INFLUENCE OF REACTION OPTIMIZATION ON THE RESULTS OF PCR AMPLIFICATION OF PANTON-VALENTINE LEUKOCIDIN GENES AMONG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATES

Özgün Çalışma/Original Article Mikrobiyol Bul 2009; 43: 519-528 STAPHYLOCOCCUS AUREUS İZOLATLARINDA PANTON-VALENTIN LÖKOSİDİN GENLERİNİN POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU İLE AMPLİFİKASYON SONUÇLARI ÜZERİNE REAKSİYON KOŞULLARININ ETKİSİ* INFLUENCE OF REACTION OPTIMIZATION ON THE RESULTS OF PCR AMPLIFICATION OF PANTON-VALENTINE LEUKOCIDIN GENES AMONG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATES Zeynep Ceren KARAHAN 1, İştar DOLAPÇI 1, Alper TEKELİ 1 1 Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara. (ckarahan@medicine.ankara.edu.tr) ÖZET Panton-Valentin lökosidini (PVL), Staphylococcus aureus un önemli bir virülans faktörüdür. PVL pozitifliğini saptamada, PVL yi kodlayan gen bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifikasyonu en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu çalışmada, iki farklı primer seti ve her set için farklı bağlanma sıcaklıkları kullanılarak, primer seçiminin ve termal döngü koşullarının PCR ile PVL gen amplifikasyon sonuçları üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, çeşitli klinik örneklerden izole edilen toplam 321 adet S.aureus suşu (%84.4 ü metisiline dirençli; %76.9 u hastane kökenli) dahil edilmiştir. Suşların PVL gen amplifikasyonları için iki farklı primer seti ile ikişer farklı bağlanma sıcaklığı uygulanmıştır. Bu amaçla, luk-s PV ve luk-f PV genlerini içeren 433 bç lik bölgeyi çoğaltmak için luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ve amplifikasyon için 55 C ve 58 C lik sıcaklıklar kullanılırken; aynı genleri kapsayan 1918 bç lik bölgeyi çoğaltmak için PVLup ve PVLdn primerleri ve amplifikasyon için 50 C ve 48 C lik bağlanma sıcaklıkları uygulanmıştır. Çalışmamızda, luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile S.aureus izolatlarının %50.2 (161/321) sinde 55 C de amplikon elde edilirken, 58 C de sadece %1.6 (5/321) sında amplikon elde edilmiştir. PVL pozitif amplikonların, hatalı amplifiye edilen PCR ürünlerinden ayrımını yapabilmek amacıyla, restriksiyon endonükleaz analizi yapılmış ve luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile 58 C de elde edilen beş amplikonun da, BspH1 enzimi ile PVL pozitif amplikonlarda beklenildiği şekilde kesildiği görülmüştür. PVLup ve PVLdn primerleri ile yapılan deneylerde ise 321 S.aureus izolatının hiçbiri (pozitif kontrol suşu hariç) 50 C de amplikon vermemiş, sıcaklık 48 C ye indirildiğinde beş (%1.6) klinik izolatta PVL pozitifliği saptanmıştır. Bu izolatların da luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile 58 C de PVL pozitif bulunan suşlar ile aynı olduğu izlenmiştir. Bu veriler, çalıştığımız izolatlardaki gerçek PVL gen pozitifliğinin %1.6 (5/321) olduğunu gös- * Bu çalışma Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Müdürlüğü tarafından desteklenmiştir (Proje no: 20050809006HPD). Geliş Tarihi: 10.11.2008 Kabul Ediliş Tarihi: 13.03.2009

Staphylococcus aureus İzolatlarında Panton-Valentin Lökosidin Genlerinin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Amplifikasyon Sonuçları Üzerine Reaksiyon Koşullarının Etkisi termiştir. Bulgularımız, uygun olmayan döngü koşullarının, PVL gen amplifikasyonunda yalancı negatif ya da yalancı pozitif değerlendirmelere yol açabileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, PVL araştırmalarında, çalışma sonuçlarını yorumlamadan önce, farklı primerler ve farklı bağlanma derecelerinin kullanılması uygun görünmektedir. Her çalışmada pozitif ve negatif kontrol suşlarının kullanılması ve çalışma protokolünün sadece literatür bilgilerine dayanarak değil, aynı zamanda laboratuvar deneyimleri ile optimizasyonu, güvenilir verilerin elde edilmesinde kritik önem taşımaktadır. Anahtar sözcükler: Staphylococcus aureus, Panton-Valentin lökosidini, polimeraz zincir reaksiyonu. ABSTRACT Panton-Valentine leukocidin (PVL) is an important virulence determinant of Staphylococcus aureus. