 Az tatlı Çok Sofralık, Şıralık Gürsöz, omuzlu Çok sulu 1993 14 G Devegözü Yalangöz Omuzlu dallı, Yuvarlak Yeşil-sarı Orta kalın Dolgun etli, Sulu 3-4 Orta tatlı Az Sofralık Gürsöz, konik 1993 15 G Kara Yürükkara, Kanatlı konik Yuvarlak Kırmızı-siyah Kalınca Dolgun etli, Az 2-3 Tatlı Az Sofralık Gürsöz, Terazi karası sulu 1993 16 G Horoz karası Kilis karası Omuzlu, dallı İğde, küt iğ Kırmızı-siyah Kalın Dolgun etli, Orta 2-3 Orta tatlı Çok Sofralık, Gürsöz, konik sulu Şaraplık, 1993 17 G Azezi Beziki sarısı Konik, silindirsel Kurutmalık Oval Sarı-yeşil İnce Etli, Sulu 2-3 Tatlı Çok Sofralık, Şıralık Gürsöz, 1993
Çizelge 3.1 Araştırmada kullanılan Gaziantep iline ait üzüm çeşitlerine ilişkin kısa ampelografik özellikler (devam) 42 No Çeşitler Sinonimleri Salkım Şekli Tane Şekli Tane Rengi Tane Kabuğu Tane İçi 18 T Rumi Konik Yuvarlak Yeşil-sarı Kalın Dolgun etli, Çok sulu 19 T Künefi Konik, Yuvarlak Kırmızımsı Kalın Gevrek etli, Orta omuzlu sulu 20 G Çiloreş Kızlar, Kızlartahtası, Kızıltahtası, Çekirdek Sayısı Tadı Verimlilik Değerlendirme Şekli Kaynak 2-4 Tatlı Çok Sofralık, Şıralık, *T.B.A.E Kurutmalık 1-2 Tatlı Orta Sofralık Gürsöz, 1993 Gürsöz, 1993 Omuzlu konik Kısa oval Yeşil-sarı Orta kalın Etli, Sulu 2-3 Orta tatlı Çok Sofralık, Şaraplık 21 G Timbo Dallı konik Yuvarlak Kırmızı-siyah Orta kalın Yumuşak etli, Sulu 2-3 Tatlı Çok Şaraplık, Sofralık Gürsöz, 1993 22 T Öküzgözü Çavgolik Omuzlu dallı Yuvarlak Kırmızı-siyah Kalın Yumuşak etli, Çok sulu 3-4 Orta tatlı Orta Şaraplık, Sofralık Gürsöz, 1993 23 T Yediveren Ariş Omuzlu konik Yuvarlak Kırmızı-siyah Kalın Dolgun etli, Sulu 2-3 Orta tatlı Çok Sofralık, Şıralık Gürsöz, 1993 24 T Dökülgen Şirelik, Hüveydi Dallı, omuzlu konik Hafif oval Yeşil-sarı Orta kalın Dolgun etli 1-2 Tatlı Çok Sofralık, Şıralık Şaraplık, Gürsöz, 1993 25 G Kışüzümü Omuzlu konik Hafif oval Yeşil-sarı Kalınca Yumuşak etli, Orta sulu 2-3 Orta tatlı Orta Sofralık Gürsöz, 1993 26 G Bandırma Besni Basit ve kanatlı konik Palamut Yeşil-sarı Çok ince Etli, Çok sulu 1-2 Çok tatlı Az Sofralık, Kurutmalık Kısakürek, 1950 27 G Kızılbanki Kızılvanki Omuzlu, dallı Kısa oval Kırmızımsı Orta kalın Gevrek etli, Az sulu 2-3 Tatlı Çok Sofralık Gürsöz, 1993 28 G Karakurnur Talikireş, Reşki, Karakondur, Sergi karası, Yeşilsaplı, Tirireş, Çöpüyeşil Omuzlu Uzun oval, sivri iğ şekilli Kırmızı-yeşil Kalın Etli, Az sulu, Kekremsi 3-4 Tatlı Orta Kurutmalık Gürsöz, 1993 29 G Ağbanki Ağvanki Dallı konik Kısa oval Yeşil-sarı Kalın Etli, Sulu 2-3 Orta tatlı Çok Sofralık Gürsöz, 1993 30 G Timbu Karakureyş, Tirireş, Havger, Tilgören Omuzlu, dallı Yuvarlak Kırmızı-siyah Orta kalın Yumuşak etli, Çok sulu 2-3 Az tatlı Çok Şaraplık, Sofralık Gürsöz, 1993 31 G Oğlak karası Antep karası, Karalık, Çöpüyeşil Omuzlu İğde, küt iğ Kırmızı-siyah Kalın Etli, Az sulu 3-4 Kekrem-si tatlı 32 G Kirkit Kanatlı konik Elips Açık sarımtrakyeşil İnce ve sert Dolgun etli, Az sulu Orta Kurutmalık Gürsöz, 1993 2-3 Tatlı Orta Sofralık Kısakürek, 1950
