ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ FARKLI İRAN BAL ARISI (A. mellifera meda) POPULASYONLARINDA COI- COII MİTOKONDRİYEL DNA LOKUSLARI ARASINDA YER ALAN BÖLGEDEKİ GENETİK VARYASYONUN PCR- RFLP YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ Bahman FAKHRI Danışman: Doç. Dr. Mehmet Ali YILDIZ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI ANKARA 2008 Her hakkı saklıdır.
ÖZET Yüksek Lisans Tezi FARKLI İRAN BAL ARISI (A. mellifera meda) POPULASYONLARINDA COI-COII MİTOKONDRİYEL DNA LOKUSLARI ARASINDA YER ALAN BÖLGEDEKİ GENETİK VARYASYONUN PCR- RFLP YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ Bahman FAKHRI Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Zootekni Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Mehmet Ali YILDIZ Bu çalışmada, PCR-RFLP ve DNA dizi analizi yöntemlerinden yararlanılarak farklı İran bal arısı (Apis mellifera meda ) populasyonları arasındaki genetik varyasyonun mtdna COI-COII arasındaki bölge bakımından DraI ve HinfI enzimleri kullanılarak belirlenmesi amaçlanmıştır. İran ın 15 farklı yöresini temsil eden toplam 92 işçi arı örneği materyal olarak kullanılmıştır. Çalışılan örneklerin tamamında mitokondriyel DNA COI-COII arasındaki bölgenin DraI enzim kesimi sonucunda genetik varyasyon tespit edilmemiştir. Tüm örneklerde DraI enzim kesimi sonucunda 420, 64, 47 ve 41 bç lik tek bir bant modeli belirlenmiştir. Mitokondriyel DNA COI-COII arasındaki bölgenin HinfI enzimi kullanılarak kesilmesi sonucunda iki farklı haplotip elde edilmiştir. HinfI enzimi kullanılarak Karaj, Ardabil ve Hamadan örnekleri 292, 260 ve 26 bç lik bant modeli veren birinci tip haplotipi (COI- II/HinfI-C1) oluştururken, diğer tüm örnekler 292, 240, 26 ve 20 bç lik bant modeli veren ikinci tip haplotipi (COI-II/HinfI-C2) meydana getirmişlerdir. DraI enzim kesimi sonucunda İran bal arısı populasyonlarının mtdna C genetik soyu içerisinde değerlendirilebileceği ortaya konmuştur. HinfI enzimi kullanılarak Karaj, Ardabil ve Hamadan örneklerinin diğer populasyonlardan farklı bir haplotipe sahip olduğu belirlenmiştir. Elde edilen PCR-RFLP sonuçları yapılan DNA dizi analizi sonuçları ile de doğrulanmıştır. 2008, 53 Sayfa Anahtar Kelimeler: İran Bal Arısı (A. m. meda), mtdna, COI-COII, PCR-RFLP, DNA Dizi Analizi, Haplotip. i
ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF GENETIC VARIATION IN COI-COII INTERGENIC REGION OF MITOCHONDRIAL DNA IN DIFFERENT PERSIAN HONEYBEE (A. mellifera meda) POPULATIONS BY USING PCR-RFLP BAHMAN FAKHRI Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Animal Science Supervisor: Assoc. Prof. Dr. MEHMET ALI YILDIZ The objective of this study was the determination of genetic variation in COI-COII intergenic region of mtdna in different Persian honeybee (A. mellifera meda) populations by using PCR-RFLP and DNA sequencing methods and DraI and HinfI restriction enzymes. 92 worker honeybees collected from 15 different localities of Iran were used as material. DraI digestion of COI-COII intergenic region revealed 4 restriction fragment with 41, 47, 64 and 420 bp. in all samples and no genetic variation was detected among the samples. Restriction with HinfI revealed two different haplotypes. In 3 samples collected from Karaj, Ardabil and Hamendan HinfI digestion revealed 3 restriction fregment with 292, 260 and 26 bp. (COI-II/HinfI-C1) and the rest of samples revealed 4 restriction fregment with 292, 240, 26 and 20 bp. (COI-II/HinfI-C2). According to DraI restriction Persian honeybees (A. mellifea meda) was grouped as a member of C mtdna lineage. The result of HinfI restriction shows that the Karaj, Ardabil and Hamendan populations are only differenr haplotype (COI-II/HinfI-C1) from other populations. PCR-RFLP results were confirmed by DNA sequencing. 2008, 53 pages Key words: Persian honeybee (A. m. meda), mtdna, COI-COII, PCR-RFLP, DNA sequnce analysis, Haplotype. ii
TEŞEKÜR Bu tez çalışmasında bana araştırma olanağı sağlayan, çalışmalarım sırasında yakın ilgi ve önerileri ile beni yönlendiren, bilgileriyle yol gösteren ve yardımlarını esirgemeyen danışman hocam sayın Doç. Dr. Mehmet Ali YILDIZ a literatür konusunda temel kaynaklara ulaşma olanağı sağlayan sayın Doç. Dr. H. Vasfi GENÇER ve Uzman Dr. Fulya ÖZDİL e labaratuvar bilgi birikimini benimle paylaşan ve hiç bir zaman benim sorunlarımdan bıkmayan Araş. Gör. Hasan MEYDAN a, labaratuvar çalışmalarımda bana yardımcı olan yüksek lisans öğrencileri Yasemin GEDİK ve Ozan TAŞKESEN e tezin yazımı ve hazırlanmasında yardımlarını esirgemeyen doktora öğrencisi Amir OROJPOUR a teşekür ederim. Son olarak eğtimimin her aşamasına maddi ve manevi destekleriyle benim yanımda olan ve hiç bir zaman desteklerini esirgemeyen sevgili babam, annem ve kızkardeşime sonsuz teşekürlerimi sunarm. Bahman FAKHRI Ankara, Haziran 2008 iii
İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TAŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... vi ŞEKİLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ... 1 2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ÖZETLERİ... 4 2. 1 Mitokondri ve Mitokondriyel DNA (mtdna) Molekülü... 4 2. 2 Mitokondrinin Görevi... 7 2. 3 Bal Arısı Mitokondriyel DNA Molekülü... 8 2. 4 Genetik Çalışmalarında Varyasyon Belirleme Yöntemleri... 11 2. 4. 1 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)... 11 2. 4. 2 Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemi... 14 2. 5 Bal Arısının (Apis mellifera L) Sistematik Sınıflandırmadaki Konumu... 16 2.6 Kaynak Özetleri... 18 2.6.1 İran bal arısı (Apis mellifera meda)... 30 2.6.2 İran bal arısının morfolojik ve davranış özellikleri... 31 3. MATERYAL VE YÖNTEM... 34 3.1 Materyal... 34 3.1.1 Canlı materyal... 34 3.1.2 Araç ve gereç... 36 3.2 Yöntem... 38 3.2.1 Genomik DNA izolasyonu... 38 3.2.2 Mitokondriyal DNA Molekülünün Sitokrom C Oksidaz I ile II arasındaki intergenik bölgenin (COI-COII intergenik bölge) PCR yöntemi ile çoğaltılması... 39 3.2.3 Sitokrom C Oksidaz I ile II arasındaki intergenik bölgenin (COI-COII intergenik bölge) DraI ve HinfI restriksiyon enzimleri ile kesilmesi... 40 iv
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA... 41 4.1 Sitokrom C Oksidaz I ile II Arasındaki İntergenik Bölgenin (COI-COII İntergenik Bölge) PCR Çoğaltımı... 41 4.2 Sitokrom C Oksidaz I ile II Arasındaki İntergenik Bölgenin (COI-COII İntergenik Bölge) DraI Kesim Sonucu... 42 4.3 Sitokrom C Oksidaz I ile II Arasındaki İntergenik Bölgenin (COI-COII İntergenik Bölge) HinfI Kesim Sonucu... 43 4.4 Sitokrom C Oksidaz I ile II Arasındaki İntergenik Bölgenin (COI-COII İntergenik Bölge) Dizi Analizi Sonucu... 45 5. SONUÇ... 47 KAYNAKLAR... 49 ÖZGEÇMİŞ... 53 v
SİMGELER DİZİNİ A Adenin nükleotidi APS Amonyum persülfat ATP Adenozin trifosfat bç Baz çifti bdh 2 O Bidestile su C Sitozin nükleotidi COI Sitokrom C oksidaz I COII Sitokrom C oksidaz II Cyt b Sitokrom b geni dntp Deoksiribonükleid trifosfat EDTA Etilen diamin tetra asetik asit G Guanin nükleotidi lrrna Ribizomun büyük alt ünitesi µl Mikrolitre MgCl 2 Magnezyum klorür mtdna Mitokondriyell DNA M Mol NaCL Sodyum klorür ng Nanogram PCR Polimeraz zincir reaksiyonu RFLP Restiksiyon parça uzunluk polimorfizmi rpm Dakikadaki devir sayısı SDS Sodyum dodesil sülfat T Timin nükleotidi TBE Tris-borik asit-edta tampon çözeltisi TE Tris-EDTA tampon çozeltisi TEMED Tetra Etil Metilen Diamin vi
ŞEKİLER DİZİNİ Şekil 2.1 Hayvan hücresi (Russell 2005)... 4 Şekil 2.2 Mitokondrinin yapısı A: ( Griffiths et al. 2000), B: (Kılıç 2005)... 5 Şekil 2.3 Mitokondriyel DNA nın bölünmesi (Kılıç 2005).... 5 Şekil 2.4 Heteroplazmik yapı ve bunun döllere aktarılması... 6 Şekil 2.5 Nokta mutasyonları... 6 Şekil 2.6 Endosimbiotik teori. Kılıç (2005) dan değiştirilerek çizilmiştir... 7 Şekil 2.7 Apis mellifera nın mtdna genom haritası... 10 Şekil 2.8 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) döngüsü (Özdil 2007)... 12 Şekil 2.9 PCR döngüsü kullanılarak hedeflenen DNA bölgesinin üssel çoğaltımı... 13 Şekil 2.10 Restriksiyon enzimleri ile elde edilen yapışkan ve küt uçlu DNA parçacıkları... 15 Şekil 2.11 Genetik farklılıkların RFLP yöntemi kullanılarak belirlenmes(özdil 2007)... 15 Şekil 2.12 A. mellifera nın mtdna COI-COII bölgesinin gen sırası (Moritz 1994)... 19 Şekil 2.13 trna leu ve Q 2 arasındaki benzerlik (Moritz 1994)... 19 Şekil 2.14 A. mellifera mtdna genomunun restriksiyon haritası (Cornuet and Garnery 1991)... 20 Sekil 2.15 Üç coğrafi soydaki trna leu ve COII geni arasında yer alan P/P 0 ve Q tekrarlarının durumu... 21 Şekil 2.16 Substitüsyon (baz değişimi) nükleotitleri küçük haflerle gösterilen COI-COII mitotiplerinin P bölgesi... 25 Şekil 2.17 42 farklı COI-COII mitotiplerinin kesim haritaları... 26 Şekil 2.18 Tayland bal arılarında (A1 = ThaiA1, A2 = ThaiA2, ve B = ThaiB) COI-COII intergenik Bölgenin DraI ve HinfI enzim kesim sonucu ortaya çıkan bant modeleri... 29 Şekil 2.19 A. m. meda nın dağılımı (Ruttner 1988)... 31 Şekil 3.1 Bal arısı örneklerinin alındığı yöreler... 35 vii
Şekil 4.1 COI-COII intergenik bölgesinin % 4 lük agaroz jel elektroforezi ile elde edilen 578 bç. lik PCR ürünleri(1-18 örnekler).... 41 Şekil 4.2 COI-COII intergenik bölgesinin DraI enzimiyle kesim işleminden sonra % 10 luk poliakrilamid jellerinde elde edilen bant modelleri... 42 Şekil 4.3 COI-COII intergenik bölgesinin HinfI enzimiyle kesim işleminden sonra % 4 lük poliakrilamid jellerinde elde edilen haplotipler... 44 Şekil 4.4 Mitokondriyel DNA nın COI-COII intergenik bölgesinde yer alan 3380-3895 pozisyonunun nükleotid sırası... 46 viii
ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 A. mellifera genomunda bulunan genler, A+T içeriği, D. yakuba ile olan benzerliği ve her genin nükleotid sayısı (Moritz 1994). 9 Çizelge 2.2 Bal arılarının sistematik sınıflandırmadaki yeri... 16 Çizelge 2.3 Batı bal arısı ( A. mellifera L.) alttürleri ve yayılma alanları (Ruttner 1988).... 17 Çizelge 2.4 A. m. meda ve ligustica arasındaki farklılıklar (Ruttner et al.1985).... 32 Çizelge 3.1 Bal arısı örneklerinin alındığı yöreler ve örnek genişlikleri... 34 Çizelge3.2 Çalışmada kullanılan araç ve gereçlerin listesi... 36 Çizelge 3.3 Elektroforez ve metafor agaroz jellerin hazırlanmasında kullanılan stok ve tampon çözeltilerin bileşimleri... 37 Çizelge 3.4 Elektroforez ve poliakrilamid agaroz jellerin hazırlanmasında kullanılan stok ve tampon çözeltilerin bileşimleri... 37 Çizelge 3.5 PCR Reaksiyonu(Garnery et al. 1993)... 39 Çizelge 3.6 PCR şartları(garnery et al. 1993)... 40 ix
1. GİRİŞ Dünyada yetiştiriciliği yapılan bir çok ırkın çeşitli nedenlerden dolayı yok olma riski taşıdığı ve bu durumun dünya tarımsal üretimini yakın gelecekte olumsuz yönde etkileyebileceği tahmin edilmektedir. Anadolu nun ilk ve en eski tarımsal üretimin yapıldığı alanlardan biri olduğu düşünüldüğünde, bu coğrafyada da gen kaynakları bakımından kayıpların olduğu bilinmektedir. Bu süreç günümüzde de artan bir ivme ile devam etmekte, farklı türlerden çeşitli genotiplerde hızlı bir azalma meydana gelmektedir. Ekonomik verim seviyeleri tatmin edici seviyelerde olmamasına rağmen, yetiştirildikleri coğrafi bölgelere özgü koşullara son derece iyi uyum sağlamış olan yerli ırklar kimi hastalıklara karşı dirençli olmakta, en kötü çevre şartlarında bile herhangi bir ürün verebilmekte ve ayrıca üreme yeteneklerini en kötü koşullarda bile sürdürebilmektedirler. Yerli gen kaynaklarının taşıdıkları bu niteliklere ne zaman gereksinim duyulabileceğini şimdiden tahmin etmek güç olmakla beraber imkansız da değildir. Bu gen kaynaklarının varlıklarını sürdürebilmeleri için sahip oldukları üstün niteliklerinin ortaya çıkarılması ve bu özelliklerden yararlanılması ancak bu hayvanların güncel yöntemlerle tanımlanmasıyla mümkün olabilecektir (Ertuğrul vd 2000). Yerli gen kaynaklarının korunması ve ekonomik üretimlerinin sürdürülebilmesindeki ilk ve en önemli aşama bu ırkların genetik yapılarının çeşitli boyutlarda tanımlanmasıdır. Gen kaynaklarının korunması kapsamında koruma altına alınacak gen kaynaklarının tamamının süresiz olarak elde tutulmasındaki kimi zorluklar koruma altına almada öncelik verilecek ırkların genetik yapılarının ve ırklar arasındaki genetik ilişkilerin ortaya konulmasını zorunlu hale getirmektedir. Herhangi bir ırkın tanımlanmasında morfolojik özellikler, kan grupları ve biyokimyasal genetik polimorfizmleri gibi klasik yöntemlere ilave olarak, son yıllarda genomik (çekirdek DNA (ndna) ve mitokondriyel DNA (mtdna) yapıdaki farklılıkları doğrudan hedef alan güncel yöntemlerden de yaygın bir şekilde yararlanılmaya başlanmıştır. Hayvanlar aleminin en kalabalık sınıfı insecta nın bir üyesi olan bal arısı (Apis mellifera Linnaens) bugün kutuplar haricinde hemen her yerde yetiştirilen evcil bir hayvandır. Koloni halinde yaşarlar ve balmumu, arı sütü, polen propolis ve arı zehiri gibi kantitatif verimleri ile insan hizmetinde bulunurlar. Üretimi çok eskilere dayanan bal tarih 1
boyunca insan beslenmesi ve sağlığı açısından önemli bir besin kaynağı olmuştur. Bu değerli ürüne ek olarak arıcılık sektörü arı sütü ve polen gibi ürünlerin üretimi konusunda da önemli ilerlemeler kaydetmiş ve bu ürünleri de balla birlikte insan kullanımına sunmuştur. Yatırım ve işletme maliyetlerinin düşük olması, diğer tarım kollarına kıyasla daha az işgücü gerektirmesi, ürünlerinin değerli olması ve saklanabilmesi gibi nedenler bu sektörü üstün kılmaktadır. Ayrıca arıların tozlaştırma etkinliğinin çevreye ve bitkisel üretime sağladığı yararlar düşünülürse bu böceğin çok daha yararlı ve önemli olduğu anlaşılmaktadır. Bal arıları, bütün dünyada yaygın olarak yetiştirilmeleri nedeniyle doğadaki en önemli tozlayıcı böcek gruplarından birini oluştururlar (Fıratlı ve Gençer 1994). Bal arıları her zaman genetik çalışmaları için önemli bir materyal olarak görülmüştür. Yirminci yüzyılın başında, meyve sineği (Drosophila melanogaster) ni genetik çalışmalarda güçlü bir deney hayvanı olarak tanıtılıncaya kadar bal arıları genetik model sistemlerin içinde yer almıştır. Mendel 1800 lü yıllarda bal arılarını bir materyal olarak ele almış ancak yaptığı çalışmada kafesler içerisinde kontrollü çiftleştirme gerçekleştiremediği için bezelye üzerine kurulmuş teorisini doğrulayacak F 2 döllerini elde edememiştir. Bugün gelinen aşama, meyve sineği kullanılarak elde edilen detaylı moleküler genetik bilgilerin bal arısı genetiği çalışmalarına hızlı bir ilerleme sağlayacak şekilde aktarılmasıdır. Böylece, meyve sineği kullanılarak elde edilen detaylı bilgilerden yararlanılarak bal arıları üzerinde yürütülen moleküler genetik çalışmalar, temel genetik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına ve bal arılarına özgü genetik problemlerin üstesinden gelinmesi konusunda bilgi artışı sağlamaktadır (Moritz 1994). Esas olarak bal üretimi ve tozlaşmada kullanılan bir böcek olan bal arıları 4 farklı tür altında incelenmektedirler. Bu türler; a) batı bal arısı (Apis mellifera Linnnaeus, 1758), b) doğu bal arısı (Apis cerana Fabricius, 1793), c) dev arı (Apis dorsata Fabricius, 1793) ve d) cüce arı (Apis florea Fabricius, 1787) olarak sınıflandırılmıştır. Batı bal arısının dışındaki üç bal arısı türü Asya kıtasında bulunmaktadır. Türkiye de bulunan bal arıları, Batı bal arısı (Apis mellifera L.) türü içinde sınıflandırılmıştır. Batı bal arısı Afrika, Avrupa ve Yakın Doğu yu içine alan çok geniş bir coğrafyada yayılmış bulunmaktadır (Ruttner et al. 1978, Ruttner 1988). 2
Bu türlerden batı bal arısına ait alt türler orijinleri, genetik çeşitlilikleri, sürdürülebilir tarım kavramı çerçevesindeki tatmin edici üretim seviyeleri nedeniyle uzun zamandan beri ilgi görmektedir. Genetik çeşitliliğin yüksek olması bal arılarını herhangi bir ırka veya alttüre dahil etmede güçlükler oluşturmaktadır. Ekonomik ve kültürel önemlerinden dolayı, bal arılarını ırk/alttür seviyesinde değerlendirmek üzere sınıflandırılmasına büyük çaba sarf edilmektedir. Çeşitli markerler vasıtasıyla yapılan sistematik çalışmalar sonucunda batı bal arısı türü içerisinde değerlendirilebilecek yaklaşık olarak 26 alt türün var olduğu tespit edilmiştir (Ruttner et al. 1978, Ruttner 1988, Whitfield et al. 2006). Bal arısı populasyonlarının sınıflandırılmasında populasyonların orijinleri hakkında mevcut yerel kaynaklardan elde edilen morfolojik ve biyokimyasal farklılıklara dayalı bilgiler çoğu zaman yeterli olamamaktadır. Bu nedenle arı genetik kaynaklarının daha etkin kullanımı için alttür sınıflandırmalarının DNA seviyesinde geliştirilen yöntemlerle daha objektif bir sisteme dayandırılması kaçınılmaz bir zorunluluktur. DNA molekülü seviyesinde bal arısı genomunun detaylı bir şekilde çalışmasına Honeybee genom başlıklı bir proje ile 2003 yılında başlamıştır. Yürütülen projenin ilk yayınlanan araştırma sonuçlarına göre; bal arısı genomunun büyüklüğü ile nükleotid içeriğinin tahmin edilmesine, genomdaki genlerin fonksiyonları ile organizasyonlarına, kromozomların karyotip analizlerine, bal arısı türleri/alttürleri arasındaki filogenetik ilişkilerin belirlenmesine ve evrim sürecinde bal arısı ile diğer bazı türler arasındaki genomik benzerliklerin ortaya konulmasına yönelik detaylı veriler elde edilmiştir (Whitfield et al. 2006) Bu tez çalışmasında, farklı İran bal arısı (A. mellifera meda) populasyonlarında sitokrom C oksidaz I ile II arasındaki intergenik bölge (COI-COII intergenik bölge) mitokondriyel DNA lokusları arasında yer alan bölgedeki genetik varyasyonun DraI ve HinfI kesim enzimlerinden yararlanılarak PCR-RFLP yöntemi ile belirlenmesi amaçlanmıştır. 3
2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Mitokondri ve Mitokondriyel DNA (mtdna) Molekülü Mitokondri, tüm ökaryotik canlılarda bulunan bir organeldir (Şekil 2.1) Solak vd. (2000) bildirdiğine göre mitokondri organeli hakkındaki ilk bilgiler şu şekilde özetlenebilir. Mitokondri 1850 de Kolliker tarafından ilk defa görülmüştür. Ancak sistematik olarak tanımlanması ilk defa 1894 de Altman tarafından yapılmıştır. Hücre içerisinde granüler ve ipliksi yapılar şeklinde görülen bu organel 1897 de Benda tarafından ipliksi granül anlamına gelenmitokondrion, çoğul: mitochondria olarak ifade edilmiştir. Mitokondri (mitochondrion) kelimesi yunanca iplik (mitos) ve granül (chondrion) kelimelerinden türetilmiştir. Mitokondriler ilk defa Bensley and Hoerr (1934) tarafından karaciğer hücrelerinden izole edilmiştir. Mitokondrinin oksidatif fosforilasyonun merkezi olduğu 1948 de Eugene Kennedy and Albert Lehinger tarafından ortaya konulmuştur. Nass et al. (1963) mitokondri organelinin DNA molekülü içerdiğini ilk defa tespit etmişler ve boylece DNA molekülünün sadece çekirdek içinde bulunabileceği düşüncesi yıkılmıştır. Şekil 2.1 Hayvan hücresi (Russell 2005) 4
Elektron mikroskobu altında incelendiğinde mitokondrilerin büyüklükleri yaklaşık olarak 1 µm kadardır. Mitokondriler şekil, sayı ve yerleşimleri bakımından hücre tipine ve doku işlevine bağlı olarak değişiklikler göstermektedirler. Pek çok bitki ve hayvan hücresinde binlerce mitokondri bulunabilmektedir (Şekil 2.2). A B Şekil 2.2 Mitokondrinin yapısı. A: ( Griffiths et al. 2000), B: (Kılıç 2005). Mitokondriler daima bakterilerin çoğalarak bölünmesinde olduğu gibi daha önce var olan mitokondrilerin bölünmesiyle çoğalmaktadır. Hücre bölüneceği zaman mitokondri bölünmektedir. Mitokondri DNA sı bölünme öncesi ve bölünme esnasında kopyalanır ve kardeş DNA molekülleri kardeş mitokondrilere geçmektedir (Şekil 2.3). Şekil 2.3 Mitokondriyel DNA nın bölünmesi (Kılıç 2005). 5