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the genes encoding PVL is the most widely used method for determining PVL-positivity. In this study, we used two different primer sets and different annealing temperatures for each set to investigate the effect of optimization of PCR parameters on the amplification results. A total of 321 S.aureus clinical isolates (84.4% methicillin-resistant S.aureus, 76.9% nosocomial) were included to the study. Two different primer sets and two different annealing temperatures were applied for the amplification of PVL gene. For this purpose while luk-pv-1 and luk-pv-2 primers and 55 C and 58 C annealing temperatures were used to amplify the 433 bp region inhabiting the luk- S PV and luk-f PV genes, PVLup and PVLdn primers and 50 C and 48 C annealing temperatures were used to amplify the 1918 bp region inhabiting the same genes. luk-pv-1 and luk-pv-2 primers yielded amplicons at 55 C in 50.2% (161/321) and at 58 C in 1.6% (5/321) of the isolates. To discriminate the positive amplicons from the crossly amplified PCR products, restriction endonuclease analysis was performed and it was observed that the five amplicons generated by luk-pv-1 and luk-pv-2 primers at 58 C were cut by BspH1 enzyme as expected for the positive amplicons. None of the isolates yielded amplicons by PVLup and PVLdn primers at 50 C, however, only 1.6% of the isolates yielded amplicons at 48 C. These isolates were the same with the ones that were PVL positive with luk-pv-1 and luk-pv-2 primers at 58 C. These data revealed that only 1.6% of the study isolates were PVL positive. These results showed that inappropriate cycling conditions may lead to false-negative or false-positive results in PVL-gene amplification. Restriction endonuclease or sequence analysis may be used to differentiate crossly-amplified sequences from PVL-positive amplicons. We suggest using different primers and different annealing temperatures in PVL gene amplification before concluding on the study results. Using positive and negative control strains in each run and optimization of the study protocol not only according to the literature data but also due view to the laboratory experience seems critical for obtaining reliable data. Key words: Staphylococcus aureus, Panton-Valentine leukocidin, polymerase chain reaction. GİRİŞ Panton-Valentin lökosidini (PVL), Staphylococcus aureus suşları için önemli bir virülans belirleyicisidir. PVL, diğer lökosidinler ve γ-hemolizinlerle birlikte, yeni tanımlanmış bir aile olan sinergohimenotropik toksinler ailesine aittir. Bu toksinler, S (slow eluted) ve F (fast eluted) olarak gösterilen ve birbirileri ile ilişkili olmayan iki grup salgısal proteinin sinerjik etkisi sonucu, konak savunma hücrelerinin (örn. lökositler, makrofajlar) ve eritrositlerin membranlarında porlar oluşturarak bu hücreleri parçalamaktadırlar. S.aureus klinik izolatlarının neredeyse tamamı γ-hemolizin salgılamakla birlikte, PVL üretimi izolatların sadece %5 inden azında gösterilmiştir 1,2. PVL nin sitolitik aktivitesi, yan yana duran ve birlikte transkribe edilen iki ayrı gen tarafından kodlanan LukS-PV (sınıf S protein) ve LukF-PV (sınıf F protein) proteinlerine bağlanmaktadır 1-5. PVL için özgül olan bu prote- 520

