ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Şebnem PARLAK GIDA KORUYUCU MADDESİ OLAN BİFENİL İN İNSAN LENFOSİTLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ, KROMOZOM ANORMALLİĞİ VE MİKRONÜKLEUS OLUŞUMU ÜZERİNE ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2007

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA KORUYUCU MADDESİ OLAN BİFENİL İN İNSAN LENFOSİTLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ, KROMOZOM ANORMALLİĞİ VE MİKRONÜKLEUS OLUŞUMU ÜZERİNE ETKİLERİ Şebnem PARLAK YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez 11/01/2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza. İmza. İmza Doç.Dr.Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Prof.Dr.Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2006YL22 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA KORUYUCU MADDESİ OLAN BİFENİL İN İNSAN LENFOSİTLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ, KROMOZOM ANORMALLİĞİ VE MİKRONÜKLEUS OLUŞUMU ÜZERİNE ETKİLERİ Şebnem PARLAK ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI İkinci Danışman : Doç. Dr. Hasan Basri İLA Yıl : 2007, Sayfa: 72 Jüri : Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Bu çalışmanın amacı, besinlerde antimikrobiyal madde olarak kullanılan Bifenil in genotoksik etkisinin olup olmadığını insan periferal lenfositlerinde kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozom anormalliği (KA) ve mikronükleus (MN) testleri ile araştırmaktır. Bu amaçla insan periferal lenfositleri bifenil in 4 farklı konsantrasyonu (10, 30, 50 ve 70 µg/ml) ile 24 ve 48 saat boyunca muamele edilmişlerdir. Bu çalışmada farklı konsantrasyonlardaki bifenil ile 24 ve 48 saatlik sürelerde muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD, KA ve MN sayısı hem muamelesiz kontrole hem de çözücü kontrole (DMSO) göre istatistiksel olarak önemli derecede artmıştır. Bu artışın genellikle doza bağlı olduğu görülmüştür. Ancak bu artışlar pozitif kontrol olan MMC deki kadar olmamıştır. Bifenil, sadece kromozom yapı anormalliğini artırmış, kromozom sayı anormalliğini ise artırmamıştır. Bu çalışmada bifenil, hem 24 saatlik hem de 48 saatlik muamele sürelerinde replikasyon indeksi (RI) ve nükleer bölünme indeksi (NBI) ni her iki kontroldekine göre önemli ölçüde düşürmüş ve bu düşüş doza bağlı olarak gerçekleşmiştir. Fakat bifenil mitotik indeks (MI) i etkilememiştir. Anahtar Kelimeler:Bifenil, İnsan periferal lenfositleri, Kardeş kromatid değişimi, Kromozom anormallikleri, Mikronükleus I

ABSTRACT MSc THESIS THE EFFECTS OF FOOD PROTECTOR BIPHENYL ON SISTER CHROMATID EXCHANGE, CHROMOSOME ABERRATION AND MICRONUCLEUS IN HUMAN LYMPHOCYTES Şebnem PARLAK DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Co Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Hasan Basri İLA Year : 2007, Pages: 72 Jury : Assoc. Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU The aim of this study was to determine the possible genotoxic effects of biphenyl, which is used as an antimicrobial agent in food, by using sister chromatid exchanges (SCEs), chromosome aberrations (CAs) and micronucleus (MN) tests in human peripheral lymphocytes. The human peripheral lymphocytes were treated with four concentrations of biphenyl (10, 30, 50 ve 70 µg/ml) for 24 and 48 hours treatment periods. In the present study, biphenyl significantly increased the frequency of SCEs, CAs and the frequency of MN when compared with both untreated control and solvent (DMSO) control. The induction of these abnormalities were in a dosedependent manner. However, the potency of biphenyl on induction of SCEs, CAs and MN were lower than that caused by the positive control MMC. Biphenyl was capable to induce the structural CAs instead of numerical CAs. Biphenyl also showed a cytotoxic effect by decreasing the replication index (RI) and nuclear division index (NDI) in a dose dependent manner for both 24 and 48 hours treatment periods. However, biphenyl did not affect the mitotic index (MI). Key Words: Biphenyl, Human peripheral lymphocytes, Sister chromatid exchange, Chromosome aberration, Micronucleus II

TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve bütün çalışmalarım boyunca bana rehber olan, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, öğrencisi olmaktan onur ve mutluluk duyduğum Sayın Hocam Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI na sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Yardımlarından dolayı Biyoloji Bölüm Başkanı Sayın Hocam Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a ve ikinci danışmanım Doç. Dr. Hasan Basri İLA ya, Arş.Grv. Ayşe YAVUZ, Biyolog Ümit ZAN ve Biyolog Semir CANIMOĞLU na teşekkür ederim. Ayrıca bütün çalışmalarım boyunca desteğini ve yardımlarını hiç esirgemeyen değerli arkadaşım Uzman Biyolog Sebile AZIRAK a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Evlatları olmaktan büyük gurur ve mutluluk duyduğum sevgili annem ve babama, yüksek lisans eğitimim süresince destek ve yardımlarını devamlı üzerimde hissettiğim sevgili ablam ve enişteme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Projemizi maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Araştırma Fonu yöneticilerine de teşekkür ederim. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ. I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR. III İÇİNDEKİLER. IV ÇİZELGELER DİZİNİ..VIII ŞEKİLLER DİZİNİ. IX SİMGELER VE KISALTMALAR.. XII 1.GİRİŞ 1 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR.. 7 2.1. Benzoik Asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 7 2.2. Bifenil, sodyum-ortofenil-fenol ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 7 2.3. Borik asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 8 2.4. Lisozim ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 9 2.5. Nisin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 9 2.6. Propiyonik asit [(2-hydroxy-(1-N-nitrosoindole)] ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 9 2.7. Sodyum benzoat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 10 2.8. Sodyum nitrit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 11 2.9. Sorbatlar ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 12 2.9.1. Sorbik asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 12 2.9.2. Kalsiyum sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 13 2.9.3. Potasyum sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 13 2.9.4. Sodyum sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 14 2.10. Sulfitler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 14 2.11. Tiabendazol ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları... 15 3. MATERYAL VE METOD 17 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları.. 17 IV

3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler.. 17 3.1.1.1. Bifenil... 17 3.1.1.2. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)... 18 3.1.1.3. Kromozom Medyumu... 18 3.1.1.4. Kolşisin (Kolkisin).... 19 3.1.1.5. Hipotonik Eriyik 19 3.1.1.6. Fiksatif.. 19 3.1.1.7. 5 -Bromo-2 -deoxyuridine (BrdUrd). 20 3.1.1.8. Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer).. 20 3.1.1.9. Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği 20 3.1.1.10. Giemsa.. 21 3.1.1.11. Entellan 21 3.1.1.12. Nitrik Asit (HNO 3 ). 21 3.1.1.13. Mitomycin C (MMC).. 21 3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları.. 22 3.1.2.1. Hassas Terazi. 22 3.1.2.2. Santrifüj. 22 3.1.2.3. Mikroskop. 22 3.1.2.4. İnkübatör... 22 3.1.2.5. ph Metre 22 3.2. Lamların Temizlenmesi... 23 3.3. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) (Sister Chromatid Exchange= SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosomal Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler... 23 3.3.1. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması.. 23 3.3.2. Preparatların Boyanması. 25 V

3.3.3. Mikroskobik İnceleme 26 3.3.3.1. KKD ve Replikasyon İndeksinin (RI) (Proliferasyon İndeksi=PI) Saptanması.. 26 3.3.3.1.(1). KKD Sayısının Saptanması... 26 3.3.3.1.(2). Replikasyon İndeksinin (RI) (Proliferasyon İndeksi=PI) Saptanması. 27 3.3.3.2. Kromozomal Anormallikler (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması.. 32 3.3.3.2.(1). Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması. 32 3.3.3.2.(2). Mitotik İndeksin (MI) Saptanması 33 3.4.. Mikronukleus (MN) Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler 33 3.4.1. Mikronukleus Sayısını Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması. 33 3.4.2. Preparatların Boyanması. 35 3.4.3. Mikroskobik İnceleme 35 3.5. Mikroskopta Fotoğraf Çekme. 36 3.6. İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi. 37 4.BULGULAR 38 4.1. Bifenil in KKD Üzerindeki Etkileri... 38 4.2. Bifenil in Kromozomal Anormalliklerin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri 40 4.3. Bifenil in Mikronükleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkileri.. 46 4.4. Bifenil in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri... 51 VI

5. TARTIŞMA. 55 5.1. Bifenil in KKD, KA ve MN Oluşumu Üzerindeki Etkileri... 55 5.2. Bifenil in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri. 58 6. SONUÇ VE ÖNERİLER.. 60 KAYNAKLAR 61 ÖZGEÇMİŞ. 72 VII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde ortalama KKD sayısı.. 38 Çizelge.4.2. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde yapısal kromozom anormallikleri 41 Çizelge 4.3. Değişik dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde mikronükleuslu binükleer hücre yüzdesi ve nükleer bölünme indeksi... 47 Çizelge 4.4. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde RI ve MI.. 52 VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Kardeş kromatid değişiminin olduğu ve olmadığı durumun şematik olarak gösterilmesi... 27 Şekil 3.2. Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin (du) in kimyasal yapıları 28 Şekil 3.3. BrdUrd in DNA yapısına girmesi ile 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin ayırt edilmesinin şematik olarak açıklanması. 30 Şekil 3.4. Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000 31 Şekil 3.5. İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000 31 Şekil 3.6. Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000 32 Şekil 3.7. Bir, iki, üç ve dört nükleus içeren hücreler... 36 Şekil 4.1. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre.... 39 Şekil 4.2. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre nin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05)... 39 Şekil 4.3. Farklı dozlarda bifenil ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre nin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05). 40 Şekil 4.4. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde 11 KKD içeren hücre (30 µg/ml, 48 saat, ). x1000. 40 Şekil 4.5. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde yapısal KA yüzdesi.. 42 Şekil 4.6. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde yapısal KA yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05) 42 Şekil 4.7. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid kırığı (50 µg/ml, 24 saat, ).x1000. 43 Şekil 4.8. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromozom kırığı (30 µg/ml, 24 saat, ).x1000.. 44 IX

Şekil 4.9. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kardeş kromatid birleşmesi ve kromatid kırığı (70 µg/ml, 24 saat, ).x1000. 44 Şekil 4.10. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid değişimi (30 µg/ml, 24 saat, ).x1000.. 45 Şekil 4.11. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde poliploid hücre (30 µg/ml, 48 saat, ). x1000.. 45 Şekil 4.12. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronükleuslu iki nükleuslu hücre yüzdesi.. 48 Şekil 4.13. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronükleuslu iki nükleuslu hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05) 48 Şekil 4.14. Farklı dozlarda bifenil ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde iki nükleuslu hücre başına düşen MN sayısının doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05). 49 Şekil 4.15. Bifenil ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde tek mikronükleus içeren iki nükleuslu hücre (30 µg/ml, 48 saat, ) 49 Şekil 4.16. Bifenil ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde iki mikronükleus içeren iki nükleuslu hücre (10 µg/ml, 48 saat, ). 50 Şekil 4.17. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde nükleer bölünme indeksi 51 Şekil 4.18. Farklı dozlarda bifenil ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde nükleer bölünme indeksinin doza bağlı düşüşünü gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).. 51 Şekil 4.19. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde RI. 53 X

Şekil 4.20. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MI.. 53 Şekil 4.21. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MI in doza bağlı düşüşünü gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).. 54 Şekil 4.22. Farklı dozlarda bifenil ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MI in doza bağlı düşüşünü gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05) 54 XI