Çizelge 3.1 Araştırmada kullanılan Gaziantep iline ait üzüm çeşitlerine ilişkin kısa ampelografik özellikler (devam) 43 No Çeşitler Sinonimleri Salkım Şekli Tane Şekli Tane Rengi Tane Tane İçi Çekirdek Tadı Verimlilik Değerlendirme Kaynak Kabuğu Sayısı Şekli 33 G Balüzümü Konik Uzunca yuvarlak Yeşil-sarı İnce Yumuşak etli, Sulu 2-3 Çok tatlı Orta Sofralık Gürsöz, 1993 34 G Muhammediye Omuzlu konik Yuvarlak Yeşil-sarı Orta kalın Etli, Sulu 2-3 Tatlı Çok Sofralık Gürsöz, 1993 35 G Rumi Kilisurumusu, Urumu Konik, omuzlu Uzunca yuvarlak Yeşil-sarı İnce Dolgun etli, Çok sulu 3-4 Çok tatlı Çok Sofralık, Şıralık Kurutmalık Gürsöz, 1993 36 G Sergi karası Antep karası, Karalık, Çöpü Omuzlu, konik Uzun oval, Sivri iğ şekilli Kırmızı-siyah Kalın Etli, Az sulu 3-4 Kekrem-si tatlı Orta Kurutmalık Gürsöz, 1993 yeşil 37 G Dusuzu Konik, silindirsel Uzun oval Yeşil-sarı Orta kalın Yumuşak etli, Sulu 2-3 Az tatlı Orta Şıralık Gürsöz, 1993 38 G Dımışkı Nebidede, Şami Omuzlu konik Uzun oval Yeşil-sarı Orta kalın Dolgun etli, Orta sulu 2-3 Tatlı Çok Sofralık, Kurutmalık Gürsöz, 1993 39 T Hatunparmağı Kadınparmağı, Dallı, omuzlu Uzun oval Yeşil-sarı İnce Dolgun etli, Az 2-3 Çok tatlı Çok Sofralık, Gürsöz, İnekmemesi konik sulu Kurutmalık 1993 40 T Hönüsü Dallı konik Silindirik Kırmızı Kalın Gevrek etli, Az 2-3 Tatlı Çok Sofralık *T.B.A.E sulu 41 G Külahi Muhammediye Basit ve kanatlı konik Yuvarlak Sarımtrak - yeşil Kalınca Gevrek etli, Sulu 2-3 Çok tatlı Orta Sofralık Kısakürek, 1950 42 G Pafı Konik, silindirsel Yuvarlak Yeşil-sarı Orta kalın Dolgun etli, Az sulu 2-3 Tatlı Çok Şıralık Gürsöz, 1993 43 T Dımışkı Omuzlu konik Uzun oval Yeşil-sarı Orta kalın Dolgun etli, Orta 2-3 Tatlı Çok Sofralık, *T.B.A.E sulu Kurutmalık 44 G Şekeri Omuzlu dallı Yuvarlak Yeşil-sarı Orta kalın Dolgun etli, Sulu 2-3 Çok tatlı Orta Sofralık Gürsöz, 1993 45 G Beyazsergi Kanatlı konik ve piramit İri yumurta Çok açık sarı Orta kalın Etli 2-3 Kekrem-si tatlı Çok Kurutmalık Kısakürek, 1950 46 G Kızlartahtası Omuzlu, dallı Kısa oval Yeşil-sarı Orta kalın Yumuşak etli, Orta sulu 2-3 Orta tatlı Çok Sofralık, Şaraplık Gürsöz, 1993
