ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Ahmet KAYRALDIZ SODYUM METABİSÜLFİT İN SIÇAN KEMİK İLİĞİ HÜCRELERİNDE İN VİVO GENOTOKSİK ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2005

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SODYUM METABİSÜLFİT İN SIÇAN KEMİK İLİĞİ HÜCRELERİNDE İN VİVO GENOTOKSİK ETKİLERİ Ahmet KAYRALDIZ DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez 12 / 9 / 2005 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği / Oy Çokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza İmza İmza Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI DANIŞMAN ÜYE ÜYE İmza Doç. Dr. Gökhan CORAL ÜYE İmza.. Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Ana Bilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Tez Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE D. 36 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ SODYUM METABİSÜLFİT İN SIÇAN KEMİK İLİĞİ HÜCRELERİNDE İN VİVO GENOTOKSİK ETKİLERİ Ahmet KAYRALDIZ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Yıl : 2005, Sayfa: 67 Jüri : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Doç. Dr. Gökhan CORAL Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA Bu çalışmanın amacı, gıdalarda antimikrobial madde olarak kullanılan Sodyum Metabisülfit (SMB) in sıçan kemik iliği hücrelerinde in vivo genotoksik etkilerini araştırmaktır. Bu çalışmada SMB, intraperitonal (ip) uygulamada anormal hücre yüzdesini (AH) ve KA/hücre genel olarak tüm muamele sürelerinde (6, 12, 24 Saat) ve konsantrasyonlarda (250, 500, 750 ve 1000 mg/kg vücut ağırlığı (v.a.)) kontrole göre önemli ölçüde arttırmıştır. Ancak bu artış pozitif kontrol (Ethyl Carbamate) kadar olmamıştır. SMB, 6 saatlik muamele süresinde mitotik indeksi (MI) sadece 750 ve 1000 mg/kg v.a. dozlarda kontrole nazaran önemli derecede düşürürken, bu düşüş 12 ve 24 saatlik muamele sürelerinde ise tüm konsantrasyonlarda önemli derecede bulunmuştur. SMB, gavage (gv) uygulamada anormal hücre yüzdesini (AH %) ve KA/hücre sayısını 6 saatlik muamele süresinin tüm konsantrasyonlarında hem kontrol hem de pozitif kontrole göre önemli ölçüde arttırmamıştır. Halbuki SMB, 12 saatlik muamele süresinde ve tüm konsantrasyonlarda AH % si ve KA/hücre sayısını kontrole göre önemli ölçüde artırmıştır. 24 saatlik muamele süresinde ise SMB, AH% si ve KA/Hücre sadece 750 ve 1000 mg/kg v.a. konsantrasyonlarda kontrole göre önemli ölçüde artırmıştır. SMB gavage uygulamada 6 saatlik muamele süresinde sadece 1000 mg/kg v.a. konsantrasyonunda MI pozitif kontrole nazaran düşürürken, 12 saatlik muamele süresinde 250 mg/kg v.a. konsantrasyonu hariç tüm konsantrasyonlarda, 24 saatlik muamele süresinde ise tüm konsantrasyonlarda MI i hem kontrol hem de pozitif kontrole nazaran önemli ölçüde düşürmüştür. Anahtar Kelimeler: Gıda Katkı Maddesi, Sodium Metabisülfit, In vivo Kromozom Aberasyonu, Sıçan I

4 ABSTRACT PhD THESIS IN VIVO GENOTOXIC EFFECTS OF SODIUM METABISULFIT ON BONE MARROW CELLS Ahmet KAYRALDIZ DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Year : 2005, Sayfa: 67 Jury : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Assoc. Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Assoc. Prof. Dr. Gökhan CORAL Asist. Prof. Dr. Hasan Basri İLA The aim of this study was to investigate the genotoxic effects of sodium metabisulphite (SMB), which is used as an antimicrobial substance in foods on bone marrow cells of rats. In this study, SMB increased the percentages of abnormal cells with chromosomal abnormalities and CA/cell in all the concentrations (250, 500, 750 and 1000 mg/kg body weight (b.w.)) and treatment periods (6, 12 and 24 h) when compared with control after intraperitonally administration. However, SMB did not increase the abnormallities as much as positive control (Ethyl Carbamate). SMB decreased the Mitotic Index (MI) at 750 and 1000 mg/kg b.w.concentrations for 6 hour treatment period while SMB decreased the MI in all the concentrations for 12 and 24 hours treatment periods when compared with control. SMB did not increase the percentage of abnormal cells and CA/cell in all the concentrations for 6h treatment period when compared with control and positive control in bone marrow cells of rats treated with SMB orally (gavage). However, SMB significantly increased the abnormallities at all concentrations for 12 hour treatment period when compared with control. At 24 hour treatment period, SMB increased the abnormalities only at 750 and 1000 mg/kg b.w. when compared with control. In all concentrations and treatment periods, SMB did not induced the abnormalities when compared with positive controls when orally administreted. SMB decreased the MI at 1000 mg/kg b.w. for 6 h treatment period when compared with positive control. At all concentrations for 12 h treatment period, SMB significantly decreased the MI when compared with control and positive control except 250 mg/kg b.w. In addition, SMB significantly decreased the MI at all concentrations for 24 h treatment period according to control and positive control. Key Words: Food Additive, Sodium Metabisulphite, In vivo Chromosomal Aberrations, Rat II

5 TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve çalışmalarım sırasında bana rehberlik eden, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Hocam Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a, bana göstermiş olduğu sabır ve ilgiden dolayı Sayın Hocam Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI na sonsuz minnetlerimi sunarım. Genetik Laboratuarında birlikte çalıştığımız ve çalışmam esnasında benden yardımlarını esirgemeyen Sayın Hocam Yrd. Doç. Dr. Hasan Basri İLA ya, araştırma görevlisi arkadaşım Ayşe YAVUZ a, biyolog arkadaşlarım Mehmet ARSLAN ve Fatma Funda KAYA ya teşekkür ederim. Projemizi maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Araştırma Fonu yöneticilerine de teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR.... III KISALTMALAR... IV ÇİZELGELER DİZİNİ.... VI ŞEKİLLER DİZİNİ.... VII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Asetik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Benzoatlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Bifenil, Sodyum Ortofenil Fenolle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Borik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Formaldehitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Formik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Laktik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Lizozimle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Malik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Nisinle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Nitrit ve Nitratlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Potasyum Bromatla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Propionic Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Sodyum Hipokloritle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Sorbatlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Sülfitlerle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Tiabendazolle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları MATERYAL VE METOD Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Sodium Metabisülfite (SMB) Sodium Metabisülfite nin Kimyasal Özellikleri. 29 IV

7 Ethyl Carbamate (EC=Ürethan) Kolkisin Fizyolojik Çözelti Hipotonik Çözelti Fiksatif Sorensen Tampon Çözeltisi Giemsa Entellan Nitrik Asit Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Santrifüj Mikroskop İnkübatör Lamların Temizlenmesi Kromozom İncelemeleri İçin Deney Hayvanlarına SMB ve EC nin Verilmesi, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Deney Hayvanlarına SMB nin ve EC nin Verilmesi İntraperitonal Yolla (ip) SMB nin ve EC nin Deney Hayvanlarına Uygulanması Gavage Yoluyla (gv) SMB nin ve EC nin Deney Hayvanlarına Uygulanması Kromozom İncelemeleri İçin Preparatların Hazırlanması Preparatların Boyanması Mikroskobik İncelemeler Kromozom Anormalliklerinin (KA) (Chromosome Aberration=CA), Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Kromozom Anormalliklerinin Saptanması Mitotik Indeksin (MI) Saptanması Mikroskopta Fotoğraf Çekme İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi.. 36 V

8 4. BULGULAR SMB nin Sıçanlara İntraperitonal Yolla Enjekte Edilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Anormal Hücre Yüzdesi (Kromozom Anormalliğine Sahip Hücre Yüzdesi), KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndeks SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Anormal Hücre Yüzdesi (Kromozom Anormalliğine Sahip Hücre Yüzdesi), KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndeks SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla ve İntraperitonal Yolla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Oluşan Anormal Hücre Yüzdesi, KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndekslerin Karşılaştırılması TARTIŞMA SMB nin Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Kromozom Aberasyonu Oluşumu Üzerine Etkileri ve Sitotoksiditesi SMB nin Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Kromozom Aberasyonu Oluşumu Üzerine Etkileri SMB nin Hücre Bölünmesi Üzerine Etkisi SONUÇ VE ÖNERİLER.. 56 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ VI

9 KISALTMALAR B Kromatid Kırığı B Kromozom Kırığı F Fragment KD Kromatid Değişimi KKB Kardeş Kromatid Birleşmesi DS Disentrik Kromozom T Translokasyon P Poliploid BrdUrd 5 -Bromo-2 -Deoxyuridine AH Anormal Hücre KA Kromozomal Anormallik MI Mitotik İndek RI Replikasyon İndeksi va Vücut Ağırlığı CAC FAO nun Gıda Komisyonu WHO Dünya Sağlık Teşkilatı FAO Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Teşkilatı JECFA Birleşik Gıda Katkı Uzmanları Alt Komitesi NOEL Bir Kimyasal Maddenin Hayvanlara Zarar Vermeyen Dozu ADI Bir Kimyasal Maddenin İnsanın Ömrü Boyunca Vücut Ağırlığının mg ı Başına Aldığında Zarar Vermeyen Dozu ML ADI Miktarının İzin Verilen En Yüksek Dozu SMB Sodyum Metabisülfit HGPRT Hipoksantin Guanozin Fosforibozil Transferaz IP İntraperitonal Uygulama GV Gavage Uygulama EC Ethyl Carbamate (=Ürethan) DNA Dezoksiribonukleik Asit KCI Potasyum Klorür VII

10 KKD NaCI SCE SSC SU Gy SMART ICR LD 50 CA SE Kardeş Kromatid Değişimi Sodyum Klorür Sister Chromatid Exchange Standart Saline Citrate Sister Union Gray Wing Spot testi Bir Tür Fare Bir Kimyasalın Kullanılan Deneklerin Yarısını Öldüren Toksik Dozu Chromosome Aberration Standart Hata VIII

11 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. SMB nin Sıçan Karın Zarına (İntraperitonal Olarak) Enjekte Edilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Rastlanan Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Yüzdesi, KA/hücre ve Mitotik İndeks. 39 Çizelge 4.2. SMB nin Ağız Yoluyla (Gavage Yoluyla) Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Rastlanan Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Yüzdesi, KA/hücre ve Mitotik İndeks.. 45 Çizelge 4.3. SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla ve İntraperitonal Yolla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Saptanan Anormal Hücre Yüzdesi, KA/Hücre Sayısının ve Mitotik İndekslerin Karşılaştırılması.. 50 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Sodyum Metabisülfit in Açık Formülü.29 Şekil 4.1. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 12 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi.40 Şekil 4.2. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 12 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. 40 Şekil 4.3. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi.. 41 Şekil 4.4. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi.. 41 Şekil 4.5. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde MI nın doza bağlı azalmasını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi...42 Şekil 4.6. Kardeş Kromatid Birleşmesi (KKB) (1000 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 saatlik muamele süresi, Intraperitonal Uygulama, ).X Şekil 4.7. Fragment (F) (750 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 12 Saatlik muamele süresi, İntraperitonal Uygulama, ).X X

13 Şekil 4.8. Kromatid Değişimi (KD) (500 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 Saatlik muamele süresi, İntraperitonal Uygulama, ).X Şekil 4.9. Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi...46 Şekil Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/Hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi 46 Şekil Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde MI nın doza bağlı azalmasını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi.47 Şekil Kardeş Kromatid Birleşmesi (KKD) (1000 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 12 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ).X Şekil Kromatid Kırığı (B ) (750 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ).X Şekil Kromatid Değişimi (KD) (500 mg/kg vücut ağırlığı, 12 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ).X XI

14 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ 1. GİRİŞ Günümüzde 2 milyon çeşitten fazla kimyasal madde çeşitli amaçlar için kullanılmakta ve bu sayıya her yıl yeni kimyasal madde eklenmektedir (Ağüloğlu ve Ortakaya, 1992). 20. yüzyılın başlarında çoğu doğal kaynaklı olmak üzere birkaç bin kimyasal madde kullanılmaktayken bu maddelerin kullanımı özellikle 1940 lardan sonra hızla artmıştır yılında 7 milyon ton/yıl olan dünya kimyasal madde üretimi, 1985 yılında 250 milyon ton/yıl a yükselmiştir. Bugün bu rakam 400 milyon ton/yıl a ulaşmıştır (Karakaya, 2005). Kimyasal maddelerin yoğun ve nispeten kontrolsüz olarak kullanılmaya başlandığı yıllarda yapılan hatalardan insan sağlığı ve çevre zarar görmüştür. Gerek kimyasal maddelerin her alanda yoğun olarak kullanılmaya başlanması, gerekse kontrolsüz kullanımın yarattığı ciddi sağlık ve çevre sorunları, toplumlarda kimyasal madde kullanımına karşı oluşan korku ve tepkinin nedenidir. Kimyasalların insan sağlığı üzerindeki etkileri devamlı tartışma konusu olmaktadır. Toplumlarda en önemli sağlık göstergesi doğuştan yaşam beklentisi olarak da tanımlanan ortalama yaşam süresidir yılında Dünya'da ortalama yaşam süresi iki cinsiyet ortalaması olarak 30 yıl iken, 1997 yılında 63 yıla yükselmiştir. Bu rakamlar ABD'de 1900 ve 1997 yılları için 49 ve 77'dir. Bu gelişmede başta ilaçlar ve suyun mikropsuz hale getirilmesinde kullanılan kimyasallar olmak üzere, insanlara kimyasalların da yardımıyla yeterli ve kontaminasyondan korunmuş gıdaların temin edilebilmesinin de önemli payı vardır. Ancak, bu değerlendirmeden kimyasalların insan sağlığı ve çevre için zararsız olduğu anlamı çıkartılmamalıdır. Kimyasal maddelerin rastgele kullanımı insan sağlığı ve çevre için büyük tehdittir. Özellikle 1960'lardan sonra toksikoloji bilimindeki hızlı gelişmenin yanısıra, kimyasal maddeler için risk yönetimi uygulamalarının geliştirilmesi, güvenli kimyasal kullanım olanağını getirmiştir. Günümüzde ilaç, gıda katkı maddesi, kozmetik, tarım ilacı, endüstri kimyasalı olarak kullanılan birçok kimyasalın insan sağlığı ve çevreye olan etkisi ayrıntılı olarak incelenmekte olup, insan sağlığı ve çevre üzerinde kabul edilemez ölçüde risk taşıyanların kullanımına izin verilmemektedir (Karakaya, 2005). 1

15 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ Gıda katkı maddeleri, gıdalarda mikrobiyolojik bozulmayı önleme ve dayanıklılığı arttırma, besleyici değeri koruma, teknolojik işlemlere yardımcı olma, renk, görünüş, lezzet, koku gibi duyusal özellikleri düzeltme gibi pek çok amaçla katılan maddelerdir. Gıda katkı maddelerinin kullanılması ile ilgili tarihsel gelişmeler incelendiğinde, M.Ö yıllarında et ürünlerini kürlemede tuzdan yararlanıldığı, M.Ö. 900 yıllarında ise tuz ve odun tütsüsünün gıda saklama yöntemleri olarak kullanıldıkları görülmektedir. Ortaçağlarda etlere koruyucu amaçla tuz ve tütsünün yanısıra katılan nitratın etin rengini olumlu yönde değiştirmek ve çürümeyi önlemek amacıyla kullanıldığı bilinmektedir. M.Ö.50. yılda baharatlardan lezzet verici olarak yararlanılmış, gıda boyaları ise günümüzden yaklaşık 3500 yıl kadar önce Mısırlılar tarafından renklendirici amaçla kullanılmışlardır. 19yy. daki hızlı şehirleşmenin paralelinde katkı maddelerinin kullanımları, özellikle gıdaları bozulmalara karşı koruma amacıyla yaygınlaşmış olup, günümüzde ise bu maddeler gelişen gıda teknolojisinin vazgeçilmez bir parçasını oluşturmuşlardır (Altuğ, 1999). Tüketicilerin bilinçlenmeleri paralelinde de katkı maddelerinin özellikleri ve sağlıkla olan ilişkileri gıda satın almada dikkati çeken ve özen gösterilen bir konu haline gelmiştir. Katkı maddesi ve sağlık ilişkisinde şüpheler özellikle 3 konuda yoğunlaşmış olup, bunlar şunlardır: Katkı maddelerinin kimyasal yapıda olmaları, E numaraları ile ifade edilmeleri, Allerji yapmaları Gıda biliminde kimyasal madde kavramı içinde hava, su, tuz ve laboratuvarda sentezlenen kimyasallar gibi değişik maddeler yer almaktadır. Bu maddeler arasında yukarıda belirtilen ve gıdanın yapısında doğal olarak bulunan maddeler dışında, gıdalara istenilmeden bulaşan kontaminant niteliğindeki maddeler ve gıdaya belirli amaçlar için istenilerek katılan katkı maddeleri yer almaktadır. Kontaminant, gıdalarda istenilmeyen iz elementler, aflatoksinler, nitrozaminler vb. gibi oldukça 2