SİMGELER VE KISALTMALAR ADI: Günlük Kullanılabilir Miktar (Acceptable Daily Intake) B : Kromatid Tipi Kırık B : Kromozom Tipi Kırık BrdUrd: 5 -Bromo-2 -Deoxyuridine CA: Chromosome Aberration CHO: Çin Hamster Ovaryum CHL: Çin Hamster Lenfosit DS: Disentrik Kromozom dt: Deoxytimidin du: Deoxyuridine DNA: Deoksiribonukleik Asit i.p.: İntraperitonal KA: Kromozomal Anormallikler KCl: Potasyum klorür KD: Kromatid Değişimi KKD: Kardeş Kromatid Değişimi MMC: Mitomycin C MI: Mitotik indeks NaCl: Sodyum klorür P: Poliploidi RI: Replikasyon indeksi rpm: Round (Rotor) Per Minute (devir/dakika) SCD: Kardeş kromatidlerin farklı boyanması SCE: Sister Chromatid Exchange SSC: Standart Saline Citrate SU: Sister Union UV: Ultraviole (Morötesi) WHO: Dünya Sağlık Teşkilatı (World Health Organisation) FAO: Gıda Tarım Örgütü (Food and Agriculture Organisation) XII

1. GİRİŞ Şebnem PARLAK 1.GİRİŞ Tüketime sunulan veya sunulacak olan gıdaların görünüm ve lezzetlerini tüketicinin arzu ettiği duruma getirmek, bozulmalarını önleyerek, gıdaların raf ömrünü uzatmak amacıyla, tüketime sunulmadan önce bilinçli ve amaçlı olarak gıdalara ilave edilen maddelere gıda katkı maddeleri denilmektedir. Gıda katkı maddeleri, gıdalarda mikrobiyolojik bozulmayı önleme ve dayanıklılığı arttırma, besleyici değeri koruma, teknolojik işlemlere yardımcı olma, renk, görünüş, lezzet, koku gibi duyusal özellikleri düzeltme gibi pek çok amaçla katılan maddelerdir (Altuğ, 1999). Gıda katkı maddelerinin kullanılması ile ilgili tarihsel gelişmeler incelendiğinde, M.Ö. 3000 yıllarında et ürünlerini kürlemede tuzdan yararlanıldığı, M.Ö. 900 yıllarında ise tuz ve odun tütsüsünün gıda saklama yöntemleri olarak kullanıldıkları görülmektedir. Ortaçağlarda etlere koruyucu amaçla tuz ve tütsünün yanı sıra katılan nitratın etin rengini olumlu yönde değiştirmek ve bozulmayı önlemek amacıyla kullanıldığı bilinmektedir. M.Ö. 50 li yıllarda baharatlardan lezzet verici olarak yararlanılmış, gıda boyaları ise günümüzden yaklaşık 3500 yıl kadar önce Mısırlılar tarafından renklendirici amaçla kullanılmışlardır. 19. yüzyıldaki hızlı şehirleşmenin paralelinde katkı maddelerinin kullanımları, özellikle gıdaları bozulmalara karşı koruma amacıyla yaygınlaşmış olup günümüzde ise bu maddeler gelişen gıda teknolojisinin vazgeçilmez bir parçasını oluşturmuşlardır ( Altuğ, 1999). Belirli görevleri olan çok çeşitli gıda katkı maddeleri [renklendiriciler, antimikrobiyal maddeler, tatlandırıcılar, emülsifiyerler (yağlarla suyun karışımını sağlayan maddeler), enzimler, ph yı kontrol eden maddeler, koku vericiler gibi] vardır. İnsanların toplu halde yaşamaya başlamaları ile birlikte gıdaların korunması amacıyla güvenilir yöntemlerin kullanılması gereksinimi ortaya çıkmıştır. Tarımsal uygulamalardaki değişiklikler, dayanıksız gıdaların diyette fazlaca yer alması, gelişmiş dağıtım sistemlerindeki kontaminasyon olasılığının artması, kolay ve pratik gıdalara yönelme gibi nedenler gıdaları koruma tekniklerinin gelişmesini zorunlu kılmıştır. Endüstride kullanılan koruma yöntemlerinin başlıcaları ısıtma, dondurma, 1

1. GİRİŞ Şebnem PARLAK kurutma ve ışınlamadır. Ancak bunların uygulanamadığı ya da yetersiz kaldığı durumlarda gıdalara koruyucu madde katılımı söz konusu olmaktadır. Koruyucu maddeler, gıdayı mikroorganizmaların sebep olduğu bozulmalara karşı koruyarak, gıdanın raf ömrünü uzatan kimyasal maddeler olarak tanımlanmaktadır. Tuz, şeker ve sirke yüzyıllar boyunca gıdalardaki mikrobiyal bozulmaları önlemek amacıyla kullanılan maddeler olmakla birlikte, günümüzde katkı maddesi olarak nitelendirilmemektedirler. Koruyucuların antimikrobiyal özellikleri; maddenin antimikrobiyal spektrumu, kimyasal ve fiziksel özellikleri, konsantrasyonu, etki şekli, gıdanın bileşimi, işlem şartları, ph sı ve depolama sıcaklığı gibi faktörlere bağlıdır. Kimyasal koruyucular mikroorganizmaları birçok mekanizma ile etkilemektedir. Bunlar; proteinlerin denatürasyonu, enzimlerin inhibisyonu, DNA nın, hücre çeperinin ya da sitoplazmik membranın tahrip edilmesi veya değiştirilmesi, hücre duvarı sentezinin baskılanması ya da esansiyel metabolitlerle rekabet şeklinde olabilmektedir. Koruyucular meyve-sebze ürünlerinde, et ve et ürünlerinde, su ürünlerinde, süt ürünlerinde, margarinlerde, hububat ürünlerinde ve alkollü içecekler gibi pek çok alanda kullanılmaktadır. Bu alanlardan meyve sebze teknolojisi, reçel ve marmelat üretiminden kurutulmuş meyve sebze üretimine uzanan geniş bir uygulama alanını kapsamakta olup, kullanılan koruyucular da geniş spektrum göstermektedirler. Taze meyvelerin korunmasında kullanılan fungisitler, meyvelerin çürümesini engellemek amacıyla, genellikle ambalaj materyallerine uygulanarak kullanılmaktadır. Son 30 yıldır gelişmiş ülkeler başta olmak üzere, yiyecek maddelerinde kullanılan katkı maddelerinde tam bir patlama olmuştur. Örneğin sadece İngiltere'de bir yıl içinde kullanılan katkı maddelerinin iki yüz bin tonu geçtiği sanılıyor. Çoğu aroma/lezzetlendirici olmak üzere toplam altı bin civarında katkı maddesi bulunuyor. Bu maddelerin tüketimi arttıkça, bazı rahatsızlıklarla olan bağlantılara yönelik bulgular da ortaya çıkmıştır. Bunların içinde en sıkça görünenleri egzema, astım, baş ağrısı, alerjik kaşıntılar, gastrik rahatsızlıklar, ishal (özellikle çocuklarda), hiperaktiflik ve aşırı duyarlılık vb. Gıda katkı maddelerinin bu muhtemel etkileri yanında çok ciddi olan ve gelecek nesillerin sağlıksız olmasına sebep olabilecek diğer bir tehlike de mutasyon veya kanser oluşturma riskleridir. 2

1. GİRİŞ Şebnem PARLAK Günümüzde birçok gıda katkı maddesinin çeşitli test sistemleriyle mutajen oldukları hatta bazılarının kanser oluşumuna da sebep oldukları bildirilmiştir (Abe ve Sasaki, 1977; Wolff ve Rodin, 1978; Leonard ve Leonard, 1979; Rao ve ark., 1979; Suzuki ve Suzuki, 1988; Munzer ve ark., 1990; Akın ve Sümer, 1991; Chlopkiewicz ve ark., 1995; Matsui ve ark., 1996; Mukherjee ve Chakrabarti, 1997; Rencüzoğulları ve ark., 2001a; Rencüzoğulları ve ark., 2001b; Sasaki ve ark., 2002). Bu gıda katkı maddelerin pek çok amaçla kullanılmalarının yanında, bunların insan genomunda mutasyonlara sebep olup olmadıklarının ortaya çıkarılması da son derece önemlidir. Bir kimyasal maddenin böyle bir etkisinin olup olmadığının belirlenmesi, kısa süreli genotoksisite testleri ile mümkün olabilmektedir. Bugün kısa süreli genotoksisite testleri olarak bilinen ve bir kimyasal maddenin genotoksik olup olmadığının belirlenmesinde kullanılan metodlar; kardeş kromatid değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE), kromozom aberasyonu (KA) (Chromosome Aberration=CA) ve mikronükleus (MN) testleridir. Perry ve Evans (1975) in bilinen mutajen ve kanserojenlerin Chinese hamster (Cricetulus griseus = Çin kemiricisi) yumurta (CHO) hücrelerinde KKD ve KA yı uyardığını saptamalarından sonra bu testler mutajen ve kanserojenlerin belirlenmesinde kullanılmaya başlanmıştır. Daha sonra Carrano ve ark. (1978) mutajen ve kanserojenlerin toksik dozlarının altında meydana getirdikleri genetik hasarın süratle gösterilmesinin KKD ve KA analizleri ile mümkün olabileceğini, ayrıca bir maddenin mutasyon meydana getirmesi ile KKD oluşumunu artırması arasında doğrusal bir ilişkinin olduğunu da belirtmişlerdir. Kısa süreli genotoksisite testleri kullanılarak antimikrobiyal olarak kullanılan maddelerin genotoksik etkilerinin olup olmadığını ortaya çıkarmaya çalışan pek çok bilimsel çalışma mevcuttur. Abe ve Sasaki (1977), Potasyum ve sodyum sorbat ın Chinese hamster hücrelerinde yüksek konsantrasyonlarda KA ve KKD ni artırdığını saptamışlardır. Tohda ve ark. (1980), Benzoik asitin insan lenfoblastoid hücrelerinde sitotoksik etkiye sahip olduğunu saptamışlardır. Hasegawa ve ark. (1984), Sorbik asit ve onların sodyum ve potasyum tuzlarının kültür edilmiş Chinese hamster V79 hücrelerinde kardeş kromatid değişimini, kromozom anormalliğini ve gen mutasyonlarını arttırdığını bulmuşlardır. Munzer ve ark. (1990), Potasyum sorbat ve 3

