Legionella Pneumophillia yı Tür Düzeyinde Algılayan Biyosensör Escherichia Coli Hücrelerinin Oluşturulması Başak Alan, Özgür Ozan Ceylan, Cansu Çelik, Berkhan Genç, Sevecen Kaplan, Süleyman Mert Yiğitbaşı Danışman: Prof. Dr. Feride İffet Şahin ÖZET Dönem III Çalışma Grubu ile yürütülmekte olan çalışmamızda, genetik mühendisliği yöntemlerini kullanarak Legionella pneumophila yı özgül olarak algılayabilen ve ifadelenme düzeyinde bu algıya cevap vererek bazı Stafilokok suşlarının salgıladığı anti-legionella peptidini üretebilen E. coli hücrelerinin oluşturulması hedeflenmiştir. 2012 yılında itibaren Baskent_Meds ismiyle çalışan takımımız International Genetically Engineered Machine (igem) yarışmasına katılmayı amaçlamaktadır. Bu kapsamda çalışma grubumuz 2013 Ekim-Kasım aylarında düzenlenecek olan yarışmaya katılmak için kayıt yaptırmıştır. Bu yarışmada amaç, organizasyon tarafından temin edilen biobrick adı verilen parçalar kullanılarak fonksiyonel üniteler geliştirmektedir. Anahtar kelimeler: anti-legionella peptidi Legionella quarum sensing, BioBrick, biyosensör,
GİRİŞ Legionella bakterileri gram negatif patojen mikroorganizmalardır. Su depolama tankları, havuzlar, klimalar gibi sistemler bu bakterinin çoğalması için elverişli ortamlardır (3,10). Elliye yakın çeşidi tespit edilmiş olup, L.pneumophilla, Legionella kökenli tüm enfeksiyonların yaklaşık %90 ına kaynaklık etmektedir. Virulans faktörünü insanda intrasellüler yaşam sürdürdüğü akciğer alveolar hücrelerinde göstermektedir (13). Bakterilerin bulunduğu ortamda popülasyon yoğunluğunun düşük veya yüksek olduğunun ayırt edilebilmesi türlere özel sinyal moleküllerinin algılanması ile mümkün olmaktadır. Böylelikle hücre sayısındaki değişikliğe cevap olarak gen ekspresyonu, simbiyozis, virülans, antibiyotik üretimi ve biyofilm oluşumunun popülasyon düzeyinde kontrolü düzenlenebilmektedir. Bu olay Quorum Sensing olarak ifade edilmektedir (6, 14, 15). Legionella pneumophila ve Vibrio cholera türlerinin quorum sensing molekülleri α-hidrosilketon türleridir (18). L. pneumophila da lqsa (autoinducer synthase), lqsr (response regulator) ve lqss (sensor kinase) genlerinden oluşan lqs (legionalla quorum sensing) gen kümesi quorum sensing mekanizmasından sorumludur (15-19). Neden olduğu ölümlerin çoğu, kolay tespit edilememesi ya da belirtilerinin Klebsiella pneumoniae belirtileri ile karıştırılmasından kaynaklanmaktadır (13). L. pneumophila lqs algılama sisteminin bazı gen bileşenlerinin başka bir bakteriye aktarılması ile L. pneumophila yı tür düzeyinde özgül olarak algılayabilen ve ifadelenme düzeyinde bu algıya cevap verebilen hücreler oluşturmak mümkündür. GEREÇ VE YÖNTEM: Kullanılan Besiyerleri SOC medium Luria Broth Agar-Ampisillin (50-100 µg/ml) Luria Broth Agar-Kanamisin (50 µg/ml) Luria Broth Agar- Ampisillin (50 µg/ml) + kanamisinin (50 µg/ml) (8) DH5α ve XL1-Blue E.coli suşlarından CaCl 2 çöktürme yöntemi ile kompetan (alıcı uyumlu) hücre eldesi: Bir gece katı besiyerinde (Luria Broth Agar; LBA) büyüyen kültürler sıvı besiyerine (LB) inoküle edilir. Ardından 37 C de yaklaşık 3 saat inkübasyon yapılır ve optik yoğunluk (OD) 30 dakikada bir 600 nm de ölçülür. OD 0,6 ya yakın veya eşit olduğu durumda; kültürler 15 ml lik falkon tüplerde 10dk buz üzerinde inkübe edilir. İnkübe edilen kültürler 4 C de 4000 rpm de 10dk santrifüj edilir. Süpernatant atılır ve pellet kurutulur. Pellete 2.5 ml 0,1 M CaCl 2 eklenerek pellet çözülür. Tekrar 4 C de 4000 rpm de 10dk santrifüj edilir. Süpernatant atılır ve pellet 1,2 ml 0,1 M CaCl 2 içeren 500 L süspansiyon eppendorf tüplere dağıtılır. Her birine 7.5 L gliserol eklenir. Elde edilen hücreler -40 C de saklanır.
