Bitki Doku Kültürü Metotları ile Antepfıstığı Fidanı Üretimi Ahmet Onay Bitki doku teknikleri gibi modern teknikler kullanarak klonal antepfıstığı fidanı üretebilen bir market bulabilir misiniz? Bahçenizde bulunan en verimli ağacın tek bir sürgününden itibaren onlarca yeni bahçe kurmak mümkün müdür? Kısa bir sürede tek bir tohumdan şaşırtıcı bir şekilde aynı karakteristik özelliklere sahip, istenirse milyonlarca fidan üretmek mümkün müdür? Tabii ki de bu soruların cevabı in vitro ortamda bitki doku kültürü tekniklerini kullanarak mümkün olduğudur. Peki, ne demektir in vitro ortam? Bu kavram, deney tüpü, şişe, petri kutusu ya da ışık ve sıcaklık gibi fiziksel faktörlerin kontrol edilebildiği bitki doku kültürü büyüme odaları içinde gerçekleştirilen çalışmaları belirtir. Bu kontrollü koşullarda kültüre alınan ya da çoğaltılmak istenen bitkilerden alınan eksplantlar (bitki doku parçaları) her bakımdan manipüle edilebilir. Eksplantların genellikle içinde bitki gelişmesi için gerekli olan makro ve mikro besin elementleri, şekerleri, vitaminler, bitki büyüme düzenleyicileri ve vitaminleri içeren yarı katı ve hatta sıvı besi ortamında kültüre alınarak çoğaltılması mümkündür. Doğada bitkiler, tohum, çelik ve sporlardan gelişirlerken, in vitro ortamda tohum, anter ve ovaryum gibi generatif üreme organları yanı sıra kök, gövde, yaprak gibi her türlü vegetatif organlarından da çoğaltılabilirler. Bahçeciler meyve, sebze ve süs bitkilerini çoğaltmak için çok sayıda farklı teknikler kullanırlar. Çoğu sebze türü melez olarak-tohumdan yetiştirilir. Bazı bitkiler köklenmiş vegetatif çeliklerden çoğaltılır. Antepfıstığında olduğu gibi çoğu meyve ağaçlarının fidanları ise, ağacın gelişme kuvvetini kontrol eden ve toprak kökenli hastalıklara dirençlilik sağladığı bilinen anaçların üzerine aşılanarak çoğaltılır. Bu makalenin amacı; antepfıstığı ve diğer meyve türlerinin in vitro klonal çoğaltılmasında kullanılan bitki, hücre, doku ve organ kültürleri tekniklerini özellikle organogenezisi örnek vererek, bu metotların fidan üretimindeki önemini vurgulamak ve ülkemizde de kullanılması için farkındalık oluşturulmasına katkıda bulunmaktır. Antepfıstığı fidanı üretimi Ticarette antepfıstığı meyve iriliği, çatlaklık oranı ve meyve rengine göre sınıflandırılır. Genellikle küçük taneli fıstıklar yeşil içlidir. Yeşil içli fıstıklar daha iyi bir aroma ve tesktüre sahip olmakla birlikte, daha pahalı satılır. Antepfıstığı için Dünya da giderek artan bir talep mevcuttur. Bu talebi karşılamak için verimli bahçelerin tesis edilmesi gereklidir. Ancak, ükemizde antepfıstığı yetiştiriciliği büyük oranda sulanmayan koşullarda yapılmakta olup, bugüne kadar kapama bahçelerde genellikle P. vera çeşitlerinin tohumları anaç olarak kullanılmıştır. Ancak, antepfıstığı fidanları tohum ile çoğaltıldığında genetik açılımdan dolayı her tohumdan gelişen fidanların verimliliğe etkisi farklı olacaktır. Çünkü bu türün doğal heterozigotik yapısından dolayı tohumdan gelişen fidanların %50 erkek ve %50 si dişi bitki olma olası vardır. Ayrıca, antepfıstığı bahçelerinin tesisinde kullanılan fidanların, tohumdan gelişen heterozigot anaçlar üzerine yetiştirildiği bölgede verim özellikleri bilinen üstün nitelikli kültür çeşitleri ile mutlaka aşılanması gerekir çünkü antepfıstığı çelikleme ile köklenmez ve antepfıstığının doğal dış döllenme özelliğinden dolayı da anaç ve kültür çeşitleri arasındaki gözlenen uyuşmazlıklar ara aşı gerektirir. Fakat mevcut tekniklerle antepfıstığı bahçe tesisi yavaş ve pahalı olmasından dolayı yeni bahçelerin tesisi oldukça azdır. Oysa antepfıstığı endüstrisinde rekabet ettiğimiz özellikle Amerika da ıslah programları ile geliştirilmiş çeşitler doku kültürü yöntemleri ile yetiştirilerek yeni bahçeler tesis edilmektedir. Yeni tekniklerle çoğaltılan fidanların kullanıldığı bahçelerin tesisi yapılmazsa önümüzdeki yıllarda şu anda üretim miktarı bakımdan üçüncü durumda olan yerimizi Suriye veya hızla üretim hacmini arttıran Çin e kaptırabiliriz. Diğer üretici ülkelerle rekabet