1. GİRİŞ Şebnem PARLAK sodyum sorbat ın genotoksisitesini Ames testi, Chinese hamster ovaryum hücrelerinde HGPRT (hipoksantin guanin fosforibozil transferaz) ve sıçanlarda kardeş kromatid değişim testi ve Chinese hamster kemik iliği hücrelerinde mikronükleus testlerini kullanarak araştırmışlardır. Her iki kimyasal maddenin in vitro testlerde bir genotoksisite göstermediğini, in vivo testlerde ise bu maddelerin taze hazırlanmış eriyiklerinin hiçbir klastojenik etki göstermemesine rağmen, bekletilmiş eriyiklerde böyle bir etkiye sahip olduklarını göstermişlerdir. Ishidate ve Odashima (1977), kültür edilmiş Chinese hamster hücrelerinde içinde gıda katkı maddelerinin de bulunduğu 134 çeşit kimyasal maddenin genotoksik etkisini araştırmış ve bunlardan potasyum benzoat ve sodyum bezoat ın kromozom aberasyonu testinde pozitif sonuç verdiğini bulmuşlardır. Schlatter ve ark. (1992), Potasyum sorbat ın 2.5 mg/ml dozda Chinese hamster V79 hücrelerinde mitotik indeksi (MI) düşürdüğünü saptamışlardır. Ishidate ve Odashima (1977), sodyum nitrit ve sodyum nitrat ın Chinese hamster fibroblast hücrelerinde kromozom testinde pozitif sonuç verdiğini saptamışlardır. Meng ve Zhang (1992), sodyum metabisülfit in insan lenfosit hücrelerinde KA, KKD ve mikronükleus oluşumunu artırdığını bulmuşlardır. Mukherjee ve ark. (1988), sorbik asitin ve sodyum nitritin, fare kemik iliği hücrelerinde tek başlarına ve birbirleriyle karışım halindeyken etkilerini araştırmışlar ve sorbik asitin yüksek dozlarda KKD ni ve mikronükleusu artırdığını, sodyum nitritin ise tüm dozlarda KKD ni artırdığını, bu maddeler karışım halinde verildiğinde ise KKD nin ayrı ayrı verildiklerinden iki kat fazla olduğunu saptamışlardır. Ferrand ve ark. (2000a), sorbik asitin ve potasyum sorbat ın HeLa hücreleri ve plazmid DNA larında mutajenik ve genotoksik etkisinin olmadığını bulmuşlardır. Rencüzoğulları ve ark. (2001a) ve (2001b), sodyum metabisülfit in Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde mitotik anormallikleri artırdığını ve MI i düşürdüğünü, insan lenfosit hücrelerinde KA ve KKD ni artırdığını, Replikasyon indeksini (RI) ve MI i düşürdüğünü saptamışlardır. Şu anda piyasada satılan gıda katkı maddelerinde antimikrobiyal amaçlı olarak kullanılan maddelerden biri de bifenil dir. Bifenil, çok çabuk buharlaşabilen ve bu nedenle etkisi azalan bir madde olup, ambalaja, kağıt ve kartonların her m 2 yüzeyinde 1-5 g bifenil olacak şekilde uygulanmaktadır. Bifenil bir aromatik 4

1. GİRİŞ Şebnem PARLAK hidrokarbondur ve çeşitli gıda maddelerinde koruyucu olarak kullanılmaktadır. En çok taze meyve ve sebzelerde, özellikle turunçgillerin yüzey uygulamalarında koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Ayrıca antifungal etkiye sahip olup, fungisit olarak veya böceklere karşı kullanılan (pestisit olarak) bir bileşiktir. Bazı ülkelerde kullanımı yasaklanmıştır. Bifenil, daha çok narenciyelerin yüzey uygulamalarında koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Sasaki ve ark. (2002), erkek farelerde ağız yoluyla bir defada 2000 mg/kg bifenil verildiğinde gastrointestinal organlardaki DNA da hasar meydana gelmesini uyardığını bulmuşlardır. Bifenil in farenin çeşitli organlarında alkalin tek hücre jel elektroforez analizleriyle (SCG) (Comet testi) in vivo genotoksik etkisi araştırılmıştır (Sasaki ve ark. 1997). Bu deneylerde farenin mide, karaciğer, böbrek, mesane, akciğer, beyin ve kemik iliği ile çalışılmıştır. Sonuçta bifenil (2000 mg/kg), çalışılan birçok organda DNA zararlarını indüklemiştir. Ayrıca bifenil in 7 farklı türevinin karşılaştırmalı mutajenik aktivitesi araştırılmıştır (Abilev ve ark. 1993). Bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium un TA1537, TA97, TA1538, TA98 suşunda çerçeve kayması mutasyonlarını indüklediği gösterilmiştir. Bunun dışında bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium (TA98 ve TA100) ve Çin sıçanlarının V79 hücrelerinde mutajenik etkileri araştırılmıştır (Glatt ve ark. 1992). Bazı bifenil bileşikleri (Polybrominated biphenyls) in vitro mutajenite denemelerde negatif sonuç verirken, bazıları da (3-Fluorobiphenyl) Salmonella typhimurium TA100 suşunda kuvvetli mutajenik etki göstermiştir. Yukarıdaki çalışmalardan da görüldüğü gibi bifenil in insan lenfositlerinde in vitro genotoksik etkisiyle ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Bir kimyasal maddenin mutajenik ya da kanserojenik etkiye sahip olup olmadığının belirlenebilmesi için kısa süreli mutajenite ve kanserojenite testlerinden oluşan bir test grubu ile kimyasalın test edilmesi ve ona göre karar verilmesi gerekmektedir. İşte bu çalışmanın amacı, gıda koruyucu maddesi olarak kullanılan bifenil in insan periferal lenfositlerinde genotoksik etkiye sahip olup olmadığını kromozom aberasyonu (KA), kardeş kromatid değişimi (KKD = SCE) ve mikronükleus (MN) 5

1. GİRİŞ Şebnem PARLAK testleri ile araştırmak ve bu testler yardımı ile insanlar için herhangi bir genotoksik risk oluşturup oluşturmadığını saptamaktır. 6

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bu araştırma ile ilgili olarak, bazı gıda koruyucu maddeler ile yapılan genotoksisite çalışmaları aşağıdaki gibi özetlenebilir. 2.1. Benzoik Asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Ham karanfil, kuru erik, tarçın ve yoğurt gibi bazı gıdalarda doğal olarak da bulunan benzoik asit (C 6 H 5 COOH) genellikle sodyum tuzu formunda, gıdalarda koruyucu katkı maddesi olarak uzun süreden beri kullanılmaktadır. Tohda ve ark. (1980), benzoik asitin sitotoksik etkisini araştırmış, insan lymphoblastoid hücrelerinde 30 mmol/litre konsantrasyonda sitotoksik etkiye sahip olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca Zeiger ve ark. (1988), Salmonella typhimurium un, TA97, TA98, TA100, TA1535 ve TA1537 suşlarında benzoik asitin 5000 µg/petri üzerinde sitotoksik etkisi olduğunu saptamışlardır. Nair (2001), benzoik asit, benzil alkol ve sodyum benzoat ile yaptığı sıçan ve fare çalışmalarında, benzoik asit in bazı sıçanlarda kusurlu oluşumlara neden olduğu, sodyum benzoat a maruz bırakılan fare ve sıçan çalışmalarında üreme ve gelişme üzerine toksik etki yaratmadığı, aynı biçimde benzoik asit in iki sıçan çalışmasında da negatif sonuç verdiğini saptamıştır. Sonuç olarak genotoksisite çalışmalarının büyük bir çoğunluğu ile kanserojenite çalışmaları negatif sonuç vermiştir. 2.2. Bifenil, Sodyum-ortofenil-fenol ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Bifenil (C 6 H 5 C 6 H 5 ) ve sodyum-ortofenil-fenol (C 6 H 5 C 6 H 4 ONa) daha çok narenciyelerin yüzey uygulamalarında veya ambalaj kağıtlarına emdirilerek kullanılan koruyucu katkı maddesidir. Glatt ve ark. (1992), bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium (TA98 ve TA100) ve Çin sıçanlarının V79 hücrelerinde mutajenik etkilerini araştırmışlardır. Bu araştırmalar sonucunda, bazı bifenil bileşikleri (Polybrominated biphenyls) in vitro mutajenite denemelerinde negatif sonuç verirken, bazıları da (3-7

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK Fluorobiphenyl) Salmonella typhimurium TA100 suşunda kuvvetli mutajenik etki göstermiştir. Abilev ve ark. (1993), bifenil in 7 farklı türevinin karşılaştırmalı mutajenik aktivitesini araştırmışlar ve bu amaçla Salmonella typhimurium ile çalışmışlardır. Bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium un TA1537, TA97, TA1538, TA98 suşlarında çerçeve kayması mutasyonlarını indüklediğini göstermişlerdir. Sasaki ve ark. (1997), birçok yaştaki farenin çeşitli organlarında, alkalin tek hücre jel elektroforez analizlerini (SCG) (Comet testi) kullanarak, bifenil in in vivo genotoksik etkisini araştırmışlar ve bu deneyler için farelerin mide, karaciğer, böbrek, mesane, akciğer, beyin ve kemik ilikleri ile çalışmışlardır. Bu analizler sonucunda bifenil (2000 mg/kg), çalışılan birçok organda DNA zararlarını indüklemiştir. Sasaki ve ark. (2002), erkek farelere ağız yoluyla bir defada 2000 mg/kg bifenil verildiğinde gastrointestinal organlardaki DNA da hasar meydana gelmesini uyardığını saptamışlardır. 2.3. Borik Asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Antimikrobiyal amaçla kullanılan gıda katkı maddelerinden biri de borik asittir (H 3 BO 3 ). Borik asit, et, havyar ve balık konservelerinin sterilizasyonu gibi amaçlarla kullanılır. Ayrıca, turunçgillerin işlenmesinde de kullanılmaktadır. Buna göre meyveler % 5-8 düzeyinde boraks içeren çözeltiyle yıkanarak küf mantarlarının zararları önlenmektedir. Borik asit in Salmonella/mikrosom testinde mutajen olmadığı, Chinese hamster yumurta hücrelerinde KA ve KKD ni indüklemediği saptanmıştır (National Toxicology Program, 1987). Mc Gregor ve ark. (1988), borik asit in çalışılan tüm konsantrasyonlarında, in vitro fare lenfotik hücrelerde kromozomal anormalliklere sebep olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca, borik asit varlığında nötronların mutajenik etkilerinin daha fazla olduğu bulunmuştur (Nakano ve ark., 1995; Poller ve ark., 1996; Kinashi ve ark., 1997). Hubbard (1998), borik asit in yüksek dozlarının fertiliteyi olumsuz etkilediğini saptamıştır. Odunola (1997), borik asit in E. coli PQ37 de B-galaktisidaz sentezini S9 varlığında ve yokluğunda artırdığını bulmuştur. Dönbak ve ark. (2002), borik asit in Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde mitotik 8

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK indeks i (MI) düşürdüğünü ve birçok mitotik anormalliğe sebep olduğunu bulmuşlardır. Arslan (2004) borik asit in insan periferal lenfositlerinde KA ve KKD oluşumunu indüklediğini, ayrıca sitotoksik etkiye de sebep olduğunu bildirmiştir. 2.4. Lisozim ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Lisozim (N-asetil heksozaminidaz), İtalyan, Edam ve Gouda peynirleri gibi sert peynirlerin üretiminde Clostridium tyrobutricum un neden olduğu gaz çıkışını engellemek için kullanılmaktadır. Japon firmaları lisozimi koruyucu olarak istiridye, karides gibi deniz ürünlerinde, ayrıca suşi, sake, patates salatası ve kremalarda kullanmaktadırlar. Nagao ve ark. (1977), lisozimin Salmonella typhimurium TA98 ve TA100 suşlarında mutajen olduğunu bulmuşlardır. 2.5. Nisin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Gıdalarda antimikrobiyal koruyucu olarak kullanılan kimyasallardan diğer bir grup da antibiyotiklerdir. Gıdalarda antibiyotik olarak kullanılan maddelerden biri de nisin dir. Nisin irmik, puding, krema ve peynirlerde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Ayrıca nisin, vücuda alındıktan sonra hızlı bir şekilde sindirim enzimleri tarafından bağırsakta inaktive edilmektedir. Murinda ve ark. (2003), nisin in Simian virus 40 ile enfekte olmuş insanların kalın bağırsağında ve Vero maymun böbreklerinde toksik olduğunu saptamışlardır. 2.6. Propiyonik Asit [(2-hydroxy-(1-N-nitrosoindole)] ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Propiyonik asit (C 2 H 5 COOH) ambalajlanmış dilimli ekmeklerde koruyucu katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Ayrıca İsviçre peynirinde %1 e kadar çıkabilen oranlarda doğal olarak bulunmakta olup, memeli vücudunda diğer yağ asitleri gibi metabolize edilmektedir. 9