3.2 Yöntem Araştırmada kullanılan SSR tekniği, DNA izolasyonu, PCR uygulaması ve SSR Tekniğinin otomatik dizi analizi sistemi kullanılarak kapilar elektroforezde uygulanması ve sonuçların değerlendirilmesi şeklinde incelenmiştir. 3.2.1 DNA izolasyonu DNA izolasyonu Lefort et al. (1997) yöntemine göre yapılmıştır. Çeşitlerin genç ve yarı genç yapraklarından alınan örneklerle DNA izolasyonu gerçekleşmiştir. İzolasyonda izlenen aşamalar aşağıda belirtilmiştir. Buna göre; Genç yaprak havana konulup sıvı azotla havanda iyice ezildi, Toz haline gelen yaprak örneğinden 0,1 gr alınarak 1,5 µl ependorf tüplere aktarıldı, Üzerine 1 ml DNA ekstraksiyon tampon çözeltisi ilave edildi ve homojen hale gelinceye kadar ependorf tüpe hafifçe vurarak karışması sağlandı, 65 o C de 15 dakika sıcak suda bekletildi, Üzerine 0,5 ml kloroform/isoamil alkol (24:1) karışımı eklendi ve hafif bir şekilde iyice çalkalandı, bu arada buzda bekletildi, Oda sıcaklığında, 1 dakika 14.000 rpm hızında santrifüj edildi, Ependorf tüpün üst kısmındaki sıvı, diğer bir temiz ependorf tüpe aktarıldı, Üzerine 0,8 ml isopropanol eklendi, 15 dakika buz üzerinde tutuldu ve 1 dakika 14.000 rpm hızında santrifüj edildi, Üst sıvı tekrar diğer bir ependorf tüpe aktarıldı, 1 ml % 70 lik ethanol eklendi ve yine 1 dakika 14.000 rpm hızında santrifüj edildi, Eklenen ethanol uzaklaştırıldı ve ependorf tüpün ağzı açık bırakılarak alkolün tamamen uçması sağlandı, 44
DNA, 200-300 µl TE tampon çözeltisi (ph 8,0) içinde çözüldü, Her 100 µl için 1 µl RNase-A eklenerek, 37 o C de 15 dakika etüvde bekletildi. DNA izolasyonunda kullanılan çözeltiler aşağıda verilmiştir. Ekstraksiyon tampon çözeltisi (50 ml için); 2 ml TRIS (50 mm, ph 8,0) 4 ml EDTA (50 mm, ph 8,0) 10 ml LiCl (4M) 1 g CTAP (% 1) 2 g PVP (% 2) 0,5 ml TWEEN 20 ( % 0,5) Kloroform/isoamil alkol; (24:1) (hacim:hacim) TE çözeltisi; 10 mm TRIS-HCl ve 1 mm EDTA (ph 8,0) Rnase-A (Sigma R9009); 10 mg/ml 3.2.2 PCR uygulaması DNA çoğaltımı için Biometra Thermocycler cihazı kullanılmış ve PCR optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. PCR çoğaltma öğeleri olarak 2.5 µl DNA, 1.25 µl 10X Buffer, 1 µl MgCl 2, 2.5 µl dntp, 0.2 µl primer 1, 0.2 µl primer 2, 0.05 µl GoldTaq, 4.8 µl su olmak üzere toplam 12.5 µl PCR karışımı hazırlanmıştır (Çizelge 3.2). DNA çoğaltımı için örnekler PCR da 95 o C de 7 dakika, 94 o C de 45 saniye, primerin bağlanma derecesine bağlı olarak 50, 54 ve 55 o C de 45 saniye, 72 o C de 1 dakika 30 saniye ve son yazılım safhasında 72 o C de 7 dakika tutulmuş ve 35 döngü uygulanmıştır (Çizelge 3.3). 45
