YAPAY KROMOZOMLAR Yapay kromozomlar ilk defa tomurcuklanan maya olan Saccharomyces cerevisiae. de kurulmuştur. Halkasal plazmid maya sentromerinden,replikasyon orijininden, seçici bir işaret geninden ve bir palindromik telomerik yapılardan oluşur. 1
Doğrusal yapılar, 50 kb uzunluğunda, bir sentromer içeren, bir replikasyon orijini ve replike olmuş iki telomer and %99 doğrulukta ayrışım gösteren mitoz bölünmede en az 20 nesil boyunca kültürde kaybolmayan yapılardır. 2
YAPAY KROMOZOMLARIN TARİHİ Kromozomlar 1880 de isimlendirildi fakat bu onların kalıtım bilgisini içeren moleküler kompleksler olduğunu açıkça göstermiyordu. 1980 lerde yapısı bozulmuş gerçek kromozomu taklit eden nukleoprotein yapıda kompleksleri oluşturulması denenmiştir. 3
Doğal kromozomların işlevsel olan ve olmayan dizilerinin analizi yerine bunlar üzerinde çalışılmıştır. Yapay kromozomların de novo formasyonlarının oluşmasında klonlanmış kromozomal DNA elementlerinin transferi öncülük etmiştir. Bu elementler tekrarlanmış telomerik ve sentromerik DNA, Ori/ARS bölgeleri, çok klonlama bölgeleri ve işaret genler. 4
YAC (Yeast Artificial Chromosome) Maya Yapay Kromozomu 5
Maya yapay kromozomları (YACs) genellikle yabancı DNA ların (Örneğin insan DNA sı) çok büyük bir parçasını klonlamak için kullanılan vektörlerdir. 6
YAC lar karakteristik olarak 250.000 ile 1 milyon baz çifti uzunluğundadır. YAC lar ilk olarak Burke tarafından 1987 de yaratılmıştır. O günden sonra YAC lar büyük ölçüde fiziki haritalamada, contig yapımında ve harita bazlı gen klonlamasında kullanılmıştır. 7
YAC; sentromer, replikasyon orijini ve S.cerevisiae nın içine girebilmesini kolaylaştıran iki telomere sahiptir. Ek olarak her kromozom kolu seçilebilir ürünleri kodlayan genleri içerir. 8
Bunlar, doğal maya kromozomlarının temel işlevsel kısımlarının birleştirilmesiyle meydana getirilir. Daha sonra yabancı DNA parçası ile birleştirilir. 9
Meydana gelen bu kromozom tekrar maya hücresine (sanki maya kromozomunun normal bir parçasıymış gibi) sokulur. Sonuç olarak oluşan koloni hücrelerinin her biri yabancı DNA nın aynı parçasını içeren bir kopyasını taşır., 10
11
İşlevsel YAC, kendi kendinin çoğalmasını mümkün kılan 3 tane spesifik DNA fragmentine ihtiyaç duyar 1.Telomer: Her kromozomun sonunda bulunur. Doğrusal DNA yı nükleazlar tarafından kesilmekten korurlar. 12
2.Sentromer: Mitotik iğ ipliklerinin bağlanma bölgesidir. 3.Replikasyon Orijini: DNA replikasyon makinelerinin DNA üzerine tutunmasını sağlayan özel DNA dizileridir. 13
14
Yapay kromozomlara birkaç özel diziler de eklenebilir. Örneğin: Seçici İşaretler (Selectable marker): Yapay kromozomu alan maya hücrelerinin kolay izolasyonuna imkan verir. Tanıma Bölgeleri : İki restriksiyon enzimi içindir (EcoRI ve BamHI) 15
YAC LARIN FAYDALARI ve KUSURLARI YAC vektörlerinin esas kullanım avantajı; onların 200-800 kbp büyüklüğünde DNA parçasıyla birleşebilmesidir. 16
Maya hücresine klonlanabilen en uzun DNA parçası 0.5 ile 1 milyon nükleotid arasındadır. Bakteri de ise yaklaşık olarak sadece 50.000 nükleotiddir. Büyük insertlerin olması daha az klonun incelenmesini sağlar. 17