16 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ toksik maddeler olup, gıdalara bulaşma yollarının önlenmesi için çeşitli çalışmalar yapılmakta ve gıdalarda bulunabilecek sınırları yasalarla belirlenmektedir. Gıda katkı maddeleri ise gıdalara istenilerek katılan maddeler olup, bu maddelerin özellikleri ve gıdalarda kullanım sınırları Dünyada uluslararası düzeyde araştırmalarla ele alınan bir konudur. Bu amaçla Dünya Sağlık Teşkilatı (WHO) ve Gıda Tarım Örgütü (FAO) nün oluşturduğu gıdalarla ilgili komisyon (CAC) ve bu kuruluşun gıda katkı maddeleri ile alt komitesi olan Birleşik Gıda Katkı Uzman Komitesi (JECFA) katkı maddelerinin insan sağlığı açısından güvenilirliği konusunda çalışmalar yapmakta ve belirli dozlarda kullanımında sakınca olmadığı belirlenen maddelerle ilgili listeler hazırlanmaktadır. JECFA komisyonunda görev alan tarafsız uzmanlar gerçekleştirdikleri uzun süreli ve detaylı toksikolojik değerlendirmeler sonucunda, sözkonusu katkı maddesinin deney hayvanlarına zarar vermeyen dozunu (NOEL) saptamaktadır. Bu değer, insanlar için bir ömür boyu vücut ağırlığının mg başına alındığında zararlı etki yapmayacak doza (ADI) çevrilirken güvenlik faktörü olan 100 rakamına bölünmektedir. Bu verilere dayanarak hazırlanan listelere katkının ADI değeri ve bu değer esas alınarak değişik gıdalarda izin verilecek maksimum miktarları (ML) belirtilmekte, sakıncalı olabilecek maddeler (Butter Yellow, Hidrojen Peroksit, vb.) liste dışı bırakılmaktadır. CAC tarafından önerilen listeler Avrupa Topluluğu (EC) tarafından da benimsenmiş olup, bu topluluğun da benzer listeleri mevcuttur. Dünyadaki çeşitli ülkeler listeleri esas alarak kendi ülkelerinde kullanımına izin verilen katkı maddelerinin listelerini düzenlemektedirler. Ülkemizde de kullanımı uygun görülen gıda maddeleri CAC ve EC tarafından oluşturulan listelerden titizlikle seçilmektedir (Altuğ, 1999). Bazı kişiler bazı katkı maddelerine karşı allerjik reaksiyonlar gösterebilirler, ancak allerji durumlarının çilek, yumurta, kakao, çikolata hatta süt gibi pek çok doğal gıdaya karşı oluştuğu da bilinen bir gerçektir. İngiltere'de yapılan bir çalışmada katkı maddesi kullanımı ile olan allerjik reaksiyonların populasyonun yalnızca % 0.1 inde görüldüğünü ortaya çıkarmıştır. Ayrıca değişik ülkelerdeki yönetmeliklerde allerji yapabilen tartrazin, sunset yellow, kükürtdioksit gibi katkı içeren gıdaların etiketlerinde ikaz ibaresi bulundurulmasının öngörüldüğü bilinmektedir. 3

17 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ Bu bilgilerden de anlaşılacağı gibi ülkemizde katkı maddeleri konusu, dünyadaki tüm gelişmiş ülkelerde olduğu gibi titizlikle ele alınmakta ve yasal kuruluşlarca denetlenmektedir. Kullanımına izin verilen katkı maddelerinin denetiminde değerlendirilmesi gereken en önemli iki husustan birincisi bu maddelerin gıda saflığında olmaları, diğeri ise gıdalarda izin verilen sınırı aşmamaları gerektiğidir. Bu denetim ise ancak ülkede etkin bir kontrol sisteminin kurulması ile gerçekleşebilir. Gerek katkı maddeleri kullanımında, gerekse genel anlamda gıda tüketiminde Toksikoloji biliminin öncülerinden Paracelcus ( ) un "Her madde toxindir, ancak toxin ile ilacı birbirinden ayıran dozdur" ifadesi de unutulmamalıdır (Altuğ, 1999). Gıda katkı maddelerini şu şekilde sınıflandırmamız mümkündür 1.Kaliteyi koruyarak raf ömrünü uzatanlar (Koruyucular) a. Antimikrobiyaller (nitrit, benzoik asit, sorbik asit, kükürt dioksit sodium metabisulfite...) b. Antioksidanlar (Butylated Hydroxyanisole, Butylated Hydroxytoluene, propil gallat...) 2. Hazırlama ve pişme özelliğini geliştirenler a. ph ayarlayıcılar (asetik asit, propionik asit, kalsiyum karbonat...) b. Topaklanmayı önleyenler(magnezyum oksit, magnezyum karbonat, silikon dioksit...) c. Emülsiyon yapıcılar (lesitin, mono ve digliseritler...) d. Stabilizörler, kıvam arttırıcılar ( kalsiyum asetat, kalsiyum karbonat...) 3. Aroma, lezzet,tad ve renk geliştiriciler a. Lezzet vericiler (aroma maddeleri) b. Lezzet arttırıcılar (Monosodium Glutamate, inisitol) c. Renklendiriciler (tartrazin, kurkumin,annotto, β-karoten...) 4

18 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ d. Yapay tadlandırıcılar (aspartam, sakarin, asesulfam K, neoherperidin DC...) Bu çalışmada kullanılan Sodyum Metabisülfit (SMB) de bir gıda katkı maddesidir. Gıda katkı maddelerinin genotoksik etkiye sahip oldukları da bir çok farklı test sistemiyle araştırılmıştır (Karakaya, 1999). Abe ve Sasaki (1977) kültür edilmiş Chinese hamster hücrelerini 30 farklı kimyasala maruz bırakmışlar ve potassium sorbate ve sodium benzoate nin Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) ve Kromozomal Aberasyonları (KA) artırdığını bildirmişlerdir. Bir başka çalışmada Nagao ve ark. (1977) lizozim in Salmonella typhimurium un TA100 ve TA98 suşları için mutajen olduğunu bildirmişlerdir. Ishidate ve Odashima (1977) in vitro kromozomal aberasyon testi kullanarak aralarında yiyecek katkı maddelerinin de bulunduğu 134 çeşit kimyasal maddenin mutajenitesini incelemişlerdir. İncelenen bu 134 kimyasal maddeden bakteriler için mutajen olan hemen hemen hepsinin KA testinde de pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Yine Ishidate ve ark. (1984) Japonya da kullanılmakta olan 190 sentetik kökenli, 52 doğal kökenli gıda katkı maddesinin genotoksiditesini in vitro Chinese hamster fibroblast kültürlerinde kromozom aberasyonu ve Salmonella typhimurium da Ames testi ile araştırmışlar, bu çalışma sonucunda bu maddelerden yalnızca 14 tanesinin Ames testinde pozitif sonuç verdiğini, 54 tanesinin de kromozomal anormallik testinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Ancak bunlardan 11 tanesinin (fast gren, hidrojen peroksit, potasyum bromat, sodyum klorit, sodyum hipoklorit, sodyum nitrit, kakao ve karamel) hem KA testinde hem de Ames testinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Njagi ve Gopalan (1982) Vicia faba kök ucu hücreleri ile yapmış oldukları çalışmada sodyum sulfite ve sodyum benzoate nin dozunun artmasına bağlı olarak kromozomal anormalliklerde bir atış olduğunu, ayrıca interfazda kromatin erozyonuna neden olduklarını bildirmişlerdir. Hasegawa ve ark. (1984) sorbik asit ve onların potasyum ve sodyum tuzlarının kültüre edilmiş Chinese hamster V79 hücrelerinde kardeş kromatid değişimi ve gen mutasyonlarını arttırdığını bildirmişlerdir. Luca ve ark (1987) in vivo ve in vitro denemelerle sodyum nitrit in mutajenitesini araştırmışlar ve nitritin anormal metafaz 5

19 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ hücrelerinin oranını seçilen 3 türde de (sıçan, fare ve tavşan) önemli derecede arttırdığını bildirmişlerdir. Mukherjee ve ark. (1988) akut olarak sodyum nitritin ve sorbik asitin, tek başlarına ve karışım halinde fare kemik iliği hücrelerine olan etkilerini araştırmışlar ve kontrol ile kıyaslandığında sorbik asitin en yüksek üç konsantrasyonda KKD frekansını önemli ölçüde arttırdığını, sodyum nitritin ise seçilen tüm dozlarda KKD frekansını arttırdığını bildirmişlerdir. Kombinasyon halinde verildiklerinde ise KKD frekansı ayrı ayrı verildiklerinden iki kat fazla olmuştur. Munzer ve ark. (1990) potasyum sorbat ve sodyum sorbat ın genotoksisitesini Ames testi, Chinese hamster ovaryum hücrelerinde HGPRT enzimi geninde gen mutasyonu ve kardeş kromatid değişimi testlerini, sıçan ve Chinese hamster kemik iliği hücrelerinde mikronukleus testlerini kullanarak test etmişler, her iki kimyasalın in vitro testlerde bir genotoksidite göstermediğini, in vivo testlerde ise bu katkı maddelerin taze hazırlanmış eriyiklerinin hiçbir klastojenik etki göstermemesine karşılık, bekletilmiş eriyiklerinde klastojenik bir etkiye sahip olduklarını bildirmişlerdir. Çalışmamızda kullandığımız sodyum metabisülfit (SMB) antimikrobiyal madde olarak bisküvitlerde, çukolatalarda, şekerlerde, salam ve sucuklarda, şarap, şampanya, vs. gibi alkollü içeceklerin bir çoğunda kullanılmaktadır. Tarım Bakanlığı SMB nin kullanılabilecek en yüksek dozunun 300 µg/ml olması gerektiğini bildirmişlerdir (Tarım Bakanlığı Gıda Kodeksi, 1997). SMB suda çözündüğünde sodyum bisülfit ve sülfür dioksite dönüşmektedir. Bisülfit in genotoksik etkilerini araştırmak amacıyla bugüne kadar birçok çalışma yapılmıştır. Meng ve Zhang (1992) bisülfit in (HSO 3 ) insan periferal lenfositlerinde mikronükleus oluşumunu, ayrıca kardeş kromatid değişimini ve kromozomal anormallikleri arttırdığını bildirmişlerdir. Bir diğer çalışmada Meng ve Zhang (1999) bisülfit in CHO AS52 hücrelerinde guanin fosforibozil transferaz (GPT) geninde mutasyonu arttırdığını saptamışlardır. Ayrıca Pagano ve Zeiger (1987) bisülfit in ph 5-6 da Salmonella typhimurium un TA1535 ve TA97 suşları için zayıf mutajen olduğunu ancak TA1537 ve TA1538 suşları içinse mutajen olmadığını bildirmişlerdir. 6

20 1. GİRİŞ Ahmet KAYRALDIZ Rencüzoğulları ve ark. (2001a) Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde SMB nin tüm konsantrasyon ve muamele sürelerinde MI i düşürdüğünü, mitotik anormallikleri de doza bağlı olarak arttırdığını bildirmişlerdir. Aynı araştırma grubu (Rencüzoğulları ve ark. 2001b) SMB nin tüm konsantrasyon ve muamele sürelerinde insan periferal lenfositlerinde kardeş kromatid değişimi ve kromozomal aberasyonları doza bağlı olarak arttırdığını, buna karşılık mitotik indeksin ve replikasyon indeksinin doza bağlı olarak düştüğünü bildirmişlerdir. Yukarıdaki çalışmalardan da görüldüğü gibi SMB nin in vivo genotoksik etkisiyle ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır. İşte bu çalışmanın amacı sıçan kemik iliği hücrelerinde SMB nin in vivo genotoksik etkiye sahip olup olmadığını kromozom aberasyonu (KA) testi ile araştırmaktır. 7

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gıdalardaki katkı maddeleri ve gıdaların sterilizasyonunda kullanılan maddelerle yapılmış olan genotoksidite ve toksidite çalışmalarını aşağıdaki şekilde açıklayabiliriz Asetik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Et ve et ürünlerinde, süt ürünlerinde, meyve ve sebze konservelerinde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Morita ve ark. (1990), Chinese hamster ovaryum K1 hücrelerini kullanarak asetik asit in klastojenik aktivitelerinin medyumun ph ile olan ilişkisini test etmişlerdir. Bu çalışmaya göre, bu asitin mm lık konsantrasyonunun başlangıç ph ı 6 veya daha aşağı olan besiyerlerinde kromozomal aberasyonlarını hem S9 bulunan hem de bulunmayan ortamlarda uyardığı bildirilmiştir. Bu asitin mm lık konsantrasyonunun ph 5.7 veya daha aşağıdaki medyumlarda da toksik olduğu saptanmıştır Benzoatlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Benzoatlar, muz, kek, hububat, çikolata, soslar, katı ve sıvı yağlar, meyankökü, margarin, mayonez, süt tozu, patates tozu ve kuru maya gibi bazı gıdaların işlenmesi sırasında gıda koruyucusu olarak kullanılır. Abe ve Sasaki (1977), kültüre edilmiş Chinese hamster hücrelerini 33 çeşit farklı kimyasala maruz bırakarak, kardeş kromatid değişimi ve kromozomal anormalliklerini incelemişlerdir. Bu çalışmalar sonucunda potasyum benzoat ve sodyum benzoat ın kardeş kromatid değişimi ve kromozomal anormalliklerinin frekansında önemli bir artışa neden olduğu saptanmıştır. Ishidate ve Odashima (1977), kültüre edilmiş Chinese hamster hücrelerinde aralarında gıda katkı maddelerinin de bulunduğu 134 çeşit kimyasalın genotoksik etkisini incelemişler ve sodyum benzoat ile potasyum benzoat ın kromozom 8

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ anormalliği testinde pozitif sonuç verdiğini, ancak kesin bir yargı için ilave testlerin yapılması gerektiğini bildirmişlerdir. Tohda ve ark. (1980), insan lenfoblastoid hücreleri için 30 mmol/litre konsantrasyonundaki benzoik asit in sitotoksik etkili olduğunu bildirmişlerdir. Sato ve ark. (1987), benzoik asit, vanilin, vanilik asit, ferulik asit ve resorkcinol maddelerinin herhangi bir mutajenik etkiye sahip olmadıklarını bildirmişlerdir. Vernole ve ark. (1987) ve Vernolle ve ark. (1988) benzoik asit in potasyum tuzlarının insan periferal lenfositlerinde KKD ve KA üzerine etkilerini araştırmışlar ve benzoik asit in potasyum tuzunun ne KKD yi nede KA yı arttırmadığını saptamışlardır. Zeiger ve ark. (1988) Salmonella typhimurium un TA97, TA98, TA100, TA1535 ve TA1537 suşlarında sodyum benzoat ın 5000µg/plate in üzerindeki dozlarda sitotoksik etkili olduğunu bildirmişlerdir. Kuboyama ve Fujii (1992), bir gıda katkı maddesi olan benzoik asitin Salmonella /mikrozom testinde TA100 suşu için zayıf mutajen olduğunu bildirmişlerdir. Nair (2001), sıçan ve fare ile yapmış oldukları in vivo çalışmada sodyum benzoat ın sıçanlarda ve farelerde herhangi bir toksisite göstermediğini bildirmiştir Bifenil, Sodyum Ortofenil Fenolle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Taze meyve ve sebzelerde, daha çok narenciyelerin yüzey uygulamalarında koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Sasaki ve ark. (1997), oral olarak verdikleri ortho-phenylphenol (2000mg/kg), biphenyl (2000 mg/kg) ve tiabendazol (200 mg/kg) ün genotoksiditesini in vivo olarak alkaline jel elektroforez tekniğiyle (comet testi) göstermeye çalışmışlardır. Bu çalışma sonucunda ortho-phenylphenol, biphenyl ve tiabendazol ün mide, karaciğer, böbrek, idrar yolları ve akciğerde DNA hasarını arttırdığı ortaya çıkmıştır. 9

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Sasaki ve ark. (2002), gıda sektöründe kullanılan 39 farklı kimyasalı farelere oral yolla verip 8 farklı (mide, barsak, akciğer, böbrek, idrar torbası, karaciğer, beyin ve kemik iliği) organda comet assay deneyini kullanarak genotoksiditelerini saptamaya çalışmışlardır. Bu çalışma sonucunda biphenyl, sodium o-phenylphenol ve tiabendazol ün sindirim sistemiyle ilgili organlarda DNA hasarını uyardığı saptanmıştır Borik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Et ve balık konservelerinde ve havyarda antimikrobiyal ajan olarak kullanılmaktadır. Uluslararası Toksikoloji Programı (1987), borik asit in Chinese hamster ovaryum hücrelerinde KKD ve KA yı etkilemediğini, Salmonella /mikrozom testinde de mutajen olmadığını bildirmiştir. Odunola (1997), borik asit in E. coli PQ37 de β-galaktozidaz sentezini ortamda S9-Mix bulunduğunda ve bulunmadığında önemli ölçüde arttırdığını saptamıştır. Dönbak ve ark. (2002), borik asit in Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde c- mitoz u hafif bir şekilde artırdığını ve ayrıca mitotik aktiviteyi düşürdüğünü saptamışlardır. Arslan (2004), borik asit in insan periferal lenfositlerinde kromozomal aberasyonları 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde, KKD yi ise sadece 48 saatlik muamele süresinde doza bağlı bir şekilde arttırdığını bildirmiştir. Ayrıca, bu çalışmada borik asit in gerek 24 saatlik gerekse 48 saatlik muamele sürelerinde MI ve RI nin doza bağlı bir şekilde düştüğü kaydedilmiştir. 10

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ 2.5. Formaldehitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Provolon peynirinde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Basler ve ark. (1985), S9 mix ve sıçan hepatositlerinin bulunduğu ve bulunmadığı in vitro ortamlarda kardeş kromatid değişimi üzerinde formaldehit in etkisini Chinese hamster V79 hücre kültürlerinde araştırmışlardır. Araştırıcılar, S9 mix in bulunmadığı ortamlarda formaldehit in kardeş kromatid değişimini toksik olmayan dozlarda doza bağlı olarak arttırdığını, S9 mix ve sıçan hepatositleri gibi bir metabolik aktivatörün varlığında ise kardeş kromatid değişimini arttırmadığını saptamışlardır Formik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Gazlı içecekler, meyve ve sebze konservelerinde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Morita ve ark. (1990), Chinese hamster ovaryum K1 hücrelerini kullanarak formik asit in klastojenik aktivitelerinin medyumun ph sı ile olan ilişkisini test etmişlerdir. Bu çalışmaya göre bu asitlerin her birinin ayrı ayrı mm konsantrasyonunun başlangıç ph ı 6 veya daha aşağı olan besiyerlerinde kromozomal aberasyonlarını hem S9 mix bulunan hem de bulunmayan ortamlarda uyardıkları bildirilmiştir. Bu asitin mm konsantrasyonlarının ph 5.7 veya daha düşük ph lı medyumlarda da toksisite gösterdiği saptanmıştır. Al-Tarazi ve Alshawabkeh (2003), propionik asit ve formik asit in karışım halinde Salmonella pullorum üzerinde inhibisyon etkisini araştırmışlar ve karışım halinde propionik asit-formik asit karışımının kültürdeki koloni sayısında kontrole göre önemli derecede bir azalmaya neden olduğunu saptamışlardır. 11