Çizelge 3.2 PCR çoğaltma öğeleri konsantrasyon ve miktarları PCR Çoğaltma öğeleri Kullanılan konsantrasyon PCR da kullanılan miktar (μl) DNA 30 ng 2,5 10XBuffer 1X 1,25 MgCl2 1.5 mm 1 dntp 25 μm 2,5 Primer 1 2.5 μm 0,2 Primer 2 2.5 μm 0,2 Taq 0.5 U 0,05 Su 4,8 Toplam 12,5 Çizelge 3.3 Primerlerin PCR daki döngü koşulları Ön denatürasyon Denatürasyon Primer bağlanma Yeni iplikçik yazılımı Son yazılım Toplam döngü sayısı 95 ºC-7 dk 94 ºC-45 sn 50 ºC-45 sn 1 72 ºC-1 dk 30 sn 72 ºC-7 dk 35 95 ºC-7 dk 94 ºC-45 sn 54 ºC-45 sn 2 72 ºC-1 dk 30 sn 72 ºC-7 dk 35 95 ºC-7 dk 94 ºC-45 sn 55 ºC-45 sn 3 72 ºC-1 dk 30 sn 72 ºC-7 dk 35 1 VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VVMD34, VrZAG62, VrZAG79. 2 VVMD25, VVMD28, VVMD31. 3 VVMD24,VVIB23, VMC3B10, VMC6F1, VMC2C3, VMC2H4, VMC5A1. Çalışmada Kullanılan SSR Primerleri Çalışmada, GENRES 081 Avrupa Birliği Araştırma Projesince, Avrupa daki asma çeşit koleksiyonları için kullanılan ve artık tüm dünya tarafından minimum standart set olarak kabul gören VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 ve VrZAG79 mikrosatelit lokusları da dahil olmak üzere toplam 17 SSR primeri (VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD24, VVMD25, VVMD27, VVMD28, VVMD31, VVMD34, VrZAG62, VrZAG79, VVIB23, VMC3B10, VMC6F1, VMC2C3, VMC2H4, VMC5A1) kullanılmıştır. Her forward primer Fam (mavi), Hex (yeşil) ve Ned (sarı) renklerde fluoresan işaretlenmiş olup primerlere ait baz dizileri Çizelge 3.4 de verilmiştir. 46
Çizelge 3.4 Kullanılan primerlere ait bilgiler Primer 5-3 Primerlere ait baz dizileri Fluoresan Boya VVS2 F 6-FAM-CAG CCC GTA AAT GTA TCC ATC Fam R AAA TTC AAA ATT CTA ATT CAA CTG G VVMD5 F HEX-CTA GAG CTA CGC CAA TCC AA Hex R TAT ACC AAA AAT CAT ATT CCT AAA VVMD7 F 6-FAM-AGA GTT GCG GAG AAC AGG AT Fam R CGA ACC TTC ACA CGC TTG AT VVMD24 F 6-FAM-GTG GAT GAT GGA GTA GTC ACG C Fam R GAT TTT AGG TTC ATG TTG GTG AAG G VVMD25 F HEX-TTC CGT TTA AGC AAA AGA AAA AGG Hex R TTG GAT TTG AAA TTT ATT GAG GGG VVMD27 F HEX-GTA CCA GAT CTG AAT ACA TCC GTA AGT Hex R ACG GGT ATA GAG CAA ACG GTG T VVMD28 F HEX-AAC AAT TCA ATG AAA AGA GAG AGA GAG A Hex R TCA TCA ATT TCG TAT CTC TAT TTG CTG VVMD31 F 6-FAM-CAG TGG TTT TTC TTA AAG TTT CAA GG Fam R CTC TGT GAA AGA GGA AGA GAC GC VVMD34 F HEX-GGT ACA TCA GTA CTT GAA ATG GTT GC Hex R TTC TCC GTA GAA GCG TAA ACA GC VrZAG62 F HEX-GGT GAA ATG GGC ACC GAA CAC ACG C Hex R CCA TGT CTC TCC TCA GCT TCT CAG C VrZAG79 F 6-FAM-AGA TTG TGG AGG AGG GAA CAA ACC G Fam R TGC CCC CAT TTT CAA ACT CCC TTC C VVIB23 F 6-FAM-GGTCACGTAGATATTGAAGTTG Fam R TTTGTATTTTGGGCATTTGCAG VMC3B10 F Hex R VMC6F1 F Fam R VMC2C3 F Ned R VMC2H4 F Fam R VMC5A1 F Ned R Referans Thomas and Scott 1993 Bowers et al. 1996 ve 1999 Sefc et al. 1999 Merdinoglu et al. 2005 Vitis Microsatellit Consortium dizileri henüz ilan edilmemiştir 3.2.3 SSR tekniğinin otomatik dizi analizi sistemi kullanılarak kapilar elektroforezde uygulanması Genotiplerin moleküler analizi, SSR tekniği ile içinde GA 3100 POP-4 (Applera firması) polimer içeren ABIPrism 3100 otomatik dizi analizi sistemi kullanılarak kapilar elektroforezle yapılmıştır. 