T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI KALA-AZARLI HASTALARDA ETKEN TÜRLERİN PCR-RFLP YÖNTEMİ İLE TANIMLANMASI Dr. Dilek NAS ÖZERDEM DOKTORA TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ ADANA-2009
TEŞEKKÜR Doktora eğitimim süresince bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen, tez konumun seçimi ve yürütülmesinde yol gösteren ve destekleyen tez danışmanım Parazitoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ a teşekkür ederim. Tez çalışmalarım süresince bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan Parazitoloji Anabilim Dalı Bilim Uzmanı Biyolog Fadime EROĞLU ve Biyokimya Anabilim Dalı Doktora öğrencisi Biyolog Ahmet GENÇ e teşekkür ederim. Örneklerimin toplanmasında desteğini esirgemeyen Parazitoloji Anabilim Dalı çalışanlarına ve tezimin yazılmasındaki katkılarından dolayı Dr. Günhan ÖZERDEM e teşekkür ederim. Ayrıca tez çalışmasını TF2005D4 no lu proje ile destekleyen Ç.Ü. Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ne teşekkür ederim. Dr. Dilek NAS ÖZERDEM ii
İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY TEŞEKKÜR İÇİNDEKİLER ŞEKİLLER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ ÖZET ABSTRACT i ii iii vi vii viii ix 1.GİRİŞ 1 2.GENEL BİLGİLER 3 2.1.Leishmania ların Sınıflandırılması 4 2.2.Yapı 5 2.2.1.Amastigot Şekil 5 2.2.2.Promastigot Şekil 6 2.3.Leishmania Parazitlerinin İnce Yapısı 7 2.3.1.Plazma Zarı ve İlgili Organeller 7 2.3.2.Kamçı ve Bazal Cisim 8 2.3.3.Kinetoplast 8 2.3.4.Mitokondri 9 iii
2.3.5.Çekirdek 9 2.3.6.Diğer Organeller 9 2.4.Leishmania ların Evrimi 9 2.5.Visseral Leyişmanyoz 12 2.5.1.Epidemiyoloji 12 2.5.1.1.Dünyada Visseral Leyişmanyoz 12 2.5.1.2.Türkiye de Visseral Leyişmanyoz 12 2.5.2.İmmünoloji 13 2.5.3.Patogenez 15 2.5.4.Klinik 16 2.5.4.1.İmmun Yetmezliği Olan Kişilerde Kala-Azar 18 2.5.4.2. Kala-Azar Sonrası Deri Leyişmanyozu 19 2.5.5.Tanı 19 2.5.5.1.Etkensel Tanı 19 2.5.5.2.Serolojik Tanı 21 2.5.5.2.1.rK39 Hızlı Tanı Testi 22 2.5.5.3.Moleküler Tanı 22 2.5.5.3.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu 23 2.5.5.3.2.Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi 23 2.5.6.Tedavi 24 2.6.Leishmania Türlerinin PCR-RFLP ile Tanımlanması 25 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 28 3.1.Kan Örneklerinden DNA İzolayonu 28 iv
3.2.Amplifikasyon İçin Gerekli Çözeltiler ve Kimyasal Maddeler 29 3.2.1.Çözeltiler 29 3.2.2.Amplifikasyon Koşulları 30 3.2.3.Termal Cycler ile PCR Protokolü 30 3.2.4.Agaroz Jelde Yürütme 31 3.2.5.1.Çözeltiler 31 3.2.5.2.Yöntem 31 3.3.Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi 32 4. BULGULAR 33 5. TARTIŞMA 37 6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER 44 7. KAYNAKLAR 46 8. EKLER 51 9. ÖZGEÇMİŞ 53 v
ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil.1.1. Leishmania amastigotu 6 Şekil.1.2. Leishmania promastigotları 6 Şekil.2.1. Leishmania amastigot ince yapısı 7 Şekil.2.2. Leishmania promastigot ince yapısı 8 Şekil.3. Leishmania nın yaşam döngüsü 11 Şekil.4. Miniekzon PCR-RFLP genotipleri 27 Şekil.5.13A-13B primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları 35 Şekil.6.Fme-Rme primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları 35 Şekil.7.Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.donovani bulunan örnekler 36 Şekil.8. Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.infantum bulunan örnekler 36 vi
ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1. Visseral leyişmanyozlu hastaların klinik belirtileri 17 Çizelge 2. Visseral leyişmanyoz tanısında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması20 Çizelge 3. Araştırma ve gelişim dönemindeki antileishmania ilaçları 25 Çizelge 4. Leishmania cinsine özgül primer dizilimi 30 Çizelge 5. 13A-13B ve Fme-Rme primerleri için kullanılan PCR programı 30 Çizelge 6. Enterobacter aerogenes (Eae I) restriksiyon enzimi 32 Çizelge 7. rk39 ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 33 Çizelge 8. PCR ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 33 Çizelge 9. PCR ve rk39 ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 34 vii
ÖZET KALA-AZARLI HASTALARDA ETKEN TÜRLERİN PCR-RFLP YÖNTEMİ İLE TANIMLANMASI Kala azar( VL) özellikle Çukurova bölgesinde ve ülkemizde halen önemli bir halk sağlığı sorunudur. Akdeniz e kıyısı bulunan ülkelerde endemiktir. Hastalığın tanısında kemik iliğinden ve kandan yapılan yayma preparat, kültür ve serolojik yöntemler kullanılmaktadır. Visseral leyişmanyoz (VL) endemik bölgelerde yaşayan immun sistemi baskılanmış HIV enfeksiyonlu hastalarda olduğu gibi bağışıklığı yetersiz hastalarda da fırsatçı bir infeksiyon olarak bildirilmektedir. Bu yüzden visseral leyişmanyozun tanısı böyle hastalarda zordur, serolojik tanı güvenilir sonuçlar vermemekte, ayrıca kültür yöntemi ve doğrudan mikroskop bakısı da hassas olmamakta ve kültür zaman alıcı olmaktadır. Bu nedenle, son yıllarda hastalığın tanısı ve daha da önemlisi hangi türün hastalığa neden olduğunu saptamak için özellikle DNA ya dayalı moleküler yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmada visseral leyişmanyoz ön tanısı ile izlenen 50 hastaya ait kan örnekleri doğrudan mikroskop bakısı, rk39 hızlı tanı testi ve PCR-RFLP yöntemi ile çalışıldı. On hastanın doğrudan mikroskop bakısında amastigotlar görülürken, 40 hastanın mikroskop bakısında amastigotlar görülmedi. On üç hasta rk39 (+) pozitif, otuz yedi hasta rk39(-) negatif bulundu. Yirmi dokuz hastanın PCR (+) pozitif, yirmi bir hastanın PCR (-) negatif olduğu görüldü. PCR ın doğrudan mikroskop bakısı ve rk39 hızlı tanı testine oranla sırasıyla %90 -% 100 duyarlı ve %50-% 56.8 özgül olduğu görüldü. Sonuç olarak bu çalışmada etken türlerin L.infantum ve L.donovani olduğu saptandı. Anahtar Sözcükler: Visseral leyişmanyoz, ayırıcı tanı, PCR-RFLP. viii