Karahan ZC, Dolapçı İ, Tekeli A. inler, sırasıyla 32 ve 38 kda büyüklüğünde olup, luks-pv ve LukF-PV genleri tarafından kodlanmaktadır. Bu genler iki ayrı açık okuma bölgesi içerir ve sırasıyla 939 ve 978 nükleotid büyüklüğündedir. Bunlar birbirinden tek bir timin nükleotidi ile ayrılırlar ve tek bir mrna molekülü olarak transkribe olurlar 2. Bu genler, PVL negatif S.aureus suşlarını PVL üreticilerine dönüştüren çeşitli ılımlı bakteriyofajlar üzerinde taşınmaktadır 3,6,7. PVL üreten S.aureus suşları sıklıkla primer deri ve yumuşak doku enfeksiyonları ve toplumdan kazanılan nekrotizan pnömoni ile ilişkilidirler; ancak bütün sistemlerde enfeksiyon oluşturabilirler 1,8-20. PVL üretiminin saptanmasında en yaygın olarak kullanılan yöntem, PVL kodlayan genlerin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilmesidir. Bu çalışmada, iki farklı primer seti ve her set için farklı bağlanma sıcaklıkları kullanarak, primer seçimi ve döngü koşullarının PCR ile PVL gen amplifikasyon sonuçları üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. GEREÇ ve YÖNTEM S.aureus Suşları PVL gen varlığının araştırılması için, çeşitli klinik örneklerden (yara, balgam, endotrakeal aspirat, dren, kan, steril vücut sıvıları, beyin omurilik sıvısı, kateter) izole edilen, toplam 321 adet S.aureus suşu kullanıldı. Suşların 74 (%23.1) ü toplumdan kazanılmış, 247 (%76.9) si ise hastane kökenliydi. Tanımlama, standart mikrobiyolojik yöntemlerle (koloni ve mikroskopik morfoloji, katalaz reaksiyonu ve tavşan plazması ile koagülaz testi) yapıldı. Toplumdan kazanılmış izolatların 64 (%86.5) ü ile hastane kökenli izolatların 207 (%83.8) sinin metisiline dirençli S.aureus (MRSA) olduğu belirlendi. Metisilin direnci sefoksitin disk difüzyon yöntemi ile saptandı ve meca geninin PCR amplifikasyonu ile doğrulandı. DNA Ekstraksiyonu Genomik DNA daha önce tarif edilen şekliyle standart fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi ile elde edildi 21. Ekstrakte edilen DNA örnekleri çalışılıncaya kadar -20 C de saklandı. PVL Genlerinin Amplifikasyonu S.aureus suşlarının PVL gen amplifikasyonları için iki farklı primer seti seçildi ve farklı bağlanma sıcaklıkları uygulandı. luk-pv-1 (5 ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A3 ) ve luk-pv-2 primerleri (5 GCA TCA AST GTA TTG GAT AGC AAA AGC 3 ) ile yapılan PCR amplifikasyonu, luk-s PV ve luk-f PV genlerini içeren 433 bç lik bölgeyi çoğaltmak için literatürde belirtilen şekilde gerçekleştirildi 1. Amplifikasyon için iki ayrı bağlanma sıcaklığı (55 C ve 58 C) kullanıldı (Resim 1). luk-s PV ve luk-f PV genlerini kapsayan 1918 bç lik bölgenin amplifikasyonu, PVLup (5 AAG ACT ATT AGC TGC AAC ATT GTC3 ) ve PVLdn (5 AAT CTA TCT GTT TAG CTC ATA GGA3 ) primerleri kullanılarak, daha önce tarif edilen şekliyle yapıldı 22. 50 C ve 48 C olmak üzere iki farklı bağlanma sıcaklığı uygulandı. Özgül olmayan primer bağlanmasını artıracağı için daha düşük bağlanma sıcaklıklarında çalışılmadı (Resim 2). PCR amplifikasyonlarında GRE14 suşu PVL-pozitif kontrol olarak kullanıldı 20. 521

Staphylococcus aureus İzolatlarında Panton-Valentin Lökosidin Genlerinin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Amplifikasyon Sonuçları Üzerine Reaksiyon Koşullarının Etkisi PK NK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 433 bç 1A M PK NK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 433 bç Resim 1. luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile 55 C (1A) ve 58 C (1B) bağlanma sıcaklıklarında elde edilen PCR amplikonları. M: Moleküler ağırlık belirteci (O Range Ruler 50 bp ladder, Fermentas, Litvanya), PK: PVL-pozitif kontrol (GRE-14), NK: DNA içermeyen negatif kontrol. Aynı numaralar her iki jelde de aynı suşlara karşılık gelmektedir. Sekans Analizi 1B Çoğaltılan bölgenin DNA dizisini belirlemek için, luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile elde edilen daha kısa (yaklaşık 350 bç) iki amplikon, yine luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri kullanılarak, ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, ABD) cihazında