Transformasyon Transformasyon aşamasında kullandığımız vektörler pnt-1, pts-2, ligasyonlardan elde edilen ürünler, igem kitlerinden elde edilen plazmidler. Transformasyonda kullanılacak olan plastik malzemeler soğuk olarak kullanılır.-40 C dan çıkartılan hücreler buz üzerinde eritilir (0 C>). 50 L hücre kültürüne 3 L plasmid eklenir. 30dk buzda inkübe edildikten sonra 60sn 42 C deki su banyosunda inkübasyon yapılır. Ardından 1dk buzda inkübasyon yapılır. 250 L SOC besiyeri eklenir. 37 C 1 saat çalkalamalı inkübasyon yapılır. 50 L kültür LBA (amp) besiyerine yayma yöntemi ile inoküle edilir (4). Plasmid İzolasyonu Promega Pure Yield Plasmid Miniprep System ile QIAprep Spin Miniprep Kit kullanılmıştır. Restriksiyon Endonükleaz Kesimi Reaksiyon karışımı Vektör (0,3-0,8 g) Restriksiyon endonükleaz (10-12U/ L) 10X Tampon BSA (10 mg/ml) dh 2 O RE ünite: gvektör > 20 1X 0,1 mg/ml toplam hacim 50 L 5-16 saat, 37 C inkübasyon yapıldı. Ardından 20 dk, 60 C / 80 C inaktivasyon yapıldı. Jelden Bant Elüsyonu Promega Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System üretici protokolüne uygun olarak kullanıldı. Ligasyon Reaksiyon karışımı Plazmid (50-100 ng) Hedef DNA T4 DNA ligaz (3U/ L) 10X Tampon dh 2 O 1,5 U 1X Toplam hacim 10 L Vektör : hedef DNA oranı; 1:3, 1:2, 1:1 olarak uygulanmıştır (ng vektör x insert bç) / vektör bç x (insert : vektör oranı) = ng hedef DNA
Çalışmalarımızda 50 ya da 100 ng plazmid ile başlayarak hedef DNA yı 3 kat molar oranda kullanıldı. Baz uzunluklarını gözeterek kullanacağımız hedef DNA nın miktarı hesaplandı. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) Reaksiyon karışımı L PZR Koşulları C Süre Döngü dh2o 10X PZR Tamponu 5X PZR Tamponu 25 mm MgCl2 2.5 mm dntp 100p mol/ L primerler Taq polimeraz Kalıp DNA 25,7 5 10 1 4 1/1 0,3 2 İlk denatürasyon 95 15dk 1 Denatürasyon 95 1dk Bağlanma Uzama 60 45sn 72 3dk Son uzama 72 7dk 1 İnkübasyon 4 40 Toplam hacim 50 Agaroz Jel Elektroforezi Agaroz Jel Hazırlanması; Gerekli miktarda agaroz tartılır, erlene koyulur. Gerekli miktarda TBE eklenir. Ardından hafifçe çalkalanıp mikrodalga fırına koyulur. Mikrodalga fırın örnek kaynamaya başlayana kadar yüksek ayarda çalıştırılır. Aralıklarla erlen mikrodalgadan çıkarılıp çalkalanır. Kaynama başladıktan sonra mikrodalganın ayarı düşürülür. Tamamen eriyene kadar çalkalanarak ısıtılır. Sonra etidyum bromür eklenir ve çalkalayarak tüm çözeltiye dağılması sağlanır. Solüsyonun biraz soğuması beklendikten sonra yavaşça dökülür ve polimerize olması için en az 15 dakika beklenir. Örneklerin Jele Yüklenmesi; Jel tanka yerleştirilir. Tank jelin üstünü kapatacak kadar TBE ile doldurulur. Küçük bir parça parafilm alınır ve yüklenecek örnek sayısı kadar yükleme tamponu (yaklaşık 1 er μl) üstüne koyulur. 5 μl örnek yükleme tamponu ile karıştırılıp jele yüklenir. Bir kuyucuğa da marker koyulur. 90 V da 45 dakika yürütülür (5). Moleküler ağırlık belirleyicisi olarak 50bp lik gene ruler DNA ladder (Fermentas) kullanılmıştır.