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ 2.7. Laktik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Meyve ve sebze konserveleri, reçel, marmelatlar ve şekerlemelerde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Morita ve ark. (1990), Chinese hamster ovaryum K1 hücrelerini kullanarak laktik asit in klastojenik aktivitelerinin medyumun ph sı ile olan ilişkisini test etmişlerdir. Bu çalışmaya göre bu asitin mm konsantrasyonlarının başlangıç ph ı 6 veya daha aşağı olan besiyerlerinde kromozomal aberasyonlarını hem S9 bulunan hemde bulunmayan ortamlarda uyardıkları bildirilmiştir. Bu asitin mm ı ph 5.7 veya daha aşağıdaki medyumlarda da toksik oldukları saptanmıştır Lizozimle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Olgunlaştırılmış peynirde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Nagao ve ark. (1977), lizozim in memeli metabolik aktivasyon sistemli in vitro ortamda Salmonella typhimurium un TA100 ve TA98 suşları için mutajenik olduğunu bildirmişlerdir Malik Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Şekerleme, şerbet, şuruplar, dondurmalar ve gazsız içeceklerde koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Fiume (2001), çeşitli dozlarda malik asiti sıçan, fare ve tavşanların besinlerine katarak toksiditesini araştırmıştır. Bu çalışma sonucunda malik asit in herhangi bir toksisiteye neden olmadığı, sadece yüksek konsantrasyonlarda hayvanlarda çok düşük oranlarda kilo kaybına neden olduğu saptanmıştır. 12

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Nisinle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Süt ürünlerinde, konserve meyve ve sebzelerde antimikrobiyal madde olarak kullanılmaktadır. Murinda ve ark. (2003), bir koruyucu madde olan nisin in yüksek derecede bakteriostatik olduğunu ve memeli hücreleri için de toksik olduğunu bildirmişlerdir Nitrit ve Nitratlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Nitrit ve nitratlar hem koruyucu olarak hem de renklendirici ve lezzet arttırıcı olarak kullanılır. Nitrat ve nitritler özellikle sosis, salam gibi et ürünlerinde ve süt ürünlerinde bulunur. Kodama ve ark. (1976), kültüre edilmiş fare FM3A kanser hücre hattının çeşitli dozlardaki sodyum nitrit ile muamelesi sonucunda incelenen hücrelerin %80 ninde kromozomal aberasyon olduğunu bildirmişlerdir. Ishidate ve Odashima (1977), kültüre edilmiş Chinese hamster hücrelerinde aralarında gıda katkı maddelerinin de bulunduğu 134 çeşit kimyasalın genotoksik etkisini incelemişler ve sodyum nitrat ve sodyum nitrit in kromozom testinde pozitif sonuç verdiğini, ancak kesin bir yargı için ilave testlerin yapılması gerektiğini bildirmişlerdir. Tsuda ve Kato (1977), kültüre edilmiş Chinese hamster hücrelerini çeşitli dozlardaki sodyum nitrit ile muamele etmişlerdir. Bu çalışma sonucunda in vitro da sodyum nitrit in endoredublikasyonu ve kromozomal anormallikleri arttırdığı saptanmıştır. Inui ve ark. (1979), Syrian golden hamster ları sodyum nitrit in farklı dozları ile bir hafta süreyle oral uygulama ile muamele etmişler, bu süre sonunda uterustaki embriyonik hücreleri izole ederek bu hücrelerde mikronükleus oluşumu, kromozomal anormallikler ve morfolojik anormalliklere bakmışlardır. Bu çalışma sonucunda sodyum nitrit in doza bağlı olarak mikronükleus oluşumunu arttırdığı, fakat kromozomal anormalliklerde bir artışa neden olmadığı ayrıca bu uygulama sonunda hücrelerde morfolojik anormalliklerin de meydana geldiği bildirilmiştir. 13

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Vachkova-Petrova (1979), sodyum nitrit ve basfungin in çeşitli dozlarını karışım halinde intraperitonal yolla sıçanlara vermişler ve basfungin in mutajenik etkisine sodyum nitrit in bir etkisinin olup olmadığını araştırmıştır. Bu çalışma sonucunda basfungin in tek başına yapmış olduğu etkinin karışım halinde verildiğinde de aynı şekilde devam ettiği saptanmıştır. Blitek ve ark. (1983), oxytetracycline ve potasyum nitrit in tek başlarına ve karışım halinde uygulandıklarında Salmonella suşları ve Swiss farelerindeki mutajenitesini araştırmışlar ve Salmonella/mikrozom testinde ne oxytetracyclin in nede potasyum nitrit in mutajenik olmadığını, karışım halinde bile tolere edilebilen dozlara kadar bir mutajenitenin olmadığı, oxcytetracycline ve potasyum nitrit in Swiss farelerinin kemik iliği hücrelerinde ayrı ayrı mikronükleus frekansını arttırdıklarını, karışım halinde ise nitrit oranının düşük olduğu konsantrasyonlarda frekansta bir artmanın olmadığı, nitrit in dozunun yükselmesi durumunda frekansın arttığını saptamışlardır. El Nahas ve ark. (1984), çok yaygın olarak kullanılan bir koruyucu madde olan sodyum nitrit in çeşitli konsantrasyonlarını gebe ve gebe olmayan albino sıçanların içme sularına karıştırarak vermişlerdir. Bu çalışma sonucunda sodyum nitrit in hem gebe hem de gebe olmayan sıçanların kemik iliği hücrelerinde kromozom anormalliklerini arttırdığı bulunmuştur. Ayrıca sodyum nitritin gebe sıçanların embriyolarının karaciğer hücrelerinde kromozomal anormalliklere neden olduğu bildirilmiştir. Ishidate ve ark. (1984), Japonya da hala kullanılmakta olan 190 sentetik kökenli, 52 doğal kökenli gıda katkı maddesinin mutajenitesini in vitro Chinese hamster fibroblast kültürlerinde kromozom aberasyonu ve Salmonella typhimurium da Ames testi ile araştırmışlardır. Araştırıcılar, bu çalışma sonucunda bu maddelerden yalnızca 14 tanesinin Ames testinde pozitif sonuç verdiğini, 54 tanesinin de kromozomal anormallik testinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Ancak, bunlardan 11 tanesinin (Fast green, hidrojen peroksit, potasyum bromat, sodyum klorit, sodyum hipoklorit, sodyum nitrit, kakao ve karamel) hem KA testinde hem de Ames testinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. 14

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Banerjee ve Giri (1986), sorbik asit in 30 günlük oral uygulama şeklinde tek başına ve sodyum nitritle birlikte, fare kemik iliği hücrelerindeki etkilerini incelemişlerdir. Bu çalışmaya göre sorbik asit in tek başına iğ iplikciğinin aktivitesini etkilediği, ancak kromozomlarda herhangi bir hasar oluşturmadığı, fakat nitrit in tek başına klastojenik olduğu, kombinasyon halinde verildiklerinde ise sinerjitik bir etkiye sahip olduğu bildirilmiştir. Krishna ve ark. (1987), sodyum nitrit ile nitroze edilmiş kömür tozunun oral yolla akut ve kronik uygulanmasından sonra fare kemik iliği hücrelerinde in vivo genotoksik etkilerini araştırmışlar ve nitrozlanmış kömür tozunun fare kemik iliği hücrelerinde genotoksik bir etkisinin olmadığını saptamışlardır. Luca ve ark. (1987), in vivo ve in vitro çalışmalarla sodyum nitrit in dişi sıçan, fare ve tavşandaki mutajenitesini araştırmışlardır. Kromozomal aberasyon çalışmaları sonucunda her üç türden sadece farede mikronükleus sayısında bir artışın olduğunu, her üç türde de kromozomal anormallik taşıyan metafazların oranının yüksek olduğunu saptamışlardır. Alavantic ve ark. (1988), dişi farelerin eşem hücrelerinde nitrit (60 ve 120 mg/kg/gün-14 gün boyunca) ve nitratların (600 ve 1200 mg/kg/gün-14 gün boyunca) in vivo genotoksik etkilerini zamansız DNA sentezi ve sperm anormallik testi kullanarak araştırmışlardır. Bu çalışmadan elde edilen sonuca göre bu iki madde ne zamansız DNA sentezini ne de sperm başı anormalliğini uyarmıştır. Mukherjee ve ark. (1988), sorbic asit ve sodyum nitrit in farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılmış farelerde kardeş kromatid değişimi ve mikronükleus oluşumunu araştırmışlardır. Sodyum nitrit in uygulanan tüm dozlarda kardeş kromatid değişimini ve mikronükleus oluşumunu kontrol ile mukayese edildiğinde önemli ölçüde arttırdığını bildirmişlerdir. 1:1 oranında sorbik asitsodyum nitrit karışımının da sinerjitik bir etkiye sahip olduklarını bildirmişlerdir. Ohara ve ark. (1988), sodyum nitrit in mutajenik aktivitesini Salmonella typhimurium histidin reversiyon deneyleri ve rekombinasyon deneyiyle DNA hasar aktivitesini ölçmüşlerdir. Bu çalışmada sodyum nitrit in asidik ortamda triptofan ile reaksiyona girerek triprofanı mutajenik bir forma dönüştürdüğü saptanmıştır. 15

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Til ve ark. (1988), 6 haftalık sıçanlara sodyum nitrit in 100, 300, 1000 ve 3000 mg/litre konsantrasyonlardaki sodyum nitriti 13 hafta süresince ağız yoluyla vererek, sodyum nitrit in oral toksisitesini değerlendirmişlerdir. Bu çalışmaya göre en yüksek konsantrasyon olan 3000 mg/litre de dahi sıçan tükrük bezinde eser miktarda nitrite rastlanmış, ayrıca idrar yollarında da hiçbir olumsuz etkisinin olmadığını kaydetmişlerdir. Shimada (1989), 7 gün boyunca mg/l dozlarda sodyum nitriti oral yolla gebe ICR farelerine vermişler ve sodyum nitrit in embriyotoxic etkisini araştırmışlardır. Bu çalışma sonucunda embriyoda toksisite gelişimi açısından kontrol ile aralarında bir fark olmadığını belirtmişlerdir. Jonker ve ark. (1990), Wistar sıçanlarında sodium metabisülfit, mirex, loperamide, metaldehyde, stannus cloride, lysinoalanine ve potasyum nitritin karışım halinde oral toksisitesini araştırmışlardır. Bu amaçla bu maddelerin etki göstermemesi üzerine, minimum etkiyi gösterdiği dozlarını 4 hafta boyunca karışım halinde sıçanların içme sularına karıştırmışlardır. Bu çalışma sonucunda bu maddelerin minimum etkiyi gösterdiği dozlarda yani gıda sektöründe kullanılan dozlarının karışımlar halinde verildiğinde herhangi bir etkiye neden olmadığı saptanmıştır. Akın ve Sümer (1991), Salmonella/mikrozom testini kullanarak sıçan karaciğer fraksiyonunun (S9) bulunduğu ve bulunmadığı ortamlarda sodyum nitrit in mutajenitesini araştırmışlardır. Bu çalışmada sodyum nitrit Salmonella typhimurium un TA1535 suşu için mutajen, TA100 suşu için zayıf mutajen olduğu saptanmıştır. Prival ve ark. (1991), Amerika da kullanımına izin verilen 49 gıda katkı maddesinin mutajenitesini Salmonella typhimurium ve E. coli WP2 bakterilerini kullanarak saptamaya çalışmışlar ve çalışmaya göre 44 katkı maddesinin yapılan testler sonucunda mutajenik olmadığı, diğer 5 katkı maddesinin revertantların sayısında artışa neden olduğunu ve bunlardan yapısında histidin bulunan papain ve pepsin in sonuçlarının mutajeniteyi ispatlayacak oranda olmadığını, hidrojen peroksit ve potasyum nitrit in mutajenik olduğunu ve beta-karoten in durumunun şüpheli olduğunu belirtmişlerdir. 16

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Sushko ve Malenchenko (1992), tek dozda (50 cgy) ve kesikli (25 cgy) olarak gama ışını-sodyum nitrit ( mg/kg) muamelesine maruz bırakılan fare spermatositlerinde hem kesikli hem de tek doz gama ışını uygulamalarında gama ışını ve sodyum nitrit in sinerjitik bir etki göstererek, resiprokal translokasyonda önemli bir artışa neden olduğunu kaydetmişlerdir. Ryu ve Lloyd (1995), sodyum nitrit ve diğer nitrozlu bileşiklerin metronidazole hassas Trichomonas vaginalis e olan etkisini araştırmışlar ve çalışma sonucunda 8 mm lık sodyum nitrit, 1.2 mm lık sodyum nitroprusside, Trichomonas vaginalis in üremesini durdurucu bir etkilerinin olduğunu bildirmişlerdir. Tohamy ve ark. (1996), sıçan kemik iliği ve karaciğer hücrelerinde sodyum nitratın oluşturduğu anormalliklere karşı soya fasülyesiyle beslemenin koruyucu bir etkisinin olup olmadığını araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre soya fasülyesi ile beslenmenin nitrozaminlerin yol açabileceği genotoksik ve kanserojenik etkiye karşı bir koruyucu etkisinin olduğunu kaydetmişlerdir. Abuharfeil ve ark. (2001), sodyum nitrit in çeşitli konsantrasyonlarının insan kanından elde edilen doğal öldürücülerin (natural killer) anti-tümör aktivitesine olan etkilerini araştırmışlar ve çalışma sonucunda sodyum nitrit in WEHI-164 hücrelerine karşı doğal öldürücülerin anti-tümör aktivitesinde %25 ila %66 oranında bir azalmaya neden olduğunu, bu nedenle de sodyum nitrit in tümör oluşumunu teşvik edici bir etkisinin olabileceğini bildirmişlerdir. Ohsawa ve ark. (2003), dimetilamin, proline ve morfinle eş zamanlı olarak ayrı ayrı sodyum nitriti farelere ağız yoluyla vermişler ve farelerin organlarında görülen DNA zararlarını comet assay testi ile tespit etmişler. Yapılan bu çalışma sonucunda test edilen organlardan sadece karaciğer de DNA hasarları gözlenmiştir Potasyum Bromatla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Un beyazlatıcısı olarak kullanılmaktadır. Ishidate ve ark. (1984), Chinese hamster fibroblast hücrelerinde 190 sentetik, 52 doğal kökenli katkı maddesinin mutajenik etkiye sahip olup olmadıklarını kromozom anormalliği testi ve Salmonella typhimurium da Ames testi ile 17

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre testlerde kullanılan toplam 242 katkı maddesinden 54 ü kromozomal anormallik testinde pozitif, 3 tanesi (erythorbic acid, chlorine dioxide ve pancar kırmızısı) Ames testinde pozitif, aralarında potasyum bromatında bulunduğu 11 tanesi ise hem Ames testinde hem de kromozomal anormallik testinde pozitif sonuç vermiştir Propionic Asitle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Propionic asit, dilimlenmiş ve ambalajlanmış ürünlerde koruyucu ve antioksidant madde olarak kullanılmaktadır. Basler ve ark. (1987), bir koruyucu madde olan propionik asit in genotoksik aktivitesini E. coli DNA tamir deneyleri, SOS kromotesti, Salmonella /mikrozom testi, in vitro KKD testi ve in vivo mikronükleus testi kullanarak saptamaya çalışmışlardır. Bu çalışmada E. coli tamir testi haricinde tüm testlerde negatif sonuç bulunmuş ve propionik asitin mutajenik bir madde olmadığı bildirilmiştir. Surjan (1989), Drosophila melanogaster mozaik kanat testini kullanarak 16 çeşit kimyasalın mutajenitesini saptamaya çalışmıştır. Yaptığı çalışmaya göre testte kullandığı 16 kimyasaldan 14 nün testte negatif sonuç verdiğini, chlor-diaminotoluene ve sorbik asit in pozitif sonuç verdiğini, ayrıca propionic asit in tek başına mitotik rekombinasyona neden olduğunu bildirmiştir. Vorobjeva ve ark. (1991), propionik asit in Salmonella typhimurium un TA1535 suşu için mutajenik olan sodyum azid e karşı antimutajenik bir etkiye sahip olduğunu, yine Vorobjeva ve ark. (1993) propionik asit in Salmonella typhimurium un TA100 suşu için mutajenik olan 4-nitroquinoline-N-oxide kimyasalına karşı antimutajenik bir etkiye sahip olduğunu bildirmişlerdir. Philipose ve ark. (1997), propionik asit in türevleri olan ibuprofen, ketoprofen ve naproxen in mutajenitesini in vivo KKD ve Ames testleriyle araştırmışlar ve her üç türevin de mutajen olmadığını, fakat kemik iliği hücrelerinde KKD yi zayıf bir şekilde arttırdığını bildirmişlerdir. Al-Tarazi ve Alshawabkeh (2003), propionik asit ve formik asit in karışım halinde Salmonella pullorum kültüründe inhibisyon etkisini araştırmışlardır. Bu 18

