Ankara Ecz. Fak. Mec. J. Fac. Pharm. Ankara 8. 80 (1978) 8. 80 (1978) Türkiyede Sat ılan İlaçlardaki Antranilik Asit ve Sübstitüe Aril Asetik Asit Tiirevi Antiromatizmal Bile şikler Üzerinde Ara ştırmalar. I. Renk Reaksiyonlar ı, İnce Tabaka Kroınatografileri, RM Değerleri ve LD 50 ile RM Değerleri Aras ındaki İlişkiler. Studies on the Anthranilic Acid and Substituted Aryl Acetic Acid Derived Antirheumatoid Compounds Used in the Drugs Marketed in Turkey. I. Color Reactions, Thin Layer Chromatography, R, Values and Relations Between R M Values and LD 50's. Ningur NOYANALPAN* Okan ATAY** Seçkin ÖZDEN* Baz ı antranilik asit türevleri ile (1), baz ı sübstitüe aril asetik asit türevleri (7) antiromatizmal etkilidir. Türkiyede sat ılan antiromatizmal ilaçlar ın önemli bir k ısmını bu grup bile şikler olu şturmaktad ır. Satışa sunulan ilaçlar ın içinde antranilik asit türevi olarak Mefenamic Acid, Flufenamic Acid ba şta gelmektedir. Niflumic Acid yap ı olarak antranilik asit türevlerine benzeyen fakat benzen çekirde ği yerine piridin halkas ı içeren izomeridir. Sodium Diclofenac'da antranilik asit türevlerine yak ınlık gösterir, ancak karboksil grubu ile benzen halkas ı aras ına bir metilen grubu girmi ştir. Bu grubun giri şi nedeni ile asetik asit türevi olarak dü şünülür. Ibuprofen, Ketoprofen, Aclofenac, Fenoprofen, Naproxen, Fenopropen Calcium, Methiazinic Acid ve Sodim Diclofenac sübstitüe aril asetik asit türevi olarak s ınıfland ır ılır. Bu bile şiklerin çoğunda hem aromatik k ısım hem de asitin 2 nolu konumu sübstitüe edilmi ştir. Bu grup bile şikler diğer antiromatizmal bile şikler ile dü şünülerek bir çok analitik yöntem denenmi ştir. Nitel olarak kromatogra- Redaksiyona verildiği tarih: 12 Nisan 1978. * Farmasötik Kimya Kürsüsü, Eczac ılık Fakültesi, Ankara Üniversitesi. ** Ilaç Kontrol Şb., Refik Saydam H ıfz ısıhha Enstitüsü, Ankara.
Axil Asetik Asit Türevi Antiromatizmal Bile şikler... 81 fik çal ışmalar, (3-6,8,11) nicel olarak da baz ı titrimetrik yöntemler denenmi ştirii. Ad ı geçen bile şiklerin tümünün asit olmas ından yararlanarak alkali ile titrimetrik saptamalar yap ılmıştır. Nitel yönden iyi ayr ılmayan türevler diazometan ile metillenerek ayr ılmalar ı sağlanmıştır. Bu ilaçlardan çoğunun absorbsiyonu, distribüsyonu, metabolizasyonu ve ekskresyonu üzerine çal ışmalar yap ılmıştır. (9,10) Ancak yukarıda ad ı edilen bile şikler literatürde sistematik olarak ele al ınmamış yalnız bu grubun analizi üzerinde durulmam ışt ır. Ayr ıca bu bile şiklerin RM, P, a ve bunlara bağlı değerleri üzerinde yap ılan çalışmalar yeterli değildir. Bu nedenle yukar ıda adlar ı sayılan bütün bileşiklerin renk reaksiyonlar ı, ince tabaka kromatografileri, Rf değerleri incelenmi ştir. Daha sonra tüm bile şiklerin RM de ğerleri verilmiştir. Bu bileşiklerin log P leri üzerinde yap ılan çalışmalar baz ı ilginç sonuçlar göstermi ştir. Bu nedenle log P leri ve di ğer fiziko kimyasal parametreleri ile ilgili çal ışmalar ileride yay ınlanacakt ır. Kromatografik çal ışmalardan sonra ço ğunun RM değerleri ile LD, İ, leri korrele edilmi ştir. Bu amaçla grafikler haz ırlanıp biyolojik etkileşim yönünden birbirlerine yak ınlıklar ı bulunanlar gösterilmi ştir. MATERYAL ve YÖNTEM DENEL KISIM Bu çal ışmada kullan ılan bileşiklerin tümü önce ilaç ilkel bile şiği olarak ar ı şekilde ele al ınmış, tüm renk reaksiyonlar ı bu arı bile şiklerle incelenmi ştir. Daha sonra kromatografik çal ışmalar için yine a-,rı bileşikler kullan ılmıştır. Kromatografik denemeler bir kez de piyasada sat ılmakta olan ilaçlarla denenmi ştir. Arı bile şikle preparat aras ında separasyon ve R f değerleri yönünden herhangi bir ayr ıcal ık bulunmamıştır. Çalışmam ızda kullan ılan kimyasal bile şiklerin tümü analitik nitelikte ar ıdır. Adsorban olarak Kieselgel HF254 kullanılmıştır. Tabaka kal ınlığı 0.3 mm dir. Aktivasyon 110 C da 30 dakika süre ile yap ılmıştır. Her bile şikten 25 mg, 10 ml metanol içinde çözülrnü ş ve plak üzerine bu çözeltiden 0.01 ml konularak çal ışılmıştır. Lekeler önce ultra viyole ışığı alt ında incelenmi ş daha sonra a şağıda listesi verilen belirteçler uygulanm ıştır.