ABSTRACT IDENTIFICATION OF CAUSATIVE SPECIES IN PATIENTS WITH VISCERAL LEISHMANIOSIS BY PCR-RFLP ASSAY Visceral leishmaniosis is a health care problem especially in Çukurova region and in Turkey. Visceral leishmaniosis is endemic in the countries beside of the Meditterranean Sea. Direct microscopic examination from blood and bone marrow, culture and serological tests are the methods that used for diagnosis of visceral leishmaniosis. Visceral leishmaniosis has been reported to be an oppurtunistic infection in immunosuppressed patients and immunocompromised subjects such as patients with human immunodeficiency virus infections living in areas in which visceral leishmaniosis is endemic. Because of this the diagnosis of visceral leishmaniosis is difficult in such patients, serological diagnosis is not reliable for immunosuppressed patients, direct diagnosis and culture is not sensitive and culture is time consuming. Therefore recently several methods especially based on DNA have been developed for the diagnosis and more important from that for the identification of the species which caused infections. In this study, blood samples belonging to 50 patients whose were following by preliminary diagnosis of visceral leishmaniosis were studied by direct microscopic examination, rk39 dipstick test and PCR-RFLP. Amastigote forms were detected from 10 samples, and not detected other 40 samples by direct microscopic examination. Thirteen samples were found to be rk39 (+) and 37 samples were found to be rk39 (-). Twenty nine samples were (+) and 21 samples were (-) by PCR. Sensitivity of PCR was found to be %90-%100 compare to direct microscopic examination and rk39 dipstick test. On the other side specifity of PCR was found to be %50-%56.8 compare to direct microscopic examination and rk39 dipstick test. As a result, in this study we found the causative species as L.infantum and L.donovani. Key Words: Visceral leishmaniosis, identification, PCR-RFLP. ix
1.GİRİŞ Leyişmanyoz (Leishmaniosis) dünyada vektör aracılığı ile yayılan hastalıklar arasında önem sırasına göre üçüncü sırada yer alan, 72 si az gelişmiş veya gelişmekte olan ülke olmak üzere toplam 88 ülkenin tropikal ve subtropikal bölgelerinde görülen bir hastalıktır. Afrika, Amerika ve Asya nın pek çok ülkesinde endemiktir. Dünyada bilinen 12-13 milyon leyişmanyoz olgusu vardır ve yılda tahminen 500.000 i visseral (organ leyişmanyozu, kala azar) leyişmanyoz olmak üzere 2 milyon yeni olgu görülmektedir, 350 milyon insan infeksiyon riski altındadır. Hastalığın bildirimi 32 ülkede zorunludur ve önemli sayıda olgu tespit edilememektedir 1,2,3. Avrupa da; Fransa, İtalya, Yunanistan, Malta, İspanya ve Portekiz in de içinde bulunduğu 16 ülkede insan olguları görülmektedir. Deri leyişmanyozu olgularının %90 ından fazlası İran, Afganistan, Suudi Arabistan, Suriye, Brezilya ve Peru dadır. Kala-azar olgularının %90 ından fazlası ise Bangladeş, Brezilya, Hindistan, Nepal, Etiyopya ve Sudan dadır. Kala-azardan iyileşmeyi takiben ortaya çıkabilen ve kala-azar sonrası dermal leyişmanyoz (PKDL) olarak bilinen şekil ise Hindistan ile başlıca Sudan ve Kenya olmak üzere diğer Afrika ülkelerinde görülmektedir. Deri leyişmanyozunu takiben ortaya çıkabilen ve mukokutanöz leyişmanyoz olarak bilinen diğer şekli ise Meksika ile Orta ve Güney Amerika da endemiktir 1,2. Yirmiden fazla Leishmania türü insanlarda infeksiyona neden olabilir ve 30 dan fazla tatarcık türü hastalığın yayılımında rol alır 2. Kala-azar, sıtma, tifo, tüberküloz gibi bir grup hastalıklar ile benzer klinik şekillerde görülebildiğinden ve bunların bazıları da kala-azar ile birlikte olabileceğinden (koenfeksiyon) klinik tanısı zordur. Ayrıca HIV nedeni ile bağışıklığı baskılanmış hastalarda leyişmanyoz, fırsatçı infeksiyon olarak da karşımıza çıkabilmektedir. Bu nedenle 1980 lerin başından beri leyişmanyoz tanısında kullanılan klasik metodlara ilaveten DNA ya bağlı moleküler teknikler gerek tanı gerek hastalığa neden olan türü tanımlamak için geliştirilmiştir. Çeşitli moleküler yöntemler ile infeksiyon tanımı için 1
Leishmania DNA sını bulma ve türlerin tanımlanması hedeflenmiştir. Birçok araştırıcı tarafından Leishmania ya özgü primerler ile PCR amplifikasyonu yapılarak (nükleer veya minisörkıl kinetoplast DNA, small subunit RNA veya miniekson DNA sekansları) tür tayini yapılmaktadır. Leishmania türlerini tanımlamak için kullanılan metodlar multiplex PCR, rastgele amplifiye polimorfik DNA (RAPD), single-strand konformasyon polimorfizmi, restriksiyon fragment length polimorfizmi (RFLP) ve DNA dizi analizidir. DNA ya dayalı bu genotipik moleküler teknikler diğer tanı yöntemlerine oranla daha güvenilir ve özgüldür 5,6,7. Bu çalışmada klasik metodlar ile tanısı konulan ya da konulamayan kala-azarlı hastalarda tanı amacıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi kullanılmış ve restriksiyon enzimi uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemi ile de tür tayini yapılmıştır. 2
2. GENEL BİLGİLER Antartika dışında bütün kıtalarda görülen leyişmanyoz vektör aracılığı ile yayılım gösteren zoonotik/antroponotik karakterli bir paraziter infeksiyon hastalığıdır 3. Protozoonların Mastigophora grubunda bulunan Trypanosomatidae ailesinin Leishmania ve Trypanosoma cinsi insanların kan ve dokularında yerleşirler 5,8. Leishmania türleri yaşam döngülerinde biri omurgalı diğeri omurgasız olmak üzere iki konak kullanırlar; insan, köpek, kemirgen, sırtlan, kobay gibi omurgalı canlıların vücudunda hücre içi paraziti olarak amastigot şeklinde; omurgasız konakta ve in vitro kültür ortamlarında promastigot şeklinde bulunurlar. Bu parazitlerin vektörü ya da omurgasız konağı Eski Dünya da Phlebotomus ve Yeni Dünya da Lutzomyia cinsi kan emici kum sinekleridir. Sadece dişi olanlar biyolojik vektörlük yapabilir; çünkü erkek tatarcık kan emmez 5,8,9. Leyişmanyoz insanda üç klinik şekilde görülür. -İç organlar leyişmanyozu (visseral leyişmanyoz, VL, kala-azar) -Deri leyişmanyozu (Kutanöz leyişmanyoz, KL) -Mukokutanöz leyişmanyoz (Espundia, MKL) Sonraki yıllarda diffüz (yaygın) deri leyişmanyozu (DKL) ve kala-azar sonrası deri leyişmanyozu (PKDL) da bu gruplara eklenmiştir 3,8,9. Asya da kara hastalık veya kala-azar olarak bilinen visseral leyişmanyoz uzamış ve düzensiz ateş, splenomegali, hepatomegali, kilo kaybı, progresif anemi, pansitopeni, hipergamaglobulinemi ve komplikasyon olarak ciddi infeksiyonlarla karakterizedir. Visseral leyişmanyoz hastalığın en ciddi şeklidir ve tedavi edilmezse %100 ölümle sonuçlanmakta, bağışıklık bırakmamaktadır 3,4. Visseral leyişmanyoz 88 ülkede görülmekle birlikte olguların %90 ı Hindistan ve Sudan dadır. Visseral leyişmanyozdan iyileşmeyi takiben bazı hastalarda (Sudan da %50 ve Hindistan da %1-3 oranında) uzun süreli ve pahalı tedaviyi gerektiren kala-azar sonrası deri leyişmanyozu (PKDL) gelişmektedir. Visseral leyişmanyozun yayılımında bu hastalar önemli role sahiptir. Visseral leyişmanyoza Leishmana donovani kompleksi neden olmaktadır. Bu kompleks üç türü kapsar; L. donovani, L. infantum ve L. chagasi. 3