0,4 µl PCR ürünü, 9,55 µl formamide ve 0,25 µl ROX 500 içsel DNA standardı olmak üzere toplam 10,2 µl hacim 94 C de 3 dakika denatüre edildikten sonra otomatik dizi analizi sistemine yüklenmiştir. Sonuçlar, GeneScan 3.7. 47
yazılım programında analiz edilmiş, Genotyper 3.7. programıyla görüntülenmiş ve veriler toplanmıştır. Her lokustaki allel büyüklükleri pikler halinde elde edilmiştir. 3.2.4 Sonuçların değerlendirilmesi Araştırmamızdaki 48 asma genotipinin 17 lokusla analizi sonucunda, benzerlik oranı indeksi Microsat (Minch et al. 1995) programı ile ve genetik parametreler ise (her lokusa ait allel sayısı, allel frekansı, beklenen ve gözlenen heterozigotluk oranı, ebeveynlik durumunu, sessiz (null) allel frekansını ve tespit olasılığı (PI, Probability of Identity)) IDENTITY 1.0 (Wagner and Sefc 1999) yazılım programı kullanılarak tespit edilmiştir. Genotiplere ait dendogram NTsys (versiyon 2.02g, Exeter Software, Setauket, NY) yazılım programıyla oluşturulmuş ve görüntülenmiştir. Kümeleme analizi için UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic means) yöntemi uygulanmıştır. Tüm analiz sonucunda genetik benzerlik oranı yüksek olan çeşitlerin sinonim olup olmadıklarına karar vermek için yapılan aynı genotip olma olasılığı testi (Martínez Zapater (2006) 1 ) elle hesaplanarak yapılmıştır. Bu teste göre, iki genotipin aynı olan lokuslarındaki allel frekansları çarpılır. Elde edilen değer, örneğin 1/10.000 değerinden düşük çıkarsa, genetik benzerlik oranı yüksek olan bu çeşitlere ait alleller 10.000 de 1 olasılıkla populasyondaki herhangi iki genotipte de görülebilir anlamına gelmektedir. Bu değerin düşük çıkması, populasyon içindeki herhangi iki genotipin aynı olma olasılığının da düşük olacağını ifade edeceğinden bu iki çeşit için muhtemelen aynı çeşit ifadesi kullanılabilir. 1 Martínez Zapater ile sözlü görüşme yapılmıştır 48
4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1 DNA İzolasyonu DNA izolasyonu sonucunda elde edilen DNA ların, spektrofotometrede yoğunluklarına bakılarak, her bir örnek için 30 ng olacak şekilde 100 µl hacme eklenecek olan DNA miktarı tespit edilmiştir (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1 Araştırmada kullanılan üzüm çeşitlerine ait DNA yoğunlukları, saflık dereceleri ve 100 ml sulandırılmış DNA hazırlamada kullanılan