edebilmemiz için, büyük çapta ticari antepfıstığı bahçelerinin tesisi gereklidir. Yeni tesis edilecek bahçelerde Gaziantep Antepfıstığı Araştırma Enstitüsü İstasyonu bünyesinde tamamlanmış ıslah projeleri ışığında üstün anaçlık özellikleri belirlenmiş ve toprak kökenli hastalıklara dayanıklı genotiplerden klonal fidanların üretimi için bitki doku kültürü tekniklerinin mutlaka kullanılmaya başlanması zorunludur. Çünkü hâlihazırda yeni tesis edilen bahçelerde çiftçiler kendi bahçelerinde yetiştirdikleri açık tozlaşma sonucu gelişen tohumların çimlendirilmesiyle gelişen çöğürler anaç olarak kullanmaktadır. Bitki doku kültürü nedir? Doku kültürü, bitkiden izole edilen doku (eksplant) parçalarını yapay besi ortamında süresiz yaşatma tekniğidir (Onay et al. 2012). Bitki doku kültürü metotlarını kullanılarak bir bitki türünden çok sayıda yeni neslin üretilmesinde kullanılacak stok bitki materyallerinin hızlı bir şekilde çoğaltılması için yapılan işleme mikroçoğaltım denir. Mikroçoğaltım geleneksel metotlarla ıslah edilmiş ya da genetik olarak modifiye edilmiş bitkilerin çoğaltılmasında kullanılır. Çelikleme ile çoğaltılmayan bitkiler veya fıstık ağacı gibi tohumdan çoğaltılması uygun olmayan bitkilerin üstün özellikler gösteren çeşitlerinden istenildiği kadar çoğaltılabilir. Ayrıca, doku kültürü teknikleri doğal koşullarda nesli tükenmekte olan ve üstün özellik gösteren bitkileri muhafaza ederek ıslah programları için istenilen bitkileri geliştirmek ve bitkilerden virüsleri elimine etmek için de kullanılabilir. Doku kültürü ya da mikroçoğaltmanın temeli hücre teorisini tanımlayan Schleiden (1838) ve Schwann ın (1839) çalışmaları sonucu totipotensi (çok hücreli bir organizmanın her canlı hücresinin uygun koşullar sağlanırsa bağımsız olarak gelişme kapasitesine sahip olması) kavramının anlaşılmasıyla başlamıştır. Başarısız sonuçlar alınsa da, bitkilerin in vitro kültürünü ilk defa Haberlandt (1902) tarafından Eichhornia crassipes bitkisinin izole edilmiş yaprak hücrelerinde çalışmıştır. İn vitro ortamda bitki üretim konsepti ise, Knudson (1920) tarafından orkide tohumlarının çimlendirilmesi ve kültürü ile başlamıştır. Mikroçoğaltma ilk defa Cornell Universitesi botanikçilerinden Frederick Campion Steward tarafından 1950 li yıllarda özellikle havuç bitkisinin tek hücresinden itibaren bitkilerin üretilebileceğini keşfetmesiyle başlamıştır (Cocking 1993). Hastalıkların eliminasyonu için Morel ve Martin (1952) meristem ucu kültürlerini kullanarak ticari mikroçoğaltma çalışmalarını başlatmıştır. 1970 li yıllarda Kaliforniya üniversitesinden Dr. Toshio Murashige ve Dr. Skoog un MS adıyla bilinen kültür besi ortamını geliştirmesiyle ticari olarak bitkilerin mikroçoğaltımı yapılmaya başlanmıştır. Antepfıstığının farklı türlerinin mikroçoğatılması üzerine yapılan in vitro çalışmalar ilk defa Alderson ve Barghchi (1982) tarafından başlatılmıştır. Seçkin antepfıstığı genotiplerinin in vitro klonlanması için farklı eksplantlar kullanılarak çok sayıda organogenezis ve embriyogenesis protokolleri tanımlanmış (Onay, 1996; Onay, 2000; Tilkat, 2006; Tilkat vd. 2008) ve bu çalışmaların büyük kısmı son zamanlarda yayınlanan bir derleme ile güncellenmiştir (Tilkat vd. 2012). Kaç çeşit bitki doku kültürü tekniği vardır? Bitkilerin in vitro ortamda çoğaltılmasında kullanılan teknikler aşağıdaki gibi sınıflandırılabilir: 1.Bütün bitkinin kültürü (Orkide tohum kültürü) 2. Embriyo kültürü (Embriyo kurtarma) 3. Organ kültürü: Mikroçoğaltma A. Katı veya yarı katı besi ortamında organogenezis 1. Meristem ve sürgün ucu kültürü 2. Tomurcuk kültürü 3. Kök kültürü 4. Yaprak kültürü 5. Anter kültürü B. Somatik embriyogenezis