L. donovani Hindistan da görülen visseral leyişmanyoz etkenidir. L. infantum Akdeniz bölgesinde çocuklarda görülen kala-azar etkenidir. Bununla birlikte bu bölgede HIV infeksiyonunun artan prevalansı nedeniyle HIV-VL koenfeksiyonu erişkin populasyonda sıklıkla rapor edilmektedir. L. chagasi ise Latin Amerika da çocuklarda görülen ve lenfadenopatinin baskın olduğu kala-azar etkenidir. Eski Dünya deri leyişmanyozu etkeni olan L.tropica nın bağışıklığı baskılanmış kişilerde kala-azara neden olduğu da rapor edilmiştir 4. Leishmania nın 20 den fazla türü insanları infekte edebilir, özellikle HIV/AIDS birlikteliğinde farklı türler görülebilmektedir. Hastalığın yayılımında rol alan 30 tatarcık türü tanımlanmıştır. Leyişmanyoz hayvan rezervuarlardan dolayı zoonotik bir hastalık iken bazı bölgelerde ise insan hastalığın tek rezervuarıdır, bu da vektör ve rezervuar kontrolünü masraflı ve imkânsız kılmaktadır 2. 2.1. Leishmania ların Sınıflandırılması Leyişmanyozda insan infeksiyonu 30 Leishmania türünün 21 i tarafından oluşturulmaktadır. Bu farklı türler yapısal olarak ayırt edilememekte ancak izoenzim analizleri, moleküler metodlar veya monoklonal antikorlar kullanılarak tür tayinleri yapılabilmektedir 3. Alem: Protista Alt alem: Protozoa Şube: Sarcomastigophora Alt şube: Mastigophora Takım: Kinetoplastida Aile: Trypanosomatidae Cins: Leishmania Türler: L. donovani, L. infantum, L. chagasi, L. tropica, L. major, L. aethiopica, L. mexicana (L.m. mexicana, L.m. amazonensis, L.m. venezuelensis, L.m. pifanoi, L.m. enrietti) 4
2.2. Yapı Leishmania cinsine ait türlerin insan ve diğer memelilerin vücudunda kamçısız (amastigot) ve tatarcık vücudunda kamçılı (promastigot) olmak üzere iki evrim şekli vardır 3,5. 2.2.1 Amastigot Şekil Amastigotlar 2.5-6.8 µm büyüklüğünde yuvarlak veya oval şekilli ve hareketsizdir. Parçalı çekirdekli lökositler, monositler ve endotel hücreleri içinde tek tek veya gruplar halinde veya hücre dışında bulunurlar. Besinlerini içinde bulundukları hücreden alırlar, aeropturlar, büyük makrofajlar içinde boyuna ikiye bölünerek çoğalırlar 3,8,10. Amastigotlar çok küçük olduklarından dolayı ışık mikroskobunda Giemsa ile boyalı preparatlarda mavi sitoplazmalı merkezi yerleşimli yuvarlak veya oval pembekoyu kırmızı çekirdek veya çekirdeğe bitişik fakat daha küçük olan yuvarlak veya çubuk şeklinde parlak kırmızı-menekşe renkte boyanan bir sonraki dönemde kamçının çıkacağı yer olan kinetoplast dışında iç yapısı ayırt edilemez (Şekil 1.1 ) 8,10. Sitoplazmada ayrıca vakuoller, nokta şeklinde bleforablast (kamçı kökü) ve bleforablasttan çıkıp ön kısımda sonlanan bir akson bulunmakta, ancak kamçı hücre dışına serbest olarak çıkmamaktadır 3. Bütün Leishmania türlerinde sitoplazmada tek bir mitokondrium, düz ve granüllü endoplazmik retikulum, golgi cihazı ve lizozomlar yer almaktadır. Golgi cihazı endositoz ve ekzositozda rol alır, lizozomlar içerdikleri hidrolitik enzimler sayesinde çeşitli enzim aktiviteleri ile parazitin beslenmesine yardımcı olurlar 3,10. 5
Şekil 1.1. Leishmania amastigotu X100 2.2.2. Promastigot Şekil Promastigotlar vektörü olan tatarcıkların bağırsaklarında ve amastigotların uygun besiyerlerinde şekil değiştirmesinden sonra görülür. Promastigotlarda da organeller sayıca değişmekle beraber aynıdır. En önemli fark promastigotların 8-15 µm mekik şeklinde ve hareketli olmalarıdır. Ön uçtan çıkan 18-20 µm uzunluğunda serbest bir kamçısı ve kamçı kökü yanında yerleşmiş 9 çift periferik ve bir çift merkezi liften oluşmuş bir aksonemi bulunmaktadır. Ön uçta yuvarlak veya at nalı şeklinde bir kinetoplast, kinetoplastın ön kısmında ve kamçının dip kısmında bleferoblast bulunmaktadır. Merkezi bir çekirdek ve çekirdekçik ve çekirdek zarında da porlar bulunmaktadır (Şekil 1.2 ) 8,10. Şekil 1.2. Leishmania promastigotları X100 6
2.3 Leishmania Parazitlerinin İnce Yapısı 2.3.1. Plazma Zarı ve İlgili Organeller Amastigot ve promastigot şekillerinde bulunan plazma zarı 2-4 nm genişliğinde ve 3 tabakalı görünümdedir. Hemen altında 20-22 nm çaplı ve düşük yoğunlukları nedeniyle plazma zarından ayırt edilebilen birbirine paralel yerleşimli subpelliküler mikrotübüller uzanmaktadır, bunlar organizmanın iskeleti görevini görürler. Mikrotübüllerin sayıları, kalınlıkları, birbirinden uzaklıkları türlere göre değiştiği için Leishmania türlerinin ayırımında da kullanılmaktadır. L. donovani de 80-120; L. tropica da 80-115 arasında mikrotübül bulunmaktadır. Bu ayrım Yeni Dünya ile Eski Dünya türleri arasında daha belirgin olarak görülmektedir 3,10. Plazma zarı parazitin ön ucunda invagine olarak bir kese oluşturmaktadır. Bu kese "kamçı kesesi" veya "rezervuar" olarak adlandırılmakta ve parazit için hayati öneme sahip olan kamçıyı barındırmaktadır (Şekil 2.1 ve 2.2) 3. Şekil 2.1.* Leishmania amastigot ince yapısı 10 7
Şekil 2.2.* Leishmania promastigot ince yapısı 10 * n: çekirdek, k: kinetoplast, f: kamçı, fp: kamçı kesesi, ly: lizozom, g: glikozom, gc: golgi kompleksi, mt: mikrotubül, mi: mitokondri, pm: plazma zarı 2.3.2 Kamçı ve Bazal Cisim Promastigotlarda bulunan kamçı ince, uzun, ip gibi, dışı hücre zarından yapılı kılıfla kaplı bulunmaktadır. Kılıf içinde 9 çift çevrede, bir çift ortada olmak üzere 10 çift mikrotübülden oluşmaktadır. Kamçı 200 nm kalınlığında olup parazitin gövdesinden daha uzundur, başlangıç ucu kamçı kesesi ile çevrilidir 3. 2.3.3 Kinetoplast Kinetoplastida takımında yer alan Leishmania, Trypanosoma, Crithida ve diğer cinslere ait olan organizmaların hepsi kamçının bazal kısmında yerleşmiş kinetoplast adı verilen bir hücresel organele sahiptir. Kinetoplast birkaç bin kopya sarmal DNA molekülünden oluşmuştur, mitokondrium içine yerleşiktir. Bu DNA şebekesi kinetoplast DNA (kdna) olarak adlandırılmaktadır. Kinetoplast büyük sarmal 8