82 Ningur NOYANALPAN, Okan ATAY, Seçkin ÖZDEN Bu çal ışmada kullan ılan renk belirteçleri a şağıda gösterilmektedir. Tablo 1 de, a şağıda ta şıdıklar ı say ılar ile gösterilmi ştir. 1. Dragendorff Belirteci. 1.7 g bazik bizmut nitrat ve 20 g tartarik asitin 80 ml sudaki çözeltisi ile 16 g potasyum iyodürün 40 ml sudaki çözeltisinden e şit niceliklerde kar ıştırılıp 5 ml sini 50 ml % 20 tartarik asitli suda çözerek haz ırlanan belirteçdir. 2. İyod/ Kloroform Belirteci. Kloroform içinde % 0.5 lik iyod çözeltisidir. 3. Demir (III) Klorür Belirteci. 0.5 N HC1 içinde 6 mol sulu demir (III) klorürün % 2.5 luk çözeltisidir. 4. Sodyum Diklorofenol İndofenol'ün etanol içindeki 0.1 lik çözeltisidir. 5. Hidrojen peroksit Belirteci. Hidrojen peroksitin % 0.3 lük sulu çözeltisidir. 6. pfenilendiamin HCl Belirteci. pfenilendiamin HCI'in % 10 triklorasetik asitteki % 0.05 lik çözeltisidir. 7. Formaldehid Sülfürik Asit Belirteci. 1 ml % 37 lik formaldehid'in 50 ml konsantre sülfürik asit içindeki çözeltisidir. 8. Dimetilaminobenzaldehid HCl Belirteci. 1 g pdimetilaminobenzaldehid'in 25 ml % 36 HC1 de çöçözülerek metanolle 100 ml ye tamamlanm ış çözeltisidir. Yukar ıda verilen belirteçlerden ba şka denenen fakat iyi sonuç al ınamayan belirteçler şunlard ır: 9. 5 mol sulu bak ır sülfat' ın % 10 luk sulu çözeltisinin amonyakla 5/1 oran ında karışt ır ılıp süzülmesinden elde edilen süzüntü. 10. Glukoz Anilin Belirteci. 10 ml % 10 luk glukoz çözeltisi ile 10 ml Anilin'in etanollü çözeltisinin kar ışt ırılıp nbutanol ile 50 ml'ye tamamlanmas ıyla elde edilen çözelti.