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK Basler ve ark. (1987), propiyonik asitin genotoksik etkiye sahip olup olmadığını araştırmışlar, bunun için de E.coli DNA tamir mekanizması, SOS kromotest, Salmonella/mikrozom testi, KKD ve in vivo mikronükleus testlerini uygulamışlardır. Bu testler sonucunda, DNA tamir mekanizması dışındaki testlerin negatif sonuç verdiğini bulmuşlardır. Ohara ve ark. (1988), propiyonik asitin 160 µg/petri konsantrasyonunda Salmonella typhimurium da mutasyon frekansını uyardığını bulmuşlardır. Surjan (1989), propiyonik asit in Drosophila da mitotik rekombinasyonlara sebep olduğunu saptamıştır. Philipose ve ark. (1997), propiyonik asidin türevleri olan ibuprofen, ketoprofen ve naproxen in mutajenitesini Salmonella typhimurium un TA97, TA98, TA100 ve TA102 suşlarında, Ames testi ve fare kemik iliği hücrelerinde in vivo KKD testi ile test etmişlerdir. Sonuçta Ames testinde her üç türevin mutajen olmadığını, fakat fare kemik iliği hücrelerinde KKD ni zayıf bir şekilde artırdığını ve Salmonella typhimurium un TA98 suşlarında 160 µg/plate konsantrasyonunda mutasyonu artırdığını bulmuşlardır. 2.7. Sodyum Benzoat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sodyum benzoat gıdalarda koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Sodyum benzoat ticari olarak beyaz toz veya pulcuklar halinde bulunmakta olup, sıvılara toz olarak karıştırılmakta ve çabuk çözünmektedir. Abe ve Sasaki (1977), sodyum benzoat ın yüksek konsantrasyonlarının Chinese hamster hücrelerinde KA ve KKD ni artırdığını bulmuşlardır. Ishidate ve Odashima (1977), potasyum benzoat ın Chinese hamster hücrelerinde MI i artırdığını saptamışlardır. Njagi ve Gopalan (1982), Vicia faba kök hücrelerinde sodyum benzoat ın doza bağlı olarak mitotik indekste azalmaya sebep olduğunu, ayrıca anafaz safhasında köprü oluşumunu indüklediğini ve interfaz nükleusunda kromatin erozyonuna neden olduğunu saptamışlardır. Nair (2001), sodyum benzoat a maruz bırakılan fare ve sıçan çalışmalarında üreme ve gelişme üzerine toksik etki yaratmadığını, genoktoksidite çalışmalarının büyük bir çoğunluğu ile kanserojenite çalışmalarında negatif sonuç verdiğini saptamıştır. 10

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK 2.8. Sodyum Nitrit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sodyum nitrit (NaNO 2 ) et, et ürünleri ve balıklarda karakteristik lezzet, renk özelliklerini vermek ve mikrobiyal stabilitelerini sağlamak amacı ile kullanılan kürleme ajanlarıdır. Ayrıca sodyum nitrit, fotoğrafçılıkta kükürt dioksit içeriği ile indirgen madde olarak, boya, yıkama ve deri endüstrisinde renk giderici madde olarak, tekstil endüstrisinde anti-klor olarak kullanılmaktadır. Tsuda ve ark. (1976), sodyum nitrit in 50 mm ve 100 mm de in vitro hamster embriyonik hücrelerinde hücresel morfolojik değişmelere neden olduğunu, ayrıca KA ve endoreduplikasyonu da uyardığını bulmuşlardır. Ishidate ve Odashima (1977), Chinese hamster hücrelerinde sodyum nitrit in kromozom testinde pozitif sonuç verdiğini saptamışlardır. Luca ve ark. (1987), sodyum nitrit in mutajenitesini yaptıkları in vivo ve in vitro deneylerde araştırmışlardır. In vivo deneylerde üçten fazla hayvanla çalışılmış (erkek sıçan, fare ve tavşan) ve bunlara 1.72, 5.18, 15.55, ve 46.66 mg/kg vücüt ağırlığı dozlarda sodyum nitrit verilmiş, sonuçta ne kromozomal anormalliklerde ne de mikronükleus oluşumunda bir artış görülmüştür. Aynı araştırıcıların yaptığı in vitro deneyler için BSC-1 ve HeLa hücreleri 0.265 ve 0.530 mg/ml dozlarda sodyum nitrit ile muamele edilmiş ve her iki dozda da kromozom anormalliğinde kayda değer bir artış gözlenmemiştir. Mukherjee ve ark. (1988), sodyum nitrit in fare kemik iliği hücrelerinde çalışılan tüm dozlarında KKD ve mikronükleus oluşumunu artırdığını bulmuşlardır. Akın ve Sümer (1991), sodyum nitrit in mutajenitesini Salmonella typhimurium un TA100, TA1535 suşlarında araştırmışlar, sonuçta S9 lu ve S9 suz ortamlarda TA1535 için test maddesinin mutajen olduğunu ancak TA100 için zayıf mutajen olduğunu bulmuşlardır. Sushko ve Malenchenko (1992), fare spermatositlerini sodyum nitrit, sodyum nitrat ve radyasyona maruz bıraktıklarında, bu maddelerin farenin spermatositlerinde kromozom aberasyonunu indüklediğini saptamışlardır. 11

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK 2.9. Sorbatlar ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sorbik asit (C 5 H 7 COOH) ve onun kalsiyum (CaC 12 H 14 O 4 ), potasyum (KC 5 H 6 COOH) ve sodyum (NaC 5 H 6 COOH) tuzları 1945 yılından beri antimikrobiyal olarak kullanılmaktadır. Sorbik asit ve tuzları gıdalarda koruyucu madde olarak kullanımına izin verilen tek doymamış organik asittir. Sorbik asit ve onun Ca, K ve Na tuzları peynir yüzeyinde oluşabilecek küf gelişimini önlemekte, bu nedenle 40 çeşide yakın peynir ve peynirli gıdada kullanılmasına izin verilmektedir. 2.9.1. Sorbik Asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Hasegawa ve ark. (1984), Chinese hamster V79 hücrelerinde sorbik asit in yüksek konsantrasyonlarının KA ve KKD ni artırdığını ve çok düşük genotoksik etkiye sahip olduğunu bulmuşlardır. Liewen ve Marth (1985), sorbik asit in Salmonella typhimurium un TA97, TA98, TA100, TA1535, TA1537, TA 1538 suşlarında mutajen olduğunu saptamışlardır. Mukherjee ve ark. (1988), sorbik asit ve sodyum nitrit in, tek başlarına ve karışım halinde fare kemik iliği hücrelerinde etkilerini araştırmışlar ve sorbik asitin yüksek konsantrasyonlarının KKD ni ve mikronükleus oluşumunu artırdığını, sodyum nitritin ise tüm dozlarının KKD ni artırdığını, bunlar karışım halinde verildiğinde KKD nin ayrı ayrı verildiklerindekinden iki kat fazla olduğunu bulmuşlardır. Walker (1990), sorbik asit in KA ve KKD testleri sonucunda klastojen olmadığını, Ames testi sonucunda ise mutajen olmadığını bulmuşlardır. Jung ve ark. (1992), sorbik asit in 5000 mg/kg dozdan daha yüksek dozlarının fare kemik iliği hücrelerinde KKD ni ve mikronükleus oluşumunu artırmadığını bulmuşlardır. Aynı araştırıcılar in vivo insan A549 hücrelerinde düzensiz DNA sentez testinde DNA tamirini artırmadığını ve sonuç olarak sorbik asitin genotoksik olmadığını saptamışlardır. Ferrand ve ark. (2000b), sorbik asit in HeLa hücreleri ve plazmid DNA ları için mutajen olmadığını bulmuşlardır. 12

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK 2.9.2. Kalsiyum Sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Ferrand ve ark. (2000c), HeLa hücreleri ve plazmid DNA larla yaptıkları genotoksisite çalışmaları ve Ames testi sonucunda Kalsiyum sorbat ın mutajenik etkiye sahip olmadığını bulmuşlardır. 2.9.3. Potasyum Sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Potasyum sorbat ın yüksek dozlarının Chinese hamster V79 hücrelerinde KA ve KKD ni artırdığı saptanmıştır (Abe ve Sasaki, 1977; Hasegawa ve ark., 1984). Munzer ve ark. (1990), potasyum sorbat ın genotoksisitesini araştırmak amacıyla Ames testi ile Chinese hamster ovaryum hücrelerinde HGPRT ve kardeş kromatid değişim testini uygulamışlardır. Ayrıca, sıçan ve Chinese hamster kemik iliği hücrelerinde mikronükleus testlerini kullanmışlar ve bu kimyasalın in vitro testlerde bir genotoksisite göstermediğini, in vivo testlerde ise bu maddenin taze hazırlanmış eriyiklerinde hiçbir klastojenik etki göstermediği halde, bekletilmiş eriyiklerinde klastojenik bir etkiye sahip olduğunu saptamışlardır. Jung ve ark. (1992), potasyum sorbat ın 400-1200 mg/kg konsantrasyon aralığında DNA da tek iplik kırıklarına neden olmadığını ve dolayısıyla genotoksik olmadığını bulmuşlardır. Schlatter ve ark. (1992), potasyum sorbat ın 2.5 mg/ml konsantrasyonunun Chinese hamster V79 hücrelerinde in vitro şartlarda MI düşürdüğünü fakat genotoksik olmadığını bulmuşlardır. Ferrand ve ark. (2000a), potasyum sorbat ın HeLa hücrelerinde ve plazmid DNA larında mutajenik ve genotoksik etkiye sahip olmadığını bulmuşlardır. Kitano ve ark. (2002), potasyum sorbat ın mutajenik etkiye sahip olup olmadığını askorbik asit ve Fe tuzu varlığında Ames testini uygulayarak araştırmışlar ve bu üç madde birlikte kullanıldığında Salmonella typhimurium un TA98 (S9 mix varlığında veya S9 mix yokluğunda) ve TA100 (S9 mix varlığında) suşlarında mutajenik etkili olmadığını, buna karşın TA100 (S9 mix yokluğunda) suşunda doza bağlı bir mutajenik etki gösterdiğini saptamışlardır. Ancak bu üç madde ayrı ayrı kullanıldığında herhangi bir mutajenik etki görülmemiştir. 13

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK 2.9.4. Sodyum Sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Hasegawa ve ark. (1984), Sodyum sorbat ın yüksek Chinese hamster V79 hücrelerinde KA ve KKD ni artırdığını bulmuşlardır. Munzer ve ark. (1990), sodyum sorbat ın genotoksisitesini araştırmışlar, bu amaçla Ames testi, Chinese hamster ovaryum hücrelerinde HGPRT ve kardeş kromatid değişim testlerini, sıçan ve Chinese hamster kemik iliği hücrelerinde mikronükleus testlerini uygulamışlar ve sonuçta bu kimyasal maddenin in vitro testlerde bir genotoksisite göstermediğini, in vivo testlerde ise bu maddenin taze hazırlanmış eriyiklerinin hiçbir klastojenik etki göstermemesine rağmen, bekletilmiş eriyiklerinde böyle bir etki yarattığını bulmuşlardır. Schlatter ve ark. (1992), sodyum sorbat ın 2.5 mg/ml dozunun Chinese hamster V79 hücrelerinde mitoz bölünmeyi düşürdüğünü ancak genotoksik olmadığını bulmuşlardır. Schiffmann ve Schlatter (1992), sodyum sorbat ın taze hazırlanmış eriyiğinin genotoksik olmadığını saptamışlardır. 2.10. Sulfitler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Sülfitler kükürt dioksit kaynağı olarak yiyecek ve içecek endüstrisinde koruyucu ve sterilizasyon amaçlarla ve ayrıca unda beyazlatıcı madde olarak da kullanılmaktadır. Gıdalarda kükürt dioksit kaynağı olarak kullanılan sülfit bileşikleri sodyum metabisülfit (Na 2 S 2 O 5 ), potasyum metabisülfit (K 2 S 2 O 5 ) ve sodyum sülfit (Na 2 SO 3 ) tir. Meng ve Zhang (1992), sodyum metabisülfit in insan lenfosit hücrelerinde KA, KKD ve mikronükleus oluşumunu artırdığını bulmuşlardır. Rencüzoğulları ve ark. (2001a), sodyummetabisülfit in Allium cepa L. da mitotik anormallikleri artırdığını ve mitotik indeksi düşürdüğünü saptamışlardır. Aynı araştırıcılar, insan lenfosit hücrelerinde KA ve KKD ni artırdığını, replikasyon indeksini (RI) ve mitotik indeksi (MI) düşürdüğünü bulmuşlardır (Rencüzoğulları ve ark., 2001b). Nair ve Elmor (2003), sodyum ve potasyum metabisülfit in 160 mg/kg dan daha yüksek dozlarının fare, sıçan, hamster ve tavşanlarda teratojenik etkiye sahip olmadığını, mutajenite çalışmalarında ise negatif sonuç verdiğini saptamışlardır. Aynı araştırıcılar, 14