(maksisörkıl) ve küçük sarmal (minisörkıl) adı verilen iki gruptan oluşmuştur; her kinetoplastta büyük sarmalda 20-35 kb büyüklüğünde, homojen 20-50 kopya; küçük sarmalda ise 0.5-2 kb büyüklüğünde heterojen 5 bin-10 bin kopya bulunmaktadır 3,10. 2.3.4 Mitokondri Tüm Leishmania türlerinde tek bir mitokondri bulunmaktadır, ancak bazen ek olarak çok küçük ve az kristalı başka mitokondrilerde görülebilmektedir. Kinetoplast da mitokondri içinde yer almaktadır 3. 2.3.5 Çekirdek Parazitin ön kısmına yakın bulunan oval veya yuvarlak çekirdek 7 nm kalınlığında iki zardan oluşmaktadır. Merkezi bir çekirdekçiği bulunmakta, dış çekirdek zarı endoplazmik retikulum ile devam etmektedir 3. 2.3.6 Diğer Organeller Endoplazmik retikulumun hem düz hem de granüllü tipleri bulunmakta ve çekirdeğin etrafında yer almaktadır. Stoplazmanın her yerine dağılmış durumdadır. Golgi cihazı çekirdek veya kinetoplasta yakın bir yerde bulunmaktadır. Lizozomlar kamçı rezervuarı ile çekirdek arasındadır, vakuoller sitoplazmada yer alan zarla çevrili yapılar olarak görülmektedir 3. 2.4 Leishmania ların Evrimi Leishmania türlerinin vektörü olan Phlebotomus veya Lutzomyia cinsi tatarcıklar leyişmanyozlu bir omurgalı konaktan kan emerken makrofajlar içinde bulunan paraziti amastigot şeklinde almaktadır. Tatarcık vücudunda amastigotlar gelişim sürecinde birkaç farklı yapısal şekle dönüşürler, bunlar sırasıyla prosiklik promastigotlar, nektomonad promastigotlar, haptomonad promastigotlar, paramastigotlar ve metasiklik promastigotlar olarak adlandırılır 3. İn vitro koşullarda uygun kültür ortamı ve sıcaklık ( genellikle 26 o C) sağlandığında amastigotların promastigotlara dönüşümü 24-48 saatte tamamlanır 3,5. Tatarcıkların kan emmesinden 1 saat sonra amastigotlar abdominal midededir, 12-24 saat sonra abdominal midenin peritrof zarının içinde promastigotlar 9
görülmektedir. Nektomonadlar midede 36-48 saat sonra görülürler, 3. günde torasik midede haptomonadlar, 6. günde bütün sindirim kanalında promastigotlar görülmeye başlar, 14. güne kadar gittikçe artar. Tatarcıklardaki evrim süresi Leishmania nın türüne ve çevrenin sıcaklığına bağlı olarak 4-18 gündür 5,8,9. İnfektif metasiklik promastigotları barındıran vektör tatarcık, kan emmek için omurgalı konağı soktuğu zaman belli miktarda (500-1000) promastigotları da gidiş yönü kan akımının tersine olduğu halde konağa inoküle ederler. Deriden vücuda giren promastigotlar ilk saatlerde serumdaki kompleman tarafından opsonize edilmekte ve bu şekilde komplemanla opsonize edilmiş parazit omurgalının makrofaj, monosit veya Langerhans hücreleri tarafından kolayca fagosite edilmektedir. Fagosite edilen promastigotlar kamçılarını kaybederek amastigot şekle dönüşürler, bu süreç 12-24 saatte tamamlanır 3,8. Amastigotlar daha sonra konak hücrenin fagolizozomal kompartmanında fagositik vakuol içinde bölünerek çoğalır. İnfekte hücre parazitin sayıca çoğalması sonucunda parçalanır ve amastigotlar ortaya çıkarlar. Bu amastigotlar tekrar diğer makrofajları infekte edebilmekte ve dalak, karaciğer, kemik iliği gibi organlara dağılarak bu organlarda çeşitli patolojilere neden olmaktadır 3,11. İnfeksiyonun bundan sonraki seyrini parazitin türü, invazyon yeteneği, patojenitesi ve konağın immün cevabını yönlendiren genetik özellikleri belirler. İnfeksiyon deride sınırlı kalabilmekte veya iç organlara göç edebilmektedir 3,11.. Seyrek olarak görülse de leyişmanyoz tranplasental yol ile kan transfüzyonu ve kontamine iğneler ile de bulaşabilmektedir (Şekil 3) 2,3,11. 10
i Şekil 3. Leishmania nın yaşam döngüsü 2 11
2.5 Visseral Leyişmanyoz 2.5.1 Epidemiyoloji 2.5.1.1 Dünyada Visseral Leyişmanyoz Visseral leyişmanyoz dünyada 88 ülkenin tropikal ve subtropikal bölgelerinde endemiktir. Dünyada bilinen 12 milyon leyişmanyoz olgusu vardır, her yıl 1.5-2 milyon yeni olgu görülmektedir. Her yıl görülen 500.000 yeni visseral leyişmanyozun % 90 ı Nepal, Bangladeş, Hindistan, Sudan ve Brezilya dadır. Dünyadaki olguların yaklaşık %50 si Hindistan da görülmektedir. İnfeksiyon erkeklerde kadından daha fazla görülmektedir 1,2,3. Visseral leyişmanyozda, sadece insanın rol aldığı "insan-vektör-insan" döngüsü Hindistan gibi bazı bölgelerde meydana gelmekte diğer bölgelerde ise küçük kemirgenler veya köpekgiller rezervuar olarak davranmaktadır 1,2,3. Leyişmanyozun coğrafik yayılımı, infeksiyonun vektörü olan tatarcıkların bulunduğu yerlerle sınırlıdır. Kentleşmenin getirdiği ekonomik gelişmeler, ormanların yok edilmesi, yeni yerleşim alanlarının geliştirilmesi, kırsal alanlardan kentsel bölgelere göç tatarcıkların yayılımında rol alan faktörlerdir. Ayrıca bağışıklığı yetersiz HIV ile infekte hastalar özellikle Güney Avrupa ve Afrika da yeni bir hasta grubunu oluşturmaktadır. Leishmania/HIV koenfeksiyonu özellikle Güney Avrupa da; ki buradaki erişkin VL olgularının %25-70 i HIV ile infektedir, gerçek bir "yeni ortaya çıkan hastalık" olarak değerlendirilmelidir. Leyişmanyoz böyle hastalarda fırsatçı bir infeksiyon gibi davranmaktadır. Ayrıca Leishmania parazitlerinin RES dışında, kanda bulunması HIV ile infekte hastaları bir rezervuar ve vektörler için infeksiyon kaynağı haline getirmektedir 4. 2.5.1.2. Türkiye de Visseral Leyişmanyoz Visseral leyişmanyoz daha çok Ege ve Akdeniz bölgelerinde görülmekle birlikte hemen hemen bütün bölgelerimizden bildirilmiş olgular bulunmaktadır. Hastalığın etkeni olan Leishmania parazitleri hem insandan hem de köpeklerden izole edilmiş, izoenzim analizi, EF (excreted factor) analizi, monoklonal antikorlar ve PCR ile diğer Akdeniz bölgesi ülkelerinde olduğu gibi etkenin Leishmania infantum olduğu ve doğadaki rezervuarlığını da köpeklerin yaptığı epidemiyolojik çalışmalarla kanıtlanmıştır 3. 12
Ülkemizde visseral leyişmanyozu bulaştıran vektör Phlebotomus türü kesin olarak gösterilmemekle birlikte P. neglectus, P. syriacus ve P. tobbi olası vektörler olarak saptanmışlardır 3. Hastalık ülkemizde genelde 12 yaş altındaki çocuklarda görülmekle birlikte Denizli, İzmir ve Çanakkale gibi bazı bölgelerimizde erişkinlerde görülebilmektedir 3. 2.5.2 İmmunoloji Bağışıklık sisteminin Leishmania infeksiyonlarına karşı cevabı karmaşıktır. Birtakım özel koşullara bağlı olarak hızla iyileşebilir veya daha da kötüleşebilir. Bunlar kısmen memeli konakların genetik farklılıklarına, kısmen parazitin tür ve suşlarının genetik farklılıklarına, kısmen de ısıran sinek sayısı, yeri ve büyüklüğü gibi faktörlere bağlıdır 11. L. donovani ye karşı ise insanların direnci değişiktir. Normal insan serumunda bu paraziti eriten bazı maddelerin varlığı gösterilmiştir. Bu eritici madde yeni doğan çocuklarda vardır, fakat daha sonra azalır ve 5,5-6 yaşından sonra yeniden ortaya çıkar. İnsanda Leishmania infeksiyonları sırasında antikorlar ve hücre aracılığıyla olan bağışıklık gelişmektedir. Hücresel bağışıklık, geç tip aşırı duyarlılık reaksiyonu şeklindedir ve bunun varlığını göstermek için Leishmanin (Montenegro) deri testi kullanılır. Bu testte antijen olarak besiyerlerinde üretilmiş promastigotlar kullanılır. Test türe özgül değildir, aktif kala azarda negatiftir fakat tedaviden veya infeksiyonun kendiliğinden iyileşmesinden sonra pozitifleşir 3,5,8,9. Leyişmanyoz infeksiyonları hasta serumunda anti-leishmania antikorlarının varlığı ile karakterizedir. Deri leyişmanyozunda aktif lezyon döneminde antikor titreleri genellikle çok düşük olarak bildirilmekle birlikte bazı çalışmalarda antikor takiplerinin L. braziliensis infeksiyonlarında tanı ve prognoz takibinde kritik öneme sahip olduğu vurgulanmaktadır. Ancak kala azar olgularında antikor seviyeleri tipik olarak çok yüksek saptanmaktadır. Yapılan klinik çalışmalarda tüm hastalarda IgG1 artışı saptanırken antimon tedavisine dirençli olgularda belirgin olarak IgG2 ve IgG3 artışı olduğu, IgM, IgA ve IgE seviyelerinde değişiklik olmadığı saptanmıştır. Son çalışmalarda IgG nin koruyucu etkisi olmadığı gibi infeksiyonun ilerlemesine neden olan faktörlerden olduğu anlaşılmıştır 11. 13