Çekirdek DNA molekülünden bağımsız olarak çoğalan mtdna molekülünün bu özelliği nedeniyle hücre bölünmesi sırasında heteroplazmik (heteroplasmy) bir açılma meydana gelebilmektedir (Şekil 2.4). Heteroplazmi (heteroplasmy), bir hücrede iki ya da daha fazla kökene ait (veya normal ve mutant) farklı mtdna molekülünün aynı anda bulunması olarak ifade edilmektedir. Ayrıca; a) nükleotid eksilmesi (deletion), b) nükleotid ilave edilmesi (insertion), c) nükleotid dönüşümleri (substitution), d) belirli gen bölgelerinde DNA parçalarının farklı uzunluklarda olması ve e) herhangi bir lokustaki nükleotid dizilimlerinde gözlenen çeşitli değişimler mtdna molekülünde meydana gelen genetik varyasyonun temel kaynaklarını oluşturmaktadır (Şekil 2.5) (Moritz et al. 1986, Solignac 1991). Şekil 2.4 Heteroplazmik yapı ve bunun döllere aktarılması Yabani Tip Başlangıç mtdna dizisi A T G C A T G Mutant döllerin (haplotiplerin) mtdna dizisi G nükleotidinin eksilmesi A T G C A T -- C nükleotidinin ilave edilmesi A T G C A T G C A > G nükleotid dönüşümü A T G C G T G Şekil 2.5 Nokta mutasyonları 6
Mitokondriler aslında yarı bağımsız organeller olup kendi DNA ve ribozomları bulunmaktadır. Mitokondri DNA larının evrimsel kökeni tartışmalıdır. Genel olarak kabul edilen görüşe göre mitokondriler, çok eskiden konakçı hücrelerin sitoplazmasına girmiş ve bu organellerin öncülü olmuş bakterilerin kromozomlarının kalıntılarıdır. Endosimbiotik teori olarak ifade edilen bu teoriye göre, mitokondrilerin, çok erken dönem ökaryot hücrelerle endosimbiotik olarak yaşamış aerobik bakterilden köken aldığı ileri sürülmekedir (Şekil 2.6). Mitokondri DNA sı, mitokondri trna larının ve rrna larınının ve birkaç mitokondri proteininin sentezlenmesinden sorumludur. Mitokondri proteinlerinin % 95 inden daha fazlası çekirdek DNA molekülü tarafından kodlamaktadır. Mitokondrilerde mtdna, ribozom ile trna nın varlığı ve bunun sonucunda mitokondri iç zarına özgü olan bazı proteinleri sentezlemeleri mitokondrinin endosimbiotik köken teorisini desteklemektedir (Kılıç 2005). Şekil 2.6 Endosimbiotik teori. Kılıç (2005) dan değiştirilerek çizilmiştir. 2.2 Mitokondrinin Görevi Mitokondri, biyokimyasal reaksiyonlar için gerekli enerjinin temin edildiği hücrenin en önemli organellerinden birisidir. Bir hücredeki mitokondri sayısı, hücrenin tipine, fonksiyonuna ve enerji ihtiyacına bağlı olarak birkaç adetten binlerceye kadar değişebilir. Karaciğer ve kas gibi yüksek enerji ihtiyacı olan doku hücrelerinde mitokondri sayısı oldukca yüksektir. Mitokondrinin esas görevi hücrede oksidatif fosforilasyon olayının gerçekleştiği organel olmasıdır. Oksidatif fosforilasyon, oksidatif 7
yıkım ürünlerinden alınan elektronların moleküler oksijene aktarılırken açığa çıkan enerji ile ADP den adenosin tri fosfat (ATP) sentezlenmesi olayıdır. Oksidatif fosforilasyon mitokondrinin iç membranında gerçekleşmektedir. Bunun dışında mitokondri primidinlerin, amino asitlerin, fosfolipitlerin, nükleotidlerin, folat enzimlerinin, üre ve diğer birçok metabolitin biyosentezine de katkıda bulunur (Kılıç 2005). 2.3 Bal Arısı Mitokondriyel DNA Molekülü Genel olarak, memeli mtdna molekülü dairesel bir yapıya sahip bulunmaktadır. Replikasyon orijini yakınındaki kısa bir bölge haricinde, memeli mtdna sı tamamen herhangi bir gen ürününün sentezinden sorumlu olan gen bölgelerinden (exon) oluşmaktadır. Bu gen bölgeleri fonksiyonel olmayan (intron) bölgeleri içermemektedirler. Avise et al. (1987) a göre mtdna çekirdek DNA sına göre daha hızlı evrimleştiği için türler ve alttürlerin filogenetik çalışmalarında çok değerli bir araç olduğu ispatlanmıştır. MtDNA molekülünün iki önemli özelliği bulunmaktadır. Bunlardan birincisi, mitokondriyel genetik materyal daire şeklinde ve ikili sarmal tek bir DNA molekülünden oluştuğu için çekirdek DNA molekülünde homolog kromozomlar arasında gerçekleşen parça değişimi (crossing-over) meydana gelmez. Buna bağlı olarak da rekombinant döller oluşmaz. İkinci önemli özelliği ise, çoğu türde anaya ait (maternal) kalıtım modeline sahip olmasıdır. MtDNA nın anaya ait kalıtım modeline sahip olması, mtdna nın bal arıları genetik çalışmasında iki nedenden dolayı çok önemlidir. Bunlardan birincisi koloninin tüm bireyleri ana arının dölleri olduğu için özdeş mtdna lar taşırlar ve koloni analizlerde bir birey olarak ele alınır. Bu kural oğul verme esnasında kovanı terk eden veya herhangi bir sebepten dolayı ölen ana arının yerini kendi kızlarından birisi aldığı zaman da geçerlidir (Garnery et al. 1992). İkincisi mtdna molekülü generasyonlar boyunca büyük ölçüde korunarak dölden döle aktarıldığı için evrim sürecinde anaya ait kalıtım modellerinin belirlenmesinde ve takip edilmesinde önemli bir yer tutmaktadır. Bal arısı mtdna molekülü 16300 17000 bç uzunluğunda olup, mitokondri organelinin içerisinde yer alan daire şeklinde iki zincirden oluşan ve toplam 37 gen içeren bir 8
moleküldür. mtdna, 13 (bazen 12) protein, 22 trna, 2 ribozomal RNA kodlayan genlerin alt üniteleri ve kodlama yapmayan (replikasyon kontrol bölgesi) bölgeyi içermektedir (Crozier and Crozier 1993, Moritz 1994). Çizelge 2.1 A. mellifera genomunda bulunan genler, A+T içeriği, D. yakuba ile olan benzerliği ve her genin nükleotid sayısı (Moritz 1994) Gen A+T içeriği D.yakuba ile Nükleotid (%) Benzerlik (%) Sayısı ATPaz 8 90 64 156 ATPaz 6 85 62 678 Sitokrom C oksidaz I (COI) 84 74 1560 Sitokrom C oksidaz II (COII) 81 68 675 Sitokrom C oksidaz III (COIII) 84 66 777 Sitokrom b (cyt b) 69 66 1149 NADH dehidrojenaz 1 (ND1) 86 64 915 NADH dehidrojenaz 2 (ND2) 87 51 999 NADH dehidrojenaz 3 (ND3) 87 63 351 NADH dehidrojenaz 4 (ND4) 94 64 1341 NADH dehidrojenaz 4L (ND4L) 86 57 261 NADH dehidrojenaz 5 (ND5) 87 61 1662 NADH dehidrojenaz 6 (ND6) 87 53 501 rrna küçük alt birimi (srrna) 81 68 786 rrna büyük alt birimi (IrRNA) 85 73 1371 Yapılan çalışmalar sonrasında Drosophila yakuba da tanımlanan mtdna genlerinin tümünün bal arılarında da bulunduğu tespit edilmiştir (Çizelge 2.3). Ayrıca her iki türün sahip olduğu gen sıraları arasında şaşırtıcı bir benzerliğin bulunduğu da saptanmıştır. Apis mellifera mtdna sı protein kodlayan genleri, kontrol bölgesi ve rrna genleri D. yakuba ile aynı sırada yer alırken 22 trna kodlayan bölgeden 11 tanesi farklı pozisyonda (A+T zengin bölge ve ATPase8 arasında) yer almaktadır (Şekil 2.7). Her iki türde de A+T içeriği yüksek seviyededir. Örneğin COI bölgesinin içeriğini Apis mellifera da % 75, D. yakuba da % 80 A+T oluşturmaktadır. Tüm mtdna nın genomunun % 84.9 nu A ya da T oluşturmaktadır. Bu benzerliklerin yanı sıra farklılıklar da görülmektedir. Mitokondriyal genom A. mellifera da (16.343 bç), D. yakuba ya (16.019 bç) göre daha uzundur. Kontrol bölgesi ve intergenik bölgedeki kodlamayan dizilerin uzunluğu A. mellifera da daha fazladır. A+T zengin bölge haricinde en uzun kodlamayan dizi trna leu ve COII genleri arasında yer almakta ve bu 9
bölge D. yakuba mtdna sında daha kısadır. Apis mellifera da guanin (G) nükleotidi daha az seviyede bulunurken D.yakuba da sitozin (C) nükleotidi nadiren görülmektedir (Moritz 1994). Şekil 2.7 Apis mellifera nın mtdna genom haritası. trna genleri ilgili olduğu amino asitlerin baş harfi ile gösterilmektedir. Yıldızla işaretlenen trna genleri D. yakuba da farklı pozisyondadır. COI, COII ve COIII sitokrom c oksidaz (Cytochrome c oxidase) 1, 2, 3 ve cyt b sitokrom b (cytochrome b) proteinleri, ND1-6 ve ND4L, NADH dehidrogenaz (NADH dehydrogenase) sisteminin 1-6 alt ünitelerini ve 4L li göstermektedir. A+T replikasyon orijinini içeren A+T zengin bölgeyi göstermektedir. Oklar kodlayan bölgelerin transkripsiyon yönünü ifade eder (Crozier and Crozier 1993) 10
2.4 Genetik Çalışmalarında Varyasyon Belirleme Yöntemleri Populasyonlar ya da bireyler arasında var olan genetik benzerliklerin/farklılıkların tespit edilmesi amacıyla yapılan çalışmalarda morfolojik, fizyolojik ve genotipik farklılıklar dikkate alınmaktadır. İncelenen hemen her populasyonda bireyler arasındaki farklılıklar hemen göze çarpmaktadır. Doğada birbirinin aynı olan iki birey elde etmek neredeyse imkansızdır. Aynı genotipe sahip canlılar arasında bile (tek yumurta ikizleri, vejetatif çoğalan canlılar, klonla çoğaltılan canlılar vs.) farklılıklar bulunabilmektedir. Canlıların evrimi içerisinde populasyonlar içi ve populasyonlar arasındaki faklılıkların/benzerliklerin DNA molekülü seviyesinde tespit edilmesi amacıyla daha duyarlı yeni yöntemlerin geliştirilmesine başlanmıştır. Bu amaçla geliştirilen ve yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında DNA-DNA hibridizasyonu (DNA-DNA hybridization), Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR, Polymerase Chain Reaction), Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA), Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism), Tek Nükleotid Polimorfizmleri (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms), Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism), Basit Dizilim Tekrarları (SSR, Simple Sequence Repeats), Ardışık Basit Tekrarlar (STR, Simple Tandem Repeats), mikrosatelitler (microsatellites) ve DNA dizi analizi (DNA sequencing) gibi yöntemler yer almaktadır. 2. 4. 1 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) PCR doğal DNA replikasyon işleminin temel bileşenleri kullanılarak DNA molekülünün laboratuar (in vitro) koşullarında çoğaltılması ya da kopyalanmasıdır. PCR, üzerinde durulan bir gen yada DNA bölgesinin belirli primerler kullanılarak in vitro ortamda çoğaltılmasını sağlayan bir yöntemdir. PCR yöntemininin temel prensiplerine ilk defa 1985 de Kary Mullis tarafından değinilmiş, ancak daha sonra bu teknik Saiki et al. (1985) tarafından geliştirilmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yönteminin geliştirilmesi moleküler biyoloji alanında çok önemli bir dönüm noktası olarak kabul edilmektedir ( Saiki et al. 1988). Bu tekniğin geliştirilmesinden sonra birçok organizmada DNA varyasyonu tespit etmek amacıyla yapılan çalışmalarda büyük bir artış olmuştur. PCR yönteminde çok basit olarak DNA ikili sarmalı 11
