DONDURULMUŞ SPERMA İLE TOHUMLANAN KISRAKLARDA TOHUMLAMA ZAMANININ VE SPERMA DOZUNUN DÖLVERİMİNE ETKİSİ

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DONDURULMUŞ SPERMA İLE TOHUMLANAN KISRAKLARDA TOHUMLAMA ZAMANININ VE SPERMA DOZUNUN DÖLVERİMİNE ETKİSİ Mustafa AVCI DÖLERME VE SUN İ TOHUMLAMA ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ergun AKÇAY 2011 - ANKARA

ii TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DONDURULMUŞ SPERMA İLE TOHUMLANAN KISRAKLARDA TOHUMLAMA ZAMANININ VE SPERMA DOZUNUN DÖLVERİMİNE ETKİSİ Mustafa AVCI DÖLERME VE SUN İ TOHUMLAMA ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ergun AKÇAY 2011 - ANKARA

iii

iv İÇİNDEKİLER Sayfa No Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz v Simgeler ve Kısaltmalar vi Çizelgeler ve Şekiller vii 1. GİRİŞ 1 1.1. Genel Bilgiler 1 1.1.2. Arap atının morfolojik özellikleri 2 1.1.3. Arap atlarında spermatolojik özellikler 2 1.1.4. Spermanın dondurulması çözdürülmesi ve tohumlama 4 1.1.5. Dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlama dozu 10 1.1.6. Dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlama zamanı 13 1.1.7. Dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlamada kısrağın yaşı 16 2. GEREÇ VE YÖNTEM 18 2.1. Gereç 18 2.2. Yöntem 18 2.2.1. Spermanın Alınması ve muayenesi 18 2.2.2. Spermanın sulandırılması ve dondurulması 19 2.2.3. Kısraklarda reprodüktif değerlendirmeler 20 2.2.4. Kısrakların Tohumlanması 21 2.2.5. İstatistik Analizler 21 3. BULGULAR 27 3.1. Sperma Dozu 3.1. 1. Sperma dozu 400 x 10 6 ile tohumlanan kısraklarda gebelik 27 3.1.2. Sperma dozu 800 x 10 6 ile tohumlanan kısraklarda gebelik 27 3.1.3. Sperma dozu 1200 x 10 6 ile tohumlanan kısraklarda gebelik 27

v 3.2. Tohumlama Zamanı 31 3.3. Kısrağın Yaşı 31 3.4. Sperma dozu, tohumlama zamanı ve yaşın gebelik oranına etkisi 31 4. TARTIŞMA 34 4.1. Sperma Dozu 34 4.2. Tohumlama Zamanı 36 4.3. Kısrağın Yaşı 38 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 40 ÖZET 42 SUMMARY 43 KAYNAKLAR 44 ÖZGEÇMİŞ 46

vi ÖNSÖZ Dünyada ve Türkiye de son yıllarda Arap atlarında sun i tohumlama faaliyetlerine başlanmış ve bu faaliyetler yaygınlaşmaktadır. Suni tohumlama taze, soğutulmuş veya dondurulmuş-çözülmüş sperma ile yapılmaktadır. Türkiye de Arap atlarında spermanın dondurulması ve sun i tohumlama konusunda yapılan çalışmalar sınırlıdır. Kaliteli aygırların spermalarından etkin bir şekilde yararlanmak önem taşımaktadır. Bu bağlamda tohumlama dozu ve zamanının döl verimine etkisi önemlidir. TİGEM işletmelerinde Arap atı aygır spermalarının bir dozu (0.5 ml 16 Payet) aygıra göre 10-40 bin TL arasında satılmaktadır. En uygun dozun belirlenmesinin ekonomik yönden de önemi bulunmaktadır. Sunulan bu tez projesinde dondurulmuş - çözdürülmüş farklı dozlardaki sperma ile ovulasyon öncesi ve sonrası yapılan tohumlamanın döl verimine etkisi incelenmiştir. Böylece saha koşullarında yararlanılabilecek bilgilere ulaşılmaya çalışılmıştır. Araştırmanın planlanmasından tamamlanmasına kadar her aşamada bilgi ve deneyiminden yararlandığım doktora tez danışmanım Sayın Prof. Dr. Ergun AKÇAY a, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dölerme ve Sun i Tohumlama Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Necmettin TEKİN e, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dölerme ve Sun i Tohumlama Anabilim Dalı öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Ali DAŞKIN ve anabilim dalının diğer akademik ve idari personeline; Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Zootekni Anabilim Dalı öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Necmettin ÜNAL a çok teşekkür ederim. Projenin Tarım İşletmeleri Genel Müdürlüğü nde yürütülmesi imkanını sağlayan Genel Müdür Sayın Mehmet Halis BİLDEN ve Genel Müdür Yardımcısı Sayın Mustafa ERDOĞAN a; Atçılık Daire Başkanı Sayın Dr. Ferudun ERZURUM a; projenin uygulama aşamasında büyük yardım ve destekleri olan Sultansuyu Tarım İşletmesi Müdürü Ahmet BAŞ ve atçılık şubesi şefi Abdullah GÜLER ile çalışanlarına; Karacabey Tarım İşletmesi Müdürü Dr.Ahmet ÇIRA a ve Atçılık şubesi şefi Murat DURMAZ ile çalışanlarına; Anadolu Tarım İşletmesi Müdürü Tahsin YAĞCI ve Atçılık şubesi şefi Ali ÖZTÜRK ile çalışanlarına çok teşekkür ederim.

vii SİMGELER ve KISALTMALAR P X Sx Önemlilik derecesi Ortalama % Yüzde o C mg cm 3 mm 3 ml Standart hata Santigrat derece Miligram Santimetre küp Milimetre küp Mili litre

viii ÇİZELGELER VE ŞEKİLLER Sayfa No Çizelge 2.1. Sultansuyu Tarım İşletmesi Müdürlüğü nde araştırma 22 materyaline ait tohumlama bilgileri Çizelge 2.2. Karacabey Tarım İşletmesi Müdürlüğü nde araştırma 23 materyaline ait tohumlama bilgileri Çizelge 2.3. Anadolu Tarım İşletmesi Müdürlüğü nde araştırma 24 materyaline ait tohumlama bilgileri Çizelge 3.1. Ovulasyondan önce ve sonra 400 x 10 6 sperma dozu ile 28 tohumlanan 1. grup kısraklarda gebelik durumu Çizelge 3.2. Ovulasyondan önce ve sonra 800 x 10 6 sperma dozu ile 29 tohumlanan 2. grup kısraklarda gebelik durumu Çizelge 3.3. Ovulasyondan önce ve sonra 1200 x 10 6 sperma dozu ile 30 tohumlanan 3. grup kısraklarda gebelik durumu Çizelge 3.4. Kısraklarda gebelik oranıyla ilgili ortalama değerler 32 Çizelge 3.5. Sperma dozu, tohumlama zamanı ve yaşın kısraklarda 33 gebelik oranına etkileriyle ilgili variyans analizi Resim 2.1. CASA 25 Resim 2.2. Laboratuvar 25 Resim 2.3. Sperma sulandırma işleminin yapıldığı kabin 26 Resim 2.4. Payet yapma makinesi 26