Leishmania parazitlerinin makrofaj içinde yaşama mecburiyeti göz önüne alındığında bu parazitlerin makrofaj effektör mekanizmaları tarafından ortadan kaldırılmaya çalışılacağı ve bu yüzden de nitrik oksit sentezini tetiklediği görülmektedir. İn vitro ve in vivo modellerde bu sentezin parazitin hücre içinde yok edilmesi için gerekli olduğu gösterilmiştir 11,12. Leishmania parazitleri konak makrofajlarının fagolizozomları içinde gizlenmek suretiyle sıvısal bağışıklıktan (antikor yanıtı) kaçmaktadırlar. Hücre içindeki parazit dolaşımdaki antikorlara maruz kalmadığı için antikorların hastalığın seyri üzerine etkisi yoktur. Hayvanlarda B hücrelerinin yokluğunun infeksiyonun seyrini etkilememesi, anti-igm ile antikorların baskılanmasının herhangi bir etki yaratmaması, yüksek düzeyde IgG ve IgM seviyelerinin enfeksiyona karşı koruyucu bir etki göstermemesi gibi delillerden dolayı da bağışıklığın tamamıyla hücresel bağışıklığa bağlı olduğu belirtilmektedir 11. Leyişmanyozdaki koruyucu bağışıklık da hücresel bağışıklık ile ilgilidir. Bununla beraber T lenfositleri yabancı antijenleri sadece MHC II yüzey molekülüne sahip olan makrofajlar, Langerhans hücreleri ve keratinositler gibi antijen sunan hücreler tarafından sunulduğu zaman tanıyabilmektedir. Sistem çalıştığı zaman ve antijen sunan hücre T hücre ile etkileştiğinde T hücre sitokin üretmekte ve bu da makrofajlar tarafından Leishmania nın öldürülmesini desteklemektedir 3,11. Leishmania antijenlerinin T hücrelerine sunulması iki şekilde sonuçlanır; ya etkili bir hücresel yanıt oluşur, bu Th 1 etkisidir veya etkisiz bir humoral yanıt oluşur bu da Th 2 etkisidir. Th 1 yanıtı ile T hücreleri IL-2 ve IFN gamma sitokinlerinin sentezini arttırarak makrofajları aktive ederler. Th 2 cevabı ile de IL-4, IL-5, IL-10 ve Leishmania parazitlerinin makrofaj içinde yok edilmesini durduran TGF-β salınır. Buna rağmen her bir Leishmania türü hastalığın bir şekli ile sonuçlanır, konak hücresel bağışıklığı kliniği belirler; infeksiyon klinik veya subkliniktir, visseral, kutanöz veya mukokutanöz şekildedir, lezyonlar azdır veya yaygındır ve tedaviye yanıt tam veya yetersizdir 11,12. 14
2.5.3 Patogenez Parazite ait faktörler ve konağın savunma mekanizmaları patogenezi doğrudan şekillendirmektedir 11. Kala azara neden olan Leishmania türleri tüm vücutta RES (retiküloendotelyal sistem) hücrelerini infekte etmektedir. Dalakta mononükleer fagositlerin artması sonucu hipertrofi görülür. Lenf düğümleri folliküllerinin yerini parazitli mononükleer hücrelerin alması ile büyürler. Karaciğerde parçalı nekroz ve Kupffer hücrelerinin büyümesi ve sayıca artması sonucu hipertrofi görülür. Kemik iliğinde genellikle hiperplazi olur ve diseritropoez ile sonuçlanır. Kemik iliğinde yapısı bakımından normoblast ile megaloblast arasında ara eritroblastlara daha fazla rastlanır. Trombositopeni ve pıhtılaşma faktörlerinde azalma sonucunda kanamalar olabilmekte, ayrıca dalaktaki hipertrofiye bağlı ortaya çıkan hipersplenizm eritrosit, granülosit ve trombositlerin dalakta yıkımına neden olmakta, etkisiz eritropoez nedeniyle de ciddi pansitopeni tablosu ortaya çıkmaktadır. Beyaz kan hücre sayısı genelikle mikrolitrede 4000 in altında, 2000-3000 arasında değişmekte ve ilerleyici monositoz gelişmektedir. Gamaglobülinler serum proteinlerinin %60-70 ini oluşturabilmektedir 3,5,9. Kala azara bağlı olarak deri belirtileri de söz konusu olmaktadır. Bunlar tedavinin sonlarına doğru veya tedaviden bir iki hafta sonra görülebildiği gibi, tedaviden 1-2 yıl sonra, spontan iyileşmeden yıllarca sonra da görülebilirler. Kala azar sonrası deri leyişmanyozu (PKDL) adı verilen deri belirtileri deri leyişmanyozunun erken dönem deri belirtilerinden farklılık gösterir. Makülle başlar ve lezyon büyüdükçe epidermisin incelmesine ve böylece hipopigmentasyona neden olur. Lezyonlar eritamatöz ve nodülerdir, bol lenfosit ve plazma hücre infiltrasyonu vardır 3. Glomerüler komplekslerde IgG, IgA, IgM, kompleman ve fibrinojen tanımlanmıştır. Glomerüllerde subendotelyal ve mezenşimal immun komplekslerin birikmesiyle böbreklerin hepatosplenik şistozomiyoz olgularına benzemekte olduğu bildirilmiştir. Lenfosit ve plazma hücreleri infiltrasyonu ile interstisiyel nefrit bildirilmiştir 9. İnce bağırsağın lamina propriyasında parazit dolu makrofajlar, villuslarda genişlemeye ve bölmeli kısalmaya neden olabilirler. Ancak ülserasyon yalnızca kalın bağırsakta görülür. Ayrıca parazit içeren histiyositlere sürrenallerin sinüzoid 15
hücrelerinde, pankreas ve testisin interstisiyel bağ dokusunda ve diğer organlarda da rastlamak mümkündür. 13 2.5.4 Klinik Visseral leyişmanyoz L. infantum ve L.donovani nin neden oldukları infeksiyon ile karakterizedir. L.tropica ile de bazı olgular olabildiği bildirilmiştir. Bu iki tür de benzer kliniğe neden olur, ancak L.infantum genellikle küçük çocukları etkiler ve lenf bezi tutulumu daha önceliklidir 3. Hastalık 2 hafta ile 6 ay arasında değişebilen bir inkübasyon periyodunu takiben ortaya çıkmaktadır. Klinik bulgular ani veya sinsi başlangıçlıdır. Sinsi başlangıç endemik bölgelerde sık görülür. Ani başlayan olgularda burun, diş eti ve bağırsak kanamaları görülebilir. Anemi, granülositopeni ve hatta agranülositoz gelişebilir. Bu olgularda birkaç haftada ölüm gerçekleşebilir. Subakut ve süregen olgularda ateş, halsizlik, iştahsızlık, öksürük ve kilo kaybı vardır. Çocuklarda bu klinik bulgulara gelişme geriliği ve organomegali eşlik edebilir 3,9. Hastalık ilerledikçe zayıflama ve anemi belirginleşir. Sıklıkla karında şişlik vardır. Akut başlangıç sıtma nöbetini andıran bir periyodisite gösterir. Bazen ishal ve tifoid ateşi andıran