Differential Display. Özgür Çakır

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Differential Display. Özgür Çakır"

Engin Taşkıran
6 yıl önce
İzleme sayısı:

1 Differential Display Özgür Çakır

3 Differential gen anlatımı Gelişmeye bağlı gen anlatımı değişiklikleri Ortam uyaranları ile gen anlatımı değişimleri Doku veya hücreye özel gen anlatımları

4 Farklı anlatım yapan genlerin analizi tanımlama differential filter hybridization cdna subtraction differential display PCR (DD-PCR) serial analysis of gene expression (SAGE) Miktar belirleme Northern blotting reverse Northern blotting RNase protection competitive PCR quantitative PCR (Q-PCR) cdna (micro)array hybridization

5 Başlangıç için bir hedefe ihtiyaç yok Küçük farklılıklar yakalanabilir Substraksiyondan daha bilgi verici Laboratuvar işi uzun Klonlama gerekir Dizi tayini yapılmalı

6 Differential display Differential display, bir RT-PCR reaksiyonundan sonra oluşan farklı boydaki parçalrın karşılaştırılması temeline dayanır. PCR primerlerinden biri olası 16 nukleotid çifti tarafından takib edilen oligo(dt)dir. Diğer primer ise genellikle 6 bazlık oligolar veya onların karışımıdır. Bu karışım çok yüksek çözünürlüklü akrilamid jelde ayrılır, flouresan veya radyoaktif olarak görünür hale getirilir ve iki durum arasındaki fark izlenir. Hızlı bir metoddur. Ucuzdur, birçok gen izlenebilir Ekspresyon analizi yapmak için uygun bir yöntemdir Miktar belirlemek zordur Gen anlatımındaki küçük değişikler yakalanamaz Genler başlangıçta bilinen veya bilinmeyen genlere uygulanabilir Çok sayıdaki örnek uygun Artefkt sayısı çoktur

7 DD Çok ekstrem koşullar taranmamalı Her örnek için tekrarlar yapılmalı Çok sayıda örnek kullanılmalı Bilinmeyen veya bilinen genler için kullanılabilir

9 Differential Display-PCR mrna AAAAAAAAAA reverse transcription cdna AAAAAAAAAA TTTTTTTTTT PCR with dt-anchor primers and random decamers 80x GATGCATTAG control separate on polyacrylamide gel stimulated TTTTTTTTTT GTTTTTTTTTT 4x dow n- regulated upregulated

10 DD-PCR: mrna amplification mrna AAAAAAAAAA crna transcription using T7 RNA polymerase cdna reverse transcription AAAAAAA TTTTTTT T7 crna AAAAAAA TTTTTTT T7 T7 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 2nd strand synthesis reverse transcription ds cdna AAAAAAA TTTTTTT T7 T7 cdna TTTTTTT AAAAAAA DD-PCR

11 Differential Display Analysis Genhunter

12 Differential Display Analysis Genhunter mrna 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n

13 Differential Display Analysis Genhunter mrna 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n Reverse transcribe

14 Differential Display Analysis Genhunter mrna Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n Reverse transcribe

15 Differential Display Analysis Genhunter mrna Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n Reverse transcribe

16 Differential Display Analysis Genhunter mrna Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n Reverse transcribe 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n cdna(s)

17 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps

18 Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps

19 Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps

20 Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps X Y Z

21 Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps X Y Z Run on denaturing Polyacrylamide gel

22 Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps X Y Z Run on denaturing Polyacrylamide gel

24 Constant Induced Induced

25 Constant Induced Induced

26 Gel extract PCR amplify

27 Gel extract PCR amplify Ligate in vector, transform miniprep and sequence

28 Gel extract PCR amplify Ligate in vector, transform miniprep and sequence Spot sequences on arrays

29 Differential Display Analysis Genhunter Advantages -bu teknoloji çok basittir -ucuzdur

30 Differential Display Analysis Genhunter Dezavantajları -Miktar belirlenemez -Anlatımdaki küçük değişimler yakalanamaz

31 Differential Display Analysis Genhunter Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s)

32 Differential Display Analysis Genhunter Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s)

33 Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s)

34 Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) Restriction digest

35 Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) Restriction digest Ligate adapters

36 Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) Restriction digest Ligate adapters

37 Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) Restriction digest Ligate adapters

38 Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) XYZ Restriction digest Ligate adapters PCR Amplify

39 Differential Display Analysis Qbiogene Advantages -anlatım yapan bölgeden diziler elde edilir

40 Differential Display Analysis Qbiogene Dezavantajlar -bu teknoloji çok güvenilir değil.

43 Farklı yöntemlerin karşılaştırılması genome- sample sensitivity labor quantitaive wide size intensity diff. filter hybridization +/- - +/- + - cdna subtraction +/- - +/- + - DD-PCR SAGE ++ +/ Northern Rnase protection - + +/- + + comp. PCR rev. Northern - + +/- +/- + Q-PCR /- ++ cdna micro array ++ +/

45 Differential Display Proteomics Protein expresyon profili = global profilleme proteomics + proteomics differential display

46 Visualized by 2-DE + gel staining A B Excise spot; elute; digest Extract peptides; MS analyze Protein identification

47 Isotopik İşaretleme: differential display proteomics için bir başka yaklaşım

48 Digital differential display Genlerin bilgisayar ortamında karşılaştırılmasını sağlayan bir metod Ayrı cdna kitaplıklarının profilleri Özetle, farklı dokularda farklı anlatım yapan genler tanımlanır ve gösterilir İstatistik bir test yardımıyla

49 Digital Differential Display

Benzer belgeler

SADE ve SAGE ve Gen Ekspresyonunun Seri Analizi. Prof.Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

SADE ve SAGE ve Gen Ekspresyonunun Seri Analizi Prof.Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI Gen Anlatımının Belirlenmesi DNA mikroçalışmaları Makroçalışmaları EST (Expressed sequence tag) Gen anlatımının seri analizi