UYGULAMA PLANI
BULGULAR: 1. Kasetin Yapımı 1. LqsR (1007 bç) ve LqsS (1290 bç), pnt-1 plasmidinden dizayn edilen primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltıldı. 2. Bidirectional double terminator geninin bulunduğu plazmid (BioBrick: P224C) transforme edildi. 2. Transformant kolonilerden plazmid izole edildi. 3. Bidirectional double terminator geninin bulundupğu plazmid XbaI enzimi ile kesildi ve 3284 bç lik açık plazmid elde edilir. 4. LqsR NsiI ve SpeI enzimi ile kesildi. 5. LqsR ve bidirectional double terminator parçalarının liasyonu yapıldı.
2. Kasetin Yapımı 1. Fep A geninin bulunduğu plazmid (BioBrick:P215E) ve RBS geninin bulunduğu plazmid (BioBrick: P12M) transforme edildi. 2. Transformant kolonilerden plazmid izole edildi (Sırasıyla FepA ve RBS plazmidleri) 3. A geninin bulunduğu 5397 bç lik plazmid Xba I ve Pst I enzimleri ile kesildi. 2208 bç lik Fep A geni jelden izole edildi. 4. RBS geninin bulunduğu 2079 bç lik plazmid (BioBrick: P12M) Spe I ve PstI ile kesildi. 5. FepA geni RBS vektörüne yerleştitirildi ve içerisinde 4285 bç lik açık vektörün de bulunduğu ligasyon ürünü elde edildi.
6. Ligasyon ürünü transforme edildi. 7. Transformant kolonilerden plazmid izole edildi. 8. Transformant kolonileden elde edilen plazmid önce EcoR I ile kesilerek açıldı (4285 bç) ve SpeI ile kesilerek 2230 bç lik RBS+FepA parçası plazmidin geri kalan kısmından jelde izole edilerek ayrıldı. 8. RBS+FepA parçası EcoRI ve XbaI ile kesilmiş bidirectional terminatör geninin içerisinde bulunduğu plazmide enzim kesim bölgeleri sayesinde doğru oryantasyonda yerleştirildi. Ligasyon ürünü transforme edildi.
3. Kasetin yapımı 1. 259 bç lik LqsR promoter bölgesi, pnt-1 plasmidinden Biobrick enzim kesimlerine uygun olarak dizayn edilen primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltıldı. Çoğaltılan bölge EcoRI ve SpeI enzimi ile kesildi. 259 bç 2. RBS geninin bulunduğu plazmid EcoRI ve XbaI enzimi ile kesildi. LqsR promotor bölgeyi içeren parça RBS geninin önüne oturacak şekilde plazmide yerleştirildi. Uluslararası Genetik Mühendisliğiyle Geliştirilmiş Makine (International Genetically Engineered Machine igem) Massachusetts Teknoloji Enstitüsü (MIT) tarafından 2004 yılından itibaren dünyanın çeşitli bölgelerindeki üniversite takımlarının katılımı ile düzenlenmekte olan bir yarışmadır. Bu takımlar, sentetik biyoloji ve mühendislik yaklaşımlarını kullanarak fonksiyonel biyolojik sistemler oluşturmaktadır. Yarışma kapsamında, akademisyenler ve gönüllü araştırmacılar, DNA tabanlı yeniden standart biyolojik parçalar oluşturup tüm araştırmacıların kullanımına sunmuştur. Bu genetik parçaları kapsayan bir DNA seti ile çalışmaya başlayan biyoteknoloji konusuna meraklı yüksek lisans, lisans ve lise seviyelerindeki öğrencilerden oluşan takımlar günlük yaşamda karşılaşılan problemlere çözüm olabilecek yeni genetik programlar oluşturmaya çalışıyorlar. Bu yaklaşım oldukça karmaşık olan biyolojik veri birikimini belirli kıstaslara göre kategorize ederek bir takım standartlar
oluşturmak ve bu standartları kullanarak hazırlanacak biyolojik parçaları (genler ve genetik kontrol üniteleri) bir bilgi bankasında kataloglamak üzerine oturuyor. Yarışmanın finalinde ise takım üyeleri, araştırma projelerini içinde akademisyenlerin, endüstri ve sosyal bilimler alanında uzman kişilerin bulunduğu bir jüriye ve diğer takımlara sunuyor. Yarışma sonucu üniversite takımlarına proje fikirlerinin tutarlılığı, deneylerinde ulaştıkları sonuçlar ve projelerinin bilim dünyasına katkısı göz önünde bulundurularak 6 klasmanda Altın, Gümüş ve Bronz madalyalar veriliyor (7). Gelecek hedefimiz; Legionella pneumophila yı tür düzeyinde özgül olarak algılayabilen ve ifadelenme düzeyinde bu algıya cevap vererek, bazı Stafilokok suşların salgıladığı anti-legionella peptidini üretebilen Escherichia coli hücreleri oluşturmaktır. Proje kapsamında, iki adet transforme E. coli üretilecektir (2). Bunlardan bir tanesi L. pneumophilia LqsA gen bölgesini içeren plazmid (17) ile ikincisi ise L. pneumophilia