SSO Yöntemiyle HLA Tiplendirmesi. Gürbüz POLAT

Transkript

1 SSO Yöntemiyle HLA Tiplendirmesi Gürbüz POLAT

2 SSO Diziye özgü oligonükleotid problarıyla PCR da çoğaltılmış DNA nın hibridizasyonu ile HLA allellerini saptamak için kullanılan moleküler tipleme yöntemidir. Belirli bir HLA lokusunun özgüllüğü ikinci eksonun korunmuş bölgesindeki bir diziye özgü PCR primerleri seçilerek sağlanır. SSO tipleme için birçok alternatif yöntemler bulunuyor. Aralarındaki temel farklılıklar uzunluk, oligonükleotid probların DNA dizisi, raportör molekül ve saptama yöntemidir.

3 HLA serolojik özgüllüklerinin uyumlaştırılması, antikorlar tarafından algılanabilir epitopları kodlayan polimorfik sekansların tespitini gerektirir. Bu paylaşılan diziler, aynı serolojik tanımlı özgüllük gruplarına ait allel ailelerini belirler. Bu tipleme düzeyi sıklıkla düşük çözünürlük veya jenerik SSO olarak adlandırılır. Alternatif olarak, yüksek çözünürlükte SSO tipleme tüm bilinen alleleri ayırt edebilir. Yüksek çözünürlüklü SSO genellikle ilişkili bir allel grubunun seçici olarak çoğaltılmasını gerektirir.

4 Prob seçimi ve sentezi Oligonükleotidler hedef dizileri tamamlamalı ve hedef diziyle yakın ilişkideki diziyi ayırt eden hibridizasyon koşullarında kullanıma izin veren uzunlukta (~18 nükleotid) olmalıdır. Bir nükleotidin faklı olduğu dizilerde uyumsuz baz oligonükleotid probun ortasında yer almalıdır. Sıkı yıkama bu konumda tek baz uyumsuzluklarını daha fazla uzaklaştırır.

5 Oligonükleotid prob hibridizasyonu

6 Oligonükleotid dizisi yaklaşık %50 G+C (olasıysa) ve kendine yapışan tamamlayıcı dizi içermemelidir. Örneğin, AAAAATGCCGCTATTTTT dizisi iyi bir seçim değildir. Oligonükleotidler DNA nın iki zincirine tamamlayıcı olabilir. Çoğu kişi kodlama zincirine (literatürde yayınlanan dizisi) identik oligonükleotidler sentezler, bu yüzden HLA allel dizilerinde daha kolay bulurlar.

7 Probların işaretlenmesi Problar genellikle ucu-işaretli, kuyrukludur veya modifiye nükleotid içerir. İşaretleme nonradyoaktif ya da radyoaktif (P32) olabilir. Problar boncuklara bağlanmış ise, boncuk fluoresanla etiketli olabilir.

8 Probların DNA örneklerine hibridizasyonu Çoğaltılan DNA solid bir destek materyaline bağlanır, denatüre edilir ve işaretli SSOP ye hibridize edilir. Destek materyali bir membran, plastik plak veya boncuk olabilir. Prob hibridizasyonu

9 Hibridizasyon koşulları ve nonspesifik olarak bağlı probları uzaklaştırmak için yapılan yıkama hibridizasyon özgüllüğünün kontrolünde önemlidir.

10 Bu tekniklerden birinde çok sayıda bireyden alınan DNA örnekleri tek bir membrana uygulanır ve tek bir probla hibridize edilir. Her inceleme her prob için ayrı bir membran gerektirir. Alternatif olarak, problar bir destek materyaline bağlanır (24 kuyulu bir plak gibi) ve işaretli, denatüre, çoğaltılmış DNA hibridize edilir (reverse dot blot). Destek materyali bir membran, plastik plak veya boncuk olabilir.

11 SSO Bileşenleri

12 Destek materyaline göre yöntemler 1. Nitrosellüloz membran stripleri (Reli SSO Dynal Biotech; INNOLiPA line probe assay, Innogenetics). 2. Mikrotest plakları (enzyme-linked probe hybridization assay [ELPHA], Biotest). 3. Oligonükleotid-bağlanmış polistiren mikrosfer boncuklar (Luminex xmap technology, Luminex Corp; LIFEMATCH, Tepnel Lifecodes; LABType SSO, One Lambda Inc.).

13 Nitrosellüloz membran stripleri 1. PCR Amplifikasyonu 2. Prob Hibridizasyonu 3. Stripte Saptama 4. Sonuçların Yorumlanması

14 Reverse dot blot SSO tekniği mükemmel şekilde çok sayıda örneği analiz etmek için uygun olmasına rağmen, bireyler veya küçük sayıda örnekleri analiz etmek için uygun değildir. Alternatif revers dot blotlama tekniği aynı amplifikasyon prosedürü ve SSO problarını kullanır, fakat prob paneli solid bir desteğe bağlıdır ve amplifiye örnek işaretlenir ve o desteğe hibridize edilir. Tek bir hibridizasyon ve sıkıca yıkama, seçilen örnekte bulunan dizi polimorfizmlerinin tespitini sağlar. Reverse dot blotun çeşitli varyasyonları vardır.

