Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 8 El Kitabında tanımlanan Nitel PCR ın Özellikleri M. Querci, M. Mazzara WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR E UROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Nitel PCR ın Özellikleri 2 İçindekiler Bölüm 8 El Kitabında tanımlanan Nitel PCR ın Özellikleri El kitabında tanımlanan Nitel PCR sistemlerinin özellikleri 3 Bitki spesifik PCR 3 Lektin geninin saptanması 3 Zein geninin saptanması 3 Tarama yöntemi : CaMV 35S promotör ve nos terminatörün saptanması 4 CaMV 35S promotörün saptanması 4 nos terminatörün saptanması 5 GDO spesifik PCR 7 Roundup Ready soya CTP/EPSPS gen kasetinin spesifik saptanması 7 Bt-176 mısır cryia(b) sentetik geninin saptanması 7 MON810 mısır E35S promotör/hsp70 ekson-intron bölgesininin spesifik saptanması 9 Kaynaklar 11
Nitel PCR ın Özellikleri 3 El Kitabında tanımlanan Nitel PCR sistemlerinin özellikleri Kurs süresince birden fazla saptama sistemi kullanılacaktır: 1) Bitki spesifik primerler ile örneklerden ekstrakte edilen DNA nın varlığını ve kalitesini (amplifiye olabilirliğini) doğrulamak amacı ile kullanılan yöntem; 2) En yaygın kullanılan düzenleyici sekanslardan 35S promotör ve nos terminatör ün spesifik olarak saptanmasına dayanan, tarama yöntemi olarak adlandırılan yöntem. Bu iki yöntem için basit bir PCR protokolü izlenecektir. Son olarak, GDO-spesifik primerler kullanılarak farklı transgenik hatların selektif saptanması ve tanımlanması için nested PCR gerçekleştirilecektir. Bu bölüm Roundup Ready soya, MON810 mısır ve CryIA(b) geni içeren Bt-176 mısırın saptanması ve tanımlanması için kullanılan farklı sistemlere genel bir giriş niteliğindedir. Primer dizilimi ve kompozisyonu üzerine daha fazla bilgi için Bölüm 9 a bakınız. Bitki spesifik PCR Lektin geninin saptanması Soya DNA sının tanımlanabilmesi için soyaya özgü lektin geninin (Le1) bir parçasını tanımlayan GMO3 ve GMO4 primerleri (Meyer ve ark., 1996) kullanılacaktır. Yukarıda açıklandığı gibi, bu yöntemin amacı, soya içeren örneklerden ekstrakte edilmiş DNA nın varlığını ve kalitesini doğrulamaktır. Burada DNA kalitesi olarak aranan vasıf, istenen PCR ile amplifiye olabilme (çoğaltılabilme) özelliğidir. GMO3 ve GMO4 primerleri, işlenmiş gıdalardan DNA ekstraksiyonu üzerine Meyer ve Jaccaud (1997) tarafından rapor edilmiş bir çalışmada tanımlanmış olup, nested PCR için kullanılmaktadır. Beklenen ürün, 118 bp büyüklüğünde bir amplikondur. Bu amplikonun varlığı, analiz edilen örnekte soya bulunduğunu doğrular. Zein geninin saptanması Mısır zein (10 kb lik bir protein kodlayan Ze1,) genine spesifik ZEIN3 ve ZEIN4 primerleri, (Studer ve ark., 1997) mısır içeren örneklerden ekstrakte edilmiş DNA nın varlığı ve kalitesini doğrulamak için kullanılacaktır. ZEIN3 ve ZEIN4 primerleri işlenmiş gıdalardan ekstrakte edilen mısır DNA sının saptanması için bir nested PCR sisteminde internal primerler olarak tasarlanmıştır. Eğer ekstrakte edilen hedef DNA zarar görmemişse ve amplifiye olabiliyorsa, beklenen ürün 277 bp büyüklüğünde bir