1 1. GİRİŞ Türkiye de atçılığın gelişmesi ve sorunların çözülmesi için bu alanda çeşitli projelere ihtiyaç bulunmaktadır. At yetiştiriciliğinin iyileştirilmesi için yetiştirme koşullarının optimum olmasının yanısıra genetik değeri yüksek aygır ve kısrakların elde edilmesi önemlidir. Yüksek yarış performansı göstermiş ve bu performansını yavrularına aktarabilen aygırlardan elde edilen spermanın dondurulması, uygun zaman ve dozajda kullanılmasının araştırılması, Türkiye Arap atı yetiştiriciliğinin geliştirilmesi ile Arap atı yetiştiriciliği yapılan ülkelerle rekabet edebilmede ve konuyla ilgili bilimsel birikime önemli düzeyde katkı sağlayacaktır. Türkiye de son yıllarda Arap atlarında sun i tohumlama faaliyetleri hızla yaygınlaşmaktadır. Ülkemizde ilk defa TİGEM de 2007 yılında aygır sperma dondurma laboratuarı faaliyete geçmiştir. Dolayısıyla Arap atı yetiştiriciliğinde sun i tohumlama ile ilgili faaliyetlerin başarılı ve etkin bir şekilde yapılabilmesi için, bu alanda mevcut sorunların ortaya konması, çözüm bulunması, döl verimine etkili çeşitli uygulamaların iyileştirilmesi önem taşımaktadır. Damızlık olarak kullanılan Arap atı aygırlarının ekonomik değeri çok fazladır. Bunlardan etkin bir şekilde faydalanmak ekonomik olarak önem taşımaktadır. Bu nedenle sunulan bu çalışmada, dondurulmuş - çözdürülmüş farklı dozlarda spermanın farklı tohumlama zamanında kullanılarak, aygırlardan ve kısraklardan daha fazla yararlanma imkanı araştırılmıştır. Bu çalışmayla Arap atlarında sun i tohumlamada uygun doz ve zaman belirlenerek bir taraftan döl veriminin artırılması yönünde bilgiler ortaya konulmuş, diğer taraftan bundan sonra yapılacak bilimsel araştırmalara temel oluşturabilmesi planlanmıştır. 1.1. Genel Bilgiler Türkiye de Arap atı yetiştiriciliği son yıllarda gittikçe önem kazanmaktadır. Arap atlarında yüksek ikramiyeli yarışların düzenlenmesi bu önemin artmasında oldukça etkili olmaktadır. Arap Atı yetiştiriciliği hem özel hem de kamu kuruluşlarında yapılmaktadır. Tarım İşletmeleri Genel Müdürlüğüne bağlı Malatya

2 Sultansuyu, Bursa Karacabey ve Eskişehir Anadolu Tarım İşletmelerinde hipodromlara yönelik Arap Atı yetiştiriciliği yapılmaktadır. Atlarda taze, soğutulmuş veya dondurulmuş sperma ile yapılan suni tohumlama uygulaması kısrak sahiplerine en uygun aygır seçme ve bu seçimi daha uzak mesafelerden yapma imkanı sağlamaktadır. Ayrıca venereal hastalıkların yayılma riski de azalmaktadır (Gahne ve ark., 1997). 1.1.2. Arap atının morfolojik özellikleri Arap atlarında baş küçük ve kuru, gözler iri, alın geniş; başın yandan görünümü genel olarak düz veya bazen hafif içbükeydir. Cidago kısa, kuvvetli, az belirgin ve alçaktır. Cidago yüksekliği 145-155 cm dir. Ancak haralarda uygulanan sistemli bir yetiştirme ve iyi bakım-besleme ile cidago yüksekliği 5-8 cm daha artmıştır. Yandan bakıldığında beden bir kare içine sığabilecek durumdadır. Sırt ve bel kısa olup kuvvetlidir. Sağrı uzunca ve az meyillidir. Kuyruk bağlantısı yukarıdan olup dörtnal koşarken kuyruk yukarı kalkar ve havada S harfi şeklinde bir kavis (kuyruk tutma) yapar (Arpacık, 1999). 1.1.3. Arap atlarında spermatolojik özellikler Spermanın muayenesi ve değerlendirilmesi, yetiştiricilikte ve özellikle damızlık seçiminde önemli yer tutar. Diğer androlojik muayenelerde normal değerler elde edilse bile, spermatolojik özelliklerden birinde meydana gelen olmusuzluk dölleme yeteneğini (potensia generandi) doğrudan etkiler. Ayrıca, aynı ırk içerisinde farklı bireylerin dölleme yetenekleri de bakım besleme, çevre koşulları ve genetik faktörlere bağlı olarak değişebileceğinden (Tekin, 1994), spermanın in vitro muayenesi ve değerlendirilmesi erkek hayvanların bireysel dölleme yeteneklerini ortaya koyan önemli bir kriterdir. Erkek hayvanlarda spermanın muayenesi esas olarak, herhangi bir aygır tarafından üretilen spermatozoonların fertilizasyon kapasiteleri hakkında bir fikir

3 edinmek için yapılmaktadır. Bu, damızlıkta kullanımdan önce değerlendirme metodunun bir parçası olarak, çiftleştirme sezonu içerisinde ya da belirli aşamalarda rutin bir yetiştirme uygulaması olarak veya aygırın suni tohumlama programına alınması amacıyla yapılır. Ak ve ark. (1994 ) safkan Arap aygırlarında spermatolojik özelikleri tespit ettikleri araştırmalarında, miktarı (jelli) 56,7 ml, yoğunluğu 159x10 6 sp/ml, spermatozoa motilitesini % 62,45; anormal spermatozoa oranını % 17,1; ölü spermatozoa oranını % 21 ve ph yı 7,86 olarak saptamışlardır. Sevinç ve ark. (1984) aynı değerleri sırasıyla 28,3; 164,9; 75; 6,5; 17,5 ve 7,1 olarak bildirmişlerdir. Sevinç ve ark. (1984) tarafından Karacabey Harası kökenli Arap aygırlarda ortalama sperma miktarı 38.33 cm 3, spermatozoa yoğunluğu 202.666 milyon / cm 3, motilite % 73,33; anormal spermatozoa oranı % 28,83 ve donmuş spermanın çözdürme sonrası motilite oranı % 47,58 olarak bildirilmiştir. Çifteler Harası kökenli 7 Arap aygırdan alınan 35 ejekülatın spermatolojik özelliklerinin değerlendirildiği bir çalışmada (Yurdaydın ve ark., 1989); toplam ortalama sperma miktarı 46,70 ml; spermatozoon motilite oranı (tek yönlü hareket eden spermatozoon oranı) % 67,57; ölü spermatozoon oranı % 20,80; anormal spermatozoon oranı % 26,50 spermatozoon yoğunluğu da mm 3 de 231,428 olarak elde edilmiştir. Akçay ve ark. (2007) yaşları 8-12 arasında değişen ve yarışlardan çıkarılmış Arap aygırlardan damızlık olarak yararlanma imkanlarını araştırdıkları bir çalışmada 17 aygırdan 54 ejekülat almışlardır. Araştırmada ejekülat miktarı 26,3 99,3 ml, spermatozoa motilitesi % 36,6 74,6 (bir aygırda % 0), spermatozoa yoğunluğu 100,0 545,8 x 10 6 / ml; ölü spermatozoa oranı % 17,3 92,0; anormal spermatozoa oranı % 9,5 50,0 ve ph değeri 7.0 7.3 arasında değiştiği bildirilmiştir.

4 1.1.4. Spermanın dondurulması çözdürülmesi ve tohumlama Dondurulmuş çözdürülmüş sperma kullanılarak ilk tay 1957 yılında elde edilmiştir. Bu zamandan beri aygır spermasının dondurulması konusunda önemli bilimsel ilerlemeler sağlanmıştır. Her yıl, gerek ABD gerekse de diğer ülkelerde dondurulmuş aygır spermasının kullanımı gittikçe artmaktadır (Miller, 2008). Son yıllarda, dondurulmuş aygır spermasının kullanımına izin veren ırk soykütüğü derneklerinin sayısı artmaktadır. Ancak dondurulmuş sperma ile tohumlanan kısrak sayısı hala sınırlıdır. Bunun temel nedeni, dondurulmuşçözdürülmüş sperma ile elde edilen gebelik oranının, taze veya soğutulmuş sperma ile elde edilen gebelik oranından daha düşük olmasından kaynaklanmaktadır. (Leipold ve ark., 1998). Ancak Haflinger ırkı atlarda yapılan bir çalışmada (Erzurum, 1997) ovulasyona yakın dönemdeki tohumlamalardan taze sulandırılmış sperma ile %50, dondurulmuş sperma ile %70 dölverimi alındığı bildirilmiştir. Diğer taraftan taze sperma ile yapılan suni tohumlamada gebelik oranının, doğal aşımla elde edilen orandan daha yüksek olduğu da bildirilmektedir (Gahne ve ark., 1997). Dondurulmuş - çözdürülmüş sperma ile yapılan tohumlamadan elde edilen döl verimini spermanın kalitesi, kısrağın durumu ve tohumlama zamanı doğrudan etkilemektedir. Kısrakların östrüste çok iyi izlenmesi gerekmektedir (Samper, 2001). Dünyada dondurulmuş-çözdürülmüş sperma ile tohumlama her geçen gün artmaktadır. Ancak bu yöntemle elde edilen tay sayısı, taze veya soğutulmuş sperma ile elde edilen tay sayılarına göre oldukça azdır. Dondurulmuş sperma ile elde edilen gebelik oranı, taze sperma ile elde edilen orandan daha düşüktür. Bazı aygırların spermaları dondurmaya uygun değildir. Bu aygırların sperma kaliteleri çözdürme sonrası oldukça düşmektedir. Ancak gebeliğe diğer bazı faktörlerin de etkili olduğu göz önüne alınmalıdır (Pinto, 2010). At yetiştiriciliğinde dondurulmuş sperma kullanımının çeşitli avantajları vardır. Spermanın dondurulması, kaliteli aygırların spermasının uzun süre