Ani Asetik Asit Türevi Antiromatizmal Bile şikler... 83 Bu çal ışmada denenmi ş bulunan solvan sistemlerinden baz ılar ı başarıl ı olmamıştır. Ba şarılı ayırmalar sa ğlayan solvan sistemleri a şağı da gösterilmi ştir. Bunlardan ilk dördü, R M de ğerlerinin LD değerleri ile korrelasyonunu yapabilmek amac ı ile en az polardan en çok polara do ğru giden bir düzen içinde ayn ı solvan sisteminin değişimiyle haz ırlanm ıştır. Be şinci solvan sistemi bu amac ın dışında yaln ız iyi bir ay ır ım elde etmek için uygulanm ışt ır. Sistem- I. Benzen: Aseton: Metanol (55:20:10) Sistem- II. Benzen : Aseton: Metanol (55 :35 :10) Sistem- III. Benzen: Aseton: Metanol (55:35:20) Sistem- IV. Benzen: Aseton: Metanol (45:25:30) Sistem- V. Toluen: Aseton : kons. Amonyak (50:50:1) BULGULAR Bu çal ışmada denenmi ş bulunan belirteçler, solvanlar Materyal ve Yöntem'de liste şeklinde verilmi ştir. Bu belirteçler ile incelenmekte olan bile şiklerin verdikleri renkler ve floresans Tablo I de gösterilmektedir. Literatürde denenmi ş bulunan kromatografi solvanlar ı (1,3-6,9) genellikle asidik ya da alkalidir. Daha sonra R M değerleri hesaplan ıp bunlar ın LD liler ile korrelasyonu yap ılacağı için nötral solvanlarla çal ışmak tercih edilmi ştir. Ayr ıca literatürde verilen solvan sistemleri ile bu grup bile şiklerin iyi ayr ılmadığı saptanm ıştır. Bunun üzerine yap ılan çalışmalar, Metaryel ve Yöntem'de liste şeklinde verilen solvanlarm bulunmas ını sağlamışt ır. Bu solvan sistemleri ile tüm bileşikler birbirlerinden iyi bir şekilde ayrılmaktad ır. Her bir solvan sistemi için bile şiklerin ayr ı ayr ı Rf ve RM değerleri Tablo II de verilmektedir. RM değerleri ile LD de ğerleri aras ında yap ılan korrelasyon çal ışmaları Grafik I ve Grafik II de gösterilmektedir. Bu grafik çal ışmalar ına göre, Ibuprofen, Methiazinic Acid, Niflumic Acid aras ında ve Mefenamic Acid, Naproxen, Diclofenac aras ında biyolojik etkile şim yönünden bir benzerlik bulunabilir.
Tablo 1. Antranilik asit ve sübstitüe aril asit türevi antiromatizmal bile şikler için kullan ılan renk belirteçleri ile al ınan reaksiyonlar. Belirteçler Mefenarnıc Acid Flufenamic Acid Niflumic Acid Ibuprofen Ketoprofen Aclofenac Diclofenac Naproxen Fenopropen Calcium Methiazinic Acid 1 Pembe 2 Sarı Pembe 3 110 C da 15 dakika ısı 4 % 12.5 HCl püs kürtülüp 110 C da 15 dakika ısı Pembe Yeşil Yeşil Kahverengi Koyu Kırmızı Kahverengi Pembe-K ırmızı Pembe Pembe Pembe Pembe Aç ık Pembe Mor Açık Pembe Pembe Açık Mor Aç ık Mor Aç ık Mor Aç ık Mor Açık Mor Açık Mor Açık Mor Aç ık Mor Açık Mor Koyu Pembe 5 366 nm UV alt ında. 6 366 nm UV alt ında. Zayıf Floresans Zayıf Floresans Güçlü Floresans Güçlü Floresans Koyu pembe 7 110 C da 15 dak. ıs ı 8 110 C da 15 dak. ıs ı. Aç ık Mor Pembe Açık Gri Aç ık Gri Aç ık Mor Aç ık Kahverengi Aç ık Mor Koyu Pembe Açık Mor Pembe Gri Aç ık Gri Mor