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK sıçanlarda yaptıkları çalışmalarda sodyum sülfit in yüksek dozlarda (3.3 g/kg dan daha yüksek) sıçanlarda toksik olduğunu ancak teratojenik olmadığını saptamışlardır. Kayraldız ve ark. (2006), potasyum metabisulfitin S.typhimurium TA98 ve TA100 suşlarında mutajen olmadığını bildirmişlerdir. Njagi ve Gopalan (1982), sodyum sülfit in doza bağlı olarak Vicia faba kök ucu hücrelerinde mitotik indekste azalmaya neden olduğunu, anafazda köprü oluşumunu uyardığını ve interfaz nükleusunda kromatin erozyonuna neden olduğunu saptamışlardır. Pagano ve ark. (1987) sodyum bisulfit in S.typhimurium TA97 ve TA1535 suşlarında zayıf mutajen olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca Kayraldız (2005), sıçanlara hem intraperitonal (ip) hem de gavage olarak verilen sodyum metabisulfit in sıçan kemik iliğinde genotoksik ve sitotoksik etkiye sahip olduğunu, ip olarak verildiğinde sodyum metabisulfit in genotoksik ve sitotoksik etkinin daha fazla olduğunu saptamıştır. 2.11. Tiabendazol ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Tiabendazol (C 10 H 7 N 3 S), çimen ve süs bitkilerinde küf, çürüme gibi problemlere karşı kullanılan bir pestisit olup, bazı meyve ve sebzelerde oluşan yeşil, mavi küf çürüklerini engellemek amacıyla depolama aşamasında dış yüzeyde kullanılan bir koruyucudur. Bu amaçla en çok muz ve narenciyelerde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Mudry ve Pargament (1987), tiabendazol un 50, 100 ve 200 mg/kg dozlarını farelerde denemişler ve sonuçta en yüksek dozda KKD ni artırırken, mikronükleus oluşumunu her üç doz da artırdığını bulmuşlardır. Ardito ve ark. (1996), tiabendazol un insan lenfotik hücrelerinde DNA replikasyonunu önemli derecede azalttığını ve 48 saatlik muamelede KKD ni çok az artırdığını bulmuşlardır. Mailhes ve ark. (1997), tiabendazol un fare oositlerinde sitogenetik anormallikleri uyardığını saptamışlardır. Sasaki ve ark. (1997), birçok yaştaki farenin çeşitli organlarında alkalin tek hücre jel elektroforez analizlerini (SCG) (Comet testi) kullanarak, tiabendazol un in vivo genotoksik etkisini araştırmışlar ve bu amaçla farelerin mide, karaciğer, böbrek, mesane, akciğer, beyin ve kemik ilikleri ile çalışmışlardır. Bu analizler sonucunda, tiabendazol (200 mg/kg) çalışılan birçok organda DNA 15

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK zararlarını indüklemiştir. Schmid ve ark. (1999), Multicolar fluorescence in situ hybridization (FISH) testini kullanarak 300 mg/kg tiabendazol ile muamele edilmiş erkek farelerin spermlerinde total diploidi sıklığının önemli derecede artığını saptamışlardır. Otubanjo ve Mosuro (2001), farelerde tiabendazol un sperm başı anormalliklerini istatiksel olarak artırdığını ancak mutajen olmadığını bulmuşlardır. Delescluse ve ark. (2001), tiabendazol un insan lenfoblastoid hücrelerinde yüksek DNA zararlarına neden olduğunu, ayrıca sitokrom P450 1A1 gen ekspresyonunu başlattığını ve sonuçta tiabendazol un genotoksik olduğunu bulmuşlardır. Sasaki ve ark. (2002), tiabendazol un gastrointestinal organlarda DNA zararlarını indüklediğini saptamışlardır. Watanabe-Akanuma ve ark. (2003), tiabendazol un bakteri kültürlerindeki fotomutajenik etkisini araştırmışlar ve bu amaçla 320-400 nm dalga boyundaki UV-A ışığını kullanmışlardır. Tiabendazol bulunmayan ortamda bakteri suşlarında hiçbir mutajenik etki görülmemiş ancak tiabendazol varlığında Escherichia coli nin WP2uvrA ve WP2uvrA/pKM101 suşlarında kuvvetli fotomutajenik etki, Salmonella typhimurium un TA98 ve TA100 suşlarında zayıf fotomutajenik etki görülmüş, Salmonella typhimurium un TA1535 ve TA1538 suşlarında ise hiçbir fotomutajenik etki görülmemiştir. Watanabe-Akanuma ve ark. (2005), bakterilerde fotomutajen olan tiabendazol un insan lenfoblastoid WTK1 hücrelerinde yapılan umu-test ve tek hücre jel elektroforez (comet testi) analizleriyle DNA zararlarına neden olduğunu ve sonuçta tiabendazol un in vitro insan hücrelerinde ve bakterilerde genotoksik olduğunu saptamışlardır. 16

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK 3. MATERYAL VE METOD Bu çalışmada materyal olarak sigara içmeyen yaşları bir birine yakın sağlıklı iki erkek (20 ve 23 yaşlarında) ve iki bayandan (20 ve 23 yaşlarında) alınan periferik kan kullanılmıştır. 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 3.1.1.1. Bifenil Bu çalışmada test maddesi olan bifenil (E230) (difenil) çeşitli gıda maddelerinde koruyucu olarak kullanılan aromatik hidrokarbondur. Bilindiği gibi koruyucular, gıdaların mikroorganizmalarla bozulmalarını önleyerek raf ömürlerinin uzatılmasını sağlayan maddelerdir. En çok taze meyve ve sebzelerde, özellikle turunçgillerin yüzey uygulamalarında koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, pestisitlerde, poliklorlu bifenillerin organik olarak sentezlerinde ısı transfer maddesi olarak ve poliesterlerde boyama yardımcı maddesi olarak da kullanılmaktadır. Bifenil, çok çabuk buharlaşabilen ve bu nedenle etkisi azalan bir madde olup, ambalaja, kağıt ve kartonların her m 2 yüzeyinde 1-5 g bifenil olacak şekilde uygulanmaktadır. Ayrıca antifungal etkiye sahip olup, fungisit olarak veya pestisid olarak da böceklere karşı kullanılan bir bileşiktir. Bazı ülkelerde kullanımı yasaklanmıştır. Bifenil in molekül yapısı, iki tane 6 kenarlı karbon halkasının birleşmesinden meydana gelmiştir. Bifenil % 99,5 (min) saflıkta olup Merck firmasından temin edilmiştir. Bifenil in açık formülü ve diğer özellikleri aşağıdaki gibidir: 17

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK Bilinen adları : Phenylbenzene; 1,1 -Biphenyl; 1,1 -Diphenyl; bibenzene; lemonene; phenador-x; PHPH; xenene; Diphenyl; Bifenilo (Spanish); Biphényle (French) ; Kapalı formülü : C 6 H 5 C 6 H 5 Molekül ağırlığı : 154,21 Erime sıcaklığı : 69-72 C Kaynama sıcaklığı : 254-255 C Yoğunluğu : 1,041 Çözünürlüğü : Suda çözünmez Fiziksel durumu : Beyaz, kristal yapıda CAS No : 92-52-4 3.1.1.2. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Çözücü madde olarak kullanılan dimethyl sulfoxide (DMSO) in (Sigma Cat. No: 8418) genel yapısı ve diğer özellikleri aşağıda verilmiştir: Kimyasal adı : Dimethyl sulfoxide (DMSO) Saflık : % 99.9 Kapalı formülü: C 2 H 6 SO Molekül ağırlığı: 78.13 Sigma no : 8418 CAS No : 67-68-5 3.1.1.3. Kromozom Medyumu Bu çalışmada Biochrom firmasının ürettiği Chromosome Medium B (cat. no. F5023), hücre kültürü için kullanılmıştır. Chromosome Medium B nin her litresinde aşağıdaki bileşikler verilen miktarlarda bulunmaktadır: 18

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK MEM JOKLIK with Non essential Amino Acids...850 ml Fetal Calf Serum...150 ml Heparin...25.000 E Penicillin G, Sodium Salt...75.000 E Streptomycin Sulphate...50 mg Phytohemagglutinin M...2.5 mg Bu medyum her tüpe 2.5 ml olacak şekilde paylaştırılmış ve bu miktarlarda kullanılmıştır. Kültür tüpleri steril olarak temin edilmiştir. 3.1.1.4. Kolşisin (Kolkisin) Kromozom preparatlarının hazırlanmasında mitotik zehir olarak Colchicine (kolşisin) (Sigma Cat. No. C9754) kullanılmıştır. Kolşisin eriyiği saf su içerisinde hazırlanmış ve kromozom medyumunun her ml sinde 0.06 µg olacak şekilde (0.06 µg/ml) 2.5 ml lik kromozom medyumuna ilave edilmiştir. 3.1.1.5. Hipotonik Eriyik Hipotonik eriyik olarak %0,4 lük KCl (Merck) kullanılmıştır. Eriyik bidestile su içinde stok halinde hazırlanıp ağzı kapalı bir cam kapta buzdolabında (+4 ºC) saklanmıştır. Her preparasyondan yaklaşık 2 saat önce yeteri kadar miktar alınıp 37ºC deki inkübatörde ısıtılıp kullanılmıştır. 3.1.1.6. Fiksatif KKD ve KA için kullanılan fiksatif, 1 kısım glasial asetik asit in 3 kısım metanol ile karıştırılması sonucu hazırlanmıştır. MN için ise iki farklı fiksatif kullanılmıştır. İlk fiksatif 1 kısım glasial asetik asit in 5 kısım metanol ile 19