bir başlangıç olabilir. Ateş sürekli, intermittant veya remittant olabilmekte ve düzensiz aralıklarla oluşabilmekte, günde iki veya üç kez ateşin yükselmesi tipik olsa da her zaman görülmemektedir. Ateşin yükselmesi ile birlikte dalak ve daha yavaş olarak karaciğer büyür. Hepatomegali olguların 1/3 ünde görülür. İki organ da sıklıkla yumuşak ve genelde hassas değildir. Hastalığın ilerleyen dönemlerinde asit oluşabilmektedir. Çocuklarda ileriki dönemlerde periferal ödem görülebilmektedir ve hipoalbuminemi ile birlikte olabilir. Olguların %5-10 unda hafif bir hepatosellüler sarılık gelişir ve karaciğer enzimleri de yüksektir. Bu tablolar kötü prognozu gösterir 3,9. Deride pullanma, kepeklenme görülür ve saçlar dökülür. Kala azar, kara ateş anlamındadır ve derinin tipik olarak koyulaşmasını anlatmaktadır. Deri koyulaşması genellikle açık tenli kişilerde olmakta, çok açık tenli veya koyu tenli kişilerde bu koyulaşmayı anlamak zorlaşmaktadır. Koyuluk özellikle alın, şakaklar ve ağız etrafında belirgindir 3,9. 16
L. donovani genellikle deri lezyonlarına neden olmaz. Nadiren başlangıçta ısırma yerinde bir papül oluşur. Deri leishmanoidi olarak bilinen bir durum bazen visseral leyişmanyozun tedavi edildiği hastalarda veya subklinik olgularda görülebilir. Deri lezyonları tüm vücudu kaplayan veya yama şeklinde olan eritematöz ya da depigmente maküllerdir. Burun üzerinde kelebek şeklinde yayılım görülebilir. Daha sonra lezyonlar nodüler olmaya eğilim gösterir ve bu evrede lepra nodülleri ile karışabilir. Deri lezyonlarında parazit bulunabilir ve bu hastaların da bu yüzden rezervuar olabileceği düşünülmektedir 3. Visseral leyişmanyozlu hastalarda değişik klinik belirtiler görülür ( Çizelge 1) 3. Çizelge 1. Visseral leyişmanyozlu hastaların klinik belirtileri 3 Klinik belirti Sudan Hindistan Brezilya (%) (L. donovani) (L. donovani) (L. chagasi) Ateş 95 99 95 Splenomegali 95 98 99 Kilo kaybı 80 87 98 Anemi 75 96 98 Lenfadenopati 75 90 30 İştah kaybı 70 30 20 Öksürük 75 50 40 Hepatomegali 60 98 90 İshal 40 50 60 Bulantı 15 az az Ödem 5 _ 40 Birçok yerde sıtma daha yaygın olarak görülen bir infeksiyondur ve visseral leyişmanyoz ile kliniği benzerdir. Uzun süren düzensiz ateşi olan, antimalarya ilaçlarına yanıt vermeyen veya kan yaymaları birkaç kez incelendikten sonra sıtma parazitlerine rastlanmayan hastalarda visseral leyişmanyoz mutlaka düşünülmelidir. Ayırıcı tanıda ise; tifo, tuberküloz, AIDS, bruselloz, kronik hepatit, lenfoma ve lösemi gibi hastalıklar akla gelmelidir 3. Laboratuvarda lökopeni, trombositopeni ve serumda etkene özgü antikorların saptanması klinik tanıyı doğrulamak için önemlidir. Pnömoni, bronşit, tuberküloz, sıtma, ishal, viral infeksiyonlar, bakteriye bağlı deri infeksiyonları, orta kulak iltihabı, ağızda yaralar visseral leyişmanyoz sırasında ortaya çıkabilen ikincil infeksiyonlardır. 17
Trombositopeni nedeniyle burun, diş eti ve bağırsak kanamaları olabilir. Ölüm ikincil infeksiyonlar veya kanamalara bağlı olarak gelişir 3,13. Serolojik çalışmalar ve leishmanin deri testi sonuçları spontan iyileşen L. infantum ve L. chagasi nin neden olduğu subklinik infeksiyonların L. donovani nin neden olduğu klinik kala azardan daha sıklıkla görüldüğünü göstermektedir. Ancak L. donovani epidemilerinde infeksiyon çoğunlukla semptomatiktir ve ölüm oranı daha yüksektir 12. 2.5.4.1 İmmun Yetmezliği Olan Kişilerde Kala-Azar İmmun sistem ile son derece yakın ilişkili bir infeksiyon olan leyişmanyoz hücresel immun yanıtın azaldığı her durumda atipik bir klinikle görülmekte ve tedaviye daha dirençli olmaktadır. Bu durumdaki kişilerin çoğu HIV ile infekte kişilerdir ve özellikle Güney Avrupa, Hindistan, Güney Amerika ve Afrika da HIV/Leishmania infeksiyonlarının birlikte görülme sıklığı artmaktadır 3,4,12. Leishmania-HIV koenfeksiyonu özellikle visseral leyişmanyozlu erişkinlerin %25-70 inin aynı zamanda AIDS de olduğu Güney Avrupa da yeni bir hastalık gözüyle değerlendirilmekte ki leyişmanyoz bu hastalarda fırsatçı bir infeksiyon gibi davranmakta ve burada visseral leyişmanyozun AIDS ile sınırlı bir hastalık olarak ele alınması önerilmektedir. Ayrıca Leishmania parazitlerinin RES dışında periferik kanda da bulunması HIV ile infekte hastalarda bu kişileri vektörler için infeksiyon kaynağı ve rezervuar yapmaktadır. Periferik kanda parazit yükü genellikle fazladır ve intravenöz ilaç kullanıcıları arasında ortak şırınga paylaşımından dolayı bulaşmanın olduğu da gösterilmiştir. Farklı coğrafik bölgelerde ve farklı konaklarda leyişmanyozun yeniden ortaya çıkması infekte hastaların klinik bulgularının değişmesinden başka tanı alanında, tedavi ve hastalık kontrolünde yeni yaklaşımların olmasını gerektirmiştir 4. Kortikosteroid kullanan, immun baskılayıcı tedavi alan hastalar, lenfomalı, lösemili, kronik hepatitli, böbrek nakli olan, sarkoidozisli, Crohn hastalığı olanlar, sistemik lupus eritematozisli hastalar gibi başka nedenlerle immun sistemi baskılanan hastalar visseral leyişmanyoza daha duyarlı kişiler olarak bildirilmektedir 3. 18
2.5.4.2 Kala-Azar Sonrası Deri Leyişmanyozu Kala azar sonrası deri leyişmanyozu genel olarak visseral leyişmanyozun bir komplikasyonudur. Visseral leyişmanyoz geçirmiş ve iyileşmiş, bazen geçirmemiş hastalarda maküler, makülopapüler ve nodüler döküntü ile karakterizedir 3,12,13. Kala azar sonrası deri leyişmanyozunn ortaya çıkışında hastaların immun yanıtındaki olayların etken olduğu görüşü ağırlık kazanmakla birlikte mekanizması tam olarak açıklanamamıştır 3. L. donovani nin neden olduğu visseral leyişmanyozun başarılı tedavisinden sonra kala azar sonrası deri leyişmanyozu gelişebilmektedir ancak L. infantum ve L. chagasi nin etken olduğu olgularda ise çok ender olarak görülmektedir 3,12. Dünyada post kala-azar dermal leyişmanyoza Asya da Nepal, Bangladeş ve Hindistan da, Doğu Afrika da ise Sudan, Etopya ve Kenya da rastlanılmaktadır, ancak genel özellikleri arasında farklar olduğu belirtilmektedir 3. Afrika da ya başarılı olduğu kesin olan tedavinin sonuna doğru ya da tedaviden sonra birkaç hafta ile bir ay sonraki sürede ortaya çıkar. Sudan da subklinik ve klinik visseral leyişmanyozlu hastaların yaklaşık %55 inde kala azar sonrası deri leyişmanyozu gelişir. Hindistan da ise daha az sıklıkla gelişmekle birlikte tedaviden aylar hatta yıllar sonra ortaya çıkabilir. Kala azar sonrası deri leyişmanyozu genellikle ani ve ciddi başlangıçlıdır, deri ve mukozalarda deskuamasyonlara neden olur. Daha sıklıkla hipopigmente yamalar, nodüller ve plaklarla karakterizedir. Biyopsilerde parazit yok veya çok azdır. Salgınlarda kala azar sonrası deri leyişmanyozlu hastalar L. donavani rezervuarı olabilirler 3,12. 2.5.5 Tanı Visseral leyişmanyoz tanısında eğer olanak varsa birden fazla tanı yönteminin kullanılması önerilmektedir. Böylelikle diğer hastalıklardan ayırıcı ve doğru tanı konulması mümkün olmaktadır 3,4. 2.5.5.1 Etkensel Tanı Leyişmanyoz, klinik özellikleri ile akla gelebilir, serolojik ve deri testleri ile de desteklenebilir ancak doğrudan bakı veya kültür ile parazit görülerek doğrulanmalıdır 10. 19