açılmakta, ebeveyn molekülün her bir ekseni kalıp (şablon) olarak kullanılarak yeni iki tamamlayıcı (komplementer) eksen sentezlenmektedir. PCR yöntemi genel olarak üç basamaklık bir döngünün defalarca tekrarlanmasına dayanan bir tekniktir (McPherson and Møller 2001). Bu aşamalar; a) DNA eksenlerinin birbirinden ayrılması (denaturation), b) Primerlerin komplementer DNA bölgesiyle hibrit oluşturması (annealing) ve c) Yeni eksenlerin sentezinin yapılması (extension) aşamalarıdır (Şekil 2.8). Şekil 2.8 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) döngüsü (Özdil 2007) Kalıp DNA nın iki ekseni, yaklaşık 94-95 o C lık sıcaklık uygulamasıyla birbirinden ayrılmaktadır. PCR ın ilk aşaması olan bu işlem DNA eksenlerinin birbirinden ayrılması olarak bilinmektedir. Eksenlerin ayrılması, 15 saniyeden birkaç dakikaya kadar olabilmektedir. İkinci aşama oligonükleotid primerlerinin (6-30 bazlık) kalıp DNA üzerindeki tamamlayıcı (complementary) sıralara eşlenmeleri ve hibritlenme olayının gerçekleşmesidir. Bunun için denatürasyon sıcaklığından daha düşük hibritlenme sıcaklığına reaksiyon soğutulmaktadır. Primerlerin doğru bir biçimde 12
hibritlenmesi için sıcaklığın 40-72 o C (optimum 55 o C) arasında olması gerekmektedir. Reaksiyon bu sıcaklıklara soğutulduğunda primerlerin tamamlayıcı DNA ile hibritlenmesi sağlanmış olur. Primerlerin bağlanması için 55 o C de 1-2 dk tutmak yeterlidir. En son aşama olarak optimum sentez sıcaklığında (72 o C), sıcaklığa dayanıklı özgün bir DNA polimeraz enzimi primerlerin 3 OH uçlarına deoksiribonükleotidleri ekleyerek yeni eksenleri kalıp sıraya komplementer olacak şekilde sentezlemektedir. Bu son aşama yeni DNA eksenlerinin sentezinin yapılması olarak bilinmektedir. Uzama aşamasının 1-3 dk kadar olması önerilmektedir (McPherson and Møller 2001). Bir sonraki döngüde başlangıçta kullanılan DNA molekülü ile birlikte yeni sentezlenen DNA molekülü de birbirinden ayrılmaktadır. Her bir eksen (hem kalıp eksen ve hem de yeni sentezlenen eksen) primer bağlanma bölgesine sahiptir ve sonraki DNA sentezleri için kalıp görevi görmektedir. Bu üç aşamalı PCR döngüsü 20-40 kez tekrarlanarak istenilen kopyada DNA bölgesi çoğaltılmış olmaktadır. Her bir döngüde DNA molekülü, iki katına çıkarılarak hedeflenen DNA parçacığı üssel bir artışla çoğaltılmakta ve bu DNA parçacıkları agaroz gibi çeşitli destek ortamlarında tespit edilebilmektedir (Şekil 2.9). Şekil 2.9 PCR döngüsü kullanılarak hedeflenen DNA bölgesinin üssel çoğaltımı 13
2.4.2 Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemi PCR yönteminin geliştirilmesiyle, mtdna molekülünün PCR ile çoğaltılmış hedef kısmının RFLP analizi, populasyon genetiği çalışmalarında yaygın bir yöntem haline gelmiştir. DNA molekülünde meydana gelebilecek en basit polimorfizm tek nokta nükleotid (SNPs ) değişimleridir. PCR-RFLP ya da lokusa özgü RFLP tekniği özgün bir lokusta genetik varyasyon tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu yöntemde standart PCR işlemi ile üzerinde durulan lokus çoğaltılmakta, uygun restriksiyon endonükleaz enzimleri (restriction endonuclease) kullanılarak kesilmekte ve restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) elde edilmektedir. Kesim sonucu oluşan kesim parçacık modellerine göre kesim noktasının varlığı veya yokluğuna göre bireyler arasındaki farklılıklar tespit edilmektedir (Şekil 2.10). Bu yöntemde bireyler arasında tespit edilebilen polimorfizm, enzim tanıma bölgesinde meydana gelen bir nükleotidin eklenmesi, bir nükleotidin eksilmesi veya bir nükleotidin değişmesi şeklinde ortaya çıkan nokta mutasyonlarından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, enzimin iki tanıma bölgesi arasında meydana gelen parça ilavesi veya çıkmasıyla oluşan uzunluk farklılıkları da yine RFLP olarak tanımlanmaktadır. PCR-RFLP yöntemi kodominant kalıtım modeline uygun markerler vermektedir. Bu yöntemde rutin PCR reaksiyonunda olduğu gibi uzun oligonükleotid primerler kullanıldığı için oldukça güvenilir bir çoğaltım yapılmaktadır (Botstein et al. 1980, Hall 1998, Vicente and Fulton 2004). RFLP yönteminde kullanılan restiriksiyon endonükleaz enzimleri bakteriyel kökenli olup, çift sarmal DNA molekülünü 4-8 baz çiftlik DNA sıralarından tanıyarak bu bölgelerden özgün kesim yapan enzimlerdir. Bazı enzimler ile kesim sonucu yapışkan uçlu (sticky or cohesive ends) parçacıklar elde edilirken; bazıları ile kesim sonucu küt uçlu (blunt ends) parçacıklar elde edilmektedir (Şekil 2.11). Böylece her bir restriksiyon endonükleaz enzimi kendine özgün nükleotid dizilerini içeren DNA parçacıklarını oluşturmaktadır. Evrim ve populasyon genetiği çalışmalarında restriksiyon enzimlerinden yararlanılarak çok önemli genetik farklılıklar tespit edilmiştir. RFLP analizleri hem çekirdek ve hem de mitokondriyel genomda oldukça faydalı bilgiler ortaya koymaktadır (Griffiths et al. 1996). 14
Şekil 2.10 Restriksiyon enzimleri ile elde edilen yapışkan ve küt uçlu DNA parçacıkları Şekil 2.11 Genetik farklılıkların RFLP yöntemi kullanılarak belirlenmesi (Özdil 2007) 15
2.5 Bal Arısının (Apis mellifera L) Sistematik Sınıflandırmadaki Konumu Bal arısı (Apis mellifera L.) yüksek adaptasyon yeteneğinden dolayı hemen hemen dünyanın her bölgesine yayılmıştır. Bununla beraber bulunduğu bölgelerin ekolojik şartlarına adapte olarak çok sayıda coğrafi ırk ve bu ırklar içerisinde de farklı ekotipler oluşturmuştur. Bal arısı alttürleri arasında çeşitli morfolojik, fizyolojik ve davranış özellikleri (renk, büyüklük, dil uzunluğu, korunma davranışı, yuva yapma biyolojisi, iletişim dansı ve hastalıklara karşı direnç vb.) bakımından farklılıklar görülmektedir. Bal arısı günümüzde kutuplar hariç hemen hemen dünyanın her bölgesinde bulunmaktadır. Onaltıncı yüzyıla kadar bal arısı yalnızca Eski Dünya da (Avrupa, Asya ve Afrika kıtalarında) bulunurken daha sonra insan eli ile göçler sırasında Yeni Dünya ya (Amerika, Avustralya ve Yeni Zelanda) taşınmıştır. Dünyadaki farklı ekolojik şartlara uyum sağlamak için uğradığı evrim dikkate alındığında bal arıları arasındaki farklılıklar şaşırtıcı değildir. Bu farklılıkları incelemek ve populasyonları sınıflandırmak için kullanılan yöntemlerin başında, yüksek kalıtsallığa sahip karakterlerle ilgilenen morfometri gelmektedir. Çizelge 2.2 de bal arılarının sistematik sınıflandırmadaki konumu sunulmuştur. Çizelge 2.2 Bal arılarının sistematik sınıflandırmadaki yeri Alem Animalia ( Hayvanlar) Şube Arthropoda (Eklem Bacaklılar) Sınıf Insecta (Böcekler) Takım Hymenoptera (Zar Kanatlılar) Bölüm Apocrita Üst familya Apoidea Familya Apidae (Arılar) Cins Apis (Bal Arıları) Morfolojik özellikler kullanılarak bal arıları 4 farklı türe ayrılmıştır ( Ruttner 1988). 1. Batı bal arısı (Apis mellifera Linnaens) 2. Dev bal arısı (Apis dorsata Fabricius) 3. Doğu bal arısı (Apis cerana Fabricius) 4. Cüce bal arısı (Apis florea Fabricius) 16
Batı bal arısı (A. mellifera L.) türü ilk olarak morfolojik özellikler esasına göre sınıflandırılmış ve 24 farklı alttüre ayrılmıştır (Ruttner 1988). Bu alttürler Tropik Afrika (A), Orta Akdeniz ve Güney Doğu Avrupa (C), Batı Akdeniz (M) ve Yakın Doğu (O) olmak üzere 4 evrimsel genetik soya ayrılmıştır (Çizelge 2.3). Bu alttürlere ek olarak A. m. ruttneri ve A. m. pomonella yeni alttürler olarak sırasıyla Sheppard et al. (1997) ve Sheppard and Meixner (2003) tarafından bildirilmiştir. Morfolojik analizler sonucu A. m. pomonella nın Yakın Doğu (O) evrimsel soyuna, mtdna analizleri sonucunda ise bu alttürün C mtdna soyu içinde değerlendirilebileceği bildirilmektedir (Sheppard and Meixner 2003). MtDNA ve davranış özelliklerine göre A. m. ruttneri nin A. m. intermissa ile daha yakın akrabalık gösterdiği bildirilmektedir. Çizelge 2.3 Batı bal arısı ( A. mellifera L.) alttürleri ve yayılma alanları (Ruttner 1988). Tür Adı 1 A. mellifera anatoliaca Maa, 1953 2 A. mellifera adamii Ruttner, 1975 3 A. mellifera cypria Pollman, 1879 4 A. mellifera syriaca Buttel-reepen, 1907 5 A. mellifera meda Skorikov, 1929 6 A. mellifera caucasia Gorbachew, 1916 7 A. mellifera armeniaca Skorikov, 1929 8 A. mellifera lamarckii Cockerell, 1906 9 A. mellifera yemenitica Ruttner, 1975 10 A. mellifera litorea Smith, 1961 11 A. mellifera scutellata Lepeletier, 1835 12 A. mellifera adansonii Latreille, 1804 13 A. mellifera monticola Smith, 1961 14 A. mellifera capensis Escholtz, 1821 15 A. mellifera unicolor Laterille, 1804 16 A. mellifera sahariensis Baldensperger, 1924 17 A. mellifera intermissa Buttel-Reepen, 1906 18 A. mellifera iberica Goetze, 1964 19 A. mellifera Linnaeus, 1758 20 A. mellifera sicula montagano, 1911 21 A. mellifera ligustica Spinola, 1806 22 A. mellifera cecropia Kiesnweiter, 1860 23 A. mellifera macedonica Ruttner, 1987 24 A. mellifera carnica Pollmann, 1879 Yayılma Alanı O: Yakın doğu A: Tropik Afrika M: Batı Akdeniz C: Orta Akdeniz ve Güney Doğu Avrupa 17