5 saklanmasına ve dünyanın her yerinde yetiştiricilikte kullanılmasına imkan sağladığı için, at yetiştiriciliğine yeni bir boyut kazandırmaktadır. Spermanın dondurulması kaliteli aygırlardan mümkün olduğu kadar fazla yararlanmaya olanak sağlamakta, kısrakların nakil ve pansiyon giderleri ile bulaşıcı hastalıkların yayılmasını önemli ölçüde azaltmaktadır. Spermanın dondurulması fazla sayıda aygır içinde bazı aygırları seçme imkanı sağlamakta, ölmüş aygırlardan bile yararlanma olanağı sunmaktadır. Spermanın dondurulması, aygırların hastalık veya ölüm durumlarına karşı bir sigorta olmaktadır. Kısrağın östrüs göstermesinden daha önceki bir zamanda donmuş sperma kısrağın bulunduğu yere götürülebilmekte ve depolanabilmektedir. Böylece kısrak sahiplerinin östrusu kaçırma veya uygun çiftleştirme zamanında tohumlama yapamama olasılığını ortadan kaldırmaktadır (Miller, 2008,Tekin ve ark.1989). Loomis (2001) dondurulmuş sperma ile yapılan tohumlamaların avantajlarını aşağıdaki şekilde bildirmiştir: 1. Aygırların tohumlama ortamında bulunma zorunluluğu yoktur. 2. Aygırların hasta, yaralı ve ölmüş olması spermalarının kullanılmasına engel değildir. 3. En uygun tohumlama zamanında spermanın elde edilmesi kolaydır. 4. Donmuş sperma uluslar arası dağıtıma da imkan sağlar. 5. Özel laboratuarlarda yapılan spermanın dondurulma işlemi nedeniyle dondurulmuş spermada kaliteyle ilgili variyasyon, soğutulmuş spermaya göre daha az olmaktadır. Dondurulmuş sperma kullanımının bazı dezavantajları da vardır. Spermanın dondurulup çözdürülmesi bir çok aygır için gebelik oranını düşürmektedir. Gebelik oranının düşmemesi için çok dikkatli bir yetiştirme idaresi uygulanmalıdır. Spermanın dondurulması ve çözdürülmesi bazı durumlarda soğutulmuş taze sperma kullanımına göre maliyeti artırmaktadır (Miller, 2008). Loomis (2001) dondurulmuş sperma ile yapılan tohumlamaların dezavantajlarını aşağıdaki şekilde bildirmiştir: 1. Bir çok aygırda dondurulmuş spermada döl verimi soğutulmuş spermadan daha düşüktür.

6 2. Dondurulmuş sperma uygulamaları daha fazla teknik gerektirmektedir. 3. Dondurulmuş sperma ile tohumlama öncesi ve sonrası kısrakların çok daha fazla dikkatli bir şekilde takip edilmesi gerekir. 4. Dondurulmuş sperma ile tohumlanacak kısrakların çok daha dikkatli bir şekilde belirlenmesi gerekir. Dondurulmuş çözdürülmüş sperma kullanılacağı zaman tohumlama yapılacak kısrağın seçimi çok önemlidir. Bir kısrağın vücut kondisyonu fertilitesini etkiler. Ayrıca kısrakta döl verimini olumsuz etkileyecek üreme sistemiyle ilgili anormallikler olmamalıdır. Kısrakların yaşlı olması (>15 yaş), kısır olması veya subfertiliteyle ilgili bir sorunun olması donmuş spermayla tohumlamada başarıyı düşürmektedir (Miller, 2008). Ayrıca aygırlar arasında bireysel olarak spermanın dondurulma-çözdürülme işlemlerine karşı farklılıklar bulunmaktadır. Bazı fertilitesi yüksek aygırlardan elde edilen spermanın dondurulup çözdürüldükten sonra sun i tohumlamada kullanılmasıyla elde edilen gebelik oranının çok düşük olduğu belirtilmektedir. Aygırların %20 sinin sperması iyi dondurulabilir, %20 si kalitesiz dondurulabilir ve %60 ı ise dondurmadan olumsuz etkilenebilir ancak belli tekniklerle dondurulabilir şeklinde sınıflandırılmaktadır. Boğaların aksine aygırlarda spermanın dondurulmasını veya fertilizasyonunu temel alan bir seleksiyon uygulaması yapılmamaktadır (Kuisma ve ark., 2006). Dondurulmuş sperma ile yapılan tohumlama programlarının başarısı temel olarak üç faktöre bağlıdır. Bunlar; spermanın kalitesi, kısrağın durumu ve östrüs periyodu sırasında kısrağın izlenmesidir. Genel olarak doğal aşım, taze spermayla sun i tohumlama ya da dondurulmuş spermayla yapılan sun i tohumlamalar karşılaştırıldığında dondurulmuş sperma ile yapılan sun i tohumlamalarda her gebelik için östrüs siklusu sayısı daha fazla ve her siklus için gebelik oranı daha düşük olmaktadır. Bu nedenle dondurulmuş sperma ile tohumlamada başarının artması için aygır ve kısrak seçimi çok önemlidir. Kısrak ve aygırların dölverimi bakımından geçmişlerinin çok iyi olması gerekir. Başarıda ovulasyon zamanı da çok önemlidir. Ovulasyon zamanının çok iyi belirlenmesi, özelikle dondurma işleminin

7 olumsuz etkisinden daha fazla etkilenen aygırlardan daha fazla yararlanma imkanı sağlamaktadır (Erzurum, 1997, Tekin ve Ark 1991). Atlarda sun i tohumlama ile elde edilen gebelik oranına bir çok faktörün etkisi bulunmaktadır. Bu faktörler arasında kısrak ve aygırın döl verimi bakımından kalıtsal yapısı, kullanılan spermanın durumu (taze, soğutulmuş ve dondurulmuşçözdürülmüş), her bir dozdaki spermatozoa sayısı, tohumlama zamanı en önemlileri arasındadır. Taze aygır sperması, dişi genital organında aygırlar arası variyasyona bağlı olarak 24 saat ile 7 gün arasında yaşamını sürdürebilmektedir. Dondurulmuşçözdürülmüş sperma ile tohumlama yapılacağı zaman tohumlamanın ovulasyona yakın zamanda olması gerekir. Dondurma-çözdürme işlemi çoğu aygırda spermatozoada yaşam süresinin önemli ölçüde kısalmasına neden olmaktadır (Miller, 2008). Dondurulmuş - çözdürülmüş sperma ile yapılan tohumlama sonrasında yapılan bazı uygulamaların gebeliğe çok önemli etkisi vardır. Tohumlama sonrası kısrağın bakımına özen gösterilmelidir. Tohumlamadan sonra uterusta temiz ve akıcı bir sıvı olması normal olarak kabul edilebilir. Tohumlama sonrasında uterus yangılarının önlenmesine yönelik olarak oksitosin enjeksiyonları ile uterus lavajı (oksitosin ve/veya antibiyotiklerle beraber) önerilmektedir. Bu amaçla 1-3 litre fizyolojik tuzlu su ve oksitosin uygulaması en erken tohumlamadan 4 saat sonra uygulanmalıdır. Uterustaki yangısal yanıt genellikle tohumlamadan 8 saat sonra ortaya çıkmaktadır. Gerektiğinde ertesi gün ikinci veya üçüncü lavajın yapılabileceği bildirilmiştir (Miller, 2008). Fransa da sıcak kanlı at ırklarında dondurulmuş sperma kullanımının arttığı bildirilmektedir. Dondurulmuş sperma ile tohumlanan kısrak sayısı 1985 de sadece 90 iken, 1997 de 2150 ve 2004 de 6900 a çıkmıştır. 2003 yılı yetiştirme sezonunda dondurulmuş-çözdürülmüş sperma ile tohumlanan kısraklarda doğum oranı kamu kurumlarına ait aygırlarla tohumlananlarda %64, özel sektöre ait aygırlarla tohumlananlarda %62 ve ithal sperma ile tohumlananlarda %57 olmuş; aynı dönemde doğal aşımla tohumlanan kısraklarda doğum oranı ise % 64 hesaplanmıştır.