çift yönlü otomatize DNA sekans analizine tabi tutuldu. Restriksiyon Endonükleaz Analizi PVL pozitif amplikonların hatalı amplifiye edilen PCR ürünlerinden ayrımını yapmak amacıyla, sekanslanan bölgenin ve PVL amplikonunun kesim alanları internette bulunan WebCutter Programı (http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) kullanılarak analiz edildi. Farklı amplikonlarda farklı kesim bölgelerine sahip uygun enzimler arasından, laboratuvarımızda halihazırda bulunması nedeniyle, BspH1 (T/CATGA, New England Biolabs, İngiltere) restriksiyon endonükleazı seçildi. luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile 55 C de saptanan bütün PVL pozitif amplikonlar (161 izolat), BspH1 ile restriksiyon endonükleaz analizine ta- 522

Karahan ZC, Dolapçı İ, Tekeli A. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 NK PK 1918 bç 2A M PK NK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1918 bç 2B Resim 2. PVLup ve PVLdn primerleri ile 50 C (2A) ve 48 C (2B) bağlanma sıcaklıklarında elde edilen PCR amplikonları. M: Moleküler ağırlık belirteci (2A. Mass Ruler DNA Ladder Mix, Fermentas, Litvanya; 2B. O Range Ruler 50 bp ladder, Fermentas, Litvanya), PK: PVL-pozitif kontrol (GRE-14), NK: DNA içermeyen negatif kontrol. Aynı numaralar her iki jelde de aynı suşlara karşılık gelmektedir. bi tutuldu. PVL pozitif PCR ürünleri (433 bç) 151. ve 331. nükleotidler hizasında iki kesim bölgesi taşır ve kesim işlemi sonucunda 180, 151 ve 102 bç lik üç fragman elde edilmektedir. Primerlerin hatalı bağlanması sonucunda ortaya çıkan amplikonlar (347 bç) BspH1 ile herhangi bir kesim bölgesi içermemektedir (Resim 3). BULGULAR Toplam 321 S.aureus izolatının 161 (%50.2) i, luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile 55 C de, çoğunluğu pozitif kontrolden biraz daha kısa olmakla beraber, amplikon vermiştir. Bu 161 suşun 128 (%79.5) i hastane kökenli olup, 109 u MRSA, 19 u metisiline duyarlı S.aureus (MSSA) tur. PVL-pozitif bulunan 33 (%44.6) toplumdan kazanılmış S. aureus suşunun ise 26 sı MRSA, 7 si MSSA dır. Bu primerlerle 58 C de sadece 5 suşta 523

Staphylococcus aureus İzolatlarında Panton-Valentin Lökosidin Genlerinin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Amplifikasyon Sonuçları Üzerine Reaksiyon Koşullarının Etkisi U 1 2 3 4 5 6 7 8 PK M Resim 3. Gerçek PVL-pozitif amplikonlar ile luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerlerinin hatalı bağlanmasına bağlı oluşan yalancı pozitif amplikonların BspH1 enzimi ile elde edilen kesim paternleri. U: Kesilmemiş PCR ürünü, 1-3: Kesilmeyen 347 bç lik PCR ürünleri (primerlerin hatalı bağlanmasına bağlı elde edilen yalancı pozitif amplikonlar), 4-8: BspH1 ile kesim sonrasında elde edilen 102, 151 ve 180 bç lik PCR ürünleri (gerçek PVL pozitif suşlar), PK: BspH1 ile kesilmiş PVL-pozitif kontrol suşu (GRE-14). (%1.6) pozitif sonuç alınmıştır. Bunların 1 i hastane kökenli MRSA, diğer 4 ü toplumdan kazanılmış MRSA suşlarıdır. Pozitif kontrol suşu hariç 321 S.aureus izolatının hiçbiri, 50 C de PVLup ve PVLdn primerleri ile amplikon vermemiştir. Bağlanma sıcaklığı 48 C ye indirildiğinde, 5 (%1.6) klinik izolatta PVL pozitifliği saptanmıştır. Bu 5 izolat, luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleriyle 58 C de PVL pozitif bulunan suşlar ile aynıdır. luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile elde edilen amplikonların çift yönlü DNA dizi analizi, amplifiye edilen bölgenin beklenen PVL gen bölgesine (GenBank Accession Number: AB256039) karşılık gelmediğini göstermiştir. Hatalı amplifiye edilen gen dizisi 347 nükleotid uzunluğunda olup, luk-pv-1 primerinin son 18 bazı ile başladığı, luk-pv-2 primerinin ilk 16 bazı ile bittiği tespit edilmiştir. Bu bölgede yer alan 313 nükleotid, amplifiye edilmesi beklenen PVL gen