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK karıştırıldıktan sonra 1/1 oranında %0.9 NaCl ile seyreltilmesiyle hazırlanmıştır. Diğer fiksatifler ise NaCl ilave edilmeden kullanılmıştır. Fiksatif kullanılmadan iki saat önce hazırlanmış ve buzdolabında saklanmıştır. Her seferinde preparat yapım işleminden iki saat önce taze olarak hazırlanıp kullanılmıştır. 3.1.1.7. 5 -Bromo-2 -deoxyuridine (BrdUrd) BrdUrd Sigma firmasından (Cat. No. B 5002) temin edilmiştir. BrdUrd eriyiği bidistile su içerisinde hazırlanmış, daha sonra 0.2 µm çapındaki membran filtre (Sartorius marka) ile steril edilmiştir. Bu eriyikten kültür tüpleri içerisindeki kromozom medyumuna 10 µg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir. 3.1.1.8. Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer) KKD ni incelemek amacıyla preparat yapımı sırasında preparatlar Sorensen tamponu içerisinde UV lambası ile ışınlandırılmıştır. Ayrıca bu tampon %5 lik Giemsa boyası hazırlanmasında da kullanılmıştır. Bu tampon eriyik tampon A ve tampon B olmak üzere iki stok çözelti halinde hazırlanmış olup bu çözeltiler çalışmanın amacına uygun olarak birbirleriyle değişik miktarlarda karıştırılarak kullanılmıştır. Hazırlanışı: Tampon A:11.34 gr KH 2 PO 4 250 ml saf su içinde eritilmiştir (ph=4.8). Tampon B:14.83 gr Na 2 HPO 4.12H 2 O 250 ml saf su içinde eritilmiştir (ph=9.3). 3.1.1.9. Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği Bu eriyik ışınlamadan sonra kardeş kromatidler arasındaki kontrast farkını artırmak amacıyla kullanılmıştır. SSC eriyiğini hazırlamak için 11.05 gr trisodyum sitrat (C 6 H 5 Na 3 O 7.2H 2 O) ve 21.9 gr NaCl kullanılmıştır. Bu iki madde ayrı ayrı 20

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK kaplarda bir miktar saf su içerisinde çözülmüş, daha sonra aynı kaba aktarılarak birbirleriyle karıştırılmış ve üzerlerine 500 ml oluncaya kadar saf su ilave edilmiştir. Hazırladığımız bu stok eriyik 5xSSC dir ve bu eriyik buzdolabında saklanmıştır. Deneyimizde, bu stoktan 20 ml alıp üzeri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanarak elde edilen 1x SSC kullanılmıştır. 3.1.1.10. Giemsa Giemsa boyası Merck firmasından (Cat. No. 9204) temin edilmiş olup deneylerimizde Sorensen tamponu içinde hazırlanmış olan %5 lik boya eriyiği preparatların boyanmasında kullanılmıştır. 3.1.1.11. Entellan Preparat kapatma solüsyonudur (Merck, Cat. No. 7961). Preparatlar daimi hale getirilirken lam ve lamelin birbirlerine yapıştırılmasında kullanılmıştır. 3.1.1.12. Nitrik Asit (HNO 3 ) Lamları temizlemek amacıyla 1 N çözelti olarak hazırlanmıştır. Plastik şişede saklanarak her defasında tekrar tekrar kullanılmıştır. 3.1.1.13. Mitomycin C (MMC) Pozitif mutajen olarak kullanılmıştır. MMC steril saf suda 0.2 µg/ml olacak şekilde hazırlanmış ve buzdolabında saklanmıştır. 21

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK 3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları 3.1.2.1. Hassas Terazi Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan ve 0,0001 gr hassasiyetindeki GEC AVERY marka terazi kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır. 3.1.2.2. Santrifüj Rotor çapı 21 cm olan ve 4000 rpm e kadar yükselebilen devir hızı, 99 dk. lık zaman ayarlayıcı, açılabilir başlığa sahip ve 28 tüp kapasiteli HETTICH UNIVERSAL marka santrifüj çalışmalarda kullanılmıştır. 3.1.2.3. Mikroskop Koordinat cetveli ve immersiyon objektifi olan OLYMPUS marka binoküler ışık mikroskobu preparat incelemeleri sırasında kullanılmıştır. Fotoğraflar ise yine Olympus marka mikroskopta dijital olarak çekilmiştir. 3.1.2.4. İnkübatör Hücrelerin 37ºC de inkübe edilmesi için Dedeoğlu marka inkübatör kullanılmıştır. 3.1.2.5. ph Metre Kimyasalların ph değerlerini saptamak için WTW 315i (Germany) marka ph metre kullanılmıştır. 22

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK 3.2. Lamların Temizlenmesi Kültür süresinin bitiminden iki gün önce etiketli olan lamlar şaleye dizilerek üzerlerini iyice örtecek şekilde 1 N nitrik asit konmuştur. Şalenin ağzı kapatılarak bu şekilde 24 saat bekletilmiştir. Süre bitiminde lamlar yarım saat akan çeşme suyunda iyice yıkanmıştır. Lamlar 3-4 defa saf sudan geçirildikten sonra şale saf su ile doldurularak buzdolabında saklanmıştır. 3.3. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosomal Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler İnsanlarda genotoksik etkiye sahip olabilecek mutajenlerin ve kanserojenlerin genotoksik etkilerinin saptanması başta KKD, KA ve MN testleri yardımıyla olabilmektedir. Bu tür çalışmalar planlanırken, uygulanırken ve yorumlanırken uluslararası yönergelere uygun hareket edilmesi zorunluluğu bulunmaktadır. Bundan dolayı bifenil in insan lenfositlerindeki genotoksik etkilerinin belirlendiği bu çalışma Albertini ve ark. (2000) ları tarafından yayınlanan IPCS (The International Programme on Chemical Safety) yönergesine göre gerçekleştirilmiştir. 3.3.1. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması Bu çalışmada KKD ve KA ni saptamak amacıyla hücre kültürünün yapılması ve preparatların hazırlanması Evans (1984), Perry ve Thompson (1984) un metodlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sağlıklı ve sigara içmeyen yaşları birbirine yakın iki erkek ve iki bayandan alınan 1/10 oranında heparinize edilmiş kan örnekleri kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla (0.2 ml) (Rencüzoğulları 23

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK ve Topaktaş, 1991) ekilmiştir. Yine steril şartlarda ve daha önce hazırladığımız BrdUrd eriyiğinden her tüpe son konsantrasyonu 10 µg/ml olacak şekilde ilave edilerek iyice karıştırılmış ve hücre kültürü inkübatörde 37±1 C de 72 saat için inkübe edilmiştir. Bifenil in etkisini incelemek için kültür süresinin bitimine 24 ve 48 saat kala bifenil in daha önce belirlenmiş konsantrasyonları olan 10, 30, 50 ve 70 µg/ml lik miktarları, DMSO da çözdürülüp kültür tüplerine ilave edilmiştir. 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde çözücü kontrol olarak DMSO kullanılmıştır. DMSO tüplere 8 µl/ml olacak şekilde verilmiştir. Bifenil beyaz kristal yapıdadır ve suda çözünmez. Bu amaçla bifenil i çözmek için DMSO kullanılmıştır. Ayrıca 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde pozitif kontrol olarak MMC kullanılmıştır. MMC tüplere 0.20 µg/ml olacak şekilde verilmiştir. Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (yani kültürün 70. saatinde) her tüpe hazırlanan kolşisin eriyiğinden ilave edilmiş (0.06 µg/ml) ve tüpler hafifçe sallanarak iyice karıştırılmıştır. Hücreler 2 saat süresince (37 C de) kolşisin ile ön muameleye tabi tutulmuştur. Kültür süresi olan 72. saatin bitiminde kültür tüpleri 1200 rpm de 15 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri ihtiva eden 0.5-0.7 ml lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere, etüvde 37 C de tutulan hipotonik eriyik ilave edilmiştir. Bu eriyiğin ilavesi damla damla ve karıştırılarak yapılmıştır. Aksi halde hücrelerde kümeleşme olmakta ve amaca uygun olmayan preparatlar hazırlanmaktadır. Her tüpe 5 ml hipotonik eriyik ilave edildikten sonra tüpler, ağzı kapatılarak inkübatöre konulmuştur. Hücreler 12 dk. hipotonik eriyikte 37 C de muamele edilmiştir. Sürenin sonunda tüpler 15 dk. 1200 rpm de santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Bu sefer hipotonik eriyik ilavesi gibi yavaş yavaş ve karıştırarak her tüpe 5 ml olacak şekilde soğuk fiksatif ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile muamele edilen hücreler 1200 rpm de 15 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra tüplere tekrar fiksatif ilave edilmiştir. Bu işlem 3 kere tekrarlanmıştır. 3. fiksatif muamelesinin sonunda tüpte kalan sıvının tamamen 24

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK berraklaştığı görülmüştür. Eğer sıvı berraklaşmamışsa tekrar fiksatif muamelesine devam etmek gerekir. Her fiksatif ilavesinden sonra tüpler santrifüj edilerek üstteki sıvı atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte 0.5-0.7 ml sıvı kalacak şekilde süpernatant atıldıktan sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir. Tüpün dibinde toplanan hücreler pasteur pipeti ile karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Pasteur pipetine 4-5 damla olacak şekilde bu hücre süspansiyonundan çekilmiştir. Özel olarak hazırlanmış düzeneğe tutturulan pasteur pipetinden daha önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında saklanmış lamların üzerine 75 cm yükseklikten farklı alanlara 1 er damla olmak üzere hücre süspansiyonu damlatılarak (her lama 3-4 damla) hücrelerin ve dolayısıyla kromozomların lam üzerinde yayılması sağlanmıştır. Hücre süspansiyonunun lamlara damlatılması esnasında damlaların üst üste düşmemesine dikkat edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlar kurumak üzere 24 saat oda ısısında bekletilmiştir. 3.3.2. Preparatların Boyanması Bir kromozoma ait kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını (sister chromatid differentiation=scd) sağlamak amacıyla Speit ve Haupter (1985) in geliştirdikleri metod modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu amaçla bir günlük preparatlar ışınlama kabına konarak üzeri bir film gibi örtünecek şeklide Sorensen tamponu ile kapatılmıştır. Işınlama eriyiği, 5 ml tampon A, 5 ml tampon B den alınıp bu karışımın destile su ile 100 ml ye tamamlanmasıyla hazırlanmıştır (ph=6.8). Işınlama eriyiğinin fazla veya az olması kardeş kromatidler arasındaki kontrast farkını önemli derecede etkilediği görülmüştür. Bu şekilde ince bir tabaka halinde ışınlama eriyiği ile örtülen preparatlar, karanlıkta 15 cm yükseklikten 30W lık 254 nm dalga boyunda ışık yayabilen tek ultraviyole lambası ile 30 dk. ışınlanmıştır. Işınlama bittikten sonra preparatlar 1xSSC eriyiği içerisinde 58-60 C arasındaki sıcaklıklarda 60 dk. inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi bitmeden 15 dk. önce %5 lik Giemsa boya eriyiği hazırlanmıştır. 25

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK %5 lik Giemsa nın Hazırlanması: 5 ml tampon A, 5 ml tampon B ve 5 ml Giemsa karıştırılarak üzerleri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanmıştır (ph=6.8). Sonra bu boya dik bir şale içine filtre kâğıtları ile süzülmüştür. İnkübasyon süresinin sonunda preparatlar 1xSSC solüsyonundan alınarak direkt olarak boya içerisine konmuş ve yaklaşık olarak 20 dk. boya içerisinde bekletilmiştir (kardeş kromatidler arasındaki en iyi kontrast farkı bu sürede sağlanmıştır). Bu sürenin sonunda preparatlar boyadan çıkarılmış, üç ayrı kaptaki saf su içinden geçirilerek preparatlar üzerindeki fazla boyanın akması sağlanmıştır. Bundan sonra preparatlar dik vaziyette konularak kurumaya bırakılmıştır. Kuruyan preparatlar entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. Entellan kuruduktan sonra bu daimi preparatlarda mikroskobik incelemeler yapılmıştır. 3.3.3. Mikroskobik İnceleme Hazırlanmış olan daimi preparatlar Olympus marka binoküler ışık mikroskobunda immersiyon objektifi ile incelenmiştir (10x100=1000 büyütmede). 3.3.3.1. KKD ve Replikasyon İndeksinin (RI) (Proliferasyon İndeksi=PI) Saptanması 3.3.3.1.(1). KKD Sayısının Saptanması KKD sayısı, her kişinin kan kültürüne ait preparatlardan iyi dağılmış ve ikinci mitozu geçiren 25 hücrede (4 kişiden toplam 100 hücrede) saptanmıştır. KKD sayısı bir kromozomun açık boyanmış kromatidindeki koyu boyanmış parçaların veya koyu boyanmış kromatidindeki açık boyanmış parçaların sayılmasıyla belirlenmiştir (Topaktaş ve Speit, 1990). Ortadan bir parça değişimi olmuş ise bu iki KKD olarak değerlendirilmiş (Şekil 3.1.a), uçtan parça değişimi olmuş ise bu da bir KKD olarak sayılmıştır (Şekil 3.1.b). Ancak bu incelemeler esnasında kromatidlerin primer boğum bölgelerinden dönüm yapıp yapmadıklarına dikkat etmek gerekir. Bu durumdaki kromozomlarda KKD yoktur (Şekil 3.1.c). 26