8 Sıcak kanlı ve spor amaçlı kullanılan Selle Français ırkına ait kayıtlı 7500 kısrağın %35 i dondurulmuş sperma ile tohumlandığı bildirilmektedir. Aynı yöntemle dondurulmuş - çözdürülmüş spermada çözdürme sonrası motilite ile fertilite arasında bir ilişki bulunmaktadır. Dondurulmuş sperma ile tohumlamada ülkelere göre farklı yöntemler uygulanmaktadır. Bazı ülkelerde kısraklar günde 4-6 kez kontrol edilmekte ve ovulasyondan hemen önce veya ovulasyonda 6 saat sonra tohumlanmaktadırlar. Burada amaç dondurulmuş-çözdürülmüş spermanın kısrağın üreme sisteminde çok fazla canlı kalmayacağı görüşü nedeniyledir (Vidament, 2005). ABD de ticari uygulamalarda dondurulmuş çözdürülmüş spermayla elde edilen gebelik oranı her siklus için % 32-73; her mevsim için %56-89 arasında değiştiği bildirilmektedir (Loomis, 2001). Sieme ve ark. (2003) Hanofer ırkında soğutulmuş (500x10 6 motil spermatozoa, +5 C 2-4 saat bekletilen) veya dondurulmuş-çözdürülmüş (800 x 10 6 spermatozoa, çözdürme sonrası motilite oranı en az %35) sperma ile tohumlamanın gebelik oranına etkisi incelenmiştir. Ovulasyonu uyarmak için hcg hormonundan yararlanılmıştır. Soğutulmuş sperma ile bir, iki veya üç kez tohumlanan kısraklarda gebelik oranı sırasıyla %49,7; 56,5 ve 71,4 olmuş; bir ve üç kez tohumlama bakımından farklılık önemli (P<0,05) bulunmuştur. Dondurulmuş-çözdürülmüş sperma ile tek östrüste bir veya iki kez tohumlanan kısraklarda gebelik oranı % 42,2 ve 50,0 (P>0,05) bulunmuştur. Soğutulmuş sperma ile dondurulmuş-çözdürülmüş sperma ile tohumlamada elde edilen genel gebelik oranları bakımından (sırasıyla % 53,9 ve 44,0) önemli (P<0,05) farklılık elde edilmiştir. Karacabey Tarım İşletmesi nde yetiştirilen Arap atı kısraklarında döl verimi özelliklerinin incelendiği bir araştırmada (Küçük ve Altınel, 1992), 1983-1987 yılları arasında ve yaşları 4-15 arasında olan 309 kısrağın verileri incelenmiştir. Kısraklarda östrüs oranı %98,4; gebelik oranı %81,9; doğum oranı %80; her gebelik için ortalama tohumlama sayısı 5,8; gebelik süresi 336,3 gün ve östrüs siklusunun süresi 25,9 gün olmuştur.

9 Tunus da Arap atı kısraklarında döl verimini etkileyen faktörlerin incelendiği bir çalışmada (Benhajali ve ark., 2010), tohumlamada elde sıfat yöntemi uygulanmış ve genel olarak gebelik oranı %84 bulunmuştur. Genel gebelik oranına aygırın etkisi ile 20 yaştan büyük kısraklarda yaşın etkisi önemli olmuştur. İlk siklusta gebelik oranı ise %51 bulunmuş; bu değere yıl ve kısrağın yaşının etkisi önemli olarak tespit edilmiştir. Çifteler Harası kökenli 7 Arap aygırdan alınan spermalar dondurulmuş ve çözdürülmüş; daha sonra spermatolojik özellikleri değerlendirilmiştir (Yurdaydın ve ark., 1989). Çözdürme sonrası ortalama spermatozoon motilite oranı %44,28; ölü spermatozoa oranı %30,40; anormal spermatozoa oranı %34,40; spermatozoon yoğunluğu da mm 3 de 111,085 olarak elde edilmiştir. Yurdaydın ve ark. (1985) değişik ırktan aygırların spermalarının dondurulmasıyla ilgili yaptıkları araştırmada; Karacabey harası kökenli Haflinger aygırlarda ortalama sperma miktarı, ph, spermatozoon yoğunluğu (X 10 6 / cm3), spermatozoon motilitesi (%), donmuş spermanın çözdürme sonrası motilitesi (%) ve anormal spermatozoa oranı (%) sırasıyla 53,36; 7,1; 194,333; 68,05; 54,85 ve 26,80 olarak elde edilmiştir. Avusturya kökenli Haflinger aygırlarda aynı spermatolojik özellikler sırasıyla 32,50; 7,5; 214,900; 60,00; 46,50 ve 33,70; Avusturya kökenli Noriker aygırlarda aynı sırayla 62,50; 7,5; 199,000; 58,30; 47,50 ve 45,40 bulunmuştur. Bu çalışmayla aygır spermasının belli süre oda sıcaklığında bekletildikten sonra dondurulmasıyla, çözdürme sonrasında yüksek motilite oranı elde edilebileceği ve Türkiye at yetiştiriciliğinde spermanın dondurulmasının etkin kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Fransa da yapılan bir saha çalışmasında (Vidament ve ark., 1997) 161 Fransız sıcak kanlı (Selle Français) aygır sperması dondurulabilme durumu (dondurma için seçilen ejekulat sayısı / toplam ejekülat sayısı) bakımından değerlendirilmiştir. Aygırların % 19, 30, 27 ve 24 nün spermasının dondurulma durumu sırasıyla % 0, 0-33, 33-66 ve 66 dan fazla olmuştur. Aygırlardan birinci ve ikinci yıl alınan spermaların dondurulabilme kabiliyeti arasındaki korelasyon 0.60

10 (P<0.001) olarak hesaplanmıştır. Aygır spermasının dondurulmasında kullanılan Fransız Dondurma Tekniği ne göre spermalar dondurulamaz, zayıf dondurulabilir, orta düzeyde dondurulabilir ve iyi dondurulabilir şeklinde gruplandırılabileceği, her tohumlama dozu için toplam spermatozoon sayısının 150 x 10 6 dan daha fazla olması gerektiği bildirilmektedir. Dondurulmuş-çözdürülmüş spermanın kalitesine aygır, aynı aygırın farklı ejekülatları ve dondurmada kullanılan teknikler etkili olmaktadır (Vidament ve ark., 1997). Graham ve Moce (2005) dondurulmuş-çözdürülmüş spermanın laboratuvarda belirlenen kalite özellikleri ile bu spermaların sahada kullanılmasıyla elde edilen döl verimi arasında korelasyonların yetersiz olduğunu bildirmişlerdir. Karacabey Harası kökenli Haflinger aygırlarda ortalama sperma miktarı 30 cm 3, spermatozoa yoğunluğu 214,277 milyon / cm 3, motilite %78,94; anormal spermatozoa oranı %23,33 ve donmuş spermanın çözdürme sonrası motilite oranı %49,99 olarak saptanmıştır. Haflinger aygırların donmuş sperma ile tohumlanan 14 Haflinger kısrağın %50 si gebe kalmıştır (Sevinç ve ark., 1984). Yurdaydın ve Pohl (1987), Avusturya da 6 sıcak kanlı aygırdan aldıkları spermalarda değişik süre ve sıcaklıklarda çözdürme sonrası başlıca spermatolojik özellikleri incelemişlerdir. Donmuş spermalar su banyosunda 40, 45, 50 ve 55 C de 30, 35 ve 40 saniyede çözülmüşlerdir. Çözdürme sonrası motil spermatozoon oranı 30 saniye için sırasıyla % 26,40; 42,80; 41,00 ve 30,80; 35 saniye için aynı sırayla % 25,60; 29,81; 45,00 ve 30,38; 40 saniye için aynı sırayla % 30,20; 35,80; 49,60 ve 39,40 olmuştur. Yukarıdaki değerler ölü spermatozoon oranı için % 51,80; 37,80; 37,00; 42,28; 48,50; 41,50; 35,50; 39,80, 46,94; 39,92; 34,22 ve 36,00 bulunmuştur. 1.1.5. Dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlama dozu Dondurulmuş-çözdürülmüş spermalarda standart bir doz bulunmamaktadır. Çözdürme sonrası motilite oranı aygırlar ve ejekulatlar arasında önemli düzeyde farklı olabilmektedir. Diğer taraftan laboratuarlar arasında dondurma işlemi