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ çalışmadan elde ettikleri sonuca göre karışım halinde propionik asit-formik asitin kültürdeki koloni sayısında kontrole göre önemli derecede bir azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir Sodyum Hipokloritle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Kuru meyve ve sebzelerde sterilizasyon amaçlı kullanılmaktadır. Matsuoka ve ark. (1979), çevresel mutajen ve kanserojenleri göstermek için in vitro kromozomal aberasyon testlerinde içinde sıçan karaciğer mikrozom fraksiyonundan ibaret bir aktivasyon sisteminin de bulunduğu S9 mix kullanmışlardır. Bu çalışma sonucunda gıdaların sterilizasyonunda kullanılan sodyum hypoklorit in pozitif sonuç verdiğini göstermişlerdir Sorbatlarla Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Et ve balık ürünlerinde koruyucu madde olarak kullanılmaktadırlar. Abe ve Sasaki (1977), Potasyum sorbat ın Chinese hamster hücrelerinde yüksek konsantrasyonda kardeş kromatid değişimini ve kromozomal aberasyonları arttırdığını bildirmişlerdir. Hasegawa ve ark. (1984), sorbik asit ve onların sodyum ve potasyum tuzlarının Chinese hamster hücrelerinde kardeş kromatid değişimi ve kromozomal aberasyonlarının oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre sorbik asit ve onun potasyum ve sodyum tuzlarının kromozomal aberasyonları, kardeş kromatid değişimini ve gen mutasyonlarını arttırdığını saptanmıştır. Ayrıca, sodyum sorbat ın sorbik asit ve potasyum sorbata göre daha genotoksik olduğu bildirilmiştir. Banerjee ve Giri (1986), sorbik asiti (15 mg/kg) tek başına ve sodyum nitrit (7.5-1 mg/kg) ile karışım halinde 30 gün ağız yoluyla sıçanlara vermişler ve bu çalışmada sorbik asit in iğ iplikciği aktivitesini bozduğunu, ancak kromozomlarda hasara neden olmamasına karşın sodyum nitrit in tek başına klastojenik olduğunu 19

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ saptamışlardır. Karışım halinde bu ikisinin sinerjitik bir etki gösterdiklerini belirtmişlerdir. Rogers (1986), potasyum sorbat ın Streptococcus mutans ve Streptococcus milleri in sürekli kültüründeki antimikrobiyal etkisini araştırmıştır. Bu çalışmada bakteriler 7 saat süreyle (ph 7.0 ve ph 5.0) potasyum sorbata maruz bırakılmış ve potasyum sorbat ın antimikrobiyal etkisinin olduğu saptanmıştır. Mukherjee ve ark. (1988), sorbik asit ve sodyum nitrit in farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılmış farelerde kardeş kromatid değişimi ve mikronükleus oluşumunu araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre sorbik asit in en yüksek üç konsantrasyonda kardeş kromatid değişiminin önemli ölçüde arttığı, sadece en yüksek dozda mikronükleus oluşumunda bir artış olduğu bildirilmiştir. 1:1oranında sorbik asit-sodyum nitrit karışımının da sinerjitik etki gösterdiklerini bildirmişlerdir. Munzer ve ark. (1990), potasyum sorbat ve sodyum sorbat ın genotoksisitesini in vitro Salmonella/memeli mikrozom testi, HGPRT, Chinese hamster ovaryum hücrelerinde kardeş kromatid değişimi testi, in vivo fare ve Chinese hamster de mikronükleus testlerini kullanarak saptamaya çalışmışlardır. Bu çalışmada in vitro testlerin hiçbirinde pozitif sonuç bulunamamıştır. In vivo da ise taze hazırlanmış sulu çözeltilerde bir genotoksidite gözlenmezken, stok çözeltilerle yapılan çalışmalarda potasyum sorbatın zayıf mutajenik etki gösterdiği bildirilmiştir. Walker (1990), sorbik asit ve sorbik asit tuzlarının etkisini araştırmak için akut olarak, kesikli olarak, kısa ve uzun süreli toksisite, karsinojenite ve teratojenite testlerine tabi tutmuş ve sonuçta sorbik asit ve tuzlarının in vivo ve in vitro da klastojenik ve mutajenik olmadığını bildirmiştir. Schlatter ve ark. (1992), kültüre edilmiş Chinese hamster V79 ve Drosophila melanogaster somatik hücrelerinde sodyum sorbat ve potasyum sorbat ın antioksidant ürünlerinin (4,5-epoxy-2- hexenoic asit i) genotoksik potansiyelini wing spot testi (SMART) ile araştırmışlardır. Halen yoğun bir şekilde kullanılan sorbic asit ve onun potasyum tuzlarının genotoksik bir etkisinin olmadığını ve bu maddelerin gıda koruyucusu olarak kullanılabileceklerini bildirmişlerdir. 20

34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Schiffmann ve Schlatter (1992), sorbik asit, sodyum sorbat ve potasyum sorbat ın Syrian hamster embriyo fibroblastlarında mikronükleus testi ve in vitro da Syrian hamster embriyo hücrelerinin transformasyonu testlerini kullanarak genotoksik potansiyellerini saptamaya çalışmışlardır. Bu çalışmaya göre sodyum sorbat ve potasyum sorbat ın taze hazırlanmış sulu çözeltileri her iki testte de herhangi bir genotoksik etki göstermemiş, ancak stok hazırlanmış çözeltilerinde bir genotoksik etki belirlenmiştir. Jung ve ark. (1992), sorbik asit ve potasyum sorbat ın in vivo ve in vitro da genotoksik potansiyelini araştırmışlar ve sorbik asit in ağız yoluyla verilmesi sonucunda fare kemik iliği hücrelerinde kardeş kromatid değişiminin ve mikronükleus oluşumunun artmadığını, sonuç olarak da sorbik asit ve onun potasyum tuzunun in vivo ve in vitro da genotoksik olmadığını bildirmişlerdir. Ferrand ve ark. (2000), Ames testi ve SOS testlerini kullanarak sorbik asit in plazmid DNA da ve HeLa hücrelerinde genotoksik olmadığını saptamışlardır Sülfitlerle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları SO 2 ve sülfitleyici maddeler (Sülfür dioksit, sodyum veya potasyum sülfit, bisülfit, metabisülfit) olarak da bilinirler. Gıda koruyucusu olarak ve fermente içeceklerin kaplarında kullanılırlar. Fırınlanmış ürünler, çaylar, çeşniler, deniz ürünleri, reçeller, jöleler, kurutulmuş meyveler, meyve suları, konserve ve suyu alınmış sebzeler, dondurulmuş patates ve çorba karışımlarında, bira, şarap ve elma şarabı gibi içeceklerde bulunurlar. Chakraburtty (1975), yaptığı çalışmaya göre bisülfitlerin E. coli arginin trna sı sekonder yapıdayken sitozinde dezaminasyona sebep olması dolayısıyla arginin trna nın amino asit yakalama aktivitesinde bir kayba neden olduğunu bildirmiştir. Bhanot ve ark. (1977) ve Bhanot ve Chambers (1977), bisülfitlerin maya valin trna geninde C nükleotidinin U ya dönüşümünü indüklediğini bildirmişlerdir. 21

35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Hayatsu ve Shiragami (1979), bisülfitlerin ph 4-5 te sitozini dezamine etmek yerine sitozin-5-metilsülfonata dönüştürdüğünü, ph 6-7 de ise bisülfitlerin 5- hidroksimetilurasili urasil-5-metilsülfonata dönüştürdüğünü bildirmişlerdir. Simmons ve Friedberg (1979), urasil deoksirübonükleik asit glikozilaz (ung geni) eksikliği olan E. coli mutantlarını sodyum bisülfit ile muamele etmişlerdir. Ung+ suşlarıyla karşılaştırıldığında ung - lerin sodyum bisülfite daha hassas olduklarını bildirmişlerdir. Bu sonuçlara göre de sitozinin dezaminasyonuyla oluşan urasilin neden olduğu yanlış eşleşmeleri tamir için ura-dna glikozilaz enzimine ihtiyacı olduğunu saptamışlardır. DiPaolo ve ark. (1981), Syrian hamster embriyo hücrelerini nötr ph ta sülfür dioksit in letal olmayan mutajenik dozlarına maruz bırakmışlar ve sodyum bisülfit in dozunun artmasına bağlı olarak hücre transformasyonunu arttığını, UV ışını ile kombineli olarak verildiğinde ise transformasyonda bir artış olmadığını saptamışlardır. Njagi ve Gopalan (1982), Vicia faba kök ucu hücrelerinde Sodyum sülfit ın doza bağlı olarak mitotik indekste azalmaya neden olduğunu, anafazda köprü oluşumunu indüklediğini ve interfaz nükleusunda kromatin erozyonuna neden olduğunu bildirmişlerdir. Suwa ve ark. (1982), S9 bulunmayan ortamda Salmonella typhimurium un TA100 ve TA98 suşlarında taze hazırlanmış kahvenin mutajenik etkisinin sodyum sülfit tarafından inaktive edildiğini bildirmişlerdir. Renner ve Wever (1983), düşük Molybden diyeti uygulayarak besledikleri sıçan ve Chinese hamster lerde hepatik sülfit oksidaz aktivitesini spektrofotometrik yöntemlerle ölçmüşlerdir. Normal koşullarda sülfit oksidaz aktivitesi farede yüksek, hamsterde düşüktür. Ancak sülfit in tölere edebilecekleri maksimum dozu canlıya meyve suyu içinde veya deri altına enjeksiyon yoluyla verildiğinde her iki canlı grubunda da KKD, KA ve mikronükleus oranlarında bir artışa neden olmadığı kaydedilmiştir. Ripley ve Drake (1984), bisülfitlerin sitozini dezamine ederek timinin analoğu olan urasile dönüştürme yolu ile 37ºC de T4 bakteriyofajında G:C----A:T transisyonuna neden olduğunu bildirmişlerdir. 22

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Nakasato ve ark. (1984), kahvenin kültüre edilmiş Chinese hamster akciğer hücreleri için oldukça mutajenik aktiviteye sahip olduğunu, ancak kahvenin meydana getirdiği mutasyon oranının ortamda bulunan sodium bisülfit in varlığıyla azaldığını bildirmişlerdir. De Giovanni-Donelly (1985), Salmonella typimurium hisg46 allelini taşıyan LT2 suşlarında sodyum bisülfit in mutajenik etkisini araştırmış ve standart Ames testinde hisg46 mutasyonunu taşıyan suşlarda sodyum bisülfit in sulandırılmış çözeltisi ile pozitif sonuç vermediğini bildirmiştir. Pagano ve Zeiger (1987), Salmonella typimurium da sodyum bisülfit in mutajenitesini açıklamaya çalışmışlardır. Yaptıkları çalışmaya göre sitozinin urasile dezaminasyonunun çerçeve kayması mutasyonuna neden olmayabileceğini, mutasyonun sebebinin muhtemelen baz eşleşmesindeki düzensizlikten olabileceğini, çünkü bisülfit in otooksidasyon özelliğinin mutasyon işleminde önemli bir rol oynayabildiğini, buna göre sitozin in dezaminasyonunun bisülfit in sitozine olan afinitesinden çok oksidatif hasardan kaynaklandığını bildirmişlerdir. Popescu ve DiPaolo (1988), sodyum bisülfit in Syrian hamster hücrelerinde neoplastik transformasyona neden olduğunu, ancak kromozomal aberasyonların oluşumuna bir katkısının olmadığını, yalnızca kardeş kromatid değişimini minimal düzeyde arttırdığını bildirmişlerdir. Tsutsui ve Barrett (1990), kültüre edilmiş Syrian hamster embriyo hücrelerini nötr ph da 15 dakika 5-20 mm sodyum bisülfite maruz bırakmışlardır. Bu işlem sonucunda hücre transformasyonunda doza bağlı bir artış gözlenmiş, ancak gen mutasyonunda bir artış olmamış ve tek pozitif cevabın KKD sayısındaki artış olduğu kaydedilmiştir. Jonker ve ark (1990), Wistar sıçanlarında sodium metabisülfit, mirex, loperamide, metaldehyde, stannus cloride, lysinoalanine ve potasyum nitritin karışım halinde oral toksisitesini araştırmışlardır. Bunun için bu maddelerin etki göstermediği ve minimum etkiyi gösterdiği dozlarını 4 hafta boyunca karışım halinde sıçanların içme sularına karıştırmışlardır. Bu çalışma sonucunda bu maddelerin minimum etkiyi gösterdiği dozlarda yani gıda sektöründe kullanılan dozlarının karışımlar halinde verildiğinde bir etkiye neden olmadığını kaydedilmiştir. 23

37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Meng ve Zhang (1990), Kuzey Çin de bir sülfirik asit fakrikasında çalışan ve kronik olarak sülfür dioksite maruz kalan 40 işçinin periferal kan lenfositlerinde kromozom anormallikleri ve kardeş kromatid değişimini araştırmışlardır. Bu çalışma sonucunda araştırıcılar sülfür dioksite maruz kalmış insanların lenfositlerinde hem kromozomal aberasyonlarının hem de kardeş kromatid değişiminin kontrol gruplara göre önemli ölçüde arttığı saptanmıştır. Bu sonuçlardan da sülfür dioksit in genotoksik ve klastojenik bir ajan olduğu bildirilmiştir. Meng ve Zhang (1994), in vitro koşullarda 5x10-5 M dan 2x10-3 M konsantrasyona kadar çeşitli konsantrasyonlarda sodyum bisülfite maruz bırakılmış insan periferal lenfositlerinde kromozomal aberasyon, KKD ve mikronükleus incelemeleri yapmışlardır. Bu çalışmada sodyum bisülfit in, insan periferal lenfositlerinde KKD ve mikronükleus oluşumunu doza bağlı olarak arttırdığı, mitotik aktivitede de doza bağlı bir düşüşün gözlendiği bildirilmiştir. Molander ve ark. (1993), sitozinin urasile dezaminasyonunun asidik ph da ceryan ettiğini, asidik ph ın 3.3 ün üzerine çıkması durumunda dezaminasyon oranının azaldığını, asidik ph da sülfit iyonlarının sitozine olan ilgisinin artığını ve dezaminasyon oranının ph haricinde ortamdaki diamin ve bisülfit miktarlarına da bağlı olduğunu göstermişlerdir. Chen ve Shaw (1994), sodyum bisülfit in çift iplikli DNA da sitozinin urasil e dezaminasyonunu hassas deneylerle göstermişlerdir. Bu çalışmada urasil glikozilaz enzim eksikliği olan aktif E. coli bakteri suşlarında sitozinin urasile dezaminasyonu oranının büyük ölçüde artığı kaydedilmiştir. Meng ve Zhang (1994), farklı konsantrasyonlarda sodyum bisülfite maruz bıraktıkları insan periferal lenfositlerinde kromozomal aberasyonlarının, kardeş kromatid değişiminin ve mikronükleus oluşumunun arttığını saptamışlardır. Bu çalışmada sodyum bisülfit in doza bağlı bir şekilde KKD ve mikronükleus sayısını yükselttiği, mitotik indekste düşmeye ve mitotik gecikmeye neden olduğu bildirilmiştir. Rencüzoğulları ve ark. (2001a), sodyum metabisülfit in Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde mitotik anormallikleri arttırdığını ve mitotik indeksi düşürdüğünü bildirmişlerdir. Rencüzoğulları ve ark. (2001b), insan periferal lenfositlerinde 24

38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ sodyum metabisülfit in kromozomal anormallikleri ve kardeş kromatid değişimini arttırdığını, replikasyon indeksi ve mitotik indeksi düşürdüğünü bildirmişlerdir. Ribera ve ark. (2001), sodyum metabisülfit in subakut ve subkronik toksisitesini saptamak için fabrikada üretilmiş ve içerisinde sodyum metabisülfit katkı maddesinin bulunduğu bisküvitleri besinlerine karıştırmak yoluyla hayvanlara vermişlerdir (28 gün boyunca besleyerek). Bu çalışma sonucunda sodyum metabisülfite maruz kalmış sıçanlarda hematolojik bulgularda, klinik bulgularda, renal fonksiyonlarda, organ ağırlıklarında herhangi bir değişimin olmadığı saptanmıştır. Meng ve Zhang (2002), farklı dozlarda ve 7 gün süreyle hava yoluyla günde 4 saatlik uygulamalar şeklinde uygulanan sülfür dioksit in fare kemik iliği hücrelerindeki etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmada sülfür dioksit in kemik iliği hücrelerinde anormallik oranını doza bağlı olarak önemli ölçüde arttırdığı, düşük konsantrasyonlarda kromozomlarda kromatid tipi kırıklara, yüksek konsantrasyonlarda hem kromatid hem de kromozom tipi kırıklara neden olduğu ayrıca mitotik indeksi de doza bağlı olarak düşürdüğü saptanmıştır. Yi ve Meng (2003), sülfür dioksit (sodyum bisülfit) in genotoksisitesini Allium stavium ve Vicia faba mikronükleus testleriyle saptamaya çalışmışlar, yaptıkları çalışmada Vicia ve Allium mikronükleus testinde mikronükleus frekansında önemli bir artış olduğunu ve bu artışın doza bağlı bir durum gösterdiğini bildirmişlerdir Tiabendazolle Yapılmış Olan Genotoksidite Çalışmaları Taze meyve ve sebzelerde (muz, narenciye) koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Mudry ve ark. (1987), 50, 100, 150 mg/kg vücut ağırlığı dozlarda tiabendazol ü sıçanlara karın zarına enjeksiyon yoluyla vererek genotoksisitesini, kardeş kromatid değişimi ve mikronükleus testini kullanarak saptamaya çalışmışlardır. Yaptıkları çalışmalar sonucunda tiabendazol ün mutajenik bir ajan olduğuna karar vermişlerdir. 25