C. Biyoreaktörde organogenezis ve somatik embriyogenezis D. In vitro mikroaşılama E. İnce hücre katmanı teknolojisi (TCLs) F. Fotoototrofik kültürler 4. Kallus kültürü 5. Hücre süspansiyon ve tek hücre kültürleri 6. Protoplast kültürü ve somatik hibridizasyon Olgun veya olgunlaşmamış embriyolar, herhangi bir doku veya onun hücreleri bölünerek sürgün kök, yaprak veya tam bir bitki geliştirebilir. Bazen kültürdeki hücre ve dokulardan kallus olarak adlandırılan farklılaşmamış hücre topluluğu gelişebilir. Bitkilerin çoğaltılmasında kullanılan bütün hücre ve doku kültürü tekniklerinde görülen farklılaşma tipleri, genellikle kök ve sürgün üretimidir. Bu iki olaya birleşik olarak organogenezis adı verilir. Bazen bu iki süreç kendiliğinden düzenlenmiş olarak (zigotik bitki embriyolarındaki gibi) meydana gelir ve bu olay somatik veya adventif embriyogenezis olarak adlandırılır (Onay vd. 2012) Bitki doku kültürü metotlarından mikroçoğaltım (sürgün ucu kültürü ile) kullanılarak bu gün Amerika da sadece bir ticari firma (Paramaunt Farming Company) haftada 10.000 den fazla anacı laboratuvardan seraya aktaracak seviyede üretim yapmaktadır (Prof. Dr. John Driver ile kişisel iletişim). O halde in vitro ortamda ve steril koşullar altında, özel olarak seçilmiş besi ortamında küçük doku parçalarında yetiştirilen bitkilerin (mikroçoğatılan bitkiler) yetiştirilmesinde hangi aşamalar mevcuttur? Mikroçoğaltmanın aşamaları: A. Anaç bitkinin seçimi ve yüzey sterilizasyonunun yapılması B. Kültürlerin başlatılması C. Sürgünlerin altkültürlenmesi ve muhafazası D. Stok sürgünlerin mikroçoğaltılması E. İn vitro köklendirme F. İklime alıştırma ve toprağa aktarma A. Kültüre hazırlık, anaç bitkinin seçimi ve yüzey sterilizasyonunun yapılması Mikroçoğaltımı yapılacak bitki seçimindeki en önemli husus, verim ve kalite özellikleri bilinen ağaçlardan kültürün başlatılmasıdır. Kültür başlatılmasında başarı genotipe göre değişir. Teorik olarak yılın her hangi bir döneminde olgun meyve ağaçlarında kültür başlatılması mümkünse de, genelde ilkbahar ve yaz dönemi yılın diğer zamanlarına göre daha başarılı olur. Mikroçoğaltma metodu ile in vitro ortamda kültür başlatılması için ligninleşmiş sürgünler, apikal uçlar veya nodal tomurcuklar, aksenik yapraklar, rejenere olmuş sürgünler, olgun meyveler, olgunlaşmamış meyveler, olgun kotiledonlar eksplant olarak kullanılabilir (Şekil 1Aab). Ligninleşmiş dokular için öncelikle sera koşullarında zorlanarak gelişen sürgünlerden kültür başlatmak daha kolay olur. Yüzey sterilizasyonu klor iyonu konsantrasyonu bilinen sodyum hipokloritle (NaOCl) ile elle veya bir çalkalayıcı üzerinde yapılır (Şekil 1Ac). Eksplantların kültüre alınacağı besi ortamı içeriğinde su, mineral besin elementler, vitamin, amino asit gibi organik kimyasallar, sukroz ve glikoz gibi karbonhidratlar, oksin ve sitokinin gibi büyüme düzenleyicileri ve agar veya gelrite gibi jelleştiricilere ihtiyaç vardır. B. Kültürlerin başlatılması Bu aşamanın ana hedefi, büyüme miktarına bakılmaksızın takip eden aşamalarda kullanılabilecek aksenik (steril) veya enfeksiyonsuz rejenerantlar elde etmektir. Eksplantlar yüzeyinde bulunan bulaşıklardan arındırmak için yüzey sterilizasyonuna tabi tutulduktan sonra, yarı katı besi ortamında, kültürleri çoğaltma metoduna uygun olarak sürekli ya da periyodik ışık altında genelde 25 ± 2ºC de sıcaklıkta inkübe edilirler (Şekil 1B).