15 Reverse dot blot

16 Reverse dot blot varyasyonları 1 Poli-T kuyruğu kullanımı Bu yöntem, oligonükleotidin bağlanma etkinliğini artırarak ve bağları oluşturan spesifik bağlanma dizilerini koruyarak, zara oligonükleotid takmak için poli-t kuyrukları kullanır. Hareketsizleştirilmiş prob dizisi amplifikasyon işlemi sırasında biyotinlenmiş primerlern dahil olduğu PCR ürünü ile hibridize olur. Streptavidin yabanturpu peroksidaz konjugatı eklenir ve renkli solübl bir substrat kullanılarak pozitif reaksiyon saptanır. Alternatif olarak, pozitif sinyal kemiluminesanla görüntülenmektedir.

17 Reverse dot blot varyasyonları 2 Capture (Yakalayıcı) prob kullanımı Başka bir yöntemde, oligonükleotidler pasif absorbsiyonla bir mikro-titrasyon plağına kaplanmakta ve yakalayıcı probu olarak kullanılmaktadır Yaban turbu peroksidazına kovalent olarak bağlı iki sabit oligonükleotid saptama probu olarak kullanılır. Denatüre çoğaltılmış DNA örneğiyle bağlı yakalayıcı probların hibridizasyonu ve DNA ya saptama problarının sabitlemesi tek adımda gerçekleştirilir.

18 Reverse dot blot varyasyonları 1 Üçüncü bir yöntem, 96-kuyulu plakta gerçekleştirilir. İncelenmesi gereken DNA, avidin kaplı plağa doğrudan PCR ürünü eklemeyi mümkün kılmak için biyotinile edilmiş 3 primeri ile yapılan normal bir PCR la çoğaltılır. Sentetik oligonükleotidler 5 ucunda bir amino grubuyla üretilmekte ve alkalen fosfatazla konjuge edilmektedir. ALP-işaretli probların bağlanması, ALP nin sekonder siklik bir enzim reaksiyonunu başlatması ve kat daha büyük bir duyarlılıkla sonuçlanan bir ürün üretmesi sayesinde, kolorimetrik bir ölçümle ile saptanabilir.

19 Oligonükleotid-bağlanmış polistiren mikrosfer boncuklarla SSO (Luminex Teknolojisi) Bir süspansiyondaki 100 kadar benzersiz boncuğun eş zamanlı saptamasının yapıldığı bir uygulamadır. İki farklı lazerle tespit Farklı benzersiz boncuk seti ayrımını sağlayan kırmızı lazer Bir flöresan raportör molekülü ölçmek için kullanılan yeşil lazer

20 Luminex İki flöresan boya kullanılmaktadır: kırmızı ve kızılötesi. Organik çözücüler içinde belirli oranlarda karıştırılır. Boncuklar şişecek ve boncukların içine doğru renk difüzyonu mümkün olacaktır.

21 Luminex Özgül bir prob benzersiz boncuk setiyle eşleştirilir ve farklı boncuk setlerinin karışımı yapılır: boncuk karışımı Bead 101 Probe #1 Bead 101 Probe #1 Probe #2 Probe #2 Bead 102 Bead 102 Probe #3 Probe #3 Bead 103 Bead 103

22 Luminex PCR sırasında biyotinle işaretli amplikon boncuk karışımıyla karıştırılır ve bu da hibridizasyon sırasında tamamlayıcı bir proba bağlanır.

23 Luminex Örnek cihaz tarafından alınır ve lazerlerden geçirilir.

24 Prosedür 1. Kan Örneği a) Genomik DNA izolasyonu b)her PCR için ng gerekli 2. Genomik DNA PCR a) Farklı primerlerle PCR b) 40 PCR döngüsü 3. Hibridizasyon 4. Okuma 5. Yorumlama

25 Sonuçların değerlendirilmesi Sonuçların değerlendirilmesi için ek bir yazılım gerekli Luminex veritabanından veri alımı (MFI) Test tipi ve lot numarasını tanımlama Yorumlamayı başlatma

26 Sonuçların Yorumlanması Her örnek için konsensüs prob değerleri minimum median floresan yoğunluğunu (MFI) aşmalıdır. Minimum eşikleri lota özgüdür. Her bir prob için, kitlerle birlikte verilen eşik değerleri ile normalize değer karşılaştırılır. Yazılım bu görevi otomatik olarak yapar. Normalize değerlerin hesaplanması: MFI (prob) MFI (kontrol körü veya probu) MFI (konsensüs) MFI (kontrol körü veya konsensüs)

27 Sorunlar Kalitesiz ya da yetersiz DNA. Örnek kontaminasyonu Reaktiflerin homojenliğinin olmaması Pipetleme hataları Taq polimerazın kalitesizliği PCR program hataları Kalitesiz sarf malzemeleri

28