39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Ardito ve ark. (1996), değişik konsantrasyondaki tiabendazol ve diphenylamine ile kültüre edilmiş insan periferal lenfositlerini muamele etmişlerdir. Bu çalışma sonucunda da bu fungusitlerin kardeş kromatid değişimini zayıf bir şekilde arttırmasına karşın, replikasyon indeksini tiabendazol ün düşürdüğü, fakat diphenylamine nin bir etki yapmadığı saptanmıştır. Mailhes ve ark. (1997), fare oositlerinde tiabendazol ün etkilerini araştırmak için süper ovulasyon devresindeki ICR dişi farelerine 50, 100, 150 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonlarda tiabendazol ü karın zarına enjeksiyon yoluyla vermişler ve hiperploid oositlerin frekansını kontrol ile karşılaştırmışlardır. 100 mg/kg konsantrasyonda kontrol ile aradaki fark çok önemli bulunmuştur. Sonuç olarak araştırıcılar tiabendazol ün toksik dozlarının ovulasyonu bozabileceği sonucuna varmışlardır. Sasaki ve ark. (1997), ağız yolu ile verdikleri ortho-phenylphenol (2000mg/kg), biphenyl (2000 mg/kg) ve tiabendazol (200 mg/kg) ün genotoksisitesini in vivo olarak alkaline jel elektroforez tekniğiyle (comet testi) göstermeye çalışmışlardır. Bu çalışma sonucunda ortho-phenylphenol ün mide, karaciğer, böbrek, idrar yolları ve akciğerde; biphenyl ve tiabendazol çalışılan tüm organlarda DNA hasarını arttırdığını bildirmişlerdir. Schmid ve ark. (1999), akrilamid ( mg/kg intraperitonal olarak), kolşisin (1.5 ve 3 mg/kg intraperitonal olarak), diazepam (75, 150 ve 300 mg/kg oral yolla) ve tiabendazol (100 ve 300 mg/kg oral yolla) ün aneojenik etkilerini sperm başlarında renkli FISH tekniği kullanarak saptamaya çalışmışlar ve kolşisin in ve diazepam ın en yüksek konsantrasyonda hiperployidi yi uyardığını ve eşem hücrelerinde aneuploidiyi artırdığını, tiabendazol ve akrilamid in aneuploidiyi düşük düzeyde uyardığını saptamışlardır. Pisano ve ark. (2000), tübilin sentezinin yeni başladığı dönemdeki Chinese hamster C1-1 hücrelerini tiabendazol ile muamele etmişler ve tiabendazol ün mikrotübülleri etkileyerek aberasyonlu iğ iplikciği oluşumunu indüklediği, dolayısıyla kromozomların kutuplara çekilememe düzensizliğine neden olduğunu bildirmişlerdir. 26

40 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ahmet KAYRALDIZ Sasaki ve ark. (2002), gıda sektöründe kullanılan 39 farklı kimyasalı farelere ağız yoluyla verip 8 farklı (mide, barsak, akciğer, böbrek, idrar torbası, karaciğer, beyin ve kemik iliği) organında comet assay deneyini kullanarak genotoksititesini saptamaya çalışmışlardır. Bu çalışma sonucunda biphenyl, sodium o-phenylphenol ve tiabendazol ün sindirim sistemiyle ilgili organlarda DNA hasarını indüklediği saptanmıştır. 27

41 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ 3. MATERYAL VE METOD Bu çalışmada test maddesi olarak, gıdalarda koruyucu madde olarak kullanılan sodium metabisulphite (SMB), deney hayvanı olarak da albino sıçan Rattus norvegicus var. albinos kullanılmıştır Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Sodium Metabisülfite (SMB) Bu çalışmada test maddesi olarak kullandığımız SMB, yiyecek ve içecek endüstrisinde koruyucu ve sterilizasyon amacına yönelik kükürt dioksit kaynağı, şeker ve un için beyazlatıcı, fotoğrafçılıkta kükürtdioksit içeriği ile indirgen, boya, yıkama ve deri endüstrisinde renk giderici madde olarak, tekstil endüstrisinde de anti-klor olarak kullanılmaktadır. 28

42 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ Sodium Metabisülfite nin Kimyasal Özellikleri Bilinen Adları :Sodium Metabisulphite, Sodyum Bisulphite, Disodium disulphite, Disodium Pentaoxodisulphite, Disodium Pyrosulphite, Sodyum Pyrosulphite (Cas registry number: ; Merck no:6528) Açık Formülü : Şekil 3.1 Kapalı Formülü : Na 2 S 2 O 5 Molekül Ağırlığı : Erime Sıcaklığı : 150ºC Yoğunluğu : 1.48 g/cm 3 Çözünürlüğü : 470g/L ph : Fiziksel Durumu : İnce toz Renk : Beyaz Sıçan oral LD 50 : 1540 mg/kg Na O O S O S O O Na Şekil 3.1. Sodyum Metabisülfit in Açık Formülü Ethyl Carbamate (EC=Ürethan) Bu çalışmada Ethyl Carbamate pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Karbamik asit in esteri olan Ethyl Carbamate R 1 NH-CO-OR 2 formülü ile karakterize edilir. Bilinen en eski kanserojenik özelliğe sahip olan maddedir. Ethyl Carbamate nin genel yapısı ve diğer özellikleri aşağıda verilmiştir. 29

43 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ Yapısı: O H2N C OC2H5 Kimyasal Adı: Ethyl Carbamate (CAS registry number: ) Bilinen Adı: Urethan Kapalı Formülü: C 3 H 7 NO 2 Molekül Ağırlığı: Sigma No: U Kolkisin Kromozom preparatlarının hazırlanmasında mitotik zehir olarak Kolkisin (Kolkisin = Colchicine) (Sigma) kullanılmıştır. Kolşisin eriyiği bidestile su içinde hazırlanmıştır. 3 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonunda kolşisin preparasyondan 2 saat önce hayvanların karın zarına enjekte edilir. Kolşisin in bazı özellikleri aşağıdadır: Kapalı formülü : C 22 H 25 NO 6 Molekül ağırlığı : Etil asetat içeriği : %3.4 Kloroform içeriği : < %0.1 Sigma no : C Fizyolojik Çözelti Bu çalışmalarda destile su içinde hazırlanmış NaCI çözeltisi (%0.9) (hazırlanan stok fizyolojik sıvı buzdolabında +4 ºC saklanmış kemik iliği alınacağı zaman sıcaklığı 37 C ye yükseltilerek kullanılmıştır) kemik iliğinin ilk olarak içine alındığı izotonik sıvı olarak kullanılmıştır. Bu izotonik sıvı içine alınan kemik iliği hücrelerinden kromozom incelemeleri için preparatlar hazırlanmıştır. 30

44 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ Hipotonik Çözelti Hipotonik eriyik olarak %0,4 lük KCI (Merck) kullanılmıştır. Eriyik bidestile su içinde stok halinde hazırlanıp ağzı kapalı bir cam kapta buzdolabında (+4 ºC) saklanmıştır. Her preparasyondan yaklaşık 1 saat önce yeteri kadar miktar alınıp 37ºC deki inkübatörde ısıtılıp kullanılmıştır Fiksatif 1 kısım asetik asitin 3 kısım metil alkolle karıştırılması sonucu hazırlanmıştır. Bu karışım kullanımdan 2 saat önce hazırlanmış ve ağzı kapalı bir cam kapta buzdolabında (+4 ºC) saklanmıştır. Bu karışım her seferinde taze hazırlanıp soğuk olarak kullanılmıştır Sorensen Tampon Çözeltisi Tampon A ve tampon B olmak üzere iki stok çözelti halinde hazırlanmış olup, oda sıcaklığında kapalı kaplarda saklanır. Bu çözeltiler çalışmanın amacına uygun olarak birbiriyle değişik miktarlarda karıştırılarak kullanılmıştır. Tampon A: gr. KH 2 PO ml saf su içinde eritilmiştir (ph 4.8). Tampon B: gr. Na 2 HPO ml saf su içinde eritilmiştir (ph 9. 3) Giemsa Giemsa boyası Merck firmasından (Cat. no. 9204) temin edilmiş olup, deneylerimizde sorensen tamponu içerisinde hazırlanmış %5 Giemsa kullanılmıştır (5ml Tampon A + 5ml Tampon B + 5ml Giemsa + 85ml destile su). Boya her seferinde taze hazırlanmış ve filtre kağıdı ile süzülmüştür Entellan Şeffaf preparat kapatma solüsyonudur (Merck, cat. no. 7961). Preparatlar daimi hale getirilirken kullanılmıştır. 31

45 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ Nitrik Asit Lamları temizlemek amacıyla kullanılan nitrik asitin 1 N stok çözeltisi hazırlanmıştır. Bu çözelti plastik bir şişede saklanarak tekrar tekrar kullanılmaktadır Kullanılan Deney Ekipmanları Hassas Terazi Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan ve gr hassasiyetindeki GEC AVERY marka terazi kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır Santrifüj Rotor çapı 18 cm, 4000 rpm e kadar yükselebilen devir hızı, 99 dk lık zaman ayarlayıcı ve 28 tüp kapasiteli HETTICH UNIVERSAL marka santrifüj çalışmalarda kullanılmıştır Mikroskop Fotoğraf makinesi ve kamera monte edilebilen, koordinat cetveli ve immersiyon objektifi olan Prior marka binoküler ışık mikroskobu preparatların incelemeleri sırasında kullanılmıştır İnkübatör Dedeoğlu marka 0 ºC 100 ºC ayarlanabilir inkübatör deneyde bazı eriyiklerin 37 ºC ye ısıtılmasında kullanılmıştır Lamların Temizlenmesi Hücre preparatlarının yapımından 2 gün önce, kendinden etiketli lamlar şaleye (camdan yapılmış kaburgalı lam kabına) dizilerek üzerlerini iyice örtecek şekilde 1 N HNO 3 konulmuştur. Şalenin ağzı kapatılarak bu şekilde 24 saat bekletilmiştir. Süre bitiminde lamlar 32

46 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ yarım saat akan çeşme suyunda iyice yıkanmıştır. 3-4 defa destile sudan geçirildikten sonra, lam bulunan şale destile su ile doldurularak buzdolabında saklanmıştır. Bu lamlar, preparat yapılacağı zaman buzdolabından çıkartılarak soğuk halde kullanılmıştır Kromozom İncelemeleri İçin Deney Hayvanlarına SMB ve EC nin Verilmesi, Preparatların Hazırlanması ve Boyanması Deney Hayvanlarına SMB nin ve EC nin Verilmesi Sodyum Metabisülfit ve Etil Carbamate deney hayvanlarına intraperitonal (ip) ve Gavage (gv) yolu olmak üzere iki şekilde verilmiştir İntraperitonal Yolla (ip) SMB nin ve EC nin Deney Hayvanlarına Uygulanması Sağlıklı haftalık yaklaşık 200 gr ağırlığında genç erişkin albino sıçanlar çalışmamızda deney hayvanı olarak kullanılmıştır. SMB nin her muamele dozu (250, 500, 750, 1000 mg/kg vücut ağırlığı) ve muamele süresi (6, 12 ve 24 saat) için 3 dişi ve 3 erkek sıçan kullanılmıştır. SMB saf su içerisinde eritilerek belirlenen konsantrasyon ve muamele süreleri için karın zarı içine enjekte edilmiş, hayvanlara belirlenen konsantrasyonlarda SMB verildikten 6, 12 ve 24 saat sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir. Pozitif kontrol olarak kullandığımız ethyl carbamate 400 mg/kg vücut ağırlığı olacak şekilde tek doz olarak 3 ayrı muamele süresinde (6, 12 ve 24 saat) intraperitonal yolla deney hayvanlarına verilmiş, muamele sürelerinin bitiminden sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir. Ayrıca muamelesiz kontrol grubu da kullanılmıştır Gavage Yoluyla (gv) SMB nin ve EC nin Deney Hayvanlarına Uygulanması Sağlıklı haftalık yaklaşık 200 gr ağırlığında genç erişkin albino sıçanlar çalışmamızda deney hayvanı olarak kullanılmıştır. SMB nin her muamele dozu (250, 500, 750, 1000 mg/kg vücut ağırlığı) ve muamele süresi (6, 12 ve 24 saat) için 3 dişi ve 3 erkek sıçan kullanılmıştır. SMB saf su içerisinde eritilerek belirlenen konsantrasyon ve muamele süreleri için gavage adı verilen bir yöntem ile hayvanın midesine tek doz olarak 33

47 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ verilmiş,hayvanlara belirlenen konsantrasyonlarda SMB verildikten 6, 12 ve 24 saat sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir. Pozitif kontrol olarak kullandığımız ethyl carbamate 400 mg/kg vücut ağırlığı olacak şekilde tek doz olarak 3 ayrı muamele süresinde (6, 12 ve 24 saat) gavage yoluyla deney hayvanlarına verilmiş, muamele sürelerinin bitiminden sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir Kromozom İncelemeleri İçin Preparatların Hazırlanması SMB nin karın zarına enjeksiyonundan ve gavage yoluyla verildikten 6, 12 ve 24 saat sonra kromozom preparatları yapılmıştır. Bu preparasyon işleminden 2 saat önce ise mitoz bölünmeyi metafaz safhasında durdurmak için stok kolkisin çözeltisinden 3 mg/kg vücut ağırlığındaki doz hayvanın karın zarı içine enjekte edilmiştir. Süre sonunda hayvanlar eterle bayıltıldıktan sonra boynu kırılmak suretiyle öldürülmüş, sonra hayvanın arka bacakları kesilerek vücudundan ayrılmış, bacaktaki kaslar kemikten bistüri ile kazınarak alınmış ve daha sonra kemiğin proksimal ucu (vücuda yakın olan kısmı) ilik kanalı açıklığına kadar makasla kesilmiştir. 37 ºC ve içine yaklaşık 2 ml serum fizyolojik eriyiği (% 0.9 NaCl) bulunan ince uçlu enjektör ile açılan ilik kanalına girilerek kemik iliği hücreleri enjektör içine çekilmiş, sonra ilik kanalına fizyolojik eriyik verilip çekilerek kemik iliğinin tamamının enjektör içine alınması sağlanmıştır. Her iki uyluk kemiği için aynı işlem tekrarlanmış, kemiğin dıştan görünümü beyaz şeffaf bir hal aldığında iliğin tamamının alındığı anlaşılmıştır. Eğer enjektör içine çekilen ilik kaba partiküllü bir haldeyse enjektör çalkalanarak partiküllerin dağılması sağlanmış ve böylece homojen dağılmış hücre süspansiyonu elde edilmiştir. Hücre süspansiyonu santrifüj tüpüne aktarılmış ve sonra 1100 devir/dk. da 20 dk. santrifüj edilmiştir. Süre sonunda tüpteki hücresiz hafif bulanık sıvı pastör pipeti yardımıyla tüpün dibinde yaklaşık 1 ml kalıncaya kadar alınmıştır. Sonra dipteki hücreler tekrar homojenize edilmiş ve daha önce inkübatörde 37 ºC ye ısıtılmış hipotonik eriyik (% 0.4 KCl) damla damla tüpe ilave edilmiş, hücreler hipotonik eriyik ilavesi sırasında resüspanse edilmiştir. Hücrelerin kümeleşmemesi için bu işlem oldukça yavaş yapılmıştır. Her tüpe 5 ml. hipotonik eriyik ilave edilmiş ve hücreler 37 ºC deki inkübatörde 37 dk. hipotonik eriyikle muamele edilmiştir. Bu muamele süresi denemelerle tespit edilmiş olup, hücrelerde optimum şişmeyi gerçekleştirmektedir. Süre sonunda tüpler 1100 devir/dk. da 20 34

48 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ dk. santrifüj edilmiştir. Sonra süpernatant (tüpün üstündeki sıvı) tüpte 1 ml sıvı kalıncaya kadar alınmış ve atılmıştır. Dipteki hücreleri ihtiva eden sıvı pipet yardımıyla homojenize edilmiş, sonra taze hazırlanmış soğuk fiksatiften tüplere damla damla ilave edilmiştir. Bütün tüplere aynı işlem yapılmıştır. Tüm tüplerde fiksatif miktarı 5 ml ye tamamlanmış ve hücreler oda sıcaklığında 20 dk. fikse edilmiştir. Süre sonunda hücre süspansiyonu tekrar 1100 devir/dk. da 20 dk. santrifüj edilmiş ve hücrelerin tüpün dip kısmında toplanması sağlanmıştır. Fiksatifle muamele 3 kere tekrarlanmıştır. Son fiksatif ile muamele ve santrifüj işleminden sonra, tüpün dibinde hücreleri ihtiva eden ve yaklaşık 0.75 ml sıvı kalacak şekilde süpernatant atılmıştır. Pastör pipetiyle hücreler sıvı içerisinde homojen hale getirilmiştir. Eğer dipteki sıvı çok bulanıksa hücre yoğunluğunun fazla olduğuna karar verilmiştir ve az miktarda fiksatif ilavesi yapılmıştır. Bu hücre süspansiyonundan çok az miktarda pastör pipetine çekilerek 80 cm yükseklikten daha önce temizlenmiş ve destile su içeriside buzdolabında bekletilen lamlar üzerine ayrı ayrı yerlere olmak üzere her lama 3 damla damlatılmıştır. Bu şekilde hazırlanmış preparatlar kurumak üzere kapalı bir yerde oda sıcaklığında 24 saat bekletilmiştir Preparatların Boyanması Kurumuş bir günlük preparatlar % 5 lik Giemsa boyasıyla boyanmıştır. Bu konsantrasyondaki boya 5 ml tampon A + 5 ml tampon B + 5 ml Giemsa nın saf su ile 100 ml ye tamamlanmasıyla hazırlanmıştır. Bu boya eriyiği filtre kağıdı ile dik bir şaleye süzülmüştür ve preparatlar bu şaleye yerleştirilmiştir. Preparatların burada 15 dk. boyanması sağlanmıştır (bu süre denemeyle bulunmuştur). Boyadan çıkarılan preparatlar 3 ayrı kaptaki saf sudan geçirilerek fazla boyanın akması sağlanmış ve preparatlar dik bir şekilde yerleştirilerek kurumaya bırakılmıştır. Kuruyan preparatlar entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. Entellan kuruduktan sonra (en az iki gün) bu preparatlarda mikroskobik incelemeler yapılmıştır Mikroskobik İncelemeler Hazırlanmış olan daimi preparatlar Prior marka binoküler ışık mikroskobu ile immersiyon objektifinde incelenmiştir (10 x 100 = 1000). 35