bölgesindekilerden tamamıyla farklı bulunmuştur (Tablo I). Bu 347 bç lik DNA dizisinin karşılık geldiği gen bölgesi BLAST programı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) ile araştırılmıştır. Bu bölgenin %95 inin, S.aureus un hücre duvarı ile ilişkili fibronectin-binding protein (Acc. No: gb CP000046.1 ), conserved hypothetical protein (Acc. No: gb CP000253.1 ve dbj AP009351.1 ), ve hücre yüzey proteini (Acc. No: gb CP000255.1 ) gibi bazı korunmuş proteinlerini kodlayan gen bölgeleri ile %99 oranında benzerlik gösterdiği bulunmuştur. luk-pv-1 ve luk-pv-2 primerleri ile elde edilen 161 amplikonun 5 (%1.6) i BspH1 enzimi ile PVL pozitif amplikonlarda beklendiği gibi kesilmiştir. Bu 5 amplikon, aynı primer çifti ile 58 C de çalışıldığında bant veren izolatlara aittir. Kesim bölgesi taşımayan korunmuş bölgelere ait amplikonlar kesilmeden kalmıştır. 524

Karahan ZC, Dolapçı İ, Tekeli A. Tablo I. luk-pv-1 ve luk-pv-2 Primerleri ile Çoğaltılan PVL Gen Bölgesinin (GenBank Acc.No. AB256039), Aynı Primerler ile Hatalı Çoğaltılan Gen Bölgesi (HGB) nin ve Korunmuş Gen Bölgesi (KGB) nin (GenBank Acc.No. dbj AP009351.1 ) Dizileri* KGB gga cat gct cca cat caa aat atg atc ttt HGB a atg tct gga cat gat cca cat caa aat atg atc ttt PVL a tca tta ggt aaa atg tct gga cat gat cca aat tta ttt gtt gga tat KGB tgg ttt gca tta cca gca gac caa gtg cca gta gga aga act gac ttt gta HGB tgg ttt gca tta cca gca gac caa gtg cca gta gga aga act gac ttt gta PVL aaa cca tat agt caa aat ccg aga gac tat ttt gtg cca gac aat gaa tta KGB aca gtt aat tca gat gga aca aat gta caa tgg agt cat gga gca gga gca HGB aca gtt aat tca gat gga aca aat gta caa tgg agt cat gga gca gga gca PVL ccc cca tta gta cac agt ggt ttc aat cct tca ttt att gca act gtt tct_ KGB ggt gca aat aaa cca ctt caa caa atg tgg gaa tat gga gta aat gat cct HGB ggt gca aat aaa cca ctt caa caa atg tgg gaa tat gga gta aat gat cct PVL cat gaa aaa ggc tca gga gat aca agt gaa ttt gaa ata acg tat ggc aga KGB cat cgt tca cat gac ttt aaa ata aga aat aga agt ggc caa gta ata tat HGB cat cgt tca cat gac ttt aaa ata aga aat aga agt ggc caa gta ata tat PVL aat atg gat gtt act cat gct act aga aga aca aca cac tat ggc aat agt KGB gac tgg cca act gtc cat att tat tct tta gaa gat tta tct aga gcg agt HGB gac tgg cca act gtc cat att tat tct tta gaa gat tta tct aga gcg agt PVL tat tta gaa gga tct aga ata cac aac gca ttt gta aac aga aat tac aca KGB gat tat ttt agt gaa gct gga gcg aca cct gct act aaa HGB gat tat ttt agt gaa gct gga gcg aca cct gct act aaa PVL gtt aaa tat gaa gtg aac tgg aaa act_ cat gaa att aaa gtg aaa gga cat KGB HGB PVL aat tga t atg aaa aaa ata gtc aaa tca tca gtt gtt aca tca att gca KGB g ctt ttg HGB g ctt ttg cta tcc aat PVL ttg ctt ttg cta tcc aat aca gtt gat gc * Primer dizileri koyu ile yazılarak belirtilmiş ve diziler arasındaki tek nükleotid değişikliklerinin altı çizilmiştir. BspH1 restriksiyon endonükleazı ile tanımlanan dizilerin altı çizilmiş ve kesim bölgeleri ok işareti ile belirtilmiştir. Boş kutuların herhangi bir anlamı yoktur. 525

Staphylococcus aureus İzolatlarında Panton-Valentin Lökosidin Genlerinin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Amplifikasyon Sonuçları Üzerine Reaksiyon Koşullarının Etkisi TARTIŞMA PVL, özellikle direkt invazyon ve doku hasarı yoluyla hastalık oluşturan S.aureus suşlarının önemli bir virülans faktörüdür 1. Enfeksiyon yerine bağlı olmaksızın PVL pozitifliği, enfeksiyonun ciddiyeti ve komplikasyon risklerini artırmaktadır 23. PVL taşıyan suşlar, hastane ortamında kolaylıkla yayılıp, salgınlara yol açabilmekle birlikte 9,24-26, PVL taşıyıcılığı, toplumdan izole edilen suşlarda, hastane kaynaklı olanlara göre daha yaygın bulunmaktadır 8,24,27,28. S.aureus suşlarının PVL üretimi, çoğunlukla luks-pv ve luk-f-pv genlerinin PCR ile amplikasyonu yoluyla