Nitel PCR ın Özellikleri 4 amplikondur. Bu amplikonun varlığı, analiz edilen örnekte mısır bulunduğunu doğrular. Tarama yöntemi : CaMV 35S promotör ve nos terminatörün saptanması Bitki kaynaklı gıda maddelerinde, herhangi bir genetik modifiye girdinin tanımlanması, tarama yöntemi olarak adlandırılan bir yaklaşımla analiz edilen örnekte 35S promotör ve/veya nos terminatörün varlığının PCR ile saptanması yoluyla olur. Bugüne dek AB onayı almış genetik modifiye gıdaların hemen hepsinde bulunduğu için 35S promotör ve nos terminatörün hedef dizilimler olarak kullanımı, birçok genetik modifiye gıdanın saptanmasını sağlamaktadır (Hemmer, 1997). AB pazarında kabul görmüş bazı mısır hatlarının karakteristik özellikleri Tablo 1 de örnek olarak listelenmiştir. Kurs sırasında kullanılan 35S promotör ve nos terminatör spesifik primerleri, işlenmiş gıdada Roundup Ready soya ve Maximizer mısır (Bt- 176) ın saptanması için geliştirilen bir PCR yönteminin geçerliliğini denetlemek için de kullanılmıştır (Lipp ve ark., 2001). Tablo 1. AB pazarına resmi olarak giriş yapan transgenik mısırlar Ad Şirket Karakter Promotör Genler Terminatör Vaka 176 Ciba-Geigy Bt, bar 35 S PEPC CDPK bar cryia(b)/int.9 PEPC cryia(b)/int. 9 PEPC 35S 35S 35S Hat Bt-11 Novartis Bt, pat 35S cryia(b)/int.ivs6 nos Hat T25 AgrEvo pat 35S pat 35S Hat MON810 Monsanto Bt E35S E35S cryia(b)/int. hsp70 cryia(b)/int. hsp 70 - - CaMV 35S promotör saptanması Bu promotör Roundup Ready soya ve Bt-176 mısır gibi birçok transgenik bitkinin gen ekspresyonunu düzenler. Spesifik saptama için p35s-cf3 ve p35s-cr4 primerleri kullanılacaktır. Bu primerlerin CaMV 35S promotör diziliminin ilgili bölgesine
Nitel PCR ın Özellikleri 5 yerleştirildiği Şekil 1 de açıklandığı üzere, beklenen amplifikasyon ürünü 123 bp lik bir sekanstır. ID A18053_3; parent: A18053 AC A18053; FT promoter 396..1779 FT /note="35s3 promoter sequence derived from cauliflower FT mosaic virus isolate CabbB-JI" SQ Sequence 1384 BP; nnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn nnnnnnnnn 1140 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 1200 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga catctccact gacgtaaggg 1260 p35s-cf3 atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc 1320 p35s-cr4 atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctat aaatctatct ctctctctat 1380 aacc 1384 // Şekil 1. Cauliflower Mosaic virüsü (CaMV) 35S promotör dizi parçası ve p35s-cf3 ve p35s-cr4 primerlerinin hibridizasyon bölgesi. nos terminatör saptanması HA-nos118-f ve HA-nos118-r primerleri (Lipp ve ark., 2001) nos terminatörünün saptanması için kullanılmaktadır. Nos terminatörü Roundup Ready soya ve diğer transgenik bitkilerde (örn. Bt-11) bulunur. Nos terminatörün amplifikasyonu sonucunda 118 bp lik bir DNA sekansı ortaya çıkar. Şekil 2 de Ha-nos118-f ve HAnos118-r primerleri Roundup Ready soya transgenik bölgesinin dizilimi üzerinde gösterilmiştir.