49 3. MATERYAL VE METOD Ahmet KAYRALDIZ Kromozom Anormalliklerinin (KA) (Chromosome Aberration=CA), Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Kromozom Anormalliklerinin Saptanması Her bir hayvandan hazırlanan preparatlarda kromozomları iyi dağılmış 100 metafaz plağı ve her grup için toplam 600 metafaz plağı incelenerek kromozom anormallikleri tespit edilmiştir. Bu hücreler içinde gözlediğimiz kromozom yapı ve sayı anormallikleri kaydedilmiştir. Her bir hayvandan incelenen bu 100 hücre içinde anormal hücrelerin yüzdesi ile hücre başına düşen KA sayısı (KA/Hücre) saptanmıştır Mitotik Indeksin (MI) Saptanması Her hayvan için 3000 ve her grup için toplam hücre sayılmış ve bunlar arasındaki metafaz (bölünen hücrelerin tamamı metafaz devresinde olduğundan) devresinde olan hücreler saptanarak kaydedilmiştir. Her bir hayvanın incelenen 3000 hücresi içinde metafaz devresindeki hücrelerin oranı yüzde cinsinden hesaplanarak her bir hayvan için MI saptanmıştır Mikroskopta Fotoğraf Çekme Fotoğraf çekme işlemi, Olympus marka mikroskopta fotoğrafı çekilecek metafaz plağının durumuna göre 1500 büyütmede yapılmıştır. İncelemeler esnasında saptanan bazı ilginç kromozom anormalliklerine ait örneklerin fotoğrafları çekilmiştir. Fotoğraf çekiminde Fuji marka 100 ASA lık renkli film kullanılmıştır. Çekilen fotoğraflar renkli kartlara basılmıştır İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi Muameleli gruplardan elde edilen kromozom anormalliği içeren hücrelerin yüzdesi, KA/hücre oranı ve Mitotik Indeks t-test metoduna göre hem kontrol hem de pozitif control olan EC ile muamele edilen hayvanların preparatlarından elde edilen sonuçlar ile karşılaştırılmıştır. Doz etki ilişkisini belirlemek için korelasyon katsayısı bulunmuş ve regresyon eğrisi çizilmiştir. Mikroskobik incelemelerden elde edilen sonuçlar tablo halinde verilmiştir. 36

50 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ 4. BULGULAR 4.1. SMB nin Sıçanlara İntraperitonal Yolla Enjekte Edilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Anormal Hücre Yüzdesi (Kromozom Anormalliğine Sahip Hücre Yüzdesi), KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndeks SMB, 6 saatlik muamele süresinde 250 mg/kg lık vücut ağırlığı konsantrasyonda anormal hücre yüzdesini kontrole göre bir miktar arttırmıştır. Ancak bu artış önemli bulunmamıştır (Çizelge 4.1). Aynı muamele süresinde 500, 750 ve 1000 mg/kg lık vücut ağırlığı konsantrasyonda SMB, anormal hücre oranını kontrole göre önemli ölçüde arttırırken, bu artışın pozitif kontrol kadar olmadığı bulunmuştur. Bu muamele süresinde 250 mg/kg lık vücut ağırlığı konsantrasyonda SMB, hücre başına düşen anormallik sayısını kontrol ile mukayese edildiğinde bir miktar arttırmış fakat bu artış önemli bulunmamıştır. Aynı muamele süresinde, 500, 750 ve 1000 mg/kg lık vücut ağırlığı konsantrasyonda SMB, hücre başına düşen anormallik sayısını kontrole göre önemli ölçüde arttırmış ancak bu artış pozitif kontroldeki kadar olmamıştır. SMB nin aynı muamele süresinde 250 ve 500 mg/kg lık vücut ağırlığı konsantrasyonlarında MI de kontroldekine nazaran önemli olmayan bir düşüşe sebep olduğu, ancak 750 ve 1000 mg/kg lık vücut ağırlığı konsantrasyonlarda MI deki düşüşün önemli olduğu fakat bu düşmenin pozitif kontroldeki kadar olmadığı saptanmıştır (Çizelge 4.1). SMB nin, 12 saatlik muamele süresinde anormal hücre oranını ve hücre başına düşen anormallik sayısını kontrole nazaran önemli derecede artırdığı (Çizelge 4.1) ve bu artışın doza bağlı bir durum gösterdiği saptanmıştır (Şekil 4.1, Şekil 4.2). Aynı muamele süresinde SMB, MI i 250, 500 ve 750 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonda kontrole göre önemli ölçüde düşürmüş fakat bu düşüş pozitif kontroldeki kadar olmamıştır. Aynı muamele süresinde 1000 mg/kg lık vücut ağırlığı konsantrasyonda SMB MI i hem kontrole hem de pozitif kontrole göre önemli ölçüde düşürmüştür (Çizelge 4.1). SMB, 24 saatlik muamele süresinde anormal hücre oranını ve hücre başına düşen anormallik sayısını tüm konsantrasyonlarda kontrol ile mukayese edildiğinde 37

51 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ önemli ölçüde artırmıştır (Çizelge 4.1). Bu artışın doza bağlı olduğu bulunmuştur (Şekil 4.3, Sekil 4.4). Ancak bu artış pozitif kontrol kadar olmamıştır. Aynı muamele süresinde SMB MI i tüm konsantrasyonlarda kontrole nazaran önemli derecede düşürmüş (Çizelge 4.1), MI deki düşüş doza bağlı bir durum göstermiştir (Şekil 4.5). MI deki bu düşüş 250, 500, 750 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonlarında pozitif kontroldeki kadar olmamasına karşılık sadece 1000 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonunda pozitif kontroldeki kadar olmuştur (Çizelge 4.1). 38

52 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ Çizelge 4.1. SMB nin Sıçan Karın Zarına (İntraperitonal olarak) Enjekte Edilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Rastlanan Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Yüzdesi, KA/hücre ve Mitotik İndeks. Test Maddesi Muam. Süresi (Saat) Kons Anormallikler* mg/kg v.a. B B F KKB DS T KD P Anormal Hücre ± SE (%) KA/Hücre ± SE MI ± SE Kontrol ± ± ± ± ± ±0.10 EC ± ± ± ± ± ± ±0.49 b ±0.004 b ±0.26 b ±0.33a 2 b ±0.003 a 2 b ±0.31 b ±0.66 a 2 b ±0.006 a 2 b ±0.21 a 2 b ±0.56 a 2 b ±0.006 a 2 b ±0.25 a 1 b 2 SMB ±0.42 a 2 b ±0.004 a 2 b ±0.44 a ±0.61 a 2 b ±0.006 a 2 b ±0.18 a 3 b ±0.601a 3 b ±0.006 a 3 b ±0.32 a ±1.11 a 2 b ±0.011 a 2 b ±0.19 a 3 b ±0.49 a 1 b ±0.004 a 1 b ±0.15 a 3 b ±0.81 a 2 b ±0.008 a 2 b ±0.17 a 3 b ±0.51 a 3 b ±0.006 a 3 b ±0.10 a 3 b ±0.92 a 3 b ±0.007 a 3 b ±0.12 a 3 *B : Kromatid Kırığı; B : Kromozom Kırığı; F: Fragment; KKB: Kardeş Kromatid Birleşmesi; DS: Disentrik Kromozom; T: Translokasyon; KD: Kromatid Değişimi; P: Poliploidi a: Kontrol ile karşılaştırmada fark önemli b: Pozitif kontrol ile karşılaştırmada fark önemli 1: P 0.05; 2: P 0.01; 3: P

53 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ AH (%) y = 0.007x r= 0.990* Konsantrasyon(mg/kg v.a.) Şekil 4.1. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 12 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. *: P< KA/hücre y = X r = 0.990* Konsantrasyon (mg/kg v.a.) Şekil 4.2. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 12 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. *:P<

54 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ AH (%) y = x 0.59 r = * Konsantrasyon (mg/kg v.a.) Şekil 4.3. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. *:P< KA/hücre y = x r = 0.987* Konsantrasyon (mg/kg v.a.) Şekil 4.4. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. *:P<

55 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ MI y = x r = * Konsantrasyon (mg/kg v.a.) Şekil 4.5. İntraperitonal yolla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde MI nın doza bağlı azalmasını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. *:P<0.05 İntraperitonal yolla SMB verilen sıçanların kemik iliği hücrelerinde genellikle kardeş kromatid birleşmesi (Şekil 4.6), fragment (Şekil 4.7), kromatid değişimi (Şekil 4.8) gibi kromozomal anormalliklere rastlanmıştır. 10µ Şekil 4.6. Kardeş Kromatid Birleşmesi (KKB) (1000 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 Saatlik muamele süresi, İntraperitonal Uygulama, ). X

56 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ 10µ Şekil 4.7. Fragment (F) (750 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 12 Saatlik muamele süresi, İntraperitonal Uygulama, ). X µ Şekil 4.8. Kromatid Değişimi (KD) (500 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 Saatlik muamele süresi, İntraperitonal Uygulama, ). X

57 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ 4.2. SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Anormal Hücre Yüzdesi (Kromozom Anormalliğine Sahip Hücre Yüzdesi), KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndeks Gavage yoluyla verilen SMB, 6 saatlik muamele süresinde anormal hücre oranını ve hücre başına düşen anormallik miktarını 500, 750, 1000 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonlarda kontrole göre bir miktar arttırmış ancak bu artış kontrole nazaran önemli bulunmamıştır (Çizelge 4.2). Aynı muamele süresinde MI 1000 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonda pozitif kontrolden önemli derecede düşük bulunmuştur (Çizelge 4.2). SMB, 12 saatlik muamele süresinde tüm konsantrasyonlarda anormal hücre oranını ve hücre başına düşen anormallik sayısını kontrol ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde arttırmasına rağmen bu artış ancak son konsantrasyonda pozitif kontrol kadar olmuştur. Aynı muamele süresinde 250 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonda MI in kontrole göre önemli oranda değişmediği diğer tüm konsantrasyonlarda hem kontrole hem de pozitif kontrole göre önemli oranda düşük olduğu bulunmuştur (Çizelge 4.2). SMB 24 saatlik muamele süresinde anormal hücre oranını ve hücre başına düşen anormallik sayısını kontrol ile mukayese edildiğinde sadece 750 ve 1000 mg/kg vücut ağırlığı dozlarında artışa sebep olmuştur. Bu artış pozitif kontrol kadar olmamıştır. Ancak 24 saat süresince SMB ye maruz bırakılan sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesi ve KA/hücre doza bağlı bir artış göstermiştir(şekil 4.9, Şekil 4.10). Bu muamele süresinde MI in hem kontrol hem de pozitif kontrole nazaran önemli derecede düşük olduğu bulunmuştur (Çizelge 4.2). Yani SMB kemik iliği hücrelerinde mitoz bölünmeyi pozitif kontrolden daha fazla olumsuz yönde etkilemiştir. MI deki düşüşün doza bağlı bir düşüş olduğu saptanmıştır (Şekil 4.11). 44

58 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ Çizelge 4.2. SMB nin Ağız Yoluyla (Gavage Yoluyla) Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Rastlanan Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Yüzdesi, KA/hücre ve Mitotik İndeks. Test Maddesi Muam. Süresi (Saat) Kons mg/kg v.a. B B F KKB Anormallikler* D S T KD P Anormal Hücre ±SE (%) KA/Hücre ±SE MI ± SE Kontrol ± ± ± ± ± ±0.42 EC ± ± ± ± ± ± ±0.21 b ±0.002 b ±0.16 a ±0.22 b ±0.002 b ± ± ± ±0.17 SMB ± ± ±0.17 b ±0.42 a 3 b ±0.004 a 3 b ± ±0.66 a 2 b ±0.006 a 1 b ±0.05 a 3 b ±0.83 a ±0.008 a 2 b ±0.23 a 2 b ±0.93 a ±0.011 a ±0.19 a 3 b ±0.21 b ±0.002 b ±0.25 a 3 b ±0.79 b ±0.007 b ±0.32 a 3 b ±0.61 a 1 b ±0.007 a 1 b ±0.19 a 3 b ±0.792 a 2 b ±0.009 a 2 b ±0.32 a 3 b 2 *B : Kromatid Kırığı; B : Kromozom Kırığı; F: Fragment; KKB: Kardeş Kromatid Birleşmesi; DS: Disentrik Kromozom; T: Translokasyon; KD: Kromatid Değişimi; P: Poliploidi a: Kontrol ile karşılaştırmada fark önemli b: Pozitif kontrol ile karşılaştırmada fark önemli 1: P 0.05; 2: P 0.01; 3: P

59 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ AH (%) y = x r = 0.980* Konsantrasyon (mg/kg v.a.) Şekil 4.9. Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde anormal hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. *:P< KA/hücre 0.02 y = x r = 0.992* Konsantrasyon (mg/kg v.a.) Şekil Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde KA/hücre nin doza bağlı artışını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. *:P<

60 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ MI y = x r = * Konsantrasyon (mg/kg v.a.) Şekil Gavage yoluyla farklı dozlarda SMB verildikten 24 saat sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde MI nın doza bağlı azalmasını gösteren korelasyon katsayısı ve regresyon eğrisi. *:P<0.05 Gavage yoluyla SMB verilen hayvanların kemik iliği hücrelerinde kardeş kromatid birleşmesi (Şekil 4.12), kromatid kırığı (Şekil 4.13), kromatid değişimi (Şekil 4.14) gibi kromozomal anormalliklere rastlanmıştır. 10µ Şekil Kardeş Kromatid Birleşmesi (KKB) (1000 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 12 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ). X

61 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ 10µ Şekil Kromatid Kırığı (B ) (750 mg/kg vücut ağırlığı SMB, 24 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ). X µ Şekil Kromatid Değişimi (KD) (500 mg/kg vücut ağırlığı, 12 saatlik muamele süresi, Gavage Uygulama, ). X

62 4. BULGULAR Ahmet KAYRALDIZ 4.3. SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla ve İntraperitonal Yolla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Oluşan Anormal Hücre Yüzdesi, KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndekslerin Karşılaştırılması 6 saatlik muamele süresinde tüm konsantrasyonlarda anormal hücre yüzdesi ve hücre başına düşen anormallik oranının gavage yöntemiyle uygulama yapılan gruba göre intraperitonal yolla uygulama yapılan grupta daha yüksek olduğu bulunmuştur (Çizelge 4.3). Yine tüm konsantrasyonlarda 6 saatlik muamele süresinde mitotik indeks, intraperitonal yolla uygulamada gavage yöntemiyle uygulamaya göre daha düşük bulunmuştur (Çizelge 4.3). 12 saatlik muamele süreleri karşılaştırıldığında 250 ve 500 mg/kg lık konsantrasyonlarda anormal hücre yüzdesi ve hücre başına düşen anormallik oranı artışında gavage yöntemi ile intraperitonal uygulama arasında bir fark bulunamamıştır. Ancak 750 ve 1000 mg/kg lık konsantrasyonlarda intraperitonal uygulama sonucunda elde edilen anormal hücre yüzdesi ve hücre başına düşen anormallik oranının gavage yönteminden elde edilenlere göre daha yüksek olduğu bulunmuştur. Bu muamele süresinde mitotik indeksler tüm konsantrasyonlarda gavage yönteminde intraperitonal uygulamaya nazaran yüksek bulunmuştur (Çizelge 4.3). 24 saatlik muamele süreleri karşılaştırıldığında intraperitonal uygulamadan elde edilen anormal hücre yüzdesi ve hücre başına düşen anormallik oranının gavage yöntemine göre çok daha yüksek olduğu bulunmuştur. Ayrıca mitotik indeksler yönünden 250 ve 1000 mg/kg lık konsantrasyonlarda intraperitonal uygulamada elde edilen sonuçlar gavage yönteminden elde edilen sonuçlara göre düşük bulunurken 500 ve 750 mg/kg lık konsantrasyonlarda mitotik indeksin gavage ve intraperitonal uygulama arasında pek fark olmadığı saptanmıştır (Çizelge 4.3). Sonuç olarak intraperitonal yolla SMB nin sıçanlara verilmesinin kemik iliği hücrelerinde kromozom aberasyonlarını gavage yoluyla verilmesine göre daha fazla uyardığı, mitotik aktiviteyi de daha fazla olumsuz yönde etkilediği saptanmıştır. 49

63 Çizelge 4.3. SMB nin Sıçanlara Gavage Yoluyla ve İntraperitonal Yolla Verilmesinden 6, 12 ve 24 Saat Sonra Kemik İliği Hücrelerinde Oluşan Anormal Hücre Yüzdesi, KA/Hücre Oranı ve Mitotik İndeks Oranlarının Karşılaştırılması Test Mad. Mua. Süre. Saat Kons. mg/kg v.a. Mua. Şekli B B Anormallikler* F KKB DS T KD P Anormal Hücre ±SE (%) KA/Hücre ±SE MI±SE 250 IP ,33±0,49 0,013±0,004 4,87±0,26 GV ,33±0,21 b 2 0,003±0,002 b 2 5,93±0,16 b IP ,66±0,33 0,016±0,003 4,689±0,31 GV ,50±0,22 b 2 0,005±0,002 b 2 5,63±0,20 b 2 IP ,66±0,66 0,046±0,006 4,26±0,21 GV ,66±0,33 b 3 0,006±0,003 b 3 5,60±0,17 b IP ,50±0,56 0,036±0,006 4,45±0,25 GV ,00±0,89 b 3 0,010±0,003 b 3 5,12±0,17 b IP ,33±0,42 0,023±0,004 3,37±0,44 GV ,33±0,42 0,033±0,004 4,48±0,40 b IP ,66±0,61 0,036±0,006 3,73±0,18 GV ,66±0,66 0,026±0,006 3,86±0,05 b 1 SMB IP ,16±0,601 0,061±0,006 2,30±0,32 GV ,83±0,83 b 1 0,038±0,008 b 1 3,83±0,23 b IP ,33±1,11 0,073±0,011 1,65±0,19 GV ,00±0,93 b 1 0,045±0,011 b 1 3,76±0,19 b IP ,66±0,49 0,016±0,004 3,97±0,15 GV ,33±0,21 b 2 0,003±0,002 b 2 2,99±0,25 b IP ,00±0,81 0,050±0,008 3,02±0,17 GV ,83±0,79 b 1 0,018±0,007 b 2 2,81±0,32 1 IP ,00±0,51 0,083±0,006 2,33±0, GV ,33±0,61 b 3 0,026±0,007 b 2 2,68±0,19 IP 20-4 GV ,50±0,92 0,098±0,007 1,54±0, ,167±0,792 b 2 0,043±0,009 b 2 2,40±0,32 b 1 *B : Kromatid kırığı; B : Kromozom kırığı; F: Fragment; KD: Kromatid değişimi; KKB: Kardeş Kromatid Değişimi; P: Poliploidi; T: Translokasyon, DS; Disentrik Krm.,b: İntraperitonal uygulama ile karşılaştırıldığında fark önemli 1: P 0.05; 2: P 0.01; 3: P