DNA miktarları (μl) Genotip no * Yoğunluk (ng/μl) Saflık dereceleri (A260/A280) 100 μl için eklenen DNA miktarı (μl) Genotip no * Yoğunluk (ng/μl) Saflık dereceleri (A260/A280) 100 μl için eklenen DNA miktarı (μl) 1 690 1.83 4.34 25 260 1.95 11.53 2 615 1.89 4.87 26 330 1.84 9.09 3 515 1.89 5.82 27 515 1.92 5.80 4 230 1.87 13.04 28 265 2.07 11.32 5 495 1.98 6.06 29 225 1.88 13.33 6 280 2.01 10.71 30 325 1.96 12.76 7 455 2.03 6.59 31 275 1.95 10.90 8 490 1.90 6.12 32 515 1.95 5.82 9 520 1.96 5.76 33 440 1.98 6.81 10 355 1.88 8.45 34 345 1.98 8.69 11 505 1.91 5.94 35 300 2.07 10.00 12 395 1.92 7.59 36 355 1.90 8.45 13 565 1.91 5.30 37 290 2.11 10.34 14 410 1.98 7.3 38 350 1.96 8.57 15 445 1.92 6.74 39 645 1.74 4.65 16 385 1.66 7.79 40 350 1.94 8.57 17 325 1.80 9.23 41 360 1.97 8.33 18 310 1.91 9.67 42 305 1.95 9.83 19 520 1.94 5.76 43 380 1.94 7.89 20 405 1.95 7.40 44 430 1.74 6.97 21 325 1.67 9.23 45 675 1.96 4.44 22 360 1.82 8.33 46 465 1.91 6.45 23 410 1.94 7.30 47 1455 2.06 2.06 24 660 1.96 4.54 48 2360 2.08 1.27 * Çeşitlerin numaralandırma sırası Çizelge 3.1 e göre yapılmıştır. 49
Bu veriler incelendiğinde DNA yoğunlukları 230 ila 2360 ng/ μl arasında değiştiği görülmüştür. En az DNA yoğunluğu 4 numaralı Çilorut çeşidinde görülürken, 2360 ng/ μl ile Merlot (referans çeşit) en fazla DNA yoğunluğuna sahip çeşit olmuştur. DNA saflığının genellikle 1.8-2.0 arasında olması istenir. 48 örnekten 1.66 (Horoz karası)- 2.11 (Dusuzu) aralığında değişen saflıklar elde edilmiştir. Denemede, saflık dereceleri iyi olmayan örnekler bulunduğundan otomatik dizi analizi sisteminde SSR analizi çok tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. 4.2 Otomatik Dizi Analizi Sisteminden Elde Edilen Allel Büyüklükleri Çalışılan lokusta parçacık çoğaltımı olup olmadığını anlamak için o lokusu temsil eden 2 veya 3 örnek rastgele seçilerek agaroz jele yüklenmiş (Şekil 4.1.), çoğaltım gerçekleşmiş ise otomatik dizi analizi sistemine örnekler yüklenmiştir. Şekil 4.1 Bazı lokuslardaki PCR ürününün agaroz jel üzerindeki görünümü ABIPrism 3100 otomatik dizi analizi sistemine, 0.4 µl PCR ürünü, 9.55 µl formamide ve 0.25 µl ROX 500 içsel DNA standardı olmak üzere toplam 10.2 µl hacim 94 C de 3 dakika denatüre edildikten sonra örnekler yüklenmiştir. Sonuçlar, GeneScan 3.7. yazılım programında analiz edilmiş, Genotyper 3.7. programıyla görüntülenmiş ve veriler toplanmıştır. Her lokustaki allel büyüklükleri pikler halinde elde edilmiştir. Şekil 4.2 de VVMD24 ve VMC2H4 SSR lokuslarına ait allel büyüklüğünü gösteren piklerden örnekler görülmektedir. Genotyper 3.7. yazılım programında pikler şeklinde 50