2.6 Kaynak Özetleri A. m. ligustica, carnica ve caucasica alttürleri tüm mtdna molekülü temelinde 7 farklı restriksiyon enzimi (EcoRI, Hind III, Pst I, Bam HI, Acc I, Kpm I ve Bgl II) ile muamele edilmiştir. Çalışılan enzimler bakımından carnica ve ligustica alttürleri aynı kesim modelini gösterirken, caucasica nın sadece BglI kesimi ile diğer iki türden farklı bir modele sahip olduğu tespit edilmiştir (Moritz et al. 1986). Smith and Brown (1990) bal arılarında mtdna uzunluk varyasyonunu rapor eden ilk araştırmacılar olarak farklı sayıda baz çifti içeren 6 farklı bölgeyi belirlemişlerdir. Bu 6 bölgeden ikisi 20 bç lik küçük bir farklılık gösterirken, diğer 4 bölge 100 bç lik farklılık göstermektedir. Bu küçük boyutlu varyasyonlar COI/COII bölgesinde yer almaktadır ve rahatlıkla Bcl1 enzimi ile muamele sonucu ortaya çıkmaktadır. Büyük boyutlu varyasyonlar genellikle kontrol bölgesinin yanında yer almaktadır (Moritz 1994). Cornuet and Garnery (1991) in belirttiklerine göre büyük boyutlu varyasyonlardan ikisi A+T ce zengin bölgede bulunmaktadır (Moritz 1994). MtDNA üzerinde yapılan uzunluk varyasyonu çalışmalarında en iyi araştırılan bölge trna leu ve COII genleri arasında yer almaktadır. Bu bölge Avrupa (Cornuet et al. 1991) ve Afrika alttürlerinde (Garnery et al. 1992; Moritz et al 1994) polimorfiktir. Cornuet et al. (1991) 63 farklı koloniye ait örneklerde COI-COII bölgesinin bal arısı alttürlerinde 4 farklı uzunluğa (200, 250, 450 ve 650 bç) sahip olduğunu ortaya koymuşlardır. En uzun tipin sekans analizi sonucu bu bölgenin iki farklı üniteden oluştuğu ortaya çıkmıştır. P (54 bç % 100 A+T) ve Q (196 bç % 93 A+T). Örneklerde görülen farklı uzunluklar Q, PQ, PQQ ve PQQQ kombinasyonları ile açıklanmıştır. Ayrıca Q ünitesini üç farklı parçaya bölmüşlerdir. Q 1 (COI geninin 3 ucuna benzer), Q 2 (trna leu genine benzer) ve Q 3 (yüksek derecede P ünitesine benzer). P dizisi örneklerin bir kısmında bulunurken diğer örneklerde görülmemektedir. Bu dizi bulunduğu örneklerin bir kısmında 54 bç uzunluğuna sahip P halinde, diğer kısmında ise 69 bç uunluğuna sahip P 0 dizisi halinde görülmektedir. P dizisi P 0 dizisinin orta kısmında oluşan 15 bç lik bir delesyon ile meydana gelmektedir. Bu araştırmacılar yukarıda sözü geçen ilişkiler sonucu Drosophila yakuba nın mtdna sında karşılığı olmayan bu dizilerin ardarda 18
çoğalmasından (tandem duplication) meydana gelmiş olması hipotezini ortaya sürmüşlerdir (Cornuet et al. 1991, Moritz 1994) (Şekil 2.12 ve Şekil 2.13). COI (3 ) AATTCCATTATTAATAAAAATTTAAATTTAAAATCAATTTTAATTAAAT - ATTTCCAC - TTAATTCA - - TTTTAATTTAAAAATAAATTAAATAACAATT Q1 Q2 TTTAATAAAATAAATAATTAATTTTATTTTTATATTGAATTTTAAATTCAATCTTAAAGATTAATCTTTTTATTAAAA P TTAATAAATTAATATAAAATATAAAT - - - - - - - - - - - - - - - - TATATTTATTAAATTTAATTTATTAAA TTAATAAATTAATATAAAAAATAAAACAAAATATAACAAAATATATTTATTAAAATTTAATTTATTAAA Q3 Şekil 2.12 A. mellifera nın mtdna COI-COII bölgesinin gen sırası. trna leu geni, P parçası ve Q 1, Q 2 ve Q 3 alt ünitelerin baz dizisi. P ile Q 3 un; Q 1 ile COI 3 ucunun benzerlikleri (Moritz 1994) Şekil 2.13 trna leu ve Q 2 arasındaki benzerlik (Moritz 1994) 19
Cornuet and Garnery (1991) A. mellifera L. mtdna sını 17 farklı restriksiyon enzimi ile muamele ederek restriksiyon haritasını oluşturmuşlardır (Şekil 2.14). Şekil 2.14 A. mellifera mtdna genomunun restriksiyon haritası. Soldan sağa 1) kb skalası 1 kb =1000 nükleotid) birimi ile; 2) trna genlerin konumu ( Y, W, L, D ve K sırası ile tirozin, triptofan, lösin, aspartat ve lizin için) nükleotid sekansına göre; 3)gen haritası ve enzim kesim noktaları (Cornuet and Garnery 1991). 20
Bu araştrmada gen haritasının unsurları sekans analizi sonucunda elde edilmiştir. İki haritanın karşılaştırması gen sırasının Drosophila ile aynı olduğunu göstermiştir. Mitokondriyel genomun toplam uzunluğu 16500 ve 17000 bç arası değişmektedir ve bu değişikliğin nedeni bir kaç bölgede bulunan uzunluk polimorfizmi olarak açıklanmıştır. Bunlardan ikisi kontrol bölgesinde yer alırken üçüncüsü COI-COII genlerin arasında tespit edilmiştir. Söz konusu COI-COII intergenik bölgede A. mellifera L. mtdna genetik soyları (lineage) arasında uzunluk ve sekans bakımından varyasyon görülmektedir. Bu bölgedeki uzunluk varyasyonu P dizisinin var olup olmadığından ve Q dizisinin ardarda tekrarlanmasından kaynaklanmaktadır. Ayrıca söz konusu bölge sekans farklılığı baz değişimleri, insersiyonlar ve delesyonlar içermektedir. Doğu Avrupa ve Akdeniz genetik soyunda (C) sadece bir Q dizisi bulunurken, Batı Avrupa (M) ve Afrika soylarında 1-3 arası Q dizisinin tekrarları P dizisini takip etmektedir (PQ, PQQ, PQQQ) ancak Afrika soyunda (A) P parçasının yerine P 0 bulunmaktadır (P 0 Q, P 0 QQ, P 0 QQQ) (Şekil 2.15) (Cournet and Garnery 1991). Sekil 2.15 Üç coğrafi soydaki trna leu ve COII geni arasında yer alan P/P 0 ve Q tekrarlarının durumu Garnery et al. (1992) 10 farklı alttüre ait 68 koloniden alınan örneklerin mtdna sını 16 farklı restriksiyon enzimi (AccI, AvaI, AvaII, BclI, Bgl II, CfoI, ClaI, EcoRI, EcoRV, HincII, HindIII, NdeI, PstI, PvuII, SpeI ve XbaI) ile muamele ederek 19 farklı mitotip elde etmişler ve bu mitotipler üç ana soy içerisinde kümeleşmiştir. Bu üç ana soy farklı coğrafik dağılımlara sahip Afrika alttürleri A (A. m. intermissa, A. m. monticola, A. m. scutellata, A. m. andansonii ve A. m. capensis), Kuzey Akdeniz alttürleri C (caucasica, carnica ve ligustica) ve Batı Avrupa alttürleri M olarak adlandırılmıştır. Bu sonuçlar 21
daha önceki morfometrik ve allozimik araştırmaları doğrulamıştır. Esas farklılık Kuzey Afrika populasyonları (A. m. intermissa) A soyu yerine M soyu içerisinde yer almasıdır. Ayrıca başka türlerin coğrafik alanına bağlı olarak türlerin dağılım merkezinin Orta Doğu olduğu ve 3 hattın evrimsel olarak ayrılmasının yaklaşık 1 milyon yıl önce başladığını ileri sürmüşlerdir. Garnery et al. (1993) COI-COII intergenik bölgeyi PCR yöntemi ile çoğaltıp DraI restriksiyon enzimi ile muamele ederek daha hızlı ve basit bir yöntem ile 12 farklı alttüre ait 302 koloninin örneklerinden 21 farklı haplotip bulmuşlardır. C soyunun tüm kolonileri aynı bant modelini göstermişler ve C1 olarak adlandırılmşlardır. A ve M soylarının her birinden yakıaşık 10 farklı haplotip elde edilmiştir. Crozier and Crozier (1993) tarafından A. mellifera nın tüm sekansı ilk defa analiz edimiş ve D. yakuba ile karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma sonucu mtdna da bulunan genetik kod her iki türde de aynı bulunmuş sadece iki trna antikodonu bakımından farklılık saptanmıştır. Ayrıca 22 trna kodlayan gen hariç tüm genler ve bölgeler aynı pozisyonda bulunmaktadır. Baz kompozisyonu her iki türde de yüksek seviyede A+T den oluşmaktadır (% 84.9 A. mellifera da ve % 78.6 D. yakuba da). Moritz et al. (1994) Güney Afrika nın 29 farklı bölgesinden elde edilmiş 102 bal arısı kolonisinde COI-COII intergenik bölgesinin PCR ve DraI enzim kesim sonucu 4 farklı uzunluk ve 9 farklı mitotip elde etmişlerdir. P 0 QQ tipi % 76 frekansta en yaygın tip olarak Cournet et al. (1991) klasik P ve Q parça tekrarı modeline uymayan başka bir tipde % 2 ferekansta bulunmuştur. Morfolojik özelikler çevresel seleksiyon etkisine duyarlı olduğundan dolayı filogenetik çalışmalarda çok uygun değildir. MtDNA daha iyi bir marker olarak ele alınmaktadır. İlk mtdna varyasyon araştırmaları Ruttner in coğrafik ırklar hipotezi ile uyuşmuştur. Bu araştırmalarda üç mtdna soyunun (A, M ve C) var olduğu ve evrimsel soylarla aşağı yukarı uyuştuğu tespit edilmiştir. 7 alttüre ait 9 populasyonun mikrosatelit analizi bu üç evrimsel soyu desteklemektedir. MtDNA ile yapılan çalışmalarda moleküler markerlerle ortaya çıkan en önemli farklılık, Kuzey Afrika bölgesinin alttürlerinin (A. 22
m. intermissa ve A. m. sahariensis), Doğu Avrupa (M) soyunun yerine Afrika soyuna dahil olmasıdır. A. mellifera nın bir çok alttürden elde edilen mtdna haplotiplerinin genel bir filogenetik ağacında Mısır bal arısının temel kolda yer alması dördüncü soyun varlığını gösteren ilk ipucu olmuştur. Ruttner in sınıflandırmasında Mısır coğrafi ırkının (A. m. lamarckii) M soyu değil A soyunda yer almasına dikkat edilmelidir. İkinci ve daha ikna edici ipucu Arias and Sheppard (1996) tarafından ortaya koyulmuştur. Bu araştırmacılar 14 farklı bal arısı alttüründe mtdna nın NADH dehidrojenaz 2 bölgesinde yer alan yaklaşık 700 bç uzunluğunda bir dizinin sekans analizini yapmışlardır. Birisi Mısır dan alınan iki lamarckii kolonisine ait diğeri ise Suriye Akdeniz sahilinden alınan tek meda kolonisine ait iki dizi, diğer dizilerden ayrılarak birlikte kümeleşip dördüncü soyun var olduğu hipotezini desteklemiştir. Ayrıca ikinci meda kolonisinin dizisi (önceki koloniden bir kaç 100 kilometre doğu yönünde yerleşen) dikkate alındığında açıkça C soyuna ait olduğu görülmektedir. Ruttner tarafından O soyunun bir üyesi sayılan A. m. anatoliaca, Türkiye güney doğu bölgesinde meda ile temas içerisindedir. Türkiye kolonilerinin incelenmesi sonucu, bölgenin mtdna haplotiplerinin C soyuna ait olduğunu ortaya çıkmıştır. Benzer sonuç daha önce caucasica alttürüne ait örneklerden de elde edilmiştir (Franck et al. 2000a). Palmer et al. (2000), Türkiye nin 16 farklı bölgelesine ait 84 bal arı kolonisinin mtdna sını farklı restriksiyon enzimler ile muamele ve COI-COII intergenik bölgesinin dizi analizi sonucu 4 haplotip belirlemişlerdir. Bu haplotiplerden üçünün önceden belirlenen Doğu Akdeniz mtdna soyuna ait olduğu belirlenmiştir. Ancak Suriye sınırına yakın Hatay bölgesinden alınan örneklerde üç mtdna soyundan farklı bir kesim modeli ve sekans ortaya çıkmıştır. Bu haplotipin dördüncü bir mtdna soyunu temsil edebilceği öne sürülmüştür. Franck et al. (2000a) Lübnan dan 75 bal arısı kolonisinden alınan örneklere ait mtdna nın COI-COII intergenik bölgesini DraI enzimi ile muamele etmiş ve yeni 7 farklı haplotip elde etmişlerdir. Bu haplotiplerin çoğu Afrika soyunda görünen P 0 dizisini taşımaktadır. Yeni haplotipleri Afrika (A) soyundan ayıran esas farklılık COI- COII intergenik bölgelerinde fazladan bir kesim noktasının daha bulunmasıdır. Bu kesim noktası 66 ya da 67 bç olan bir parçanın ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Yeni 23