ortaya konulmaktadır. Çalışmaların çoğunda, Lina ve arkadaşları 1 tarafından tasarlanan primerler kullanılmıştır 1,9,11,12,16,18,19,24,29-34. Bu çalışmalarda PVL üretiminin görülme sıklığı %0.4 ile %94.1 arasında değişen oranlarda bulunmuştur 29,32. En yüksek oranlar, California da acil servis hastalarının deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarından elde edilen izolatlarda (%94.1) ve Cezayir de toplum (%86) ve hastane kaynaklı (%67.5) MRSA suşlarında gösterilmiştir 30,32. Cape Verde adalarında hastane kaynaklı MSSA izolatlarında PVL pozitifliği %35 oranında saptanmıştır 27. Yunanistan dan yapılan bir çalışmada ise, aynı primerler kullanılarak 498 MRSA izolatının %45 inin PVL geni taşıdığı gösterilmiştir 9. Bu yüksek oranlar, bizim 55 C bağlanma sıcaklığı kullandığımızda elde ettiğimiz sıklıkla (%50.2) benzerlik göstermektedir. Bağlanma derecesinin 58 C ye çıkarılması, değerlendirdiğimiz izolatlarda PVL pozitifliği sıklığında belirgin azalmaya (%1.6) yol açmıştır. Bu bulgu, bu primerler ile, özellikle düşük bağlanma sıcaklıkları kullanıldığında hatalı bağlanmalara bağlı olarak, yanlış pozitif sonuçların alınabileceğini göstermektedir. Hatalı bağlanma sonucu elde edilen amplikonlar beklenen amplikonlardan yaklaşık 100 bç kadar daha kısa olduğundan, bu amplikonların ayrımının yapılmasında elektroforezin uzun sürelerde gerçekleştirilmesi (100V da en az bir saat) yardımcı olabilir. Ayrıca amplifiye edilen gen bölgesinin doğruluğundan emin olmak için, elde edilen PCR amplikonlarının DNA dizi analizi ya da restriksiyon endonükleaz analizi ile değerlendirilmesi yapılabilir. PVL yi kodlayan genlerin diğer lökosidinleri kodlayan genlerle yüksek oranda homoloji gösterdikleri bilinmektedir 35, ancak bildiğimiz kadarıyla bu çalışma, bahsi geçen primerlerin başka korunmuş gen bölgelerine de hatalı bağlanabileceğini gösteren ilk çalışmadır. Çalışmamızda kullanılan diğer primer seti (PVLup ve PVLdn) daha önce Hisata ve arkadaşları 22 tarafından kullanılmıştır. Bu araştırıcıların gösterdiği kaynak 36 incelendiğinde ise, primer dizisi ve döngü koşullarının belirtilmediği görülmüştür. Bu çalışmada primerlerin bağlanma sıcaklıkları hesaplanarak, 50 C ve 48 C lik bağlanma sıcaklıkları kullanılmıştır. Her iki sıcaklık derecesinde de pozitif kontrol suşu (GRE14) amplikon vermiş, ancak klinik örneklerden izole edilen S.aureus suşlarında PVL pozitifliği sadece 48 C de saptanmıştır. Bu yöntem ile PVL pozitif bulduğumuz beş izolat, Lina ve arkadaşlarının 1 kullandığı primerler ile 58 C de çalıştığımızda PVL pozitif bulduğumuz suşlar ile aynıdır. Hisata ve arkadaşları 22 çalışmalarında 231 S.aureus suşu kullanmışlar ve bir tanesini PVL pozitif olarak bulmuşlardır. Aynı primerler Kuehnert ve arkadaşlarının 28 çalışmasında da kullanılmış ve 372 S.aureus izolatının dokuz (%2.4) u PVL pozitif olarak saptanmıştır. Bizim sonuçlarımız, bu primerlerin yüksek bağlanma sıcaklıklarında PVL pozitifliğini saptamada yalancı negatif sonuçlara yol açabildiğini göstermektedir. 526

Karahan ZC, Dolapçı İ, Tekeli A. Sonuç olarak; S.aureus izolatları arasında PVL pozitifliğini araştıran laboratuvarların çalışma protokollerini sadece literatürde verilen bilgilere dayanarak değil, kendi çalıştıkları laboratuvarların deneyimlerini de dikkate alarak özenle yeniden düzenlemeleri gerektiğini düşünmekteyiz. Çalışma protokollerinin oluşturulmasında aynı gen bölgesini hedefleyen farklı primer setlerinin kullanılması da, sonuçların doğrulanmasında iyi bir seçenek olabilir. Farklı çalışmalarda elde edilen sonuçları karşılaştırırken de, primer seçimi ya da termal döngü koşullarından kaynaklanan yalancı pozitif ve yalancı negatif sonuçların olabileceği akılda tutulmalıdır. KAYNAKLAR 1. Lina G, Piémont Y, Godail-Gamot F, et al. Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin Infect Dis 1999; 29: 1128-32. 2. Johnsson D, Mölling P, Strålin K, Söderquist B. Detection of Panton-Valentine leukocidin gene in Staphylococcus aureus by LightCycler PCR: clinical and epidemiological aspects. Clin Microbiol Infect 2004; 10: 884-9. 3. Narita S, Kaneko J, Chiba J, et al. Phage conversion of Panton-Valentine leukocidin in Staphylococcus aureus: molecular analysis of a PVL-converting phage, ΦSLT. Gene 2001; 268: 195-206. 4. Prévost G, Cribier B, Couppié P, et al. Panton-Valentine leukocidin and gamma-hemolysin from Staphylococcus aureus ATCC 49775 are encoded by distinct genetic loci and have different biological activities. Infect Immun 1995; 63: 4121-9. 5. Prévost G, Mourey L, Colin DA, Menestrina G. Staphylococcal pore-forming toxins. Curr Top Microbiol Immunol 2001; 257: 53-83. 6. Kaneko J, Kimura T, Kawakami Y, Tomita T, Kamio Y. Panton-Valentine leukocidin genes in a phage-like particle isolated from mitomycin C-treated Staphylococcus aureus V8 (ATCC49775). Biosci Biotechnol Biochem 1997; 61: 1960-2. 7. Kaneko J, Kimura T, Narita S, Tomita T, Kamio Y. Complete nucleotide sequence and molecular characterization of the temperate staphylococcal bacteriophage ΦPVL carrying Panton-Valentine leukocidin genes. Gene 1998; 215: 57-67. 8. Naimi T, LeDell K, Como-Sabetti K, et al. Comparison of community acquired and health care-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. JAMA 2003; 290: 2976-84. 9. Chini V, Petinaki E, Foka A, Paratiras S, Dimitracopolos G, Spiliopoulou I. Spread of Staphylococcus aureus clinical isolates carrying Panton-Valentine leukocidin genes during a 3-year period in Greece. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 29-34. 10. Couppié P, Cribier B, Prévost G. Leukocidin from Staphylococcus aureus and cutaneous infections: en epidemiologic study. Arch Dermatol 1994; 130: 1208-9. 11. Dufour P, Gillet Y, Bes M, et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in France: emergence of a single clone that produces Panton-Valentine leukocidin. Clin Infect Dis 2002; 35: 819-24. 12. Gonzalez BE, Hulten KG, Dishop MK, et al. Pulmonary manifestations in children with invasive communityacquired Staphylococcus aureus infection. Clin Infect Dis 2005; 41: 583-90. 13. Holmes A, Ganner M, McGuane S, Pitt TL, Cookson BD, Kearns AM. Staphylococcus aureus isolates carrying Panton-Valentine leucocidin genes in England and Wales: frequency, characterization, and association with clinical disease. J Clin Microbiol 2005; 43: 2384-90. 14. Li GH, Zhang YY, Wang F, Chen YJ, Nord CE, Fang H. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin gene in Shanghai, China. Int J Infect Dis 2006; 10: 482-3. 15. Rossney A, Morgan P, O Connell B. Community-acquired PVL+ MRSA in Ireland: a preliminary report. Euro Surveill 2005; 10: E050421.1. 16. Seybold U, Kourbatova EV, Johnson JG, et al. Emergence of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA300 genotype as a major cause of health care-associated blood stream infections. Clin Infect Dis 2006; 42: 647-56. 527

Staphylococcus aureus İzolatlarında Panton-Valentin Lökosidin Genlerinin Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Amplifikasyon Sonuçları Üzerine Reaksiyon Koşullarının Etkisi 17. Vandenesch F, Naimi T, Enright MC, et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence. Emerg Infect Dis 2003; 9: 978-84. 18. Von Eiff C, Friedrich AW, Peters G, Becker K. Prevalence of genes encoding for members of the staphylococcal leukotoxin family among clinical isolates of Staphylococcus aureus. Diagn Microbiol Infect Dis 2004; 49: 157-62. 19. Witte W, Braulke C, Cuny C, et al. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with Panton-Valentine leukocidin genes in central Europe. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 1-5. 