64 5. TARTIŞMA Ahmet KAYRALDIZ 5. TARTIŞMA Bu çalışmada, bir gıda katkı maddesi olan SMB nin in vivo şıçan kemik iliği hücrelerinde kromozom anormalliklerinin oluşumu ve hücre bölünmesi üzerine olan etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla SMB sıçanlara intraperitonal (karın zarına enjekte ederek) ve oral (Gavage yoluyla: mideye kadar uzatılan ucu yuvarlak bir enjektör ignesi ile direkt mideye verme) uygulama olmak üzere iki yolla verilmiştir SMB nin Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Kromozom Aberasyonu Oluşumu Üzerine Etkileri ve Sitotoksiditesi SMB nin Sıçan Kemik İliği Hücrelerinde Kromozom Aberasyonu Oluşumu Üzerine Etkileri Bu çalışmada, SMB nin sıçanlara intraperitonal olarak uygulanmasından sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde kromozomal aberasyonlarının, tüm muamele sürelerinde kontrole göre önemli ölçüde uyarıldığı saptanmış ve bu artışın 12 ve 24 saatlik muamele sürelerinde doza bağlı olarak gerçekleştiği bulunmuştur. Buna karşın bu artış pozitif kontrol kadar olmamıştır. SMB nin gavage yoluyla uygulanmasından sonra sıçan kemik iliği hücrelerinde kromozomal aberasyonları 6 saatlik muamele sürelerinde tüm konsantrasyonlarda artmazken, 12 saatlik muamele süresinde tüm konsantrasyonlarda kontrole göre önemli ölçüde artmıştır. Ancak son iki konsantrasyonlardaki artış pozitif kontrol kadar olmuştur. 24 saatlik muamele süresinde ise sadece 750 ve 1000 mg/kg lık konsantrasyonda kontrole göre bir artış olduğu saptanmıştır. Rencüzoğulları ve ark. (2001a) SMB nin Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde mitotik anormallikleri artırdığını saptamışlardır. Aynı araştırma grubu (Rencüzoğulları ve ark. 2001b) SMB nin insan periferal lenfositlerinde kromozomal anormallikleri ve kardeş kromatid değişimini arttırdığını bildirmişlerdir. Meng ve Zhang (1992, 1994) in vitro koşullarda 5x10-5 M dan 2x10-3 M konsantrasyona kadar 51

65 5. TARTIŞMA Ahmet KAYRALDIZ çeşitli konsantrasyonlarda sodyum bisülfite maruz bırakılmış insan lenfositlerinde kromozomal aberasyonları, SCE ve mikronükleus incelemeleri yapmışlardır. Bu çalışmalarda da sodyum bisülfitin, insan lenfositlerinde SCE ve mikronükleus sayısında doza bağlı olarak bir artışa neden olduğu saptanmıştır. Bu araştırıcıların sonuçları bu çalışmadan elde edilen sonuçları destekler yöndedir. Sodyum metabisülfit suda çözüldüğünde, sodyum bisülfit ve sülfür dioxid e ayrışır. Çeşitli araştırıcılar sodyum bisülfit in genotoksik etkilerini araştırmışlar, bunlardan bazıları pozitif bazıları negatif sonuçlar bulmuşlardır. Örneğin: Njagi ve Gopalan (1982) Vicia faba kök ucu hücrelerinde sodyum sülfit ın doza bağlı olarak anafazda köprü oluşumunu indüklediğini ve interfaz nükleusunda kromatin erozyonuna neden olduğunu bildirmişlerdir. Chakraburtty (1975) yaptığı çalışmaya göre sodyum bisülfit in E. coli arginil trna sekonder yapıdayken sitozinin dezaminasyonu ile arginil trna nın amino asit yakalama aktivitesinde bir kayba neden olduğunu bildirmiştir. Bhanot ve ark. (1977) ve Bhanot ve Chambers (1977) sodyum bisülfit in maya nın valin trna sında C nükleotidinin U ya dönüşümünü indüklediğini bildirmişlerdir. Hayatsu ve Shiragami (1979) bisülfit in ph 4-5 te sitozini dezamine etmek yerine sitozin-5-metilsülfonata dönüştürdüğünü, ph 6-7 de ise bisülfit in 5-hidroksimetilurasili urasil-5-metilsülfonata dönüştürdüğünü bildirmişlerdir. Simmons ve Friedberg (1979) urasil deoksirübonükleik asit glikozilaz (ung geni) eksikliği olan E. coli mutantlarını sodyum bisülfit ile muamele etmişlerdir. Ung+ suşlarıyla mukayese edildiğinde ung - lerin sodyum bisülfite daha hassas olduklarını bildirmişlerdir. Bu sonuçlara göre de sitozinin dezaminasyonuyla oluşan urasilin neden olduğu yanlış eşleşmeleri tamir için ura-dna glikozilaz enzimine ihtiyaç olduğunu kaydetmişlerdir. Ripley ve Drake (1984) sodyum bisülfit in 37ºC de T4 bakteriyofajında sitozinin dezaminasyonu yoluyla timinin analoğu olan urasilin G:C----A:T transisyonuna neden olduğunu bildirmişlerdir. Pagano ve Zeiger (1987) Salmonella typimurium da sodyum bisülfit in mutajenitesini açıklamaya çalışmışlar. Yaptıkları çalışmaya göre sitozinin urasile dezaminasyonunun çerçeve kayması mutasyonuna neden olmayabileceğini, bunun sebebinin muhtemelen baz eşleşmesindeki düzensizlikten olabileceğini bildirmişlerdir. Çünkü bisülfit in otooksidasyon özelliği mutasyon işleminde önemli 52

66 5. TARTIŞMA Ahmet KAYRALDIZ bir rol oynayabilir. Buna göre sitozinin dezaminasyonunun bisülfit in sitozine olan afinitesinden çok oksidatif hasardan kaynaklanabileceğini bildirmişlerdir. Chen ve Shaw (1994) sodyum bisülfit in çift iplikli DNA da sitozinin urasil e dezaminasyonunu hassas deneylerle göstermişlerdir. Bu çalışmada urasil glikozilaz enzim eksikliği olan aktif bakteri suşları kullanılarak M13mp2C141 bakteriyofajının LacZ genini kodlayan bir mutantın reversiyonu saptanmaya çalışılmıştır. Bu çalışmada sitozinin urasile dezaminasyonu oranının büyük ölçüde artığı kaydedilmiştir. Yine, De Giovanni-Donelly (1985) Salmonella typhimurium un hisg46 allelini taşıyan LT2 suşlarında sodyum bisülfit in negatif sonuç verdiğini bildirmiştir. Görüldüğü gibi sodyum bisülfit genellikle nokta mutasyonuna sebep olmaktadır. Oysa Renner ve Wever (1983) düşük molybden diyeti uygulayarak besledikleri sıçan ve Chinese hamster lerde sodyum bisülfit in herhangi bir sitogenetik etki göstermediğini bildirmişlerdir. Bir başka çalışmada Popescu ve DiPaolo (1988) sodyum bisülfit in Syrian hamster hücrelerinde neoplastik transformasyona neden olduğunu, ancak kromozomal aberasyonların oluşumuna bir katkısının olmadığını yalnızca kardeş kromatid değişimini minimal düzeyde arttırdığını bildirmişlerdir. Tsutsui ve Barrett (1990) kültüre edilmiş Syrian hamster embriyo hücrelerinde sodyum bisülfit in hücre transformasyonunda doza bağlı bir artışa neden olduğunu gözlemlemişler ancak, gen mutasyonda bir artış olmadığı, tek pozitif cevabın KKD de artış olduğunu kaydetmişlerdir. Tüm bunların yanında bazı araştırıcılar tarafından sodyum bisülfit in koruyucu bir etkisinin olabileceği ileri sürülmüştür: Suwa ve ark. (1982) S9 bulunmayan ortamda Salmonella typhimurium un TA100 ve TA98 suşlarında taze hazırlanmış kahvenin mutajenik etkisinin sodyum sülfit tarafından inaktive edildiğini bildirmişlerdir. Nakasato ve ark. (1984) kahvenin kültüre edilmiş Chinese hamster akciğer hücreleri için oldukça mutajenik aktiviteye sahip olduğunu ancak kahvenin meydana getirdiği mutasyon oranının ortamda bulunan sodium bisülfit in varlığıyla ters orantılı biçimde azaldığını bildirmişlerdir. Sodyum metabisülfit in suda çözünmesi sonucu oluşan bir diğer kimyasal madde sülfür dioksit ile yapılmış olan çalışmaları inceleyecek olursak; DiPaolo ve 53

67 5. TARTIŞMA Ahmet KAYRALDIZ ark. (1981) sülfür dioksit in Syrian hamster embriyo hücrelerinde nötr ph ta dozunun artmasına bağlı olarak hücre transformasyonu oranının arttığını bildirmişlerdir. Meng ve Zhang (1990) Kuzey Çin de bir sülfirik asit fabrikasında çalışan ve kronik olarak sülfür dioksite maruz kalan 40 işçinin periferal kan lenfositlerinde kromozomal aberasyonların ve kardeş kromatid değişimlerinin kontrol gruplarına göre önemli ölçüde arttığını bildirmişlerdir. Bu sonuçlardan da sülfür dioksit in genotoksik ve klastojenik bir ajan olduğunu bildirmişlerdir. Meng ve Zhang (2002) farklı dozlardaki sülfür dioksit in kemik iliği hücrelerinde anormallik oranını doza bağlı olarak önemli ölçüde arttırdığını, düşük konsantrasyonlarda kromozomlarda kromatid tipi kırıklara, yüksek konsantrasyonlarda hem kromatid hemde kromozom tipi kırıklara neden olduğunu bildirmişlerdir. Yi ve Meng (2003) sülfür dioksit in Vicia ve Allium mikronükleus testlerinde mikronükleus frekansında önemli bir artışa sebep olduğunu ve bu artışın doza bağlı olarak gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Bizim bu çalışmamızda da sodyum metabisülfit in sıçanlara gerek intraperitonal yolla gerekse gavage yoluyla verilmesi sonucunda kemik iliği hücrelerinde kromozom aberasyonunun doza bağlı olarak arttığı saptanmıştır. Bu sonuçlar yukarıdaki araştırıcıların sonuçları ile karşılaştırıldığında sodyum metabisülfit in suda çözünmesi sonucu oluşan iki maddeden sodyum bisülfit ten ziyade sülfür dioksit yoluyla kromozom aberasyonuna sebep olduğu anlaşılmaktadır. Yukarıdaki çalışmaların sonuçlarından da anlaşıldığı gibi sodyum metabisülfit in suda çözünmesi sonucu oluşan maddelerden sodyum bisülfit özellikle nokta mutasyonuna, sülfür dioksit de kromozom aberasyonlarına neden olmaktadır. Bu çalışmada SMB nin KA nın uyarılması üzerinde ip olarak sıçanlara verilmesinin (tüm muamele sürelerinde) gv yoluyla verilmesine nazaran daha etkili olduğu bulunmuştur. Bu durum ip olarak SMB nin verilmesinin hedef doku olan kemik iliğine daha hızlı ulaştığını göstermektedir. Ayrıca SMB gv yoluyla verildiği zaman hedef dokuya ulaşmadan verilen SMB nin bir kısmının dışkı yoluyla vücuttan atıldığını düşündürmektedir. Buna benzer sonuç Nakajima ve ark. (1989) tarafından potasyum bromatla yapılan çalışmada elde edilmiştir. Bu çalışmada Nakajima ve ark. potasyum bromat ın genotoksik etkisini araştırmak için iki farklı fare ırkına (MS/Ae ve CD-1) ip ve gv yoluyla potasyum bromat ı vermişler ve mikronükleuslu 54

68 5. TARTIŞMA Ahmet KAYRALDIZ polikromatik eritrositlerin (=MNPCE) oluşumunu araştırmışlar. Test maddesi verildikten 24 saat sonra MNPCE lerin oranının doza bağlı olarak arttığını bulmuşlardır ancak bu artışın sadece CD-1 ırkında ip uygulamada gv uygulamaya nazaran daha fazla olduğu bulunmuştur. Bu sonuç da bizim çalışmamızdan elde ettiğimiz sonuçları destekler yöndedir SMB nin Hücre Bölünmesi Üzerine Etkisi SMB intraperitonal uygulamada tüm muamele sürelerinde ve tüm konsantrasyonlarda mitotik indeksi kontrole göre önemli ölçüde azaltmıştır. Fakat bu düşüş genel olarak pozitif kontrol kadar olmamıştır. Ancak 1000 mg/kg vücut ağırlığı konsantrasyonunda 12 ve 24 saatlik SMB ye maruz kalma durumunda sıçan kemik iliği hücrelerinde mitotik aktivite pozitif kontroldeki kadar düşmüştür (Çizelge 4.1). Gavage yoluyla SMB verildikten 12 ve 24 saat sonra kemik iliği hücrelerinde MI hem kontrolden hem de pozitif kontrolden önemli derecede düşük bulunmuştur (Çizelge 4.2). Ayrıca intraperitonal uygulama ve gavage uygulamayı MI yönünden karşılaştırdığımızda MI daki azalma intraperitonal uygulamada gavage uygulamasına göre çok daha fazla olduğu gözlenmiştir. Bu da SMB nin intraperitonal uygulamada daha etkili olduğunu göstermektedir. Rencüzoğulları ve ark. (2001a) Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde, Rencüzoğulları ve ark. (2001b) insan periferal lenfositlerinde sodyum metabisülfit in MI yı azalttığını bildirmişlerdir. SMB nin çeşitli dozlarda in vivo veya in vitro olarak sitotoksik etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca Njagi ve Gopalan (1982) Vicia faba kök ucu hücrelerinde, Meng ve Zhang (1992), Meng ve Zhang (1994) insan periferal lenfositlerinde, Meng ve Zhang (2002) sıçan kemik iliği hücrelerinde sodyum sülfit in doza bağlı olarak MI yı azalttığını bildirmişlerdir. Bu araştırıcıların sonuçları da bizim sonuçları destekler yöndedir. 55

69 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Ahmet KAYRALDIZ 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Bilindiği gibi SMB yiyecek ve içecek endüstrisinde koruyucu madde olarak, şeker ve un sanayinde beyazlatıcı madde olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Yaptığımız çalışmaya göre SMB intraperitonal yolla genel olarak kromozom aberasyonunu uyarmıştır. Ancak bu artış genel olarak pozitif kontroldeki kadar olmamıştır. Bunun yanında SMB gavage yoluyla sıçanlara verildiğinde 6 saatlik muamele süreleri hariç diğer tüm muamele süreleri ve konsantrasyonlarında genel olarak kromozom aberasyonunu uyarmıştır. Ancak bu artış yine pozitif kontrol kadar önemli olmamıştır. Bunlara ilaveten her iki uygulama yöntemini mukayese ettiğimizde SMB nin genel olarak intraperitonal uygulamada gavage uygulamaya göre kromozom aberasyonlarını daha fazla uyardığı ortaya çıkmaktadır. Sonuç olarak SMB nin insanlar tarafından alınması besinler yoluyla olduğu için gavage yoluyla elde etmiş olduğumuz sonuçlar insanlarda görülmesi muhtemel sonuçları bize göstermesi bakımından önemlidir. Yaptığımız çalışma sonucunda gavage yoluyla uygulama 6 saatlik muamele süreleri hariç tüm muamele sürelerinde kromozom aberasyonunu indüklemiştir. Dolayısıyla bu çalışma sonucunda SMB nin insanlar için genotoksik risk oluşturabileceğini söyleyebiliriz. Başka araştırıcıların sonuçları da bu bulguları destekler yöndedir. Bundan dolayı SMB nin insan besinine ilave edilmesinin yasaklanması görüşündeyim. 56

70 KAYNAKLAR ABE, S. and SASAKI, M., Chromosome aberrations and sister chromatid exchanges in Chinese hamster cells exposed to various chemicals. J. Natl. Cancer. Int., 58(6), ABUHARFEIL, N., JARAN, A., SHABSOUGH, B. and DARMANI, H., Effects of sodium nitrite on natural killer cells isolated from human peripheral blood. Arch. Toxicol., 75(5), AGÜLOĞLU, S. ve ORTAKAYA, C., Eritromycin in İnsan Kromozomları Üzerine In vitro Etkileri. XI. Ulusal Biyoloji Kongresi, Elazığ. Genel Biyoloji, AKIN, A. and SUMER, S., The mutagenic effects of sodium nitrite and monosodium glutamate used as food additives demonstrated by the Salmonella microsome test system. Mut. Res., 25(1), ALAVANTIC, D., SUNJEVARIC, I., PECEVSKI, J., BOZIN, D. and CEROVIC, G., In vivo genotoxicity of nitrates in germ cells of male mice. I. Evidence for gonadal exposure and lack of heritable effects. Mut. Res., 204(4), AL-TARAZI, Y.H. and ALSHAWABKEH, K., Effect of dietary formic and propionic acids on Salmonella pullorum shedding and mortality in layer chicks after experimental infection. J. Vet. Med. Infect. Dis. Vet. Public Health., 50(3), ALTUĞ, T., Gıda Katkı Maddeleri, Hekim ve Yaşam Dergisi, Haziran 99, ARDITO, G., BRAMANTI, B., BIGATTI, P., LAMBERTI, L. and DOLARA, P., Cytogenetic effect of thiabendazole and diphenylammine on cultured human lymphocytes: sister chromatid exchanges and cell cycle delay. Boll. Soc. Ital. Biol. Sper., 72(5-6), ARSLAN, M., 2004, Borik asit in insan periferal lenfositlerinde in vitro kromozom aberasyonu ve kardeş kromatid değişimi üzerindeki etkileri. Yüksek Lisans Tezi, Çukurova Üniversitesi, Balcalı-Adana, 63s. 57

