GEN KLONLAMASI. copyright cmassengale

GEN KLONLAMASI copyright cmassengale 1

Klonlama nedir? Bir genin vekto re yerleştirilmesi ve bu vekto ru n bakteri hu crelerine transformasyonu sonucunda hu crelerin bo lu nmesi sırasında vekto ru n de icȩrdigĭ genin birc ok kopyasını olusţurması isļemine gen klonlaması adı verilmektedir copyright cmassengale 2

copyright cmassengale 3

Plazmidler Klonlama c alısmalarında daha yogun olarak kullanılan plazmitler ise, bakteri ve diger organizmalarda bulunan, konak hu cre kromozomundan bagımsız olarak c ogalan ku c u k, yuvarlak yapılı kromozom dısı DNA lardır. copyright cmassengale 4

Gen klonlaması c alısmalarında plazmitler kullanıldıgında, klasik olarak genler genomik DNA veya mrna dan izole edilerek Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile c ogaltılmakta, gen ve genin yerlestirilecegi plazmit bir veya daha fazla enzim ile kesilerek in vitro sartlarda genin plazmite yerlestirilmesi saglanmaktadır. copyright cmassengale 5

Gen klonlamanın temel aşamaları DNA için tasıyıcı rolü oynayan küçük ve sirküler yapılı moleküllere vektör adı verilmektedir. Klonlamada temel isļem; organizma genomundan elde edilen DNA parc asının vekto re yerlesţiril- mesidir. Vekto r DNA sına, organizmaya ait bir DNA nın yerlesţirilmesiyle olusţurulan moleku le rekombinant DNA adı verilmektedir. Bu rekombinant DNA moleku lu bakteriyel hu crelere transforme edilmesi sonucunda bakterilerin bo lu nmesiyle rekombinant DNA da replike olarak klon olarak isimlendirilen kopyalar meydana getirilmektedir (37). Klonlanan DNA nın varlıgĭ, transforme edildigĭ hu crelerden saflasţırılarak dog rulanmaktadır. copyright cmassengale 6

2. Hedef genin sec ilmesi Klonlama c alıs malarının en o nemli basamaklarından biri, hedef genin sec ilme as amasıdır. Yapısal o zelligĭ arasţırılacak, DNA ve protein as ısı c alıs malarında kullanılabilecek bir gen klonlama c alıs malarında hedef olarak sec ilebilmektedir. Hedef DNA elde edilirken kullanılacak primerlere, genin yerlesţirilecegĭ vekto re uygun enzim kesim bo lgelerinin eklenmesi o nemli noktalardan birini olusţurmaktadır. copyright cmassengale 7

3. Restriksiyon enzimleri ve DNA nın kesilmesi Rekombinant DNA teknolojisinin ve klonlamanın gelis mesinde o nemli adımlardan birisi restriksiyon enzimlerinin bulunması ve o zelliklerinin ortaya konulmasıdır. Restriksiyon enzimleri, fajlara kars ı bir savunma mekanizması olarak bakteriler tarafından u retilmektedirler. DNA yı kesen bu enzimler izole edildikleri bakterilere go re isimlendirilmektedirler. DNA yı spesifik dizilerden kesen enzimler DNA manipu lasyonları ic in anahtar rol oynamaktadırlar. Bazı restriksiyon enzimleri anahtar kilit ilisķisi gibi yapısķan ucļar meydana getirirken bazıları da kuẗ ucļar olusţurmaktadırlar. Bazı restriksiyon enzimlerinin izole edildikleri mikroorganizmalar ve enzim tanıma noktaları Tablo 1 de go sterilmisţir. copyright cmassengale 8

4. DNA nın plazmite yerlesţirilmesi Klasik metotla gen klonlaması c alıs malarında, DNA nın plazmite yerlesţirilmesi o ncesinde, restriksiyon enzimleriyle kesilen genin ve plazmitin agaroz jelden saflasţırılması gerekmektedir. Saflasţırılan gen ve plazmit, T4 DNA ligaz enzimiyle uygun ısı ve reaksiyon kos ullarında birlesţirilmektedirler. Isı derecesi ve reaksiyon su resi kullanılan enzimin u retildigĭ firma o nerilerine go re c ok farklılık go stermektedir. Isı derecesi +4 C den +25 C ye, inku basyon su resi ise 5 dakikadan bir geceye kadar degĭsȩbilmektedir. copyright cmassengale 10

T4 bakteriofajlardan elde edilen T4 DNA ligaz enzimi, E. coli DNA ligaz enziminden 400 kat daha etkindir. DNA ligazın etki mekanizması bir nu kleotidin 3' hidroksil ucu ile dig er nu kleotidin 5' fosfat gurubu arasında kovalent fosfodiester bagĭ olusţurulma temeline dayanmaktadır. T4 DNA ligaz aktivasyonunda kofakto r olarak ATP ye gereksinim vardır. Bu nedenle ATP icȩren T4 DNA Ligase buffer ların c ok sık dondurulup c o zdu ru lmemeleri gerekmektedir. copyright cmassengale 11