haplotipler 4. mtdna soyunu oluşturmakta ve dizi analizi sonucu ortaya çıkan farklılıklara göre O1a, O1b, O1c, O1, O1, O2, O3 olarak adlandırılmaktadır. Franck et al. (2000b) İtalya dan A. m. Ligustica ve Sicilya dan A. m. sicula populasyonlarında mtdna nın COI-COII intergenik bölgesinin DraI restiriksiyon analizi sonucu bölgenin A. m ligustica populasyonlarının M ve C mtdna soylarının birleşiminden oluştuğunu saptamışlardır. A soyuna ait mitotipler sadece A. m. sicula örneklerinde görülmektedir. Bu iki alttürün hibrit olduğunu göstermektedir. Araştırmacılar bu çalışmada daha önce bildirilmemiş (M22, M7, M27) üç yeni mitotip bulmuşlardır. Franck et al. (2001) tüm Afrika kıtasının 64 farklı bölgesinden elde edilen 738 koloniye ait örneklerin COI COII intergenik bölgesini RFLP yöntemini kullanarak ve DraI restriksiyon enziminden yararlanarak analiz etmişlerdir. Bu çalışmada, Kuzey Doğu Afrika bölgesinin örnekleri hariç tüm örneklerin önceden rapor edilen Afrika (A) soyunun haplotiplerine ait olduğu sonucuna varılmıştır. Kuzey Doğu bölgesinden alınan örnekler, yeni tanımlanan O ve Y soyları içerisinde yer almıştır. Bu araştırmada 738 Afrika kolonisine ek olarak Avrupa, Yakın Doğu ve Amerika nın farklı bölgelerinden elde edimiş 622 koloniye ait örnekler karşılaştırma amacıyla kullanılmıştır. Toplam 1359 koloniye ait örneklerin DraI restriksiyon enzimi ile kesilmesi sonucunda 20 alttüre ait 5 farklı soyda (A, M, C, O ve Y) sınıflandırılan 42 farklı COI-COII mitotipi elde edilmiştir. Şekil 2.16 de söz konusu mitotiplerin P parçasının dizisi ve soylarını birbirinden ayırt eden farklılıklar gösterilmiştir. Hiçbir delesyon içermeyen P 0 dizisi A ve O soylarına ait mitotipleri tanımlamaktadır. d delesiyonunu içeren P dizisi M soyuna ait mitotipleri, d1 delesyonu içeren P 1 Atlantik sahiline ait A soyunu ve d2 delesyonu içeren P 2 Etiyopya dan alınan A. m. yemenitica örneklerinden yeni ortaya çıkan Y soyunu tanımlamaktadır. Ayrıca şekil 2.17 de tüm mitotiplerin DraI enzimi ile kesim haritaları ve kesim sonucu elde edilen kesim parçacık büyüklükleri ve COI-COII bölgesinde bulunan tüm delesyon/insersiyonlar gösterilmektedir. 24
Şekil 2.16 Substitüsyon (baz değişimi) nükleotitleri küçük harflerle gösterilen COI- COII mitotiplerinin P bölgesi. Şekilde 4 tanısal dizi belirlenmektedir. Hiçbir delesyon içermeyen P 0 dizisi (A) ve (O) soylarına ait mitotipleri tanımlamaktadır, d delesyonunu içeren P dizisi (M) soyuna ait mitotipleri, d1 delesyonu içeren P 1 Atlantik sahiline ait A soyunu ve d2 delesyonu içeren P 2 yeni ortaya çıkan Y soyunu tanımlamaktadır (Franck et al. 2001) 25
Şekil 2.17 42 farklı COI-COII mitotiplerinin kesim haritaları (solda) ve kesim parçacıklarının büyüklükleri (sağda). Haritalar DraI enzimi kesim modeli ve COI-COII intergenik bölgenin dizi analizi sonucu ortaya çıkmıştır. Kesim bölgeleri 1 den 10 a numaralandırılmıştır. Delesyon ve insersiyonlar sırasıyla d ve i harfleri ile numaralandırılmıştır. Üst numaralar eşit boyutlu kesim parçacıklarına işaret etmektedir (Franck et al. 2001) 26
Sušnik et al. (2004) Slovenya nın 10 farklı bölgesinden alınan 269 A. m. carnica bal arısı örneğini DraI restiriksiyon enzimi ile COI-COII intergenik bölgesini analiz etmişlerdir. Tüm örnekler C mtdna soyunun yeni bir haplotipi olarak değerlendirilmiş ve C2c olarak adlandırılmıştır. Kandemir et al. (2006a) Türkiye nin 7 farklı bögesine ait 334 koloniden toplanan bal arısı örneklerinin mtdna COI-COII intergenik bölgesinin PCR ve DraI restriksiyon enzimiyle kesim analizi sonucunda C ve O soylarına ait 7 farklı haplotip elde etmişlerdir. Bu araştırmacılar tarafından TrDra-1 den TrDra-7 ye kadar adlandırılan 7 haplotipden 4 ünün C soyuna diğer 3 ünün ise O soyuna ait olduğu bildirilmiştir. O soyuna ait olan 3 haplotip Suriye sınırına yakın küçük bir bölgeden (Hatay) elde edilmiş örneklerde ortaya çıkmıştır. TrDra-3 = C2b, TrDra-4 = C ve TrDra-6 = O1a daha önce Franck et al. (2000) tarafından bildirilmiş diğer 4 ü yeni haplotipler olarak ifade edilmektedir. Ayrıca TrDra-1 (47,64,39 ve 420 toplam 570) Türkiye de en yaygın haplotip olduğu açıklanmıştır. Kandemir et al. (2006b) Kuzey Kıbrıs bal arılarının PCR ve DraI restriksiyon enzimiyle kesim analizi sonucu Kıbrıs alttürlerinin büyük bir kısmının mtdna C soyuna ait olduğu ve küçük bir bölümün O soyunun restriksiyon modelini gösterdiğini belirtmişlerdir. Özdil (2007) Türkiye nın 20 farklı bölgesinden toplanan 244 bal arı örneğinde DraI restriksiyon enzimiyle kesim sonucu 5 farklı haplotip belirlemiştir. Bunlardan üçü (47, 41, 64, 420 bç; 47, 40, 64, 420 bç; ve 47, 39, 64, 420 bç) daha önceki çalışmalarda bildirilmiş (Franck et al. 2000a, Kandemir et al. 2006a) diğer ikisi ise 47, 41, 64, 419 bç ve 47, 39, 64, 418 bç yeni haplotipler olarak bu çalışmada ortaya çıkmıştır. Ayrıca COI- COII intergenik bölgenin dizi analizi sonucu 11 farklı haplotip tespit edilmiştir. Bu haplotiplerin 7 tanesi C1 geriye kalan 4 tanesi C2 haplotip gruplarına dahil bulunmuştur. Daha önceki standart gösterimlere bağlı kalarak araştrmacı C1 haplotipleri C1a, C1b, C1c, C1d, C1e, C1f, C1g olarak C2 haplotipleri ise C2a, C2e, C2f, C2g olarak göstermiştir. C1a, C2a, C2e ve C2g haplotipleri daha önceki araştırmalarda bildirilmiştir geriye kalan C1b, C1c, C1d, C1e, C1f, C1g ve C2f ilk defa bu araştırmada bildirilmiştir. 27
Türkiye nin Adıyaman ilinden alınan tüm kolonilerde 3442. pozisyonda bir nükleotid eksilmesi tespit edilmiş ve C1c haplotipi olarak ifade edilmiştir. Ayrıca Hakkari/Geçimli Köyü nden örneklenen arıların 6 tanesinin C2e, 1 tanesinin de C2f haplotipinde olduğu ve bu iki haplotipde 3442. pozisyonda bir nükleotid eksilmesi tespit edilmiştir. İran ın Batı bölgesinden alınan iki (İran/Tabriz ve İran/Urumieh) A. m meda örneğinde de dizi analizi sonucu aynı noktada bir nükleotid eksilmesi saptanmıştır. Sözü geçen noktada nükleotid eksilmesi İran bal arılarına özgü olabileceği ileri sürülmektedir. Türkiye nin Adıyaman bölgesinin toplam 5 koloni ve Hakkari/Geçimli Köyü nden örneklenen 6 kolonide yapılan dizi analizi temelinde bal arılarının İran bal arısı olabileceği düşünülmüştür. Bu düşünce, Adıyaman örnekleri ile İran örneklerinin aynı küme içerisinde yer almasıyla da desteklenmektedir. Türkiye bal arısı populasyonlarında COI-COII intergenik bölgesinin HinfI enzimi ile muamele edilmesi sonucunda 2 farklı haplotip ya da enzim kesim modeli tespit edilmiştir. Bu farklı haplotipler COI-II/HinfI-C1 (292, 260 ve 26 bç lik 3 farklı bant modeli) ve COI-II/HinfI-C2 (292, 240, 26 ve 20 bç lik 4 farklı bant modeli) olarak ifade edilmiştir. Söz konusu çalışmada Bolu/Yığılca dan alınan bir örnekte farklı bir kesim modeli tespit edilmiş olup bu haplotip COI-II/HinfI-C1 ile gösterilmiştir. Diğer örneklerin tamamının COI-II/HinfI-C2 haplotipinde olduğu bildirilmiştir (Yıldız vd. 2008 kişisel görüşme). Suppasat et al. (2007) Tayland ın 4 farklı bölgesine ait toplam 476 örnek ve karşılaştırma amacıyla Tayland dışından toplam 27 A. m. ligustica (Avustralya ve Yeni Zenlanda dan), A. m. carnica (Avusturya, Almanya ve Slovenya dan), A. m. mellifera (Norveç den), A. m. scutellata (Güney Afrika dan) ve A. m. syriaca (Türkiye den) Örneklerini PCR-RFLP ve dizi analizi yöntemi ile analiz etmişlerdir. COI-COII intergenik bölgenin PCR ile çoğaltılması sonucu ThaiA adlandırılan örneklerde 573 bç. lik ve ThaiB adlandırılan örneklerde 837 bç lik PCR ürünü elde edilmiştir. DraI enzim kesimi sonucu ThaiA örneklerinde Franck et al. (2001) tarafından bildirilen C soyuna (A. m. ligustica ve A. m. carnica) ait bant modeli, ThaiB örneklerinde ise Franck et al. (2000a) tarafından O soyuna (A. m. syriaca ve A. m. lamarkii) ait bant modeli ortaya çıkmıştır (Şekil b modeli). COI-COII intergenik bölgenin HinfI ile muamelesi 28
sonucu Şekil 2.8 de a b ve c olarak gösterilen üç farklı bant modeli ortaya çıkmıştır. 837 bç. lik PCR ürününe sahip ThaiB örneklerinin tamamında a restriksiyon modeli ortaya çıkmıştır. ThaiA adlandırılan örneklerde ise A. m. carnica olarak değerlendirilen örneklerin çoğunda şekil 2.8 de b ile işaretlenen model ortaya çıkmış ve ThaiA1 olarak gösterilmiştir. c ile işaretlenen modeli ise A. m. ligustica olarak değerlendirilen örneklerinin tamamı ve A. m. carnica örneklerinin küçük bir bölümünde ortaya çıkmış ve ThaiA2 isimlendirilmiştir (Şekil2.18). Şekil 2.18 Tayland bal arılarında (A1 = ThaiA1, A2 = ThaiA2, ve B = ThaiB) COI- COII intergenik bölgenin DraI ve HinfI enzim kesim sonucu ortaya çıkan bant modelleri. Tayland A. m liguticsa (lig), A. m carnica (car) A. m mellifera (mel) Türkiye den A. m syriaca (mid) ve A. m scutellata (scu) karşılaştırma amacıyla kullanlmıştır. 29
2.6.1 İran bal arısı (Apis mellifera meda) İran bal arısı (A. mellifera meda) Apis mellifera L. nın bir alttürü olarak ilk başta 1929 da Skorikov tarafından dil uzunluğu ve abdominal sternit şekline göre tanımlanmıştır. Ruttner et al. (1985) ilk önce A. m. meda nın dağılımını Kuzey İran ve Lenkoron (Hazar denizinde yer almaktadır) olarak belirlemiştir. Ancak daha sonra 1988 de Güney Irak, Suriye ve Kuzeydoğu Türkiye ye yayıldığını açıklamıştır (Şekil 2.19) (Ruttner 1988). İran sınırları içerisinde bal arısı kolonileri doğudan Mashad, güneyden Kerman ve Şiraz bölgesine kadar uzanmaktadır. En yüksek bal arısı yoğunluğu (profesyonel arıcılık merkezi) İran nın Kuzeybatısında bulunmaktadır. A. m. meda alttürünün yetiştiriciliği çok geniş bir çoğrafyaya yayılmış olup, morfolojik ve coğrafi olarak 6 farklı lokal meda populasyonun var olduğu bildirilmektedir (Ruttner 1988). Bu populasyonların yayılış alanları şu şekilde ifade edilmiştir. 1. En büyük grup orta ve batı İran da (Azerbaycan İran nın dağlık kesimi) bulunmaktadır. Bölgenin ortalama yüksekliği 1200 1500 m ve yüksekliği 4000 m den daha fazla olan dağların 3000 m yüksekliğine kadar bal arı kolonileri bulunmaktadır. 2. Hazar denizinin subtropikal bölgesi (Mazandaran) 3. Kuzeydoğu İran (Mashhad) 4. Güneydoğu İran (Kerman) 5. Irak 6. Güneydoğu Anadolu (Van Gölünden Antakya ya kadar) 30