Nitel PCR ın Özellikleri 6 HA-nos118-r > 151 nnnnnnnnnn nnnnnnnnga tccccgatct agtaacatag atgacaccgc 201 gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt < HA-nos118-f 251 attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat 301 aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag 351 aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga / / 1601 gatccaggtg tcgccttcct tacggatcct ggcgcccatg gcctgcatgg 1651 ccttgcccgt attgatgacg tcctcgcctt ccagaaggcc ggtgatgcgc GM09 > 1701 gtttcaccgc tcgcgagacc gccgaacatg aaggaccggt gggagatcga 1751 cttgtcgccg ggaatgcgga cggttccgga aaggccagag gatttgcggg 1801 cggttgcggg ccggctgctt gcaccgtgaa gcatgcaggc tgtagccact 1851 gatgctgaaa tcctaaagga acaaaacttt tgcataaaaa ttgaatcttt 1901 tttcaaaacc aacatagaat ttgctgaatt tttcagtttt ttagatccaa GM08 > 1951 aaacaagaaa acttgaagat ttaggaactt ggggtttatg gaaattggaa 2001 ttgggattaa gggtttgtat cccttgagcc atgttgttaa tttgtgccat p35s-cr4 > 2051 tcttgaaaga tctgctagag tcagcttgtc agcgtgtcct ctccaaatga < GM07 2101 aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg < GM05 < p35s-cf3 2151 tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg 2201 aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg 2251 ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt 2301 tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc ttttccacta 2351 tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt 2401 ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca catcg Şekil 2. Patent WO 92/04449 a göre Monsanto dan alınan Roundup Ready soya transgenik bölgesinin dizilimi
Nitel PCR ın Özellikleri 7 GDO spesifik PCR Roundup Ready soya, Bt-176 mısır ve MON810 mısır tanımlanması için kullanılan amplifikasyon primerleri, sırasıyla Roundup Ready soya, Bt-176 ve MON810 mısır genomlarına eklenen genetik yapıyı özgün bir biçimde tespit edebilme potansiyellerinden dolayı özellikle seçilmiştir. Roundup Ready soyanın CTP/EPSPS gen bölgesinin spesifik saptanması GMO9/GMO5 ve GMO8/GMO7 primerleri Roundup Ready soya transgenik bölgesinin nested PCR yöntemiyle spesifik olarak saptanması için düzenlenmiştir (Meyer ve Jaccaud, 1997). GMO9 ve GMO5 eksternal primerleri, CP4 EPSPS geni ve CaMV 35S promotörü DNA dizilimlerinin tamamlayıcısıdırlar. DNA nin bu iki primer ile amplifiye olması, 447 bp büyüklüğünde bir amplikon ortaya çıkmasına neden olur. İnternal primerler olan GMO8 ve GMO7, EPSPS petunya geni ve CaMV 35S promotörünün tamamlayıcısıdır. Bu internal primerler ile amplifiye olan DNA Şekil 2 de görüldüğü gibi 169 bp büyüklüğünde bir dizi parçası verir. Bt-176 mısırın cryia(b) sentetik geninin saptanması CRYIA1/CRYIA2 ve CRYIA3/CRYIA4 primer çiftleri sentetik cryia(b) geninin nested PCR yöntemiyle spesifik olarak saptanması için düzenlenmiştir (Studer ve ark.,1997). CRYIA1 ve CRYIA2 eksternal primerleri ve CRYIA3 ve CRYIA4 internal primerleri cryia(b) geninin DNA dizilimine tamamlayıcıdır. Şekil 3 te gösterildiği gibi, internal primerler CRYIA3/CRYIA4 189 bp lik bir amplikon ortaya çıkarırken iki eksternal primer (CRYIA1/CRYIA2) 420 bp lik bir dizi parçasını kapsar.