71 BANERJEE, T.S. and GIRI, A.K., Effects of sorbic acid and sorbic acid-nitrite in vivo on bone marrow chromosomes of mice. Toxicol. Lett., 31(2), BASLER, A., HUDE, W. and SCHEUTWINKEL-REICH, M., Formaldehydeinduced sister chromatid exchange in vitro and the influence of the exogenous metabolizing system S9 mix and primary rat hepatocytes. Arch. Toxicol., 58(1), BASLER, A., VON DER HUDE, W. and SCHEUTWINKEL, M., Screening of food additive propionic acid for genotoxic properties. Food Chem.Tox., 25(4), BHANOT, O.S., AOYAGI, S. and CHAMBERS, R.W., Bisulfite-induced C changed to U transitions in yeast valine trna. J. Biol. Chem., 252(8), BHANOT, O.S. and CHAMBERS, R.W., Bisulfite-induced C changed to U transitions in yeast alanine trna. J. Biol. Chem., 252(8), BLITEK, D., PIENKOWSKA, K., GAJCY, H. and KORIOROWSKA, J., Mutagenicity of oxytetracycline. Mut. Res., 117(1-2), CHAKRABURTTY, K., Effect of sodium bisulfite modification on the arginine acceptance of E. coli trna Arg. Nucleic Acids Res., 2(10), CHEN, H. and SHAW, B.R., Bisulfite induces tandem double CC --> TT mutations in double-stranded DNA. 2. Kinetics of cyctosine deamination. Biochemistry, 33(14), DE GIOVANNI-DONNELLY, R., The mutagenicity of sodium bisulfite on base-substitution strains of Salmonella typhimurium. Teratog. Carcinog. Mutagen., 5(3), DiPAOLO, J.A., DEMARINIS, A.J. and DONIGER, J., Transformation of Syrian hamster embriyo cells by sodium bisulfite. Cancer. Lett., 12(3),

72 DÖNBAK, L., RENCÜZOĞULLARI, E. and TOPAKTAŞ, M., The Cytogenetic effects of the food additive boric acid in Allium cepa L. Cytologia. 67, EL NAHAS, S.M., GLOBUS, M. and VETHAMANY-GLOBUS, S., Chromosomal aberrations induced by sodium nitrite in bone marrow of adult rats and liver cells of transplacentally exposed embryos. J. Toxicol. Environ. Health., 13(4-6), FERRAND, C., MARC, F., FRITSCH, P., CASSAND, P. and DE SAINT BLANGUAT, G., Mutagenicity and genotoxicity of sorbic acid-amine reaction products. Toxicol., 14(5), FIUME, Z., Final report on the safety of malic acid and sodium malate. Int. J. Toxicol., 1, HASEGAWA, M.M., NISHI, Y., OHKAWA, Y. and INUI, N., Effects of ascorbic acid and its salts on chromosome aberrations, sister chromatid exchanges and gene mutations in cultured Chinese hamster cells. Food Chem. Toxicol., 22(7), HAYATSU, H. and SHIRAGAMI, M., Reaction of bisulfite with the 5- hydroxymethyl group in pyrimidines and phage DNAs. Biochemistry, 18(4), INUI, N., NISHI, Y., TAKETOMI, M. and MORI, M., Transplacental action of sodium nitrite on embryonic cells of Syrian golden hamster. Mut. Res., 66(2), ISHIDATE, M.J.R. and ODASHIMA, S., Chromosome tests with 134 compounds on Chinese hamster cells in vitro a screening for chemical carcinogens. Mut. Res., 48(3-4), ISHIDATE, M.J.R., SOFUNI, T., YOSHIKAWA, K., HAYASHI, M., NOHMI, M. and SAWADA, M., Primary mutagenicity screening of food additives currently used in Japan. Food Chem. Toxicol., 22(8), JONKER, D., WOUTERSEN, R.A., VAN BLADEREN, P.J., TIL, H.P. and FERON, V.J., week oral toxicity study of a combination of eight 59

73 chemicals in rats: comparison with the toxicity of the individual compounds. Food. Chem. Toxicol., 28(9), JUNG, R., COJOCEL, C., MULLER, W., BOTTGER, D. and LUCK, E., Evaluation of the genotoxic potential of sorbic acid and potassium sorbate. Food Chem. Toxicol., 30(1), 1-7. KARAKAYA, A.E., Gıda katkı maddeleri ve gıda kontaminantları web sayfası, ( KODAMA, F., UMEDA, M. and TSUTSUI, T., Mutagenic effect of sodium nitrite on cultured mouse cells. Mut. Res., 40(2), KRISHNA, G., NATH, J., SOLER, L. and ONG, T., In vivo induction of sister chromatid exchanges in mice by nitrosated coal dust extract. Environ. Res., 42(1), KUBOYAMA, N. and FUJII, A., Mutagenicity of analgesic, their derivatives, and anti-inflammatory drugs with S9 mix of several animal species. J. Nihon. Univ. Sch. Dent., 34(3), LUCA, D., LUCA, V., COTOR, F. and RAILEANU, L., In vivo and in vitro cytogenetic damage induced by sodium nitrite. Mut. Res., 189(3), MAILHES, J.B., YOUNG, D., AARDEMA, M.J. and LONDON, S.N., Thiabendazole-induced cytogenetic abnormalities in Mouse oocytes. Environ. Mol. Mutagen., 29(4), MATSUOKA, A., HAYASHI, M. and ISHIDITAE, M.J.R., Chromosomal aberration tests on 29 chemical combined with S9 mix in vitro, Mut. Res., 66(3), MENG, Z.Q. and ZHANG, L.Z., 1990.Chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges in lymphocytes of workers exposed to sulphur dioxide. Mut. Res. 241(1), MENG, Z. and ZHANG, L., Chromosomal aberrations, sister chromatid exchanges and micronuclei induced in human lymphocytes by sodium bisulfite (sulfur dioxide). I Chuan Hsueh Pao., 21(1), 1-6. MENG, Z. and ZHANG, L., Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by sodium bisulfite, Mut. Res., 298(2),

74 MENG, Z. and ZHANG, B Polymerase chain reaction-based deletion screening of bisulfite (sulfur dioxide)-enhanced gpt-mutants in CHO-AS52 cells. Mut. Res., 425, MENG, Z., and ZHANG, B Induction effects of sulfur dioxide inhalation on chromosomal aberrations in mouse bone marrow cells. Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 36(4), MOLANDER, J., HURSKAINEN, P., HOVINEN, J., LAHTI, M., and LONNBERG, H., Bisulfite ion-catalyzed transmination of cytosine residues with alpha, omega-alkanediamines: the effect of chain length on the reaction kinetics. Bioconjug. Chem., 4(5), MORITA, T., TAKEDA, K. and OKUMURA, K., Evaluation of clastogenicity of formic acid, acetic acid and lactic acid on cultured mammalian cells. Mut. Res., 240(3), MUDRY DE PARGAMENT, M.D., LABAL DE VINUESA, M. and LARRIPA, I., Mutagenic bioassay of certain pharmacological drugs. I. Thiabendazole (TBZ). Mut. Res., 188(1), 1-6. MURINDA, S. E., RASHID, K. A. and ROBERTS, R. F., In vitro assessment of the cytotoxicity of nisin, pediocin and selected colicins on simian virus 40- transfected human colon and Vero monkey kidney cells with trypan blue staining viability assays. J. Food Prot., 66(5), MUKHERJEE, A., GIRI, A.K., TALUKDER, G. and SHARMA, A., Sister chromatid exchanges and micronuclei formations induced by sorbic acid and sorbic acid-nitrite in vivo in mice. Toxicol. Lett., 42(1), MUNZER, R., GUIGAS, C. and RENNER, H.W., Re-examination of potassium sorbate and sodium sorbate for possible genotoxic potential. Food. Chem. Toxicol., 28(6), NAGAO, M., HONDA, M., SEINO, Y., YAHAGI, T. and KAWACHI, T., Mutagenicities of protein pyrolysates. Cancer Lett., 2(6), NAIR, B., Final report on the safety assessment of benzyl alcohol, benzoic acid and sodium benzoate. Int. J. Toxicol. 20 Suppl 3:

75 NAKAJIMA, M., KITAZAWA, M., OBA, K., KITAGAWA, Y. and TOYODA, Y., Effect of route of administration in the micronucleus tests with potassium bromate. Mut. Res., 223(4), NAKASATO, F., NAKAYASU, M., FUJITA, Y., NAGAO, M., TERADA, M. and SUGIMURA, T., Mutagenicity of instant coffee on cultured Chinese hamster lung cells. Mut. Res., 141(2), NJAGI, G.D. and GOPALAN, H.N., Cytogenetic effects of the food preservatives sodium benzoate and sodium sulphite on Vicia faba root meristems. Mut. Res., 102(3), NATIONAL TOXICOLOGY PROGRAM., Toxicology and carcinogenesis studies of Boric Acid. Natl Toxicol Program Tech Rep Ser., 324, ODUNOLA, O.A.,1997. Individual and combined genotoxic response of boric acid B1 in Escherichia coli PQ37. East Afr. Med. J. 74(8) OHARA, A., MIZUNO, M., DANNO, G., KANAZAWA, K., YOSHIOKA, T. and NATAKE, M., Mutagen formed from tryptophan reacted with sodium nitrite in acidic solution. Mut. Res., 206(1), OHSAWA, K., NAKAGAWA, S.Y., KIMURA, M., SHIMADA, C., TSUDA, S., KABASAWA, K., KAWAGUCHI, S. and SASAKI, T.F., Detection of in vivo genotoxicity of endogenously formed N-nitroso compounds and supression by ascorbic acid, teas and fruit juices. Mut. Res. 539(1-2), PAGANO, D.A. and ZEIGER, E., Conditions affecting the mutagenicity of sodium bisulfite in Salmonella typhimurium. Mut. Res., 179(2), PHILIPOSE, B., SING, R., KHAN, K. A. and GIRI, A. K., Comparative mutagenic and genotoxic effects of three propionic acid derivatives ibuprofen, ketoprofen and naproxen. Mut. Res.;393(1-2): PISANO, C., BATTISTONI, A., ANTOCCIA, A., DEGRASSI, F. and TANZARELLA, C., Changes in microtubule organization after exposure to a benzimidazole derivative in Chinese hamster cells. Mutagenesis, 15(6),

76 POPESCU, N.C. and DiPAOLO J.A., Chromosome alterations in Syrian hamster cells transformed in vitro by sodium bisulfite, a nonclastogenic carcinogen. Cancer Res., 48(24), PRIVAL, M.J., SIMMON, V.F. and MORTELMANS, K.E., Bacterial mutagenicity testing of 49 food ingredients gives very few positive results. Mut. Res., 260(4), RENCÜZOĞULLARI, E., KAYRALDIZ, A., İLA, H.B., ÇAKMAK, T. and TOPAKTAŞ, M., 2001a. The cytogenetic effects of sodium metabisulfite, a food preservative in root tip cells of Allium cepa L. Turk. J. Biol. 25, RENCÜZOĞULLARI, E., İLA, H.B., KAYRALDIZ, A. and TOPAKTAŞ, M., 2001b. Chromosome aberrations and sister chromatid exchange in cultured human lymphocytes treated with sodium metabisulfite, a food preservative. Mut. Res., 490, RENNER, H.W. and WEVER, J., Attemts to induce cytogenetic effects with sulphite in sulphite oxidase-deficient Chinese hamster and mice. Food Chem. Toxicol., 21(2), RIBERA, D., JONKER, D., NARBONNE, J.F., OBREIN, J. and ANTIGNAC, E., Absence of adverse effects of sodium metabisulphite in manufactured biscuits: results of subacute (28-days) and subchronic (85-days) feeding studies in rats. Food Addit. Contam., 18(2), RIPLEY, L.S. and DRAKE, J.W., Bacteriophage T4 particles are refractory to bisulfite mutagenesis. Mut. Res., 129(2), ROGERS, A.H., The effects of sorbate on oral streptococci grown in continuous culture. J. Dent. Res., 65(6), RYU, J.S. and LLOYD, D., Cell cytotoxicity of sodium nitrite, sodium nitroprusside and Roussin s black salt againts Trichomonas vaginalis. FEMS Microbiol. Lett., 130(2-3),

77 SASAKI, Y.F., SAGA, A., AKASAKA, M., YOSHIDA, K., NISHIDATE, E., SU, Y.Q., MATSUSAKA, N. and TSUDA, S., In vivo genotoxicity of ortho-phenlphenol, biphenyl and thiabendazole detected in multiple mouse organs by the alkaline single cell gel electrophoresis assay. Mut. Res., 395(2-3), SASAKI, Y.F., KAWAGUCHI, S., KAMAYA, A., OHSHITA, M., KABASAWA, K., IWAMA, K., TANIGUCHI, K. and TSUDA, S., The comet assay with 8 mouse organs: results with 39 currently used food additives. Mut. Res., 519(1-2), SATO, T., OSE, Y., NAGASE, H. and HAYASE, K, Mechanism of the desmutagenic effect of humic acid. Mut. Res., 176(2), SCHIFFMANN, D. and SCHLATTER, J., Genotoxicity and cell transformation studies with sorbates in Syrian hamster embryo fibroblasts. Food Chem. Toxicol., 30(8), SCHLATTER, J., WURGLER, F.E., KRANZLIN, R., MAIER, P., HOLLIGER, E. and GRAF, U., The potential genotoxicity of sorbates: effects on cell cycle in vitro in V79 cells and somatic mutations in Drosophila. Food Chem. Toxicol. 30(10), SCMID, T.E., XU, W. and ADLER, I.D., Detection of aneuploidy by multicolor FISH in Mouse sperm after in vivo treatment with acrylamide, colchicine, diazepam or thiabendazole. Mutagenesis, 14(2), SHIMADA, T., Lack of teratogenic and mutagenic effects of nitrite on Mouse fetuses. Arch. Environ. Health, 44(1), SIMMONS, R.R. and FRIEDBERG, E.C., Enzymatic degradation of uracilcontaining deoxyribonucleic acid. V. Survival of Escherichia coli and coliphages treated with sodium bisulfite.j. Bacteriol., 137, SURJAN, A., Analysis of genotoxic activity of 16 compouns and mixtures by the Drosophila mosaic test. Ann. Ist. Super Sanita, 25(4), SUSHKO, S.N. and MALENCHENKO, A.F., Chromosome aberration induction in murine spermatocytes in joint exposure to radiation and sodium nitrite and nitrate. Radiobiologiia, 32(4),

78 SUWA, Y., NAGAO, M., KOSUGI, A. and SUGIMURA, T., Sulfite supresses the mutagenic property of coffee. Mut. Res., 102(4), TARIM BAKANLIĞI, 1997.Türk Gıda Kodeksi, Dünya yayınları, 197 sayfa. TIL, H.P., FALKE, H.E., KUPER, C.F. and WILLEMS, M.I., Evaluation of the oral toxicity of potassium nitrite in a 13 week drinkinwater study in rats. Food Chem. Toxicol., 26(10), TOHAMY, A.A., EL GHOR, A.A., MOHARRAM, N.Z. and EL SHAZLY, M.M., Protective role of soybean feeding against the cytogenetical and histopathological effects of dibutylamine and sodium nitrate on bone marrow and liver of mice. Mut. Res., 360(3), TOHDA, H., HORAGUCHI, K., TAKAHASHI, K., OIKAWA, A. and MATSUSHIMA, T., Epstein-Barr virus-transformed human lymphoblastoid cells for study of sister chromatid exchange and their evaluation as a test system. Cancer Res., 40(12): TSUDA, H. and KATO, K., High rate of endoreduplications and chromosomal aberrations in hamster cells treated with sodium nitrite in vitro. Mut. Res., 56(1), TSUTSUI, T. and BARRETT, J.C., Sodium bisulfite induces morphological transformation of cultured Syrian hamster embriyo cells but lacks the ağabeylity to induce detectable gene mutations, chromosome mutations or DNA damage. Carcinogenesis, 11(10), VACHKOVA-PETROVA, R., Mutagenic activity of basfungin in its combined action with sodium nitrite. Probl. Khig., 4, VERNOLE, P., CAPOROSSI, D., TEDESCHI, B., MELINO, G., PORFIRIO, B., BONMASSAR, E. and NICOLETTI, B., Sister chromatid exchanges in human lymphocytes exposed to 1-p-(3-methyltriazeno) benzoic acid potassium salt. Mut. Res., 208(3-4), VERNOLE, P., CAPOROSSI, D., TEDESCHI, B., PORFIRIO, B., MELINO, G., BONMASAR, E. and NICOLETTI, B., Cytogenetic effects of 1-p-(3- methyltriazeno) benzoic acid potassium salt on human lymphocytes in vitro. Mut. Res. 189(3),

79 VOROBJEVA, L.I., ALTUKHOVA, E.A., NAUMOVA, E.S. and ABILEV, S.K., Antimutagenic effects of culture fluid obtained as a result of propionic acid fermentation. Mikrobiologiia, 62(6), VOROBJEVA, L.I., CHERDINCEVA, T.A., ABILEV, S.K. and VOROBJEVA, N.V., Antimutagenicity of propionic acid bacteria. Mut. Res., 251(2), WALKER, R., Toxicology of sorbic acid and sorbates. Food. Addit. Contam., 7(5), YI, H. and MENG, Z., Genotoxicity of hydrated sulfur dioxide on root tips of Allium sativum and Vicia faba. Mut. Res., 537(1), ZEIGER, E., ANDERSON, B., HAWORTH, S., LAWLOR, T. and MORTELMANS, K., Salmonella mutagenicity tests: IV. Results from the testing of 300 chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 11(12),

80 ÖZGEÇMİŞ 1974 yılında Adana da doğdum İlk, orta ve lise öğrenimimi tamamladıktan sonra 1992 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Lisans Programını kazandım yılında bu bölümden Biolog ünvanı ile mezun oldum. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans öğrenimine başladım yılında Uzman Biolog Ünvanı ile buradan mezun oldum. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Doktora Programına başladım tarihinde Biyoloji Bölümüne araştırma görevlisi olarak atandım. Halen bu görevi sürdürmekteyim. 67