Etkene yönelik araştırmalar, doğrudan etkenin kendisine veya ona karşı oluşan reaksiyonlara dayandırılmakta olup her tanı metodunun parazitin tipi ya da incelenen klinik örnekten bağımsız olarak kendi içinde avantajları ve dezavantajları bulunduğu çeşitli araştırmalarla ortaya konmuştur (Çizelge 2) 14. Çizelge 2. Visseral leyişmanyoz tanısında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması 14 Yöntem Avantajlar Dezavantajlar Doğrudan tanı *Basit *Hızlı *Parazitin doğrudan araştırılması *Parazit sayısı yüksek olmadığından *Yapısal olarak farklı düşük duyarlılık göstermesi, organizmaların ayrımı *Benzer yapıdaki organizmaların ayırt edilememesi, *Deneyimli personele gereksinim duyulması Kültür ile tanı *Virulans ve infektivitenin *Pahalı ve yavaş olması ölçülebilmesi *Örnekte parazitlerin canlılığının *Canlı parazitlerin saptanabilmesi sürdürülmesi gerekliliği *Türler arasında varyasyonların saptanmaması *Hayvan kullanımı Serolojik tanı *Basit ve hızlı *Düşük özgüllük *Çok sayıda örneğin incelenmesine *Aktif ve geçirilmiş ya da latent elverişli olması infeksiyonun ayırt edilememesi *Standardize ayıraçların gerekliliği Moleküler tanı *Doğrudan parazitin türünün *Çok aşamalı ve pahalı araştırılması ve ayrımı *Ölü organizmaların da saptanması *İnhibitörleri nedeniyle olası yanlış negatiflik (PCR) *Kontaminasyon nedeniyle olası yanlış pozitiflik (PCR) Leishmania parazitlerini görerek tanı koymak için kemik iliği, dalak, karaciğer, lenf bezi aspirasyonu yapılabilmekte veya periferik kan örneğindeki çekirdekli hücreler incelenmektedir. Alınan materyallerin bir kısmı Giemsa ile boyalı preparatlarda amastigotların gösterilmesi amacıyla kullanılır. Kalanı ise kültür amacıyla 26-28 derecede uygun besiyerlerine ekilir ve 2 hafta içinde hareketli promastigotlar pozitif kültürlerde görülür 4,13. 20
Ayrıca, aspirasyonla elde edilen örnekler veya doğrudan kan kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu uygulanabilmektedir 15,16,17,18. Özellikle immun yetmezliği olan hastalarda perifer kanda parazit sayısı çok miktarda olduğundan uygun türdeki tatarcıklar kullanılmak suretiyle hastadan kan emdirilmekte ve tatarcıkta promastigotların gelişimi disseksiyon ile araştırılmaktadır (ksenodiagnosis) 4. Visseral leyişmanyozda parazitin görülmesi; dalak aspirasyonlarında %95 den fazla, kemik iliği ve karaciğerden yapılan aspirasyonlarda %70-85 oranında, lenf bezi aspirasyonlarında (Afrika da) %58-65 oranında ve kandan yapılan bufy coatlarda %70 lere varan orandadır. Doğru yapıldığı takdirde kültürde parazitin görülme olasılığı yaklaşık %10 oranındadır 13. Yeni bir latex aglütinasyon testi (KATEX) idrardaki antijeni saptayarak tanı koymak amacıyla kullanılmaktadır. İnvaziv olmayan bu testin özellikle antikor yanıtı yetersiz olan immunsupresif kişilerde ve visseral leyişmanyoz tedavisinin takibinde çok yararlı olacağı bildirilmektedir 3. 2.5.5.2 Serolojik Tanı Leyişmanyozun serolojik tanısı için IFA (dolaylı floresan antikor) testi, IHA (dolaylı hemaglütinasyon antikor) testi, ELISA, rk39 özgül antijeninin kullanıldığı ELISA, rk39 hızlı tanı testi, DAT (doğrudan aglütinasyon testi), FAST (hızlı aglütinasyon tarama testi) ve western blot (WB) gibi yöntemler geliştirilmiş olmasına rağmen söz konusu bu yöntemlerin duyarlılıkları arasında farklar olabilmektedir 4,19. Son yıllarda geliştirilen ve visseral leyişmanyoz etkenine özgü rekombinant antijene karşı antikor varlığını gösteren rk39 hızlı tanı testi yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu test yüksek duyarlılığı ve özgüllüğünden dolayı referans test olmuştur. Bu testin kullanımı kolaydır, hızlıdır, minimal düzeyde teknoloji ve laboratuvar ekipmanı gerektirmektedir 1. 21
2.5.5.2.1 rk39 Hızlı Tanı Testi K39 proteini visseral leyişmanyoza neden olan Leishmania türlerinin amastigotlarında bulunan bir epitoptur ve visseral leyişmanyozun hızlı tanısı için uygun bir proteindir 20. Rekombinant antijen (rk39) Escherichia coli den klonlanan 39 aminoasitten oluşur. Bu 39 aminoasit, L.major un kinesin proteininin C terminalindedir. rk39 hızlı tanı testi yapılan birçok çalışmanın sonucunda hem visseral leyişmanyoz hem de kala azar sonrası deri leyişmanyozunun tanısında yüksek oranda duyarlı ve özgül bulunmuştur 20. rk39 hızlı tanı testi insan serumunda L.donovani ye karşı oluşan antikorların kalitatif tanımlanması için geliştirilmiş bir immunokromatografik testtir. Striplerin zarı test bölgesinde rekombinant VL antijeni ile kontrol bölgesinde ise tavuk anti-protein A ile kaplıdır. Eğer serumda antikor varsa zar üzerindeki rk39 antijeni ile reaksiyon gerçekleşir ve test bölgesinde kırmızı bir çizgi oluşması pozitif sonuçtur, test bölgesinde bu çizginin yokluğu negatif sonuçtur. VL antijenine karşı antikor olmadığı zaman kırmızı çizgi tavuk anti-protein A nın bulunduğu kontrol bölgesinde oluşmaktadır; bu çizginin varlığı da örneğin yeterli ve ayıraçların doğru olduğunu kanıtlamaya hizmet etmektedir 20. 2.5.5.3 Moleküler Tanı Leishmania türlerinin yapısal olarak ayırt edilmesi mümkün olmadığından patojenik türlerin sınıflandırılması için monoklonal antikorlarla izoenzim elektroforezi veya minisörkıl DNA probları gibi türe özgü problarla hibridizasyon gibi çeşitli biyokimyasal, immunolojik ve moleküler yöntemler geliştirilmiştir 21. Polimeraz zincir reaksiyonu teknolojisinin ilerlemesiyle tür tayini amacıyla pek çok PCR a dayalı yöntem geliştirilmiştir. Amplifikasyon için ya nükleer DNA (SSU rrna gen bölgesi, internal transcribed spacer gen bölgesi-its-, gp63 gen bölgesi, tubulin gen, mikrosatellit DNA) veya ekstrakromozomal DNA (minisörkıl kinetoplast DNA) bölgeleri hedef bölgeler olarak belirlenmiştir 21. Leishmania türlerini tiplendirmek için kullanılan metotlar multiplex PCR, rastgele amplifiye polimorfik DNA (RAPD), single-strand konformasyon polimorfizmi, restriksiyon fragment length polmorfizmi (RFLP) ve DNA dizi analizidir. DNA ya 22