Mashhad Shiraz Kerman Şekil 2.19 A. m. meda nın dağılımı kırmızı çizgi ile belirlenmektedir (Ruttner 1988) 2.6.2 İran bal arısının morfolojik ve davranış özellikleri Ruttner et al. (1985) tarafından yapılan çalışmada Çizelge 2.4 de gösterilen morfolojik özellikler ve bir kaç davranış özelliliği hariç A. m. meda ve ligustica arasında yüksek derecede benzerlik saptanmıştır. meda erkek arıları ligustica erkeklerine göre daha küçük ama daha koyu renktedir. Oğul verme kabiliyeti orta seviyede ve saldırganlık yüksek seviyede bildirilmiştir. Ana arı hücresi oğul verme sezonunda nadiren 10-20 ye ulaşmaktadır. Ayrıca, propolis kulanımı geniş seviyededir. 31
Çizelge 2.4 A. m. meda ve ligustica arasındaki farklılıklar (Ruttner et al.1985). Morfolojik özellik Meda (n = 93) Ligustica (n = 40) x s x s 1. Tergit 3+4 4.3560.1489 4.3877.1485 2. Dil uzunluğu(mm) 6.3354.2110 6.3587.1265 3. 3. Arka bacak (mm) 7.8211.2233 7.9686.1774 4. Ön kanat 8.9671.2310 9.2081.1746 5. İncelik İndeksi 81.81 3.83 83.48 3.31 6. Kıl Uzunluğu.2848.0410.2774.0025 7. Kubital indeks 2.56.72 2.55.41 8. Kanat indeksi 34.22.72 34.82.52 9. Vücut uzunluğu (Tergit 3+4) / arka bacak uzunluğu 55.71 1.68 55.06 1.49 İsfahan bölgesinden alınan A. m. meda örneklerini carnica, caucasia, Starline (A. m. ligustica melezi) ve Midnite (caucasica X carnica melezi) ile karşılaştırmışlardır. İlkbaharda İran bal arısı populasyonları Kafkas bal arısına göre daha hızlı, Starline ile aynı seviyede ve İtalyan ve Midnite dan daha yavaş gelişmektedir. Fakat yaz mevsiminde güçlü bir populasyona sahip değildir. İran bal arısının yıllık bal üretimi Kafkas bal arısı ile aynı seviyede olmasına rağmen, diğerlerine göre daha düşüktür. Polen toplama kabiliyeti İtalyan bal arısına göre düşük, diğerlerine göre daha yüksek seviyededir. A. m. meda karşılaştırılan diğer alttürlere göre daha saldırgan ve sokma davranışı daha yüksek seviyede olan bir alttürdür (Ebadi and Ahmadi 2004). Uzun yıllardan beri yeterince araştırma yapılmadan, saf ve hibrit ana arı ithalatı ile olumlu kalıtsal özeliklerin geçişinin yanı sıra İran bal arısı hastalıklar ve zararlılara karşı direncini kaybetmektedir (Ebadi and Ahmadi 2004). Ana arı ithalatı İran da 1956 yılında başlamış ve 1981 yılına kadar devam etmiştir. Başta Amerika ve Avustralya olmak üzere birkaç ülkeden ithal edilen ana arı sayısınn yılda 50.000 e ulaştığı ve çoğunun Starline (ligustica melezi) ve Midnite (caucasica X carnica melezi) hibritleri oldukları belirlenmiştir. Ayrıca, saf hat olarak da İtalyan ve Kafkas alttürleri ithal edilmiştir. İran a ithal edilen ana arıların çoğu hibrit olduğundan ilk generasyondan sonra iyi özelliklerini kaybetmiştir ve bu ana arılardan üretilen bir sonraki generasyon ana arılarda saldırganlık, huzursuzluk ve düşük bir performans gözlenmiştir (Hashemi 2001). 32
Tahmasebi, 1997 yılında İran nın farklı bölgelerinden toplanan işçi ve erkek arı örneklerinde morfolojik incelemeler sonucu A. m. meda arısının ülkenin kuzeyi ve geriye kalan diğer bölgeler olmak üzere iki guruba ayrıldığını belirtmiştir. Ayrıca A. m. meda nın halen korunduğunu savunmuştur ve buna son yıllarda ana arı ithalatının yapılamaması gerekçe olarak gösterilmiştir (Farshineh Adl 1999). Bienefeld et al. (1997) İran bal arısı örnekleri üzerinde yaptıkları morfometrik çalışmada İran bal arısının yabancı arı ırklarından korunduğunu belirterek Ruttner (1985) in daha önce tanımladığı İran bal arısının çok az miktarda değişime uğradığını savunmuşlardır. Farshineh Adl (1999) İran bal arısını Anadolu ve Kafkas bal arısı ile morfolojik olarak karşılaştırmıştır. Bu çalışma sonucu Tahmasebi (1997) ve Bienefeld et al. (1997) aksine yurt dışından ana arının girişi yasaklanmasına rağmen meda arısının korunmadığını bildirmiştir. İran nın Urumieh, Tabriz ve Tehran bölgelerinden alınan İran bal arısı (A. mellifera meda) örnekleri ile Türkiye nin Orta Anadolu bölgesinde yer alan Beypazarı ve Kırşehir bölgelerinden alınan Anadolu bal arısı (A. mellifea anatolica) örnekleri ve Kuzeydoğu Anadolu da Posof tan alınan Kafkas (A. m. caucasica) bal arısı örnekleri standart morfometrik metotlar kulanılarak analiz edilmiştir. Diskriminant analizi sonucu İran bal arısı, Anadolu bal arısı ve Kafkas bal arısı populasyonları farklı kümeler oluşturmuştur. Ayrıca İran nın 3 farklı bölgesinden alınan örnekler örtüşen kümeler oluşturup farklı alt populasyonlara ayrılmazken, Türkiye nin farklı bölgelerinden alınan örnekler örtüşmeyen kümeler oluşturmaktadırlar (Farshineh Adl et al. 2007). 33
3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal 3.1.1 Canlı materyal Bu tez çalışmasının materyalini İran ın 15 farklı yöresinden (Urumieh, Tabriz, Zanjan, Maragheh, Piranshahr, Ahvaz, Ardabil, Ziveh, Karaj, Hamadan, Talesh, Ramsar, Chaldoran) toplanan 92 ergin işçi bal arısı örneği oluşturmuştur (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1 Bal arısı örneklerinin alındığı yöreler ve örnek genişlikleri Yöreler Örnek Genişliği (N) Urumieh / İmamzade 5 Urumieh / Baranduz Çay 5 Ziveh 3 Piranshahr 2 Tabriz / Tabriz Üniversitesi 8 Tabriz / Ahar Yolu 7 Maragheh 10 Ahvaz 10 Ardabil 2 Zanjan 10 Karaj 10 Hamadan 5 Talesh 5 Ramsar 5 Chaldoran 5 Toplam 92 34
Şekil 3.1 Bal arısı örneklerinin alındığı yöreler 35
3.1.2 Araç ve gereç Çizelge3.2 Çalışmada kullanılan araç ve gereçlerin listesi Adı/Modeli Bidestile Saf Su Cihazı / Büchi Fontavapor 285, Ultra Saf Su Cihazı / Sg Ultra Clear Basic ph metre / Orion 420 Otoklav / Hyrama Nano Drop Spectrofotometre/ ND 1000 Çalkalayıcılı Sıcak Su Banyosu / Kotterman Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı / Janke & Kunkel KG Çalkalayıcı (Vortex) / Julabo Paramix3 Santrifüj / NÜVE NF1215 5000 rpm, Mikro Santrifüj / SIGMA 1-15, 14.000 rpm Mikro Santrifüj / HERMLE Z 231M, 15.000 rpm Soğutmalı Santrifüj / Thermo Iec Multi Rf 8467 0260, 16.800 Rpm, 30.000 g Manuel Hassas Terazi / Sartorius, 200 G Dijital Hassas Terazi / Sartorius, R 200 D, 1000 G Gradient Thermal Cycler 96 Örneklik / Biorad Thermal Cycler 25 Örneklik / Techne TC 312 Agaroz Jel Elektroforez Takımları / Thermo Güç Kaynakları / HSI 2500 DC, Bimetra P25, BioRad Model 200/2.0 Jel Görüntüleme ve Analiz Sistemi / Kodak Gel Logıc 200 Termal Yazıcı / Sony Digital Graphic Printer Up- D895 Mikro Dalga Fırını (ARÇELİK MD 500) UV Transilluminatör / Vilber Lourmat UV Lambası ve Gözlükleri / Mineralight Lamp UV-254/366 Nm Derin Dondurucu / Rua Instruments, -80 C 0 Derin Donduruculu Buzdolabı / Arçelik, -25, +4 Steril DNA İzolasyon Kabini / Metisafe Class II Çeker Ocak / Metisafe Class II Çalışmada Kullanım Amacı DNA izolasyonu ve PCR reaksiyonları için kullanılan tampon çözeltilerin hazırlanması Tampon çözeltilerin hazırlanması için gerekli ph nın belirlenmesi Kullanılan malzemlerin sterilizasyonu İzole edilen DNA örneklerinin konsantrasyonları ve saflık derecelerinin belirlenmesi DNA izolasyonu Tampon çözeltilerin hazırlanması Tampon çözeltilerin hazırlanması ve DNA izolasyonu DNA izolasyonu ve PCR aşamalarında örneklerin kısa süreli santrifüj edilerek çöktürülmesi DNA izolasyonu sırasında örneklerin bozulmadan santrifüj edilmesi Tampon çözeltilerin hazırlanmasında sarf malzemlerin tartılması Mikrosatelit lokusların çoğaltılması DNA izolasyonu ve PCR ürünlerinin tespiti Elektroforez sistemlerinin elektrik ortamlarının sağlanması DNA izolasyonu, PCR ürünleri ile mikrosatelit lokusların ön denemelerinin jelde görüntülenmesi ve bilgisayar ortamına aktarılması DNA izolasyonu, PCR ürünleri ile mikrosatelit lokusların arşivlenmesi için baskı yapılması Agaroz jellerin hazırlanması DNA izolasyonu ve PCR ürünleri ile mikrosatelit lokusların ön denemelerinin agaroz veya PAGE jel elektroforez yapılırken aynı anda fragment ayrımlarının kontrollerinin de yapılması Örnek ve çeşitli sarf malzemelerin saklanması DNA izolasyonu ve PCR işlemlerinin steril ortamda yapılması Çeşitli tampon çözeltilerin hazırlanması 36
Çizelge 3.3 Elektroforez ve metafor agaroz jellerin hazırlanmasında kullanılan stok ve tampon çözeltilerin bileşimleri Tampon Çözelti Molarite/Miktar İçerik TE Tampon Çözeltisi DNA Yükleme Tampon Çözeltisi 10 X TBE Elekrtroforez/Jel Stok Tampon Çözeltisi 1 X TBE Elekrtroforez/Jel Tampon Çözeltisi 10 mm 1mM 5.0 ml 2.0 ml 1.5 ml 1.5 ml 108.0 g 55.0 g 40.0 ml 1 litreye tamamlanır 200 ml 2 litreye tamamlanır Tris EDTA Gliserol Bromfenol EDTA Deiyonize bdh 2 O Tris Borik Asit 0.5 M EDTA (ph 8,0) Deiyonize bdh 2 O 10 X TBE Deiyonize bdh 2 O Çizelge 3.4 Elektroforez ve poliakrilamid jellerin hazırlanmasında kullanılan stok ve tampon çözeltilerin bileşimleri Çözelti Yoğunluk Bileşimi Akrilamid-Bisakrilamid Stok Çözeltisi Elektroforez/Stok Jel Tampon Çözeltisi (TBE) Elektroforez/Jel Tamponu ve Yürütme Tamponu Çözeltisi % 30 29.0 gr Akrilamid 1.0 gr Bisakrilamid 100.0 ml ye tamamlanır 10 X TBE 108.0 gr Tris 55.0 gr Borik asit 49.0 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) 1000.0 L ye tamamlanır 5 X TBE 25.0 ml 10 X TBE 25.0 ml bd H 2 O ile karıştırılır 25.0 ml bd H 2 O ile karıştırılır APS % 10 0.1 gr APS (Amonyum persülfat) 1000.0 µl ye tamamlanır Poliakrilamid Jel Tamponu Çözeltisi 60.0 ml 20.0 ml Akrilamid-bisakrilamid çözeltisi 12.0 ml 5 X TBE 1.5 ml 5 X APS ( % 10) 80.0 µl TEMED 28.0 ml steril bd H 2 O 37