Tablo 11. Antranilik asit ve sübstitüe aril asetik asit türevlerinin Rf ve RM değerleri. Bileşiğin ad ı Sistem I. Sistem II. Sistem III. Sistem IV. Sistem V. Rf RM R f RM Rf RM Rf RM Rf RM Methiazinic Acid 0.425 (0.131) 0.717 -(0.403) 0.768 -(0.519) 0.581 -(0.756) 0.360 (0.244) Flufenamic Acid 0.475 (0.043) 0.582 -(0.143) 0.662 -(0.212) 0.787 -(0.567) 0.212 (0.560) Niflumic Acid 0.450 (0.087) 0.355 (0.251) 0.433 (0.116) C.729 -(0.439) 0.133 (0.814) Ibuprofen 0.437 (0.109) C.711 -(0.390) 0.737 -(0.447) 0.367 -(0.515) 0.424 (0.132) Ketoprofen 0.400 (0.176) 0.582 -(0.143) 0.593 -(0.163) 0.619 -(0.208) 0.248 (0.481) Aclofenac 0.293 (0.382) 0.582 -(0.143) 0.525 -(0.043) 0.612 -(0.197) 0.242 (0.495) Diclofenac Na 0.525 -(0.043) 0.596 -(0.168) 0.618 -(0.209) 0.722 -(0.414) 0.206 (0.585) Naproxen 0.306 (0.355) 0.656 -(0.280) 0.668 -(0.303) 0.696 -(0.369) 0.309 (0.3 47) Fenoprofen Ca 0.393 (0.189) 0.718 -(0.405) 0.756 -(0.492) 0.787 -(0.567) 0.315 (0.337) Methiazinic Acid 0.156 (0.733) 0.521 -(0.036) 0.462 (0.065) 0.406 (0.165) 0.170 (0.688)
86 Ningur NOYANALPAN, Okan ATAY, Seçkin ÖZDEN Ibuprofen Mefenamic Naproxen L Flufenamic Diclofenac Methiazink. Nifiurnic -6-5 -4-3 -2 o.1 4. 2 Grafik 1. Sistem II ile elde edilen kromatografilr R M değerleri ve LD (Molar konsantrasyon) aras ındaki ilişkiler. SONUÇ ve TARTI ŞMA Antranilik asit ve sübstitüe aril asetik asit türevleri için yap ılmış bulunan kromatografik çal ışmalar yeterli de ğildir. Bu nedenle adı geçen türevler bu çal ışmada sistematik olarak incelenmi ştir. Ayrıca bu türevlerin renk reaksiyonlar ı ve RM değerleri incelenmi ştir. Literatürün verdi ği ince tabaka kromatografisi solvanlar ı eldeki seri bileşikler için iyi sonuç vermemi ştir. Bu nedenle yeni solvan sistemleri geli ştirilmi ş ve bu solvan sisteminin oranlar ı değiştirilerek daha sa ğ- lıklı RM değerlerinin bulunmas ına çal ışılm ışt ır. Bu bile şiklerden bir k ısmının in vivo ortamdaki absorbsiyonu, distribüsyonu, metabolizasyonu ve eliminasyonu ara şt ırılmıştır. 7'8 Fakat bu bulgular in vitro deneyler ile çak ıştırılmamışt ır. Tablo II deki solvan sistemleri soldan sa ğa doğru polariteleri yükselen bir s ırada dizilmi ştir. En solda Sistem I yer almaktad ır. Son-
Aril Asetik Asit Türevi Antiromatizmal Bile şikler... 87 Ibuprofen Mefenamic O _x ro "c3 E O 3 Flufenam ıc Naproxen Z.D ıclofenac Methiazinic Niflumic -5-4 -3-2 Rm -1 0 Grafik II. Sistem III ile elde edilen kromatografik R M değerleri ve LD 50 (Molar konsantrasyon) aras ındaki ilişkiler. ra s ıras ı ile diğerleri gelmektedir. Sistem V'e kadar R f değerlerinin ve buna bağlı olarak da RM değerlerinin düzgün bir biçimde de ğiştiği görülmektedir. Ancak Sistem V içeri ği nedeniyle korrelasyonun dışındad ır. İlaçlann RM değerleri ile biyolojik etkinliklerini gösteren parametreler aras ında korrelasyon kurmak mümkündür. Bunlar aras ında en çok kullan ılanlardan birisi de LD, dir (2). Bu çal ışmamızda antiromatizmal bile şiklerin RM değerleri ile LD leri aras ındaki korrelasyon incelenmi ştir. Bu amaçla her bile şiğin RM'si apsise, LD lerin molekül a ğırlığına bölünmesiyle elde edilen LD (Molar konsantrasyon) de ğerleri ise ordinata konulmu ştur. Be ş solvan sistemi ile ayrı ayrı grafikler çizilmi ştir. Bu grafikler aras ında en iyi korrelasyonlar ı verenler Sistem I ve Sistem III solvanlar ı ile yap ılan çal ışmalar olmuştur. Bu solvan sistemleri ile yap ılan çal ışmalar ın sonuçlar ı Grafik I ve Grafik II de verilmi ştir.