dayalı bu genotipik moleküler teknikler diğer tanı yöntemlerine kıyasla daha güvenilir ve özgüldür 5,6,7. 2.5.5.3.1 Polimeraz Zincir Reaksiyonu Polimeraz zincir reaksiyonu; dizisi bilinen iki bölge arasında uzanan bir DNA parçasını çoğaltmak için genomik DNA ya ait primerlerin kullanıldığı yapay bir tepkimedir. Bu tepkime DNA polimeraz tarafından katalizlenir ve sonunda genomik DNA konsantrasyonu moleküler yöntemlerle görüntülenebilir düzeye çıkartılır 22. Amplifikasyon için önce DNA iki oligonükleotit (primer) ve dört deoksinükleotit trifosfatın (dntp) varlığında 95 o C ye kadar ısıtılarak denatüre edilir. Daha sonra 55-65 o C arasında bir ısıya düşürülerek özgül primerlerin komplementer dizilerine yapışması (annealing) sağlanır. Son olarak 72 o C de DNA polimeraz aktivitesi gösteren ve yüksek ısıdan etkilenmeyen Taq polimeraz enzimi ortamda bulunan dntp ların 5-3 yönünde eklenmesiyle zincirin uzamasını sağlar. Denatürasyon, annealing ve DNA sentezi döngüsü defalarca tekrarlanır. Amplifikasyonun bir döngüsünün ürünleri sonraki döngü için kalıp olduğundan dolayı her bir döngü ile DNA iki katına çıkmakta ve üssel olarak artmaktadır 22,23. 2.5.5.3.2 Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi Restriksiyon enzimleri çift iplikçikli DNA da özgül bölgelerden kesim yapan ve DNA dan bir gen bölgesinin veya gen taşıyan bir DNA segmentinin çıkartılmasında rol alan enzimlerdir 21. Restriksiyon enzimlerinin büyük DNA moleküllerini özgün parçacıklara ayırması bu parçacıkların ana moleküle nazaran daha net bir şekilde görüntülenmesini sağlar, çünkü değişik uzunluktaki DNA parçacıkları aralarındaki ufak uzunluk farklılıkları nedeniyle jel ektroforezinde farklı yerlere göç etmektedir. Jel elektroforezi için yüksek çözünürlüğe sahip agaroz jeller tercih edilmektedir. Ethidium bromid sayesinde jelde oluşan DNA bantları görüntülenebilmekte, bu bantların yeri ve sayısına göre gen haritaları kullanılarak tür tayini yapılabilmektedir 21,22. 23
2.5.6 Tedavi Leyişmanyoz tedavisinin başarılı olarak sonuçlanması uygun ilaç seçimi ile mümkündür. İlaçların seçimi esnasında birçok faktör göz önüne alınmalıdır. Tedaviyi etkileyen faktörlerin en önemlilerinden biri olan Leishmania nın türü, ilaç seçiminde de önemli bir rol oynar. İnsanda infeksiyon etkeni olabilen 15 den fazla Leishmania türünün ilaçlara gösterdiği duyarlılığın farklı olması, Leishmania türlerinin biyokimyasal ve moleküler özelliklerinin farklı olmasından kaynaklanmaktadır. İn vitro çalışmalarda L.donovani ve L.brasiliensis in sodyum stiboglukonat tedavisine L.major, L.tropica ve L.mexicana dan 3-5 kat daha duyarlı olduğu gösterilmiştir 24,25. Visseral leyişmanyoz, deri leyişmanyozu, mukokutanöz leyişmanyoz ve yaygın deri leyişmanyozu olarak dört farklı klinik tabloya neden leyişmanyozun tedavisinde halen en yaygın kullanılan ilaç grubu pentavalan antimon bileşikleridir 26. Pentamidin antimonlara dirençli visseral leyişmanyoz olgularının tedavisinde kullanılmaktadır, ancak dirençli olgularda pentamidinlerin de başarı oranı %75 dir 27. Paromomisin (aminosidin) visseral leişmanyozda günde bir defa IM yolla kullanılan aminoglikozid grubu antibiyotiktir. Antimon direncinin yüksek olduğu Hindistan da ilk seçenek ilaç olarak tek başına kullanılmaktadır, ancak bu antibiyotiğin de ciddi ototoksik ve nefrotoksik yan etkileri vardır 27. Tedavide allopurinolün antimonlarla kombine kullanımının tedavi etkinliğini değiştirmediği, fakat antimona dirençli olgularda allopurinol-pentamidin kombinasyonunun tek başına pentamidin uygulamasından daha iyi yanıt verdiği randomize kontrollü çalışmalarla gösterilmiştir 27. Antifungal bir ajan olan amfoterisin B güçlü bir leishmaniasid ilaçtır. Antimonlara karşı gelişen ilaç direnci ve bu olgularda pentamidinin de etkisiz kalması, amfoterisinin popularitesini arttırmıştır. Hindistan da bu tür olgularda amfoterisin B dezoksilat ile %98 oranında başarı elde edilmiştir 24. Son zamanlarda, visseral leyişmanyoz tedavisinde amfoterisin B nin özellikle yağlı formüllerinin kullanımı gündeme gelmiştir. Bu grup ilaçlar, lipid ilişkili amfoterisin B (lipid kompleks, kolesterol dispersiyon, lipozomal amfoterisin B gibi) ya da yağ emülsiyonu içindeki amfoterisin B şeklinde olabilir. Bu yağlı formüllerin ilacın etkinliğini arttırdığı ve konvansiyonel amfoterisin B nin toksisitesini sınırladığı kanıtlanmıştır 26,27. 24
Alkilfosfokolinler serisinden bir ilaç olan miltefosin başlangıçta antineoplastik bir ilaç olarak geliştirilmiştir ancak visseral leyişmanyozda oral olarak etkili olduğu çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir. Miltefosinin antileishmania etkisi sadece sitotoksik etki ile değil ayrıca hücresel bağışıklık mekanizmalarının aktivasyonuyla da ilişkili olduğu gösterilmiştir 24,28. Visseral leyişmanyoz tedavisinde ketokonazol, itrakonazol, flukonazol, terbinafin ve metronidazol gibi farklı oral ilaçlar tek başına ve kombine olarak denenmiş fakat hiçbiri umut verici olmamıştır. Bir 8-aminokinolin türevi olan sitamakin ile ilgili yaklaşık 8 yıldır süren araştırmalar halen ilacın etkisi ve toksisitesi ile ilgili yeterli bilgi vermemektedir 27. İnterferon gama bir makrofaj uyarıcıdır, farelerle yapılan çalışmalarda antimonlarla sinerjistik aktivitesi olduğu görülmüştür, ancak insan visseral leyişmanyoz olgularında tek başına interferon gama etkisi sınırlıdır. Bazı ağır olgularda kombine interferon tedavisinin antimonlara yanıtı hızlandırdığı bildirilmektedir 24,27. Tedavide direnç gelişimi, parenteral kullanım zorluğu gibi nedenler yeni ilaç araştırmalarını gerektirmektedir (Çizelge 3) 26. Çizelge 3. Araştırma ve gelişim dönemindeki antileishmania ilaçları 26 Geç keşif fazı Faz1/Faz2 Faz3 Faz4 Bifosfanatlar (risedronat ve Sitamakin Paromomisin Miltefosin pamidronat)(vl ve KL) (VL) (VL) (VL) Likokalkon A deriveleri (VL ve KL) Topikal paromomisin (KL) Miltefosin (KL) Propilkinolinler Azoller: posokonazol (KL) Antimonlarla kombine topikal imikuimod (KL) Azoller: itrakonazol, ketokonazol,flukonazol 2.6 Leishmania Türlerinin PCR-RFLP ile Tanımlanması Leishmania populasyon genetiği çalışmalarında, tür tayininde ve suş ayırımında kullanılan polimorfik DNA sekansları PCR a dayalı yöntemlerle amplifiye edilmektedir. Tür tayini tedavinin ve kontrol yöntemlerinin planlanması kadar doğru tanı ve hastalığın prognozunun takibi açısından da çok önemlidir 29. 25