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK Şekil 3.1. Kardeş kromatid değişiminin olduğu ve olmadığı durumun şematik olarak gösterilmesi (Topaktaş ve Speit, 1990). 3.3.3.1.(2). Replikasyon İndeksinin (RI) (Proliferasyon İndeksi=PI) Saptanması Bifenil in DNA replikasyonu üzerindeki etkilerini saptamak amacı ile RI bulunmuştur. Bunun için tesadüfi seçilmiş 100 hücre incelenmiştir. Bu incelemeler sırasında gözlenen birinci, ikinci ve üçüncü metafaz devresindeki hücreler sayılmıştır. Bu verilerden yola çıkarak RI şu şekilde hesaplanmıştır: RI= 1xM 1 +2xM 2 +3xM 3 /100 M 1 : 1. Mitozdaki hücre sayısı M 2 : 2. Mitozdaki hücre sayısı M 3 : 3. Mitozdaki hücre sayısı Birinci, ikinci ve üçüncü metafazlar şu şekilde ayırt edilmiştir (Topaktaş ve Speit, 1990): BrdUrd, deoxytimidin (dt) ve deoxyuridin (du) birbirlerinin analoğu olan bileşiklerdir (Şekil 3.2). BrdUrd, dt ve du arasındaki tek fark taşıdıkları benzen halkasındaki 5.C atomuna dt de CH 3, BrdUrd de Br ve du da H atomunun bağlı olmasından kaynaklanmaktadır. 27

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK HN O CH3 HN O Br HN O H O N O N O N HO CH 2 O HO CH 2 O HO CH 2 O OH OH OH Deoxytimidin (dt) Bromodeoxyuridin (BrdUrd) Deoxyuridin (du) Şekil 3.2. Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin (du) in kimyasal yapıları. BrdUrd, DNA nın yapısında bulunan timin bazlarının analoğu olduğundan dolayı kültür ortamına BrdUrd koyduğumuzda hücre DNA sını replike ettiği sırada (1.S fazında) yeni sentezlenen polinükleotid ipliği içine timinin yerine ortamda bulunan BrdUrd ni alacaktır. Böyle hücrelerinin kromozomları boyandığında bir kromozomun her iki kromatidi de (dt/brdurd:dt/brdurd) homojen koyu renkte boyanacaktır. Bu hücreler 1. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3.A ve Şekil 3.4). Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerden meydana gelen yavru hücreler tekrar S fazına girdiğinde (BrdUrd'li ortamda 2.S fazı) timin ihtiva eden polinükleotid ipliğine komplementer olarak sentezlenen yeni DNA ipliğinde BrdUrd yer alacaktır. Bu iki polinükleotid ipliği bir kromozomun koyu boyanan kromatidini (dt/brdurd) oluşturacaktır. BrdUrd'li ipliğe komplementer olarak sentezlenen yeni ipliğe de BrdUrd girecektir ve bir kromatidi oluşturan iki polinükleotid ipliği de BrdUrd ihtiva ettiklerinden (BrdUrd/BrdUrd) bu kromatid aynı kromozomun açık boyanan kromatidini oluşturacaktır. İşte bu hücrenin metafaz devresinde preparat yapıldığında hücrenin tüm kromozomlarının (dt/brdurd:brdurd/brdurd) kromatidlerinden biri koyu diğeri ise açık renkte boyanacaktır. Bunlar da ikinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir. (Şekil 3.3.B ve Şekil 3.5). Bu hücreler tekrar S 28

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK fazına girdiğinde (BrdUrd'li ortamda 3.S fazı) ikinci mitozda açık boyanan kromatidden tüm polinükleotid ipliklerine BrdUrd girmiş olan bir kromozom meydana gelecektir ve bu kromozomun her iki kromatidi de açık renkte boyanacaktır (BrdUrd/BrdUrd:BrdUrd/BrdUrd). İkinci mitozda koyu boyanan kromatidden ise, bir kromatidin her iki ipliği BrdUrd'li ve diğer kromatidin bir ipliği BrdUrd'li diğer ipliği timinli olan bir kromozom oluşacaktır. Bu kromozom da boyandığında bir kromatidi koyu renkte, bir kromatidi de açık renkte boyanacaktır (dt/brdurd:brdurd/brdurd). İşte böyle hücrelerin metafaz devresinde preparat yapıldığında bazı kromozomların her iki kromatidi açık renkte, bazı kromozomların bir kromatidi açık, diğer kromatidi de koyu renkte boyanacaktır. Bu hücrelerde 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3.C ve Şekil 3.6). İşte bu şekilde 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücreler ayırt edilmiş, bu hücrelerin 100 hücre içindeki sayısı saptanmış, bundan da yukarıda belirtilen formüle göre replikasyon indeksi (RI) hesaplanmıştır. 29

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK Şekil 3.3. BrdUrd in DNA yapısına girmesi ile 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin ayırt edilmesinin şematik olarak açıklanması (During 1985 e göre Topaktaş ve Speit 1990 den). 30

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK 10 µm Şekil 3.4. Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000 10 µm Şekil 3.5. İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000 31

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK 10 µm Şekil 3.6. Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000 3.3.3.2. Kromozomal Anormallikler (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması 3.3.3.2.(1). Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması Her bir kişiden hazırlanan preparatlardan iyi dağılmış kromozomlara sahip toplam 100 hücre (4 kişiden toplam 400 hücre) KA ni saptamak amacıyla incelenmiştir. Bu hücreler içinde gözlediğimiz kromozom yapı ve sayı anormallikleri Uluslararası İnsan Sitogenetik Adlandırma Sistemine (ISCN= International System for Human Cytogenetic Nomenclature) uygun olarak değerlendirilmiş ve adlandırılmıştır (Mitelman, 1995 a göre Paz-y-Mino et al., 2002 dan). İncelenen bu 100 hücre içinde yapısal ve total kromozom anormalliklerinin yüzdesi bulunmuştur. Bu çalışmada sayısal kromozom anormallikleri oluşmadığı için değerlendirilmemiştir. Bu çalışmada gap lar anormallik olarak değerlendirilmemiştir. Gaplar ile kromatid ve kromozom tipi kırıklar arasındaki farklar, Kauderer ve ark. (1991) nın 32

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK bildirdiğine şu şekilde ayırt edilmiştir: Gap larda, kromatidin birinde (kromatid tipi gap) veya kromatidin her ikisinde (kromozom tipi gap) görülen boyanmamış bölge bir kromatidin genişliğinden daha azdır. Kırıklarda bir kromatiddeki (kromatid tipi kırık) veya her iki kromatiddeki (kromozom tipi kırık) boyanmamış bölge bir kromatidin genişliğinden daha fazladır. İşte bu ölçülere göre gap ve kromatid kırıkları ayrı ayrı saptanmıştır. Mace ve ark. (1978) ise gap bölgesinde DNA ipliğinde kırık olmadığını elektron mikroskobu fotoğraflarında göstermişlerdir. Bu çalışmada kromatid kırığı ve tek kol birleşmesi gibi anormallikler kromatid tipi anormallik olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca kromozom kırığı, sister union, kromatid değişimi, halka kromozom ve disentrik kromozom oluşumu gibi anormallikler de kromozom tipi anormallikler olarak değerlendirilmiştir. 3.3.3.2.(2). Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Bifenil in mitoz bölünme üzerindeki etkilerini saptamak amacı ile mitotik indeks bulunmuştur. Bunun için her kişiye ait preparatlardan toplam 3 bin hücre incelenmiş ve bunlar arasındaki metafaz devresinde olan hücreler saptanarak kaydedilmiştir. 3 bin hücre içerisinde metafazların oranı yüzde cinsinden hesaplanarak mitotik indeks saptanmıştır. 3.4. Mikronukleus (MN) Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler 3.4.1. Mikronukleus Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması Mikronükleus sayısını saptamak için Fenech (2000) ve Kirsch-Volders ve ark. (2003) tarafından geliştirilen metod modifiye edilerek kullanılmıştır. Sağlıklı ve sigara içmeyen yaşları birbirine yakın iki erkek ve iki bayandan alınan 1/10 oranında 33

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK heparinize edilmiş kan örnekleri kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla (0.2 ml) ekilmiştir (Rencüzoğulları ve Topaktaş, 1991). Hücre kültürü inkübatörde 37±1 C de 68 saat için inkübe edilmiştir. Bifenil in etkisini incelemek için, daha önce belirlenmiş olan konsantrasyonlardaki (10, 30, 50 ve 70 µg/ml) bifenil, kültür tüplerine ilave edilerek hücrelerin 24 ve 48 saat boyunca bifenil ile muamele edilmeleri sağlanmıştır. İki nukleuslu hücre oluşumunu sağlamak için de kültür bitimine 24 saat kala bütün tüplere 6 µg/ml olacak şekilde sitokalasin B (Cytochalasin B, Sigma Cat. No. C6762) ilave edilmiştir. Ayrıca 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde pozitif kontrol olarak MMC kullanılmıştır. MMC tüplere 0.20 µg/ml olacak şekilde verilmiştir. Kültür süresi olan 68. saatin bitiminde kültür tüpleri 1200 rpm de 15 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri ihtiva eden 0.5-0.7 ml lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere, etüvde 37 C de tutulan hipotonik eriyik ilave edilmiştir. Bu eriyiğin ilavesi damla damla ve karıştırılarak yapılmıştır. Aksi halde hücrelerde kümeleşme olmakta ve amaca uygun preparatlar hazırlanamamaktadır. Her tüpe 5 ml hipotonik eriyik ilave edildikten sonra tüpler, ağzı kapatılarak inkübatöre konmuştur. Hücreler 5 dk. hipotonik eriyikte 37 C de muamele edilmiştir. Sürenin sonunda tüpler 15 dk. 1200 rpm de santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Bu sefer hipotonik eriyik ilavesi gibi yavaş yavaş ve karıştırarak her tüpe 5 ml olacak şekilde soğuk fiksatif ilave edilmiştir. İlk fiksatif 1 kısım asetik asit 5 kısım metil alkol karışımının 1/1 oranında %0.9 NaCl ile seyreltilmesiyle hazırlanmıştır. Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile muamele edilen hücreler 1200 rpm de 15 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra tüplere tekrar fiksatif ilave edilmiştir. Bu işlem 2 kere tekrarlanmış ve ilk fiksatiften farklı karışımlar kullanılmıştır (1 kısım asetik asit 5 kısım metil alkol). 3. fiksatifle muamelenin sonunda tüpte kalan sıvının tamamen berraklaştığı görülmüştür. Eğer sıvı berraklaşmamışsa tekrar fiksatif muamelesine devam etmek gerekir. Her fiksatif ilavesinden sonra santrifüj edilerek üstteki sıvı atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte 0.5-0.7 ml sıvı kalacak şekilde süpernatant atıldıktan sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir. 34