C. Sürgünlerin altkültürlenmesi ve muhafazası 4 haftalık kültür süresi sonucu gelişen sürgünler (Şekil 1C) parçalanarak, tekrar proliferasyon ortamında kültüre alınırlar. D. Sürgünlerin mikroçoğaltılması Üretilen bitkilerin sayısını belirlediği için, herhangi bir çoğaltma programındaki en önemli aşamadır. Bu aşamada planlanan ya da istenilen bitki sayısını elde etmek için tekrarlanan alt kültür ve yeniden yapılan kültürlerle stok sürgünler çoğaltılır (Şekil 1D). Besi ortamının fiziksel durumu, kimyasal içeriği ve inkübasyon koşulları sürgünlerin çoğaltılmasında oldukça önemlidir. E. Köklenme Proliferasyon besi ortamında çoğaltılan sürgünler, bitki türüne göre değişen uzunluklarda kesilerek, oksin içeren bir besi ortamda kültüre alınarak köklendirilir (Şekil 1Eabc). Bu aşamada, iyi bir kök sistemi oluştuktan sonra iklime alıştırma aşamasına geçilir. F. İklime alıştırma (adaptasyon) ve toprağa aktarma İn vitro üretilen bitkiler doğrudan dış ortama aktarıldıklarında, fazla miktarda su kaybettikleri için birçoğu hemen ölür. Bu nedenle rejenerasyon sonucu oluşan bitkilerin kademeli olarak doğal gelişme ortamına alıştırılması gerekir (Şekil 1Fabcd). Doğal büyüme ortamına alıştırma safhasında bitkicikler modern tesislere sahip olmayan işletmede polietilen torbalarla kapatılır ve geçen zamanla birlikte torbada delikler açarak, dış ortama tedricen uyumu sağlanır veya ışık, sıcaklık ve nemin kontrol edilebildiği özel büyüme odaları veya kabinlerde dış ortama alıştırılır. İn vitro ortamda köklenen bitkicikler doğrudan dış ortama aktarılırsa, hemen ölürler çünkü bu bitkilerde kutikula tam olarak gelişmemiştir. Stoma fonksiyonlarının başlatılması ve fotosentezi uyarmak için, in vitro ortamda çoğaltılan bitkiciklerinin in vivo ortama aktarılmadan önce mutlaka iklime alıştırılması gereklidir. Bu nedenle bu safha bütün çoğaltım sürecindeki en son ve en önemli aşamadır. Bu yüzden bu aşama ışık, sıcaklık ve nem ile ilgili koşulların optimizasyonuyla yapılmalıdır. Şekil 1. Antepfıstığının organogenezis ile mikroçoğaltımı: A. Eksplantların kültüre hazırlanması; ligninleşmiş sürgünler (a) ve taze apikal ve nodal sürgünler (b) ve eksplantların bir çalkalayıcıda yüzey sterilizasyonu (c). B. Eksplantların kültüre alınması. C. Kültüre alındıktan 4 hafta sonra gelişen sürgünler. D. Stok sürgünlerin mikroçoğaltımı. E. Köklendirme: Kültüre alındıktan 4 hafta sonra 1 mg/l IBA içeren MS besi ortamında köklendirilmiş olgun Atlı (a), Siirt (b) ve buttum (c) sürgünleri F. İklime alıştırma: (a) aklimatizasyona alınmış fidecikler, (b) aklimatizasyondan 8 hafta sonra gelişmiş fidanlar, (c) mikroçoğaltılmış ve serada gelişmekte olan fidanlar ve (d) toprağa aktarılmış fidan.