LqsR ve LqsS gen bölgelerini (15, 16, 19) ve Warnericin RK peptidini (22 aa düz peptit) (1, 9, 11, 12, 20) içeren plazmid ile transforme edilmiş olacaktır. Bu plazmid taşıyabilirse, renk reaksiyonu oluşturacak bir gen bölgesi de içerecektir. LqsA ile transforme E. coli, çalışmamızda ürettiğimiz kompozit plazmitin Legionella pneumophilia yı algıladığını göstermek amacıyla kontrol bakteri olarak kullanılacaktır. Projeden beklentimiz, hazırladığımız plazmitin Legionella pneumophiliayı tanıyarak, kontamine edebileceği yüzeylerde çoğalmasını engellemesini sağlamaktır. Bu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Araştırma Kurulu tarafından onaylanmış (DA13/06) ve Başkent Üniversitesi Araştırma Fonunca desteklenmiştir. KAYNAKLAR 1. Bastos MCF, Ceotto H, Coelho MLV, et al. Staphylococcal Antimicrobial Peptides: Relevant Properties and Potential Current Biotechnological Applications. Pharma Biotech. 2009; 10:38-61 2. Choi JH, Lee SY. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. Appl Microbiol Biotech. 2004; 64:625 635 3. Declerck P. Biofilms: the environmental playground of Legionella pneumophilaemi. Environ Microbiol. 2010; 12(3):557 566 4. Frederick M. Ausubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J. G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), Short Protocols in Molecular Biology, 4th Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1999; 1-27 5. Frederick M. Ausubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J. G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), Short Protocols in Molecular Biology, 4th Edition, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1999; 2-14
6. Guerrieri El, Bondi M, Sabia C, et al. Effect of Bacterial Interference on Biofilm Development by Legionella pneumophila. Curr Microbiol. 2008; 57:532 536 7. http://igem.org/main_page 8. http://tip.baskent.edu.tr/egitim/mezuniyetoncesi/calismagrp/ogrsmpzsn m14/14.s22.pdf 9. Huang Y, Huang,J Chen Y. Alpha-helical cationic antimicrobial peptides: relationships of structure and function. Protein Cell. 2010; 1(2):143 152 10. Loret JF, Robert S, Thomas V, et al. Comparison of disinfectants for biofilm, protozoa and Legionella control. J Water Health. 2005; 3(4):423-33 11. Marchand A, Verdon J, Lacombe C, et al. Anti-Legionella activity of staphylococcal hemolytic peptides. Peptides. 2011; 32:845 851 12. Mohammed Al-Mahrous M, Jack WR, Sandiford SK, et al. Identification of a haemolysin-like peptide with antibacterial activity using the draft genomesequence of Staphylococcus epidermidis strain A487. Immunol Med Microbiol. 2011; 62:273 282 13. Murray PR, Rosenthal KS, and Pfaller MS, Medical Microbiology, 6th Ed, Mosby Elsevier, Philadelpia, PA, USA; 2009; 365-370 14. Sahr T, Bruggemann H, Buchrieser C, et al. Two small mcrnas jointly govern virulence and transmission in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 2009; 72(3):741-762 15. Tiaden A, Spirig T, Carranza P, et al. Synergistic Contribution of the Legionella pneumophila lqs Genes to Pathogen-Host Interactions. J Bacteriol. 2008; 7532 7547. 16. Tiaden A, Spirig T, Hilbi H et al. The Legionella pneumophila response regulator LqsR promotes host cell interactions as an elementof the virulence regulatory network controlled by RpoS and LetA. Cell Microbiol. 2007; 9(12):2903-2920 17. Tiaden A, Spirig T, Hilbi H, et al. The legionella Autoinducer Synthase LqsA Produces an α-hydroxyketane Signaling Molecule. J Biol Chem. 2008; 283(26):18113-18123 18. Tiaden A, Spirig T, Hilbi H. Bacterial gene regulation by a-hydroxyketone signaling. Trends Microbiol. 2010; 18(7):288-97 19. Tiaden A, Spirig T, Sahr T et al. The autoinducer synthase LqsA and putative sensorkinase LqsS regulate phagocyte interactions,extracellular filaments and a genomic island of Legionella pneumophila. Environ Microbiol. 2010; 12(5):1243-1259 20. Verdon J, Falge M, Maier E, et al. Detergent-Like Activity and a-helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide. Biophy J. 2009; 97:1933 1940