Nitel PCR ın Özellikleri 8 ID I41419 standard; DNA; UNC; 1947 BP. AC I41419; DE Sequence 3 from patent US 5625136. RA Koziel M.G., Desai N.M., Lewis K.S., Kramer V.C., Warren G.W., Evola S.V., RA Crossland L.D., Wright M.S., Merlin E.J., Launis K.L., Rothstein S.J., RA Bowman C.G., Dawson J.L., Dunder E.M., Pace G.M., Suttie J.L.; RT "Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in maize"; RL Patent number US5625136-A/3, 29-APR-1997. FT source 1..1947 FT /db_xref="taxon:12908" FT /organism="unclassified" SQ Sequence 1947 BP; 412 A; 729 C; 528 G; 278 T; 0 other; atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60 gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120 agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180 gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240 gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300 gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360 cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420 ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480 tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540 cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600 ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660 cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720 ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780 agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840 cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900 aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960 atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020 CRYIA1 forward primer outer PCR atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080 accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140 CRYIA3 forward primer inner (nested) PCR agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200 taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260 CRYIA4 reverse primer inner (nested) PCR
Nitel PCR ın Özellikleri 9 ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320 agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380 gagttcaaca acatcatccc cagcagccaa atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440 CRYIA2 reverse primer outer PCR aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500 cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560 cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620 atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680 ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740 agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800 cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860 cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920 accgactacc acatcgatca ggtgtag Şekil 3. Bt-176 mısıra eklenen optimize cryla(b) geni: US Patent no 5625136 ve Genbankası Erişim no 141419 a göre (SEQ ID no.3) cryla(b) geninin dizilimi MON810 mısırın E35S promotör/hsp70exon-intron bölgesininin spesifik saptanması mg1/mg2 ve mg3/mg4 primer çiftleri E35S/hsp70exon-intron bölgesininin nested PCR ile spesifik olarak saptanması için geliştirilmiştir (Zimmermann ve ark., 1998). Bu gen bölgesi MON810 mısıra spesifiktir. Internal primerler mg3 ve mg4 sırasıyla E35S promotör ve hsp70 exon 1 bölgesinin DNA diziliminin tamamlayıcısıyken, mg1 ve mg2 external primerleri sırasıyla E35S promotör diziliminin ve hsp70 intron 1 bölgesinin tamamlayıcılarıdır. Şekil 4 de gösterildiği gibi iki eksternal primer (mg1/mg2) 401 bp büyüklüğünde bir amplikon üretirken mg3 ve mg4, 149 bp büyüklüğünde bir amplikon üretir.
Nitel PCR ın Özellikleri 10 hsp70 exon 1 hsp70 intron Plant DNA P-E35S hsp70 intron 1 401 bp hsp70 exon 2 mg1 149 bp mg2 mg3 mg4 Şekil 4. Geliştirilmiş CaMV 35S promotörü, mısır hsp70 intronu ve sırasıyla mg1, mg2, mg3 ve mg4 primerlerinin göreceli konumlarını da içerecek biçimde MON810 mısır gen kasetinden bir bölgenin şematik gösterilmesi (Zimmermann ve ark., 1998)
Nitel PCR ın Özellikleri 11 Kaynaklar Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and Detection Methods. Biosafety Research and Assessment of Technology Impacts of the Swiss Priority Program Biotechnology Report 2/97, 61 pages. http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (accessed January 2010) Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504. Meyer, R., Chardonnens, F., Hubner, P. and Luthy, J. (1996). Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of soya in processed meat products. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und - Forschung A 203, 339-344. Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in processed food products: development and validation of a PCR assay for the specific detection of Glyphosate-Tolerant Soybeans. Proceedings of the EURO FOOD CHEM IX Conference, Interlaken, Switzerland, Event No. 220 1, 23 28. Studer, E., Dahinden, I., Lüthy, J. and Hübner, P. (1997). Nachweis des gentechnisch veränderten Maximizer"-Mais mittels der Polymerase- Kettenreaktion (PCR). Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und Hygiene 88, 515 524. Zimmermann, A., Liniger, M., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). A sensitive detection method for genetically modified MaisGard TM corn using a nested-pcr system. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 31, 664-667.