Bir bitki türünün in vitro ortamda ticari olarak çoğaltmak için birim kültür kabından elde edilen sürgün sayısı, köklenen sürgün sayısı ve in vivo ortama alıştırılan ve yaşayan bitki sayısının yüksek düzeyde olması gereklidir. Bu nedenle ticari mikroçoğaltımı yapılacak bitki türü için mikroçoğaltmanın bütün aşamalarının çalışılacak ayrıntılı parametrelerle optimizasyonu gereklidir. Bugün antepfıstığı da dahil olmak üzere pek çok ekonomik bitki türü halihazırda bitki doku kültürü teknikleri ile çoğaltılmaktadır. Antepfıstığı ve diğer ekonomik bitkilerimizin fidanlarının in vitro mikroçoğaltılması konusunda mevcut ve gelecekteki durum, mikroçoğaltma protokolleri hakkında ayrıntılı bilgi, doku kültürü ile ticari üretim yapmak için gerekli yatırım, bitki doku kültürü teknikleri ile ilgili mikroçoğaltım yapan uluslararası ve ulusal firmaların faaliyetleri, bitki doku kültürü laboratuarı kurulumu için gereksinim ve alt yapı, yatırım için gerekli ekipman ve maliyetleri ve bir antepfıstığı fidanı üretimi için maliyet analizlerinin ayrıntılı anlatıldığı (model olarak) bir makaleye http://yasambilimleridergisi.com/makale/pdf/1356026882.pdf adresinden ulaşabilirsiniz. Kaynaklar 1. Ahmet Onay, Hakan Yıldırım, Vedat Pirinç, Engin Tilkat, Yelda Özden Çiftçi, Hülya Akdemir, Veysel Süzerer, Nazan Çalar, Mahir Binici, Ömer Faruk Akdemir, Fatih M. Kılınç (2012) Bitkilerin Biyoteknolojik Yöntemlerle Ticari Çoğaltımı: Mevcut ve Gelecekteki Durum. Journal of Life Sciences 1.2 (2012). 2. Cocking, Edward C. (18 October 1993). "Obituary: Professor F. C. Steward".The Independent (London). 3. Tilkat, E., (2006) Erkek Antepfıstıgı (Pistacia vera L. cv. "Atlı") Ağaçlarının Mikroçoğaltılması, Doktora Tezi, Dicle Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, s.142. 4. Tilkat E., Onay A., Yıldırım H., Cetin Ozen H. (2008). Micropropagation of mature male pistachio Pistacia vera L., The Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 83(3):328-333. 5. Tilkat E., Özden Tokatli Y., Akdemir H., Onay A., Emine Ayaz (2012). Novel Methods in Micropropagation of Pistachio, in: Crop Production for Agricultural Improvement. Ashraf M.; Öztürk, M.; Ahmad, M.S.A.; Aksoy, A. (Eds.) 2012, VIII, 814 p.; pp:379-394. 6. Onayx A. (1996) In vitro organogenesis and embryogenesis of Pistachio, Pistacia vera L. PhD Thesis, University of Edinburgh, 1996, UK. Institute of Cell and Molecular Biology Daniel Rutherford Building University of Edinburgh, UK,1996. 7. Onay, A. (2000). Micropropagation of Pistachio From mature trees. Plant Cell, Tiss and Org. Cult 60: 159 162. 8. Onay, A. (2003). Micropropagation of pistachio. In: Micropropagation of woody trees and fruits. Forestry Sciences, Volume; 75, Chapter 19, Section C: 565-588. Edited by S. Mohan Jain and Katsuaki Ishii. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. 9. Onay A, Yıldırım H, Pirinç V, Tilkat E, Çiftçi YÖ, Akdemir H, Süzerer V, Çalar N, Mahir Binici, Ömer Faruk Akdemir, Fatih M. Kılınç (2012) Bitkilerin Biyoteknolojik Yöntemlerle Ticari Çoğaltımı; Mevcut Durum ve Gelecekteki Durum. Batman Üniversitesi Journal of Life Sciences, Cilt 1, Sayı 2, (2012), ss:11-27. 10. Schwann, Theodor and Schleyden, M. J., (1847), Microscopical researches into the accordance in the structure and growth of animals and plants. London: Printed for the Sydenham Society,. 11. Haberlandt, G. (1902). Culturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitz-Ber. Mat. Nat. Kl. Kais.Akad. Wiss. Wien 111 69 92. 12. Knudson L (1922). Nonsymbiotic germination of orchid seeds. Bot Gaz 73:1-25 13. MOREL, G. T., and C. Martin. (1952), "Guerison de dahlias atteints dune maladie a virus." Comptes rendus hebdomadaires des seances de l academie des sciences, 235.21 1324-1325. 14. Barghchi, M., and P. G. Alderson. 1989. "Pistachio (Pistacia vera L.)." Trees II. Springer Berlin Heidelberg, 68-98.