5. Rekombinant DNA nın c ogăltılması Genin plazmite yerlesţirilmesi ile elde edilen rekombinant DNA nın c ogăltılması sonraki c alıs malar ic in buÿu k avantajlar sag lamaktadır. Bunun ic in rekombinant DNA nın bakteri hu crelerine sokulması (transformasyon) gerekmektedir. Transformasyon isļemi, basit ve ucuz olan kimyasal metotların yanında daha etkin bir metot olan elektroporasyon metodu da arasţırıcılara alternatif olabilmektedir copyright cmassengale 12

Transformasyonda kullanılacak kompetan hu creler ticari olarak satın alınabilecegĭ gibi arasţırıcıların kendi laboratuarlarında da elde edilebilmeleri mu mku ndu r. Bunun ic in kalsiyum klorid ve rubidyum klorid gibi metotlar yogŭn olarak kullanılmaktadır. copyright cmassengale 13

Klonlanan hu crelerden vekto ru n sec imi Klonlamada kars ılas ılan sorunlardan biri de kolonilerden rekombinant plazmitlerin sec imidir. C ogŭ zaman transformasyon sonrasında onlarca hatta yu zlerce koloni kars ımıza c ıkmaktadır. Bunlardan hangilerinin rekombinant plazmitleri icȩrdigĭnin tespiti gerekmektedir. Bir c ok plazmit, ampisilin, tetrasiklin gibi antibiyotik direnc genleri icȩrmektedir. Bu direnc genleri sayesinde rekombinant plazmitlerin sec imi sag lanacaktır. copyright cmassengale 14

7. Klonlamanın dogrulanması Klonlamanın dog rulanması ic in transforme katı besiyerindeki kolonilerden, laboratuvarımızda da uyguladıgĭmız PCR- Tarama ile kolonilerin rekombinant DNA yı icȩrip icȩrmedigĭ hızlı bir sȩkilde tespit edilebilmektedir. Kolonilerin, direkt olarak agaroz jelde yu ruẗu lmesi de rekombinant plazmitin dog rulanmasına yardımcı olmaktadır. Ayrıca bu kolonilerden miniprep ile elde edilecek rekombinant DNA ların varlıgĭ enzim kesim deneyleriyle dog rulanabilmektedir. Fakat sonraki c alıs malardaki gu venilirlig i arttırmak ve klonlamanın dog rulamasını kesinlesţirmek ic in DNA dizi analizinin yapılması copyright cmassengale gerekmektedir. 15

8. Plazmitler Genetik muḧendislikte ve gen klonlaması c alıs malarında temel unsurlardan biri plazmitlerdir. Bakterilerde kromozom dıs ı ve c ift zincirli bir DNA olarak bulunan plazmitler bazı genetik manipu lasyonlara tabi tutularak genetik muḧendislikte kullanılmısļardır. Rekombinant DNA teknolojisinde ilk kulla- nılan plazmit pbr 322 dir. Bu plazmit, ampisilin ve tetrasiklin direnc genleri ve birc ok restriksiyon enzim bo lgeleri icȩrmektedirler. copyright cmassengale 16

Bu plazmitten gelisţirilen puc plazmiti ise, pbr 322 nin yarısı buÿu klu gŭ nde olup daha buÿu k DNA ların klonlanmasına izin vermektedir. puc plazmitleri birc ok farklı restriksiyon enzimiyle kesilebilen polilinker bo lge (multiple cloning site) icȩrmektedirler. Polilinker bo lge, E.coli nin lac Z geni icȩrisinde yer almaktadır. Polilinker bo lgeye sokulan DNA, lac Z geninin bozulmasına sebep olarak beyaz bakteri kolonilerinin olus masını ve dolayısıyla rekombinant DNA yı tas ıyan hu crelerin kolaylıkla tanınmasını sag lamaktadır. Klonlama c alıs malarında kullanılan, plazmitlerin buÿu klu gŭ 1 kb den 200 kb ye kadar degĭs ebilmektedir. Plazmitlerin c ogŭ bakteriyel yapılardan su perheliks yapıda izole edilen kovalent olarak kapalı çift zincirli vre yuvarlak yapılardır. copyright cmassengale 18

Plazmitlerin bakterilerde replikasyonunu sag layan ve birkac yu z baz c ifti uzunlugŭnda replikasyon orjinleri bulunmaktadır. Bu sayede amaca go re du s u k veya yu ksek sayıda replike olabilen plazmitler olusţurulmusţur. Birc ok klonlama plazmiti, genlerin yerlesţirilecegĭ bir klonlama bo lgesi ve bakteriofajlardan elde edilen T3, T7, SP6 ve tac promotorları icȩrirken gen ekspresyon c alıs malarında kullanılacak plazmitlerin bir c ogŭ ise, Sitomegalo virus (SMV) promotoru ve Simian virus promotoru (SV40) icȩrmektedir. copyright cmassengale 19