YAC lar bilim adamlarının büyük ve kompleks kromozoma sahip organizmaların genetik özelliklerinin büyük parçalarıyla çalışmalarını mümkün kılar. 18
İnsan genomunun tamamını haritalamak için (3x1.000.000.000 nükleotid baz çifti) 100.000 den fazla plazmid klonuna ihtiyaç duyulur fakat yaklaşık 10.000 YAC klonuyla gösterilebilir. 19
YAC ların kullanımının dezavantajı ise düşük transformasyon verimidir. Ayrıca YAC transformantları görüntülenmeden önce ayrı ayrı muamele edilmelidir. Bundan başka, transformant hücrelerden büyük miktarlarda rekombinant DNA elde etmek güçtür. 20
YAC lar BAC lardan daha az kararlıdır. Bir çok halde protein üretimi için BAC lar kullanılsa da bazı hallerde endotoksin eksikliğinden dolayı YAC lar daha iyi vektör oluyorlar. 21
Hepatit B antijeninin üretiminde YAC lar kullanıldığı zaman ürünler E.coli de üretilenlerden daha yüksek aktiviteye sahip oluyorlar. 22
YAC a yabancı bir DNA nın klonlanması 4 ana adımda gerçekleşir. 1. Genomik DNA restriksiyon enzimi olan EcoRI ile kısmen kesilir ve çok büyük bir DNA parçası elde edilir. 2. YAC 2 restriksiyon enzimi ile (EcoRI ve BamHI) ile kesilir. 23
3. Bu iki element EcoRI bölgesinde rekombine olur ve DNA ligaz tarafından kovalent bir şekilde bağlanır. 4. Rekombinant YAC vektörü, genomik DNA içeren maya yapay kromozomu, üretilmiş olur. Bu vektör maya hücrelerini enfekte etmek için kullanılabilir ve sınırsız sayıda kopya üretilebilir. 24
YAC TEKNOLOJİSİNİN UYGULAMALARI YAC ın esas uygulaması genom araştırmalarının başlangıç aşamasında kullanıldı. YAC lara genomların fiziksel haritalarının çıkarılmasında ihtiyaç duyulur. 25
Mayalar,insan DNA sında olduğu gibi yüksek derecede tekrarlanmış dizileri içeren yabancı DNA lara karşı daha fazla toleranslıdır. YAC ların ortaya çıkışıyla insan genomik kitaplıklarının üretimi kolaylaştırılmıştır. Bu andan itibaren YAC kitaplıkları Arabidopsis ve insan genom projesinde kullanılmıştır. 26
Fiziksel harita iki nedenle faydalıdır. Birincisi; fiziksel harita genomun genetik olarak tanımlanmış her bölgesinden faydalanma imkanı sağlar. İkincisi ise; küresel genomik çalışmalar için bir başlangıç noktası sağlamasıdır. 27
YAC lar büyük genlerin klonlanmasında kullanıldığı gibi HAC ların kurulmasında da kullanılabiliyorlar. YAC lar genlerin klonlanması için olduğu kadar memeli telomerik ve sentromerik bölgeleri ve replikasyonun kromozomal orijini içinde kullanışlıdır. Bu nedenle HAC ların gelişmesinde önemlidirler. 28
BAC (Bacterial Artifical Chromosome) Bakteri Yapay Kromozomu 29
Bakteri yapay kromozomu: Orta büyüklükte DNA parçası (100.000-200.000 baz büyüklüğünde) ile birleşen bakteriyel DNA dır. Bu DNA parçasının bakteride çoğalmasını ve dizilenmesini sağlar. 30
Genom Analizi İçin BAC Kitaplıkları Harita bazlı klonlamanın ve büyük kromozomal bölgelerin fiziksel analizinin başarısı için esas olanlardan biri genomik DNA nın büyük insertlerini içeren kitaplıkların elde edilmesidir. 31
32
Son yıllarda BAC kitaplıkları insan, fare, ve Arabidopsis, domates, arpa, mısır ve sorghum gibi bitki türleri için kurulmuşlardır. Bu kitaplıkların, büyük bölgelerin fiziksel haritalarının üretiminde ve bir çok önemli genin izolasyonunda değerli katkıları vardır. 33