11 bakımından da farklılıklar bulunmakta, her bir payetteki spermatozoon sayısı farklı olabilmektedir. Tohumlamalarda birörnekliğin artırılmasına yönelik olarak Dünya Spor Atları Yetiştiriciliği Federasyonu tarafından üye ülkeler arasında minimum standartların sağlanmasına çalışılmakta; bu bağlamda en az 250 x 10 6 motil spermatozoa ve çözdürme sonrası motilite oranı en az % 35 olan bir tohumlama dozu önerilmektedir (Miller, 2008). ABD de dondurulmuş çözdürülmüş spermalarda en az 240 x 10 6 motil spermatozoon ve %30 motiliteye sahip olan spermalar tohumlamada kullanılmaktadır (Loomis, 2001). Atlarda sun i tohumlamada farklı dozlar kullanılmaktadır. Dolayısıyla kullanılan tohumlama protokolü dikkate alınmaksızın uygun bir dozun belirlenmesi gebelik oranının artırılması bakımından çok önemlidir (Gahne ve ark., 1997). Tohumlama dozunda spermatozoa sayısının azaltılmasına yönelik artan bir ilgi ve araştırma bulunmaktadır. Bunun nedenleri olarak, tohumlanacak kısrak sayısının artması, ölmüş aygırların spemalarının optimal kullanılma zorunluluğu, çiftleştirme sonrası endometritis görülme sıklığının azalması, sperma kalitesi düşük olan aygırlardan da yararlanma ve cinsiyet ayırımı yapılmış spermanın kullanılması durumu olarak söylenebilir (Miller, 2008). Yapılan bir araştırmada (Leipold ve ark., 1998) farklı ırklardan 5 aygırdan elde edilen spermanın farklı konsantrasyonlarda ve dozlarda dondurulup çözdürüldükten sonra tohumlama dozunun gebelik oranına etkisi incelenmiştir. Bu amaçla 4 uygulama (1. uygulama: düşük konsantrasyon (400 x 10 6 /ml) ve çözdürme sonrası düşük sayı (320 x 10 6 motil spermatozoa), 2. uygulama: yüksek konsantrasyon (1,600 x 10 6 /ml) ve çözdürme sonrası düşük sayı (320 x 10 6 motil spermatozoa), 3. uygulama: düşük konsantrasyon (400 x 10 6 /ml) ve çözdürme sonrası yüksek sayı (800 x 10 6 motil spermatozoa) ve 4. uygulama: yüksek konsantrasyon (1,600 x 10 6 /ml) ve çözdürme sonrası yüksek sayı (800 x 10 6 motil spermatozoa)) yapılmıştır. Gebelik oranı sırasıyla % 15, 40, 28 ve 33 olmuş, yüksek

12 konsantrasyonla (1,600 x 10 6 ) tohumlamanın, düşük konsantrasyonla (400 x 10 6 ) tohumlamaya göre gebelik oranını yükselttiği (%37 ve 22) belirlenmiştir. Diğer taraftan motil spermatozoon sayısının 320 x 10 6 dan 800 x 10 6 ya çıkması gebelik oranında bir artışa neden olmamıştır. Araştırma sonunda 0.5 ml lik payetlerde 1,600 x 10 6 spermatozoa/ml konsantrasyonunda dondurulmuş aygır spermasının kullanılması tavsiye edilmiştir. Taze sperma ile yapılan tohumlamalarda da motil spermatozoon sayısının azaltılmasına yönelik çalışmalar yapılmaktadır. Nitekim Gahne ve ark. (1997) tarafından taze sperma ile yapılan sun i tohumlamada dozun 500 x 10 6 motil spermatozoondan 300 x 10 6 motil spermatozoona düşürülmesinin gebelik oranına etkisinin incelenmesi amacıyla yapılan bir çalışmada, düşük dozda gebelik oranı %75, yüksek dozda %64 olmuş, ancak aradaki farklılık önemsiz bulunmuştur. Araştırmada sun i tohumlamada kullanılan taze spermanın kaliteli olması koşuluyla 300 x 10 6 motil spermatozoon dozunun kullanılmasının gebelik oranına olumsuz etkisi olmadığı sonucuna varılmıştır. Kısraklarda her siklusta yeterli gebelik oranı elde edilebilmesi için en az spermatozoon sayısı, taze sperma için >300 x 10 6 motil spermatozoa; dondurulmuş sperma için çözdürmeden sonra >200 x 10 6 motil spermatazoa olarak tavsiye edilmektedir. Bu sayının 100 x 10 6 olmasıyla elde edilen gebelik oranı yetersiz olmaktadır. Kısraklarda kabul edilebilir gebelik oranı bir siklusta en az %60 olarak kabul edilmektedir. Farklı tohumlama tekniklerinin (spermanın uturusun derinliklerine bırakılması, histeroskopik ve oviduktal tohumlama) daha az sayıda sperma ile tohumlama yapılabilmektedir. Ultrason yardımıyla spermanın uterusun derinliklerine bırakılması yöntemiyle taze spermada 5 x 10 6 spermatozoa sayısıyla yeterli gebelik elde edilebilmektedir. Histeroskopik tohumlama ile bu sayının taze sperma için 1 x 10 6, dondurulmuş çözdürülmüş sperma için 3 x 10 6 ya kadar düşürülebileceği belirtilmektedir. Sonuç olarak kabul edilebilir bir gebelik oranı elde edilebilmesi için çok düşük dozda spermatozoanın utero-tubal, histeroskopik veya oviduktal tohumlama metotları kullanılarak tohumlama yapılması gerektiği; ayrıca aygırın sperma kalitesinin yüksek olması gerektiği bildirilmektedir (Morris, 2004).

13 1.1.6. Dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlama zamanı Kısraklarda ovulasyondan hemen önce veya hemen sonra tohumlama yapılmasında hangisinin daha uygun olduğu konusu halen tartışmalıdır. Aynı siklus içinde dondurulmuş sperma ile birden fazla tohumlama yapılmasının tek tohumlamaya göre gebelik oranını artırdığı belirtilmektedir. Ancak çoğu zaman her siklus için dondurulmuş spermadan tek doz bulunmakta ve böyle durumda da genellikle tohumlama ovulasyondan hemen sonra yapılmaktadır. Dondurulmuşçözdürülmüş spermanın ovidukta daha geç ulaştığı belirtilmektedir. Ancak tohumlama ile ovulasyon arası veya ovulasyon ile tohumlama arası süre arttıkça gebelik oranının azalma olasılığı artmaktadır. Kısraklar çok dikkatli bir şekilde izlenir ve ovulasyondan sonra en fazla 4-6 saat içinde tohumlanırsa gebelik oranı, ovulasyondan hemen önce tohumlananlara benzer olabileceği belirtilmektedir. ABD de laboratuarlar arasında dondurulmuş sperma ile tohumlama zamanıyla ilgili tam bir görüş birliği bulunmasa da, 21 laboratuardan 19 u ovulasyon öncesi veya sonrası 6 saat içinde tohumlama yapılmasını tavsiye etmektedirler. Tohumlama teknikleri de başarıyı etkilemektedir. Spermanın uterusa veya kornulara bırakılması gebeliği etkilemektedir. Kornulara spermanın bırakılması ovidukta ulaşan spermatozoon sayısının en yükseğe ulaşması, bu da gebelik oranının artmasına neden olmaktadır (Samper, 2001). Uygun tohumlama zamanı için ovulasyonun uyarılması yoluna gidilebilmektedir. Ovulasyonu uyarıcı ajanlar, endometriumda ödem oluştuğunda, ovaryum folikülünün çapı 35 mm veya daha büyük olduğunda çok etkili olmaktadırlar. Bu amaçla günümüzde üç ürün kullanılmaktadır. Bunlar Human Chorionic Gonadotropin (hcg), GnRH analoğu olan Deslorelin (Ovuplant) ve rlh (recombinant equine LH) dir. Örneğin deslorelin saat 16:00 20:00 arasında enjekte edilmekte; kısraklar 24 saat sonra transrektal palpasyon ve ultrasonla muayene edilmekte; ertesi sabah saat 07:00 de tekrar muayene edilmektedirler. Ovulasyon genelikle enjeksiyondan sonra ikinci günde saat 07:00 ile 13:00 arasında meydana gelmektedir. Böylece ovulasyon mesai saatleri içinde gerçekleşmektedir (Samper, 2001; Miller, 2008).