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK Tüpün dibinde toplanan hücreler pasteur pipeti ile karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Pasteur pipetine 4-5 damla olacak şekilde bu hücre süspansiyonundan çekilmiştir. Daha önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında saklanan lamın üzerine farklı alanlara 1 er damla olmak üzere hücre süspansiyonu damlatılarak (her lama 4-5 damla) hücrelerin lam üzerinde yayılması sağlanmıştır. Hücre süspansiyonunun lamlara damlatılması esnasında damlaların üst üste düşmemesine dikkat edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlar kurumak üzere 24 saat oda ısısında bekletilmiştir. 3.4.2. Preparatların Boyanması Hazırlanan preparatlar Sorensen tamponu ile hazırlanmış %5 lik giemsa boyası ile boyanmıştır. %5 lik Giemsa nın Hazırlanması: 5 ml tampon A, 5 ml tampon B ve 5 ml Giemsa karıştırılarak üzerleri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanmıştır (ph=6.8). Sonra bu boya dik bir şale içine filtre kâğıtları ile süzülmüştür. Kuruduğundan emin olunan preparatlar direkt olarak boya içerisine konmuş ve yaklaşık olarak 13 dk. boya içerisinde bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda preparatlar boyadan çıkarılmış, üç ayrı kaptaki saf su içinden geçirilerek preparatlar üzerindeki fazla boyanın akması sağlanmıştır. Bundan sonra preparatlar dik vaziyette konularak kurumaya bırakılmıştır. Kuruyan preparatlar entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. Entellan kuruduktan sonra bu daimi preparatlarda mikroskobik incelemeler yapılmıştır. 3.4.3. Mikroskobik İnceleme Hazırlanmış olan daimi preparatlar Olympus marka binoküler ışık mikroskobunda 40 lık objektif ile incelenmiştir (10x40=400 büyütmede). Bu incelemeler sırasında her bir kişiden hazırlanan preparatlardan 2000 iki nukleuslu (binükleer) hücre sayılmış, bu iki nukleuslu hücreler içerisinden mikronukleuslu olanlar saptanmıştır. Ayrıca aynı kişiden hazırlanan preparatlardan 1000 tane hücre 35

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK sayılmış, bu hücreler arasından bir, iki, üç ve dört nukleuslu olanların oranı saptanmıştır (Şekil 3.7). Bu orandan yola çıkarak Nukleer Bölünme Indeksi (NBİ) (Nuclear Division Index = NDI) hesaplanmıştır (Fenech, 2000). Hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılmıştır. NDI= 1xN 1 +2xN 2 +3xN 3 +4xN 4 /2000 N 1 : 1 nukleuslu hücre sayısı N 2 : 2 nukleuslu hücre sayısı N 3 : 3 nukleuslu hücre sayısı N 4 : 4 nukleuslu hücre sayısı 10 µm Şekil 3.7. Bir (a), iki (b), üç (c) ve dört (d) nükleus içeren hücreler. 3.5. Mikroskopta Fotoğraf Çekme Fotoğraflar Olympus marka mikroskopta trinoküler mikroskoba bağlı dijital fotoğraf makinesinde 1000 büyütmede çekilmiştir. Daha önce 1., 2., ve 3. mitozu geçiren hücrelerin kromozomlarının, bazı ilginç KA lerine ait örneklerin, iki 36

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK nukleuslu hücrelerden mikronukleusa sahip olanların ve bir, iki, üç ve dört nukleuslu hücrelerin birkaç örneğinin fotoğrafları çekilmiştir. (Olympus CX31RTSF ; 7,1 Megapixel). 3.6. İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi Mikroskobik inceleme sonucunda muameleli gruplardan elde edilen KKD, KA, MN, NBI, RI ve MI t-test metoduna göre muamelesiz, çözücü (DMSO) ve pozitif (MMC) kontrolleri ile karşılaştırılmıştır. Doz-etki ilişkisini ortaya koymak amacıyla regresyon ve korelasyon analizleri yapılmış, regresyon denklemi ve korelasyon katsayısı (r) bulunmuş ve regresyon doğrusu çizilmiştir. Ayrıca mikroskobik incelemelerden elde edilen sonuçlar çizelge ve grafikler halinde verilmiştir. 37

4. BULGULAR Şebnem PARLAK 4.BULGULAR 4.1. Bifenil in KKD Üzerindeki Etkileri Bifenil, 24 saatlik muamele süresinde 10 ve 30 µg/ml lik konsantrasyonlarda KKD sayısını her iki kontrole (kontrol ve çözücü kontrol) nazaran artırmasına rağmen bu artış istatistiksel olarak önemli bulunamamıştır (Çizelge 4.1 ve Şekil 4.1). Aynı muamele süresinde 50 µg/ml konsantrasyonda bifenil KKD sayısını sadece kontrole göre, 70 µg/ml lik konsantrasyonda ise, KKD sayısını kontrole ve çözücü kontrole göre istatistiksel olarak önemli derecede artırmıştır (Çizelge 4.1 ve Şekil 4.1). Bifenil, 48 saatlik muamele süresinde KKD sayısını kontrole göre en düşük doz hariç önemli ölçüde arttırmış, en yüksek iki konsantrasyonda da bu artış çözücü kontrole nazaran da önemli bulunmuştur (Çizelge 4.1 ve Şekil 4.1). Bifenil hem 24 hem de 48 saatlik muamele sürelerinde KKD sayısını doza bağlı olarak artırmış (Şekil 4.2 ve Şekil 4.3), fakat KKD sayısındaki bu artış pozitif kontrol olan MMC kadar olamamıştır (Şekil 4.4). Çizelge 4.1. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde ortalama KKD sayısı. Test Süre Konsantrasyon Min-Max KKD KKD/Hücre±SE maddesi (saat) µg/ml Kontrol - - 2-15 5.81±0.60 DMSO 24 8 µl/ml 2-16 6.21±0.40 MMC 24 0.2 6-57 27.96±2.95 Bifenil 24 10 2-25 6.33±0.18 c 3 24 30 2-17 7.40±0.68 c 3 24 50 2-24 8.40±0.77 a 1 c 3 24 70 3-28 9.55±0.89 a 1 b 1 c 3 DMSO 48 8 µl/ml 2-16 6.57±0.45 MMC 48 0.2 4-66 31.18±0.45 Bifenil 48 10 2-17 6.68±0.47 c 3 48 30 2-21 7.85±0.58 a 1 c 3 48 50 2-23 9.07±0.48 a 2 b 1 c 3 48 70 3-23 9.49±0.58 a 2 b 1 c 3 a: Kontrol ile karşılaştırmada fark önemli b: Çözücü kontrol ile karşılaştırmada fark önemli c: Pozitif kontrol ile karşılaştırmada fark önemli 1: P 0.05; 2: P 0.01; 3: P 0.001 38

4. BULGULAR Şebnem PARLAK 35 30 25 KKD/Hücre 20 15 10 KKD 24 Saat KKD 48 Saat 5 0 Kontrol DMSO 8 µl MMC 0.2 10 30 50 70 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.1. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre sayısı. 12 10 KKD/Hücre 8 6 4 2 0 y = 0.0533x + 5.788 r = 0.9993* 0 20 40 60 80 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.2. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre nin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05). 39

4. BULGULAR Şebnem PARLAK 12 10 KKD/Hücre 8 6 4 2 0 y = 0.0482x + 6.3425 r = 0.9634* 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.3. Farklı dozlarda bifenil ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre nin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05). 10 µm Şekil 4.4. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde 11 KKD içeren hücre (x1000) (30µg/ml, 48 saat, ). 4.2. Bifenil in Kromozomal Anormalliklerin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri Bifenil, 24 saatlik muamele süresinde 10 ve 30 µg/ml dozlarda yapısal kromozom anormalliği sayısını muamelesiz kontrole nazaran artırmazken, aynı 40

4. BULGULAR Şebnem PARLAK muamele süresinde 50 ve 70 µg/ml lik konsantrasyonlarda bifenil yapısal kromozom anormalliği sayısını hem muamelesiz hem de çözücü kontrole göre önemli ölçüde arttırmıştır(çizelge 4.2 ve Şekil 4.5). Bifenil, 48 saatlik muamele süresinde yapısal kromozom anormalliği sayısını tüm konsantrasyonlarda kontrole göre arttırmazken, 50 ve 70 µg/ml lik dozlarda ise yapısal kromozom anormalliği sayısını çözücü kontrole göre arttırmıştır. Bifenil yapısal kromozom anormalliği sayısını 24 saatlik muamele süresinde doza bağlı olarak artırmıştır (Şekil 4.6). Bifenil yapısal kromozom anormalliğini her iki muamele süresinde de MMC kadar uyarmamıştır. Çizelge.4.2. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde yapısal kromozom anormallikleri Test maddesi Süre (saat) Anormallik çeşitleri Kons. µg/ml Kromatid Kromozom Tipi Tipi Yapısal KA±SE (%) Kontrol - - 14 3 4.25±0.25 DMSO 24 8 µl/ml 7 3 2.50±0.95 MMC 24 0.2 62 29 22.75±4.71 Bifenil 24 10 5 5 2.50±0.50 c 3 24 30 9 9 4.50±0.64 c 3 24 50 20 10 7.50±0.86 a 1b 2c 3 24 70 29 12 10.25±0.62 a 2b 3c 3 DMSO 48 8 µl/ml 4 6 2.50±0.50 MMC 48 0.2 78 21 24.75±3.81 Bifenil 48 10 7 5 3.00±0.70 c 3 48 30 7 7 3.50±0.86 c 3 48 50 12 7 4.75±0.62 b 1c 3 48 70 17 14 7.75±1.54 b 1c 2 a: Kontrol ile karşılaştırmada fark önemli b: Çözücü kontrol ile karşılaştırmada fark önemli c: Pozitif kontrol ile karşılaştırmada fark önemli 1: P 0.05; 2: P 0.01; 3: P 0.001 41

4. BULGULAR Şebnem PARLAK 30 Yapısal KA Yüzdesi 25 20 15 10 5 KA 24 Saat KA 48 Saat 0 Kontrol DMSO 8 µl MMC 0.2 10 30 50 70 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.5. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde yapısal KA yüzdesi. 12 Yapısal KA Yüzdesi 10 8 6 4 2 0 y = 0.1313x + 0.9375 r = 0.9937* 0 20 40 60 80 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.6. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde yapısal KA nın doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05). Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde en fazla kromatid tipi anormalliklerden özellikle kromatid kırığı (Şekil 4.7 ve Şekil 4.9) gözlenmiştir. Daha 42

4. BULGULAR Şebnem PARLAK az oranda olmak üzere kromozom tipi anormalliklerden özellikle kromozom kırığı (Şekil 4.8), kardeş kromatid birleşmesi (sister union) (Şekil 4.9) kromatid değişimi ve halka kromozom (Şekil 4.10) gibi yapısal kromozom anormalliklerine rastlanmıştır. Bu çalışmada bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde sadece iki hücrede poliploidi (Şekil 4.11) gözlenmiş ve dolayısıyla bifenil in kromozom sayı anormalliğini artırmadığı saptanmıştır. 10 µm Şekil 4.7. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid kırığı (50 µg/ml, 24 saat, ).x1000. 43

4. BULGULAR Şebnem PARLAK 10 µm Şekil 4.8. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromozom kırığı (x1000) (30 µg/ml, 24 saat, ). 10 µm Şekil 4.9. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kardeş kromatid birleşmesi (a) ve kromatid kırığı (b) (x1000) (70 µg/ml, 24 saat, ). 44

4. BULGULAR Şebnem PARLAK 10 µm Şekil 4.10. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid değişimi (a) ve halka kromozom (b) (x1000) (30 µg/ml, 24 saat, ). 10 µm Şekil 4.11. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde poliploid hücre (x1000) (30 µg/ml, 48 saat, ). 45