BAC kitaplıları YAC kitaplıklarının birçok dezavantajının üstesinden gelmektedir. Bu sistem F faktörü bazlı vektörü kullanıyor ve insan genomik DNA sının 300 kb den büyük parçasını bulundurma kapasitesine sahiptir. 34
YAC klonlamayla karşılaştırıldığında DNA yüksek verimle klonlanır, kolaylıkla manipüle edilir ve E.coli de kararlılığını sürdürür. Bitki BAC kitaplıkları birçok ortak çalışmada başarıyla kullanılmıştır. Örneğin hastalık direnç genleriyle ilişkili BAC klonları Arabidopsis ve pirinç kitaplıklarından izole edilmişlerdir. 35
BAC klonları, bitki kromozomlarında FISH analiziyle haritalanabilir. Bu teknik, genomik klonların kromozomal yerleşimlerinin hızlı tayini için veya genetik olarak haritalanmış klonların arasındaki fiziksel mesafenin tayini için kullanılabilir. 36
BAC kitaplıkları kısa zamanda kurulabildiği ve YAC kitaplıklarından daha verimli analiz edilebildiği için BAC sistemi, bitki genom analizi için çok önemli bir araçtır. 37
MAC (Mammalian Artificial Chromosome) Memeli Yapay Kromozomları 38
39
Memeli yapay kromozomları sentromer, DNA replikasyon orijini ve telomer bölgelerinin bir araya getirilmesiyle oluşturulmuştur. MAC lar çok büyük genomik parçaları taşıyabilirler 40
MAC oluşumu YAC a göre çok daha zordur.çünkü memeli telomeri maya telomerinden 10-100 kat; memeli sentromeri ise maya sentromerinden yaklaşık 1000 kat daha büyüktür. Memeli sentromer ve telomer dizilerinin çok fazla sayıda tekrarlanması da memeli yapay kromozomu oluşturulmasını zorlaştırır. 41
MAC, memeli kromozomunun işlevi için zorunlu olan cis-acting DNA dizilerinin analizine olanak verir. MAC ın yapısı, normal kromozom replikasyonu ve ayrışması için ihtiyacımızın ne olduğunu anlamamızı sağlar. 42
MAC ların telomerli, sentromerli ve replikasyon fonksiyonlu yapısına 2 yöntemle ulaşılabilir. Birincisi: top down adı verilen yöntemle, yapay olarak indüklenmiş kromozom parçalarını, normal kromozomların mitotik özelliklerini bulunduran minimal kromozomları tanımlayıcı araç olarak kullanmaktır. 43
İkinci yaklaşım ise Build up adı verilen; işlevsel olarak tanımlanmış telomer tekrarlarıyla birlikte aday sentromer ve replikasyon orijin dizilerini içeren MAC vektörlerini toplamayı denemek üzerine yoğunlaşır. 44
MAC lar gen terapisi için ve transgenik hayvanların üretiminde faydalı olabilecek genlerin hücre içine transferinde kullanılmaktadır. 45
HAC (Human Artificial Chromosome) İnsan Yapay Kromozomları 46
HAC oluşturulmasında 2 yöntem vardır. Doğal kromozomlar parçalanarak ve de novo kromozomlar oluşturularak. 47
İlk yöntem TACF veya TDT 1991 yılında geliştirilmiştir.bu yöntem hedef seçilen kromozomlardan minikromozomlar oluşturulmasına dayanır.seçici marker ve çalışılan kromozomun herhangi bir bölgesine homolog olan bir dizi kullanılır. 48
Oluşan bu yapıya engineered minichromosome adı verilir. Bu minikromozomlar otonomdur.bu yöntem özellikle insan X ve Y kromozomlarında başarı göstermiştir. 49
İkinci yaklaşım ise insan telomer ve sentromer dizilerini insan kültür hücrelerine aktararak büyüklüğü 1-10 Mb a kadar değişen de novo kromozom oluşturmaktır. 50