14 Dondurulmuş çözdürülmüş spermanın yaşam süresi daha kısadır. Ovulasyona yakın bir zamanda tohumlama fertiliteyi artırmaktadır. ABD de tohumlamada 2 farklı uygulama yapılmaktadır. Bunlar ovulasyon sonrası tek tohumlama ve birden fazla tohumlamadır (Miller, 2008). Ovulasyon sonrası tek doz tohumlama, geleneksel olarak kullanılan yöntemdir. Sperma miktarı az (örneğin aygır ölmüşse) veya pahalı (örneğin ithal edilmişse) ise bu yöntem tercih edilmektedir. Bu yöntemde başarıyı artırmak için ovulasyonu uyaran bir ajanın kullanılması gerekmektedir. Kısrak östrüste, folikül çapı 35-40 mm ve uterus ultrasonla tespit edilebilir düzeyde ödemli olduğu zaman bu ajan uygulanmaktadır. Kısrakların çoğunluğunda (%94) hcg veya deslorelin uygulanmasından 36-42 saat sonra ovulasyon gerçekleşmektedir. Kısrakların muayenesi (transrektal palpasyon ve ultrason), ajanın uygulanmasından 12-24 saat sonra başlar, ovulasyon tespit edilene kadar her 6 saatte bir devam eder. Ovulasyon tespit edildiğinde ise tek doz sperma ile tohumlama yapılır. Bu uygulamada maliyet ve zaman kaybının azaltılması için çeşitli alternatif yöntemler üzerinde de araştırmacılar çalışmaktadırlar. Dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlamada kullanılan diğer bir uygulama ise birden fazla tohumlamadır. Bu yöntemde her siklus için en az iki tohumlama yapılmaktadır. Ovulasyon geciktiğinde üçüncü bir tohumlama da uygulanmaktadır. Sperma miktarı az değilse ve nispeten ucuzsa (ithal değilse) bu yöntem tercih edilmektedir. Günlük ultrason kontrolleriyle foliküler gelişme izlenmekte, ovulasyon öncesi folükül tespit edilmekte (çap 35-40 mm) ve bu aşamada ovulasyon uyarıcı ajan uygulanmaktadır. Kısraklar 24 saat sonra dondurulmuş-çözdürülmüş sperma ile tohumlanmaktadırlar. Bu birinci tohumlamadan 18 saat sonra kısraklar ultrasonla muayene edilmekte ve ovulasyon olsa bile ikinci kez tekrar tohumlanmaktadırlar. Ovulasyon meydana gelmemişse, kısraklar 2.tohumlamadan 12 saat sonra tekrar muayene edilmektedirler. Bu aşamada yine ovulasyon meydana gelmemişse üçüncü kez tohumlama yapılmaktadır. Böylece bu protokolün uygulanmasıyla ovulasyondan 12 saat önce başlayan ve 6 saat

15 sonrasına devam eden süre içerisinde uterusta canlı sperma mevcut olmaktadır. Bu arada bu yöntemin yaşlı kısraklar için uygun olmadığı da (uterus enfeksiyonu riski nedeniyle) bilinmelidir (Loomis ve Squires, 2005; Miller, 2008) Ovulasyondan sonra 6 saat içinde tek tohumlama ile birden fazla tohumlama arasında gebelik oranı bakımından bir farklılık bildirilmemiştir (Loomis ve Squires, 2005). Miller (2008) ABD de 2006 ve 2007 yılları tohumlama sezonlarında saha koşullarında dondurulmuş-çözdürülmüş sperma kullandığı tohumlamalardan elde edilen gebelik oranlarını değerlendirmiştir. Tohumlamada ovulasyon sonrası tek doz uygulaması yapılmıştır. Çalışmada 149 östrus siklusu esas alınmış, folikül çapı 35 mm veya daha büyük olan kısraklar deslorelin (1.5 mg i.m.) uygulaması yapılmıştır. Kısraklar deslorelin uygulamasından 24 saat sonra transrektal palpasyon ve ultrasonla muayene edilmiş; daha sonra ovulasyon tespit edilene kadar 6 saatte bir bu uygulama tekrar edilmiştir. Daha sonra kısraklar kornu uteriye tek doz sperma uygulaması yapılmıştır. Tohumlamadan 4-12 saat sonra 2 litre fizyolojik tuzlu su ile lavaj ve oksitosin (15 IU iv ve 15 IU im) uygulaması yapılmıştır. Tohumlamdan 14-16 gün sonra gebelik teşhisi yapılmış ve 67 gebelik (%45) elde edildiği bildirilmiştir. Sieme ve ark. (2003) tarafından dondurulmuş-çözdürülmüş sperma ile tek bir tohumlamanın ovulasyondan 12 saat önce ve 12 saat sonrayı kapsayan zaman diliminde; soğutulmuş sperma ile tek bir tohumlamanın ovulasyondan 24 saat önce ve 12 saat sonrayı kapsayan zaman diliminde yapılmasının en uygun olduğu; tohumlama yapıldıktan sonra eğer ovulasyon meydana gelmemişse birinci tohumlamadan 24 saat sonra ikinci bir tohumlamanın tavsiye edildiğini bildirilmiştir. Hanofer ırkında dondurulmuş-çözdürülmüş sperma ile yapılan bir araştırmada (Sieme ve ark., 2003) ovulasyonu uyarmak için hcg hormonundan yararlanılmış ve tek doz (800 x 10 6 spermatozoa, çözdürme sonrası motilite oranı en az %35) tohumlama farklı zamanlarda (hcg uygulamasından önceki 24 12 saatlik dilim içinde, hcg uygulamasından önceki 12 0 saatlik dilim içinde ve hcg

16 uygulamasından sonraki 0 12 saatlik dilim içinde) yapılmıştır. Gruplarda gebelik oranı sırasıyla % 30,8; 41,3 ve 50,0 (P<0.05) olmuştur. Aynı çalışmada tek östrüste dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile 2 kez tohumlamanın gebelik oranına etkisi de incelenmiştir. Farklı zaman dilimlerinde (hcg uygulamasından önceki 24 12 saatlik dilim içinde birinci ve hcg uygulamasından sonraki 0 12 saatlik dilim içinde ikinci tohumlama; hcg uygulamasından önceki 36 24 saatlik dilim içinde birinci ve hcg uygulamasından sonraki 12 0 saatlik dilim içinde ikinci tohumlama; hcg uygulamasından önceki 48 36 saatlik dilim içinde birinci ve hcg uygulamasından sonraki 24 12 saatlik dilim içinde ikinci tohumlama) iki kez yapılan tohumlamalardan elde edilen gebelik oranı gruplarda sırasıyla % 61,9; 40,0 ve 66,7 (P<0,05) olmuştur. 1.1.7. Dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlamada kısrağın yaşı Dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile yapılan tohumlamada elde edilen gebelik oranına kısrağın yaşının etkisi de olabilmektedir. Yapılan bir çalışmada damızlıkta ilk defa kullanılan ve 8 yaşından büyük kısraklarda dondurulmuş çözdürülmüş spermayla gebelik oranı %27,7; damızlıkta ilk defa kullanılan ve 8 yaşından küçük kısraklarda ise %43,6 olmuştur (Miller, 2008). Samper (2001), bütün kısraklarda (6 yaşından küçükler hariç) yılda en az bir kez uterus kültürü ve sitolojisi yapılması gerektiği, dondurulmuş-çözdürülmüş sperma kullanılacağı zaman bu durumun çok daha fazla önem kazandığını bildirmiştir. Hanofer ırkında farklı yaş gruplarından (2-4, 5-8, 9-12,13-16 ve 17-21) kısraklar dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlanmışlar ve gruplarda gebelik oranı sırasıyla % 32,9; 30,6; 30,6; 31,4 ve 33,3 bulunmuştur. Yaşın gebelik oranına etkisi önemsiz olmuş, ancak yaşın ilerlemesiyle gebelik oranının az da olsa azaldığı sonra da arttığı görülmüştür (Sieme ve ark., 2003).