88 Ningur NOYANALPAN, Okan ATAY, Seçkin ÖZDEN Görüldüğü gibi her iki grafikte de üçlü gruplar birlikte davranmaktad ır. Bu gruplar, 1) Ibuprofen, Methiazinic Acid, Niflumic Acid, 2) Mefenamic Acid, Naproxen, Diclofenac'tan oluşmaktad ır. Bu bile şiklerin aynı doğru üzerinde yer almalar ı, aralarında bir etkile şim benzerliği ya da etkile ştikleri reseptörler yönünden bir benzerlik olduğu anlam ına gelebilir. Bu nedenle her iki gruba giren bile şiklerin etki göstermek üzere organizmadaki adsorbsiyonlar ı, distribüsyonları, diğer etkile şimleri aras ında bir bağınt ı bulunabilir. Daha önce belirtildi ği gibi, bu bile şiklerin log P leri üzerinde yap ılan çal ışmalar baz ı beklenmedik sonuçlar göstermi ştir. Bu sonuçların kesinle şmesinden sonra ilgili yay ınlar yap ılacakt ır. ÖZET Bu çalışmada, Türkiyede sat ılan antiromatizmal ilaçlar içinde bulunan antranilik asit ve sübstitüe ani asetik asit türevi bile şiklerin renk reaksiyonlar ı, ince tabaka kromatografileri, RM değerleri ve bu değerlerin LD ile olan ili şkileri incelenmi ştir. Denenmi ş bulunan renk belirteçlerinden 8 tanesi olumlu sonuç vermi ştir. Literatürün vermi ş olduğu solvan sistemleri d ışında, Benzen: Aseton: Metanol solvan sistemi de ğişik oranlarda kullan ılarak başarılı ayırmalar yap ılmıştır. Literatürde verilen solvan sistemleri genellikle asittir. Yukar ıda ad ı edilen solvan sistemi nötraldir. Bu nedenle RM değerlerinin LD ve log P ile korrelasyonunda daha başarılı sonuçlar almak mümkündür. Benzen: Aseton: Metanol solvan sisteminin polaritesi düzgün bir biçimde artt ın ıarak Rp'nin de ği şimi incelenmi ş ve RM değerleri hesaplanm ıştır. Incelenen bile şiklerden çoğunun LD leri ile RM ğerleri aras ındaki ilişkiler grafiksel olarak incelenmi ştir. Bulgulara de göre incelenen bile şiklerden Ibuprofen, Meihiazinic Acid, Niflumic Acid aras ında ve Mefenamic Acid, Naproxen, Diclofenac aras ında biyolojik etkile şim ve absorbabiliteleri yönünden benzerlik vard ır. Ilerde yap ılacak yay ınlarda diğer ayr ıntılara girilecektir.
Ani Asetik Asit Tiirevi Antiromatizmal Bilesi er... 89 SUMMARY In this research the color reactions, thin layer chromatographic separation and R M values of the derivatives of antranilic and substituted aryl acetic which are used in the antirheumatoid drugs marketed in Turkey and also the relations of these values with LD 's have been studied. Eight color reagents have been applied successfully. Using the solvent system Benzene : Aceton: Methanol which is not mentioned in the literature, successfull separations have been obtained by changing the ratio of the components. Solvent systems mentioned in the literature are generally ic but the ones giyen above are neutral. Therefore better correlations can be a ttained between R M values and LD 's, log P values. By increasing the polarity of the solvent system Benzene : Aceton: Methanol the change in 12. 1 values has been studied and R M values have been calculated. For most of the compounds the 'relations between LD,,, and R M values have been studied. According to our findings there is a similarity among Ibuprofen, Methiazinic Acid and Niflumic Acid on one part and among Mefenamic Acid, Naproxen and Diclofenac on the other from the point of biological interactions and absorbability. Other details wili be further exploited with the publications in future. LİTERATUR 1. Adams, S.S., Cobb, R., Progress in Medicinal Chemistry, 5, Edited by G.P. Ellis and G.B. West, Butterworths. London, 1967. 2. Boyce, C.B.C., Milborrow, B.V., Nature (London) 208, 537 (1965). 3. Eiden, F., Dtsch, Apotheker-Ztg., 107, 1522 (1967). 4. Grant, D.W., J. Chromatog., 10, 511 (1963). 5. Heacock, R.A., Mahon, M.E., ibid., 17, 338 (1965). 6. Kucharczyk, N., Fohl, J., Wymetal, J., ibid., 11, 55 (1963). 7. Northover, B. J., j. Pathol. Bacteriol., 85, 361 (1963). 8 Passera, C., Padrotti, A., Ferrari, G., j. Chromatog., 14, 289 (1964). 9. Rubin, A., Rodda, B.E., Warrick, P., Ridolfo, A., Gruber, C.M., J. Pharm. Sci., 60, 1797 (1971). 10. Runkel, R., Chaplin, M., Boost, G., Segre, E., Forchielli, E., ibid., 61, 703 (1972). 11. Unterhalt, B., Archiv der Pharmazie., 303, 445 (1970)