3.2 Yöntem 3.2.1 Genomik DNA izolasyonu Genomik DNA izolasyonu, fenol-kloroform ekstraksiyon metodu mevcut laboratuvar koşullarına göre optimize edilerek yapılmıştır. DNA molekülleri aşağıda verilen işlem sıraları sonucunda izole edilmiştir. 1. Gün Etanol içinde -20 ºC de tutulan örneklerin göğüs (Thorax) kısmı, bisturi ile küçük parçalara ayrılmış ve 1.5 ml lik tüpler içine alınmıştır. Tüplere 500 µl TEN tamponu (1 M NaCl, 0.5 M EDTA, 1 M Tris (ph 8.0) ilave edilmiş ve örnekler ezilmiştir. Daha sonra 25 µl SDS (% 20), 15 µl Proteinaz K (20 mg/ml) ve 8 µl RNAz (10 mg/ml) ilave edilerek tüpler 58 ºC de gece boyu bekletilmiştir. 2. Gün Örnekler 8000 rpm (devir/dakika) de 10 dakika santrifüj edilmiş ve süpernatantlar (tüplerin üstünde kalan sıvı kısım) yeni tüplere aktarılmıştır. Tüplere 150 µl fenol + 150 µl kloroform izoamil alkol (24:1) ilave edilerek karıştırıcıda 20 dakika karıştırılmıştır. Tüpler 8000 rpm hızda 10 dakika santrifüj edilip fazların ayrılması sağlandıktan sonra süpernatantlar yeni tüplere aktarılıp üzerlerine 300 µl kloroform izoamil alkol ilave edilerek 20 dakika karıştırılmış ve 8000 rpm de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Süpernatantlar yeni tüplere alındıktan sonra üzerlerine 800 µl -20 ºC de tutulan % 95 lik etanol ve 50 µl 3M sodyum asetat ilave edilmiştir. Örnekler -20 ºC de gece boyu bekletilmiştir. 3. Gün Örnekler -20 ºC den alınıp 10.000 rpm de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Süpernatantlar dökülüp elde edilen peletler % 70 lik etanol ile iki kez yıkanmıştır. Daha sonra +37 ºC de çeker ocakta tüplerin ağzı açık olarak 1 saat bekletilerek peletler kurutulmuştur. DNA peletleri 100 µl TE tamponu (10:1) içinde çözdürülmüştür. 38
Genomik DNA izolasyonlarınnın miktar ve saflık kontrollerinnin yapılmasında NanoDrop Spektrofotometreden (Çizelge 3.2) yararlanmış ve elde edilen veriler bilgisayar ortamına aktarılmıştır. Spektrofotometre ölçümleri sonucunda 260/280 dalga boylarında 1.8-2.0 saflık derecesi ile miktar olarak 50 ng/µl değerinin üzerinde bulunmuştur. Örneklerden izole edilen genomik DNA moleküllerinin tek parça olup olmadıklarının (kırılıp kırılmadığı) kontrolleri % 1 lik agaroz jelde yapılmıştır. Jel üzerinde örneklerin tek bant oluşturduğu tek parça olduklarına işarettir. Elde edilen DNA molekülleri PCR işlemi yapılıncaya kadar +4 ºC de muhafaza edilmiştir. 3.2.2 Mitokondriyel DNA Molekülünün Sitokrom C Oksidaz I ile II arasındaki intergenik bölgenin (COI-COII intergenik bölge) PCR yöntemi ile çoğaltılması Mitokondriyal DNA molekülünün trna leu genini içeren COI-COII intergenik bölgesi ve COII geninin 5 ucunu içeren bölgesi Garnery et al. (1993) nın PCR protokolü kullanılarak çoğaltılmıştır. Bu amaçla ileri (forward) primer olarak E2: 5 GGC AGA ATA AGT GCA TTG 3, ters (reverse) primer olarak da H2: 5 CAA TAT CAT TGA TGA CC 3 kullanılmıştır (Garnery et al. 1992). PCR reaksiyonu toplam hacmi 25 µl olacak şekilde laboratuvar koşularına optimize edilmiştir (Çizelge 3.5). Çizelge 3.5 PCR Reaksiyonu (Garnery et al. 1993). 2.5 µl DNA 2.5 µl 10 x PCR Buffer 1.5 µl MgCl 2 2.5 µl dntps 0.5 µl İleri Primer 0.5 µl Ters Primer 0.2 µl Taq polimeraz 39
Çizelge 3.6 PCR şartları (Garnery et al. 1993). 94 o C 1 dak. 94 o C 1 dak. 48 o C 1 dak. 72 o C 2 dak 72 o C 5 dak. 30 döngü Ön denaturasyon (DNA eksenlerinin birbirlerinden ayrılması) Denaturasyon (DNA eksenlerinin birbirlerinden ayrılması) Bağlanma (Primerin komplimenter kalıp DNA ekseni bölgesine bağlanması) Uzama (Üzerinde durulan DNA bölgesinin sentezinin yapılması) Son uzama (Üzerinde durulan DNA bölgesinin sentezinin son kez yapılması) 3.2.3 Sitokrom C Oksidaz I ile II arasındaki intergenik bölgenin (COI-COII intergenik bölge) DraI ve HinfI restriksiyon enzimleri ile kesilmesi PCR işleminden sonra elde edilen PCR ürünleri DraI ve HinfI restriksiyon enzimleri ile 37 C de gece boyu bekletilerek muamele edilip kesim işlemi gerçekleşmiştir. DraI ve HinfI ile muamele edilen örneklerin tamamına sırası ile % 4 lük metafor agaroz ve % 10 luk poliakrilamid jel elektroforez işlemi uygulanmıştır. Görüntü analizi sisteminden yararlanılarak etidyum bromid ile boyanan jeller üzerinde örnekler arasındaki farklılıklar tespit edilmiştir. Faklı tipteki haplotiplerin doğruluğunu DNA dizi analizi ile doğrulanması amacıyla, farklılık gösteren örnekler dahil farklı yörelere (her bir yöreden 3 adet) ait toplam 32 örneğin COI-COII intergenik (3380-3895 arasında yer alan 572 bç lik bölge) bölgesinin dizi analizi (ABI PRISM 310 Avant Genetic Analyzer) yapılmıştır. 40
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1 Sitokrom C Oksidaz I ile II Arasındaki İntergenik Bölgenin (COI-COII İntergenik Bölge) PCR Çoğaltımı COI-COII intergenik bölgenin PCR çoğaltımı sonucunda 572 bç lik bir bölge çoğaltılmıştır. Bu bölgenin çoğaltımında revers primere bağlı olarak çoğu zaman 578 bç lik PCR ürünleri de elde edilmiştir. Bu PCR ürünleri % 4 lük metafor agaroz jelleri kullanılarak yapılan elektroforez yöntemiyle kontrol edilmiştir. PCR çoğaltımları sonucunda tüm örneklerde tek bir banttan (578 bç lik) oluşan model meydana gelmiştir (Şekil 4.1). Şekil 4.1 COI-COII intergenik bölgesinin % 4 lük agaroz jel elektroforezi ile elde edilen 578 bç. lik PCR ürünleri (1-18 örnekler). M: Fermentas GeneRuler 100 bp DNA Ladder. 41
4.2 Sitokrom C Oksidaz I ile II Arasındaki İntergenik Bölgenin (COI-COII İntergenik Bölge) DraI Kesim Sonucu Yapılan bu tez çalışmasında İran bal arısı örneklerinin COI-COII intergenik bölgesi PCR ile çoğaltılmış ve DraI restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. Enzim kesim sonucunda farklı yörelerden alınan 92 örneğin tamamında 3 farklı kesim noktasının bulunduğu ve buna bağlı olarak 47, 41, 64 ve 420 bç lik olmak üzere 4 bantlık bir modelin oluştuğu % 10 luk poliakrilamid jelleri üzerinde belirlenmiştir (Şekil 4.2). Bu modelin Franck et al. (2001) tarafından mtdna C genetik soyu için bildirilen sonuçla aynı olduğu görülmektedir. Şekil 4.2 COI-COII intergenik bölgesinin DraI enzimiyle kesim işleminden sonra % 10 luk poliakrilamid jellerinde elde edilen bant modelleri Garnery et al. (1993) yaptığı çalışmada İran (Astara) dan alınan 2 örnekte aynı sonucu elde etmiştir. Ayrıca mtdna C genetik soyu içerisinde yer alan A. m. meda ile ortak snırları paylaşan diğer alttürlerde de benzer sonuç elde edilmiştir. Franck et al. (2000a), Franck et al. (2000b) ve Franck et al. (2001) yaptıkları üç farklı çalışmada A. m. anatoliaca, caucasica, armeniaca ve cypria alttürlerinde COI-COII intergenik bölgesinin DraI restriksiyonu olarak benzer bant modeline sahip olduklarını ve aynı 42
mtdna C genetik soyu içerisinde yer aldıklarını ifade etmişlerdir. Buna karşılık A. m. syriaca alttürünün mtdna O genetik soyu içerisinde değerlendirilmesi gerektiğini belirtmişlerdir. 4.3 Sitokrom C Oksidaz I ile II Arasındaki İntergenik Bölgenin (COI-COII İntergenik Bölge) HinfI Kesim Sonucu COI-COII intergenik bölgesinin HinfI enzimi ile muamele edilmesi sonucunda 2 farklı haplotip ya da enzim kesim modeli tespit edilmiştir (Şekil 4.3). Farklı tiplerdeki haplotiplerin ifade edilmesinde bu haplotiplerin kısa yollarla simgeleştirilme zorunluluğu ortaya çıkmaktadır. Bu amaçla bu çalışmada elde edilen farklı haplotipler Yıldız vd. (2008 kişisel görüşme) belirttiği gibi, COI-II/HinfI-C1 ve COI-II/HinfI-C2 olarak ifade edilmiştir. Bir haplotipin bu şekilde ifade edilmesinde çalışılan gen bölgesinin adı, kullanılan restriksiyon enziminin adı, çalışılan populasyonun ait olduğu mtdna genetik soyu ve meydana gelen farklı model esas alınmıştır. Örneğin, COI- II/HinfI-C1 için; COI-II, sitokrom oksidaz I ve sitokrom oksidaz II arasındaki bölgeyi (COI-COII intergenik bölge) ifade etmektedir. HinfI, kesim amacıyla kullanılan HinfI enzimini ifade etmektedir. C, çalışılan arı alttürünün mtdna C genetik soyu içerisinde sınıflandırıldığını ifade etmektedir. 1 ve 2, : farklı kesim modellerine sahip haplotipleri ifade etmektedir. COI-II/HinfI-C1 haplotipi nadir olan haplotip olup, Karaj, Ardabil ve Hamadan yörelerini temsil eden sadece 3 kolonide tespit edilmiştir. Bu haplotiplerde COI-COII intergenik bölgesini HinfI enzimi 2 farklı noktadan keserek 292, 260 ve 26 bç lik 3 farklı banttan oluşan bir model elde edilmiştir. COI-II/HinfI-C2 haplotipi yaygın olan haplotip olup, Karaj, Ardabil ve Hamadan yöreleri dışında kalan yöreleri temsil eden örneklerin tamamında tespit edilmiştir. Bu haplotiplerde COI-COII intergenik bölgesini HinfI enzimi 3 farklı noktadan keserek 292, 240, 26 ve 20 bç lik 4 farklı banttan oluşan bir model elde edilmiştir. 43
COI-COII intergenik bölgenin HinfI ile kesimi sonucu ortaya çıkan varyasyon 3632 pozisyonunda yer alan timin (T) nükleotidin sitozin (C) ile yer değiştirmesi sonucunda ortaya çıkmaktadır. T>C şeklinde meydana gelen bu nükleotid dönüşümü yapılan DNA dizi analizi sonuçlarıyla da doğrulanmıştır. Şekil 4.3 COI-COII intergenik bölgesinin HinfI enzimiyle kesim işleminden sonra % 4 lük poliakrilamid jellerinde elde edilen haplotipler. 1. örnek: 578 bç lik PCR ürünü, 2. ve 4. örnekler: COI-II/HinfI-C2 haplotipleri, 3. ve 5. örnekler: COI- II/HinfI-C1 haplotipleri, M: Fermentas GeneRuler 100 bp DNA Ladder. Türkiye bal arısı populasyonlarında COI-COII intergenik bölgesinin HinfI enzimi ile muamele edilmesi sonucunda 2 farklı haplotip ya da enzim kesim modeli tespit edilmiştir. Bu farklı haplotipler COI-II/HinfI-C1 (292, 260 ve 26 bç lik 3 farklı bant modeli) ve COI-II/HinfI-C2 (292, 240, 26 ve 20 bç lik 4 farklı bant modeli) olarak ifade edilmiştir. Söz konusu çalışmada Bolu/Yığılca dan alınan bir örnekte farklı bir kesim modeli tespit edilmiş olup bu haplotip COI-II/HinfI-C1 ile ifade edilmiştir. Diğer örneklerin tamamının COI-II/HinfI-C2 haplotipinde olduğu bildirilmiştir (Yıldız vd. 2008 kişisel görüşme). 44