17 Fransa da yapılan bir saha çalışmasında (Vidament ve ark., 1997) dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile elde edilen doğum oranını kısrakların yaşı istatistik olarak önemli (P<0,001) etkilemiş; <16 yaşında olan kısraklarda doğum oranı % 54, 16 yaşında olanlarda ise % 42 bulunmuştur. Bu araştırmanın amacı, farklı yaşlardan Safkan Arap atı kısraklarında, dondurulmuş-çözdürülmüş spermayla farklı dozlarda (400x10 6, 800x10 6, 1200x10 6 ) ve farklı zamanlarda (ovulasyon öncesi ve sonrası) yapılan tohumlamaların kısraklarda gebelik üzerine etkisinin araştırılmasıdır.

18 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Araştırma, 2010 yılında Tarım İşletmeleri Genel Müdürlüğü (TİGEM) ne bağlı Sultansuyu, Karacabey ve Anadolu Tarım İşletmeleri Atçılık şubelerinde yürütülmüştür. Araştırmada her bir işletmede 16 baş olmak üzere yaşları 4-19 arasında değişen toplam 48 baş Arap atı kısrağı kullanılmıştır. Kısraklar Karacabey Tarım İşletmesi nde dondurulan Arap atı aygır spermaları ile tohumlanmışlardır. 2.2. Yöntem 2.2.1. Spermanın alınması ve muayenesi Aygırlardan sperma, Missouri tipi sun i vajen kullanılarak kızgın bir kısrak varlığında alınmıştır. Sperma alındıktan sonra dereceli toplama kadehi ile ejakülat miktarı ml olarak belirlenmiştir. Daha sonra steril bir gazlı bez yardımıyla filtre edilerek ejakülatın jeli ayrılmıştır. Spermatozoa motilitesi bilgisayar destekli sperma analiz cihazında (CASA) yapılmıştır (Resim 2.1). Ayrıca ölü ve anormal spermatozoa oranları tespit edilerek spermanın dondurulabilir nitelikte olup olmadığı ortaya konmuştur. Bu amaçla en az %70 motiliteye sahip, %25 den az ölü, %20 den az anormal spermatozoa oranlarına sahip spermalar dondurma işleminde kullanılmıştır. Spermatozoa yoğunluğu fotometrik yöntemle tesbit edilmiştir. Spermanın ph sı ise ph indikatör kağıtları kullanılarak saptanmıştır (Resim 2.2).

19 2.2.2. Spermanın sulandırılması ve dondurulması Missouri tipi sun i vajen ile alınan, muayenesi yapılan ve dondurulmasına karar verilen spermalar için sulandırma ve dondurma işlemine geçilmiştir. Bu amaçla, Benmari içerisinde ısıtılmış olan bir miktar Inra 96 dan boş bir tüpe 190 mikrolitre alınıp üzerine 10 mikrolitre sperma katılıp pipet yardımıyla iyice karışması sağlanmıştır. Bu karışımdan mikropipetle 40 mikrolitre alınıp CASA cihazı içindeki Thoma lamının boş haznesine bırakılmış ve CASA ya spermanın miktarı ve hangi oranda sulandırılacağı girilmiştir. Sayım bittiğinde ekrandaki veriler not edilip cihazın belirlediği oranlarına göre spermanın sulandırılacağı miktar belirlenmiştir. Bu amaçla 0,50 ml lik payette 50x10 6 motil spermatozoa olacak şekilde dozlama yapılmıştır. Sayım işlemi sonrası ortaya çıkan rakamlara göre benmari içerisinde 37 o C de bekletilen ejekulat 1/1 oranında yine benmari içersindeki EQCELLSIRE A sulandırıcı ile karıştırılmış ve karışım miktarına göre sulandırılmış sperma santrifüj işlemi için 2 veya 4 corning tüpe yerleştirilmiştir. Eşit miktarda corning tüplerin tabanına uygun pipet yardımıyla çok yavaş biçimde 3-4 ml EQCELLSIRE B konularak sarsmadan ve çalkalanmadan santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası üstteki spernatant uzaklaştırılarak tabanda kalan pelet üzerine oda sıcaklığında ilk analiz işleminde belirlenen miktar kadar, hazırlanmış olan Inra 96 sulandırıcısı ilave edilerek, homojenize edilmiş ve +4 o C soğuk kabinde saklanmıştır. Payetleme ve markalama işlemi yine otomatik makinada yapılmıştır (Resim 2.3 ve 2.4). Bu işlem için 0.50 ml lik payetler kullanılmıştır. Payetleme ve markalama sonrası payetler goblet içersinde +4 C de 2 saat ekilibrasyona tabi tutulmuştur. Ekilibrasyonu tamamlanmış payetler otomatik dondurma makinasına yerleştirilerek dondurma işlemi başlatılmıştır. Dondurma işlemi +4 o C den -145

20 o C ye (50 o C/dk) toplam 4 dakika içerisinde gerçekleştirilmiş ve dondurulan payetler -196 o C de depolanmıştır.dondurulmuş spermalar 37 o C de 30 saniyede çözdürülerek dondurma işleminin başarısı CASA cihazında test edilmiştir. İnceleme sonrası motil spermatozoa oranı %50 ve üzerinde olan dondurulmuş spermalar depolanarak sun i tohumlamada kullanılmıştır. 2.2.3. Kısraklarda östrusun belirlenmesi Aygır Muayenesi Kısraklar sıfat mevsiminde aygıra gösterilerek muayene edilmiş östrüs belirtilerinin tam (aygıra karşı aşırı ilgi, kesik kesik işeme, vulva dudaklarını açıp kapama, kuyruğunu kaldırma, arka bacakları üzerine hafif çökme) ya da eksik gözlenmesine göre değerlendirilmiştir. Spekulum Muayenesi Kısraklarda vagina ve serviksin spekulumla muayenesi yapılarak östrus döneminde vajen koyu pembe ve parlak, bir miktar sekresyon gözlenenler ve ayrıca serviks ağzı tabana yayılmış olanlar kaydedilmiştir. Rektal Muayene Kısrakların rektal muayenesi yapılarak ovaryumlar üzerinde Graaf follükülü ve uterusta ödem hissedilenler östrusta kabul edilmişlerdir. Ultrason Muayenesi Kısrakların uterus ve ovaryumları ultrason ile muayene edilerek ovaryumlar üzerinde çapı 35 mm ve üzeri olan, ultrasonda fluktuan ve çevresi düzensiz olarak belirlenen follikül ve aynı zamanda uterusu ödematöz ve tonusu artmış olduğu için

21 ultrasonda endometrimu dilimlenmiş portakal gibi bir görünüme ve intralaminal sıvıda ise hipoekoik yapıya sahip olan kısraklar östrusta olarak kaydedilmiştir. 2.2.4. Kısrakların Tohumlanması Yukarıdaki metotlarla östrusta olduğu belirlenen ve üç işletmede bulunan toplam 48 baş kısrak 3 gruba ayrılarak 3 farklı dozda (400 x 10 6, 800 x 10 6 ve 1200 x 10 6 ) ve iki farklı dönemde (ovulasyon öncesi ya da sonrası) dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile vaginal tohumlama metoduyla serviksin son 1/3 ne verilerek tohumlanmıştır (Çizelge 2.1, 2.2 ve 2.3). Tohumlama; ovulasyon öncesi gruplarda ovaryumlarda follikül büyüklüğü 40-45mm de tohumlama yapılmıştır. Ovulasyon sonrası tohumlanan gruplarda ise; uterus muayenesi ile ovulasyon kontrol edilmiş ve ovulasyon gerçekleşenler tohumlanmıştır. Bu amaçla 1. gruptaki kısraklar her biri 50 x 10 6 motil spermatozoa içeren 8 payet ile (400 x 10 6 ), 2. gruptaki kısraklar 16 adet payet ile (800 x 10 6 ) ve 3. gruptaki kısraklar ise 24 payet ile (1200 x 10 6 ) tohumlanmışlardır. Kısrakların ovulasyon takibi ultrasonla yapılmıştır. Tohumlamadan sonra 15. günde kısraklar ultrasonla muayene edilerek gebelik durumları kontrol edilmiştir. Aynı zamanda kısraklar yaşlarına göre de değerlendirmeye alınmışlardır. Buna göre kısraklar 2 gruba (4-11 ve 12-19) ayrılmışlardır. 2.2.5. İstatistik Analizler İstatistiki analizlerde gebelik oranına etki eden sperma dozu, tohumlama zamanı ve yaş faktörleri En Küçük Kareler Yöntemi ile incelenmiştir. Kısraklar yaş bakımından 2 gruba (4-11, 12-19) ayrılmışlardır. İncelenen faktörlerin etkilerinin önemliliği için variyans analizi uygulanmıştır. Hesaplamalarda SPSS paket programı kullanılmıştır (Anonim, 2001).