20. Aires de Sousa M, Bartzavali C, Spiliopoulou I, Santos Sanches I, Crisostomo MI, de Lencastre H. Two international methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones endemic in a university hospital in Patras, Greece. J Clin Microbiol 2003; 41: 2027-32. 21. Ida T, Okamoto R, Shimauchi C, Okubo T, Kuga A, Inoue M. Identification of aminoglycoside-modifying enzymes by susceptibility testing: epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Japan. J Clin Microbiol 2001; 39: 3115-21. 22. Hisata K, Kuwahara-Arai K, Yamanoto M, et al. Dissemination of methicillin-resistant staphylococci among healthy Japanese children. J Clin Microbiol 2005; 43: 3364-72. 23. Etienne J. Panton-Valentine leukocidin: a marker of severity for Staphylococcus aureus infection? Clin Infect Dis 2005; 41: 591-3. 24. Diep BA, Sensabaugh GF, Somboona NS, Carleton HA, Perdreau-Remington F. Widespread skin and softtissue infections due to two methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains harboring the genes for Panton-Valentine Leucocidin. J Clin Microbiol 2004; 42: 2080-4. 25. Linde H, Wagenlehner F, Strommenger B, et al. Healthcare-associated outbreaks and community-acquired infections due to MRSA carrying the Panton-Valentine leucocidin gene in southeastern Germany. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 419-22. 26. O Brien FG, Pearman JW, Gracey M, Riley TV, Grubb WB. Community strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus involved in a hospital outbreak. J Clin Microbiol 1999; 37: 2858-62. 27. Aires de SM, Conceiçao T, de Lencastre H. Unusually high prevalence of nosocomial Panton-Valentine leukocidin-positive Staphylococuus aureus isolates in Cape-Verde islands. J Clin Microbiol 2006; 44: 3790-3. 28. Kuehnert MJ, Kruszon-Moran D, Hill HA, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United States, 2001-2002. J Infect Dis 2006; 193: 172-9. 29. Ellington MJ, Hope R, Ganner M, et al. Is Panton-Valentine leucocidin associated with the pathogenesis of Staphylococcus aureus bacteraemia in the UK? J Antimicrob Chemother 2007; 60: 402-5. 30. Frazee BW, Lynn J, Charlebois ED, Lambert L, Lowery D, Perdreau-Remington F. High prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in emergency department skin and soft tissue infections. Ann Emerg Med 2005; 45: 311-20. 31. Johnsson D, Mölling P, Stralin K, et al. Detection of Panton-Valentine leukocidin gene in Staphylococcus aureus by using LightCycler PCR: clinical and epidemiological aspects. Clin Microbiol Infect 2004; 10: 884-9. 32. Ramdani-Bouguessa N, Bes M, Meugnier H, Söderquist B. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains resistant to multiple antibiotics and carrying the Panton-Valentine leukocidin genes in an Algeries hospital. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 1083-5. 33. Robert J, Etienne J, Bertrand X, on behalf of ONERBA (Observatoire National de l Epidemiologie de la Résistance Bactérienne aux Antibiotiques). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus producing Panton-Valentine leukocidin in a retrospective case series from 12 French hospital laboratories, 2000-2003. Clin Microbiol Infect 2005; 11: 585-7. 34. Wannet WJ, Spalburg E, Heck M, et al. Emergence of virulent methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains carrying Panton-Valentine leucocidin genes in the Netherlands. J Clin Microbiol 2005; 43: 3341-5. 35. Said-Salim B, Mathema B, Braughton K, et al. Differential distribution and expression of Panton-Valentine leukocidin among community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 2005; 43: 3373-9. 36. Okuma K, Iwakawa K, Turnidge JD, et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. J Clin Microbiol 2002; 40: 4289-94. 528