22 Çizelge 2.1. Sultansuyu Tarım İşletmesi Müdürlüğü nde araştırma materyaline ait tohumlama bilgileri Tohumlama Zamanı Sıra Kısrağın Kısrağın Adı Aygırın Adı Oulasyondan Ovulasyondan No Yaşı Önce Sonra 1. 78.K.Irak 50-06 Özgünhan 4 + 2. 32.Alseklavi 62-06 Pirkaraca 4 + 3. 36.B.Gülü 71-05 Özgünhan 5 + 4. 32.Zahide 19-92 Bilgin 18 + 5. 41.Sübeyhi 3-05 Çaş 5 + 6. 34.B.Gülü 21-03 Tamerinoğlu 7 + 7. 28.Oyuncu 62-06 Bilgin 4 + 8. 80. Matra 41-98 Bilgin 12 + 9. 48.Neame 16-91 Ağa karaca 19 + 10. 86.Matra 77-06 Ağa karaca 4 + 11. 58.Şahide 33-03 Bilgin 7 + 12. 67.Mesrure 9-06 Özgünhan 4 + 13. 30.Rode 45-04 Pirkaraca 6 + 14. 45.K.Şemsa 65-05 Tamerinoğlu 5 + 15. 37.Sübeyhi 55-00 Özgünhan 10 + 16. 34.Mahide 63-05 Pirkaraca 5 +

23 Çizelge 2.2. Karacabey Tarım İşletmesi Müdürlüğü nde araştırma materyaline ait tohumlama bilgileri Tohumlama Zamanı Sıra Kısrağın Kısrağın Adı Aygırın Adı Ovlasyondan Ovulasyondan No Yaşı Önce Sonra 1. 39.T.Nur 132/05 Araslı 5 + 2. 18.Zafire 73/98 Araslı 12 + 3. 51.Gufre 5/91 Araslı 19 + 4. 68.Neame 7/04 Atak 6 + 5. 13.Behre 60/02 Atak 8 + 6. 27.Rode 13/99 D.Kazık 11 + 7. 44.Mahsuse 76/93 D.Kazık 17 + 8. 48.Mahsuse 60/99 Koşayalp 11 + 9. 72.Neame 50/06 Koşayalp 4 + 10. 123.Zehra 30/97 Hisarhan 13 + 11. 1.All Most 18/00 D.Kazık 10 + 12. 51.Ş.Havva 89/04 Hürbatur 6 + 13. 25.Mahide 26/99 Hürbatur 11 + 14. 47.Kırşemsa 102/03 Araslı 7 + 15. Ekoletta Atak 15 + 16. 85.Matra 115/04 Koşayalp 6 +

24 Çizelge 2.3. Anadolu Tarım İşletmesi Müdürlüğü nde araştırma materyaline ait tohumlama bilgileri Tohumlama Zamanı Sıra Kısrağın Kısrağın Adı Aygırın Adı Oulasyondan Ovulasyondan No Yaşı Önce Sonra 1. 56. Mesrure 8-97 Altaha 13 + 2. Elasay 70.K.Irak 41-03 Araslı 7 + 3. Safigül 68. Seyyare 14-00 Altaha 10 + 4. 29. Sapha 25-95 Ağakaraca 5 + 5. 21.Oyuncu 4-97 Tamerinoğlu 13 + 6. 47. Mencule 78-90 Altaha 10 + 7. 48. Şahide 9-94 Altaha 16 + 8. Sahragülü 35.Sahra 5-00 Altaha 10 + 9. 14.Zafire 46-93 Altaha 17 + 10. Sultannur 36.T.Nur 17-00 Bilgin 10 + 11. 41.Necme 14-97 Altaha 13 + 12. 35.Sapha 43-97 Tamerinoğlu 13 + 13. Şekerpare 38. T.Nur 44-04 Tamerinoğlu 6 + 14. Sahibe 81. Matra 60-99 Bilgin 11 + 15. 121.Zehra 50-96 Bilgin 14 + 16. Sevilcan 40.Sübeyhi 61-02 Araslı 18 +

25 Resim 2.1. CASA Resim 2.2. Laboratuvar

26 Resim 2.3. Payetleme makinası Resim 2.4. Jet printer

27 3. BULGULAR 3.1. Sperma Dozu 3.1. 1. Sperma dozu 400 x 10 6 ile tohumlanan kısraklarda gebelik Tohumlama dozu 400 x 10 6 olan dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlanan kısraklarda gebelik durumuyla ilgili bulgular Çizelge 3.1. de verilmiştir. Ovulasyondan önce tohumlanan 8 kısraktan 2 si gebe kalmış; ovulasyondan sonra tohumlanan 8 kısrağın ise hiçbiri gebe kalmamıştır. Bu grupta gebelik oranı % 11,7 ± 9,4 hesaplanmıştır (Çizelge 3.4). 3.1.2. Sperma dozu 800 x 10 6 ile tohumlanan kısraklarda gebelik Dozu 800 x 10 6 olan dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlanan kısraklarda gebelik durumuyla ilgili bulgular Çizelge 3.2. de verilmiştir. Ovulasyondan önce tohumlanan 8 kısrağın 4 ü; ovulasyondan sonra tohumlanan 8 kısrağın ise 2 si gebe kalmıştır. Bu grupta gebelik oranı % 37,0 ± 11,7 hesaplanmıştır (Çizelge 3.4). 3.1.3. Sperma dozu 1200 x 10 6 ile tohumlanan kısraklarda gebelik Dozu 1200 x 10 6 olan dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile tohumlanan kısraklarda gebelik durumuyla ilgili bulgular Çizelge 3.3. de verilmiştir. Ovulasyondan önce tohumlanan 8 kısrağın 3 ü, ovulasyondan sonra tohumlanan 8 kısrağın 3 ü gebe kalmıştır. Bu grupta gebelik oranı % 37,5 ± 11,4 hesaplanmıştır (Çizelge 3.4).

28 Çizelge 3.1. Ovulasyondan önce ve sonra 400 x 10 6 sperma dozu ile tohumlanan 1. grup kısraklarda gebelik durumu Sıra Kısrağın Adı Tohumlama Zamanı Gebelik No Oulasyondan Önce Ovulasyondan Sonra Durumu Yaş 1. 78.K.Irak 50-06 4 + Gebe Değil 2. 32.Alseklavi 62-06 4 + Gebe Değil 3. 36.B.Gülü 71-05 5 + Gebe Değil 4. 32.Zahide 19-92 18 + Gebe Değil 5. 41.Sübeyhi 3-05 5 + Gebe Değil 6. 34.B.Gülü 21-03 7 + Gebe Değil 7. 28.Oyuncu 62-06 4 + Gebe 8. 80. Matra 41-98 12 + Gebe 9. 48.Neame 16-91 19 + Gebe Değil 10. 86.Matra 77-06 4 + Gebe Değil 11. 58.Şahide 33-03 7 + Gebe Değil 12. 67.Mesrure 9-06 4 + Gebe Değil 13. 30.Rode 45-04 6 + Gebe Değil 14. 45.K.Şemsa 65-05 5 + Gebe Değil 15. 37.Sübeyhi 55-00 10 + Gebe Değil 16. 34.Mahide 63-05 5 + Gebe Değil Gebelik Oranı (%) 25,0 0,0

29 Çizelge 3.2. Ovulasyondan önce ve sonra 800 x 10 6 sperma dozu ile tohumlanan 2.grup kısraklarda gebelik durumu Sıra Kısrağın Adı Tohumlama Zamanı Gebelik No Oulasyondan Önce Ovulasyondan Sonra Durumu Yaş 1. 39.T.Nur 132/05 5 + Gebe Değil 2. 18.Zafire 73/98 12 + Gebe Değil 3. 51.Gufre 5/91 19 + Gebe Değil 4. 68.Neame 7/04 6 + Gebe 5. 13.Behre 60/02 8 + Gebe Değil 6. 27.Rode 13/99 11 + Gebe 7. 44.Mahsuse 76/93 17 + Gebe 8. 48.Mahsuse 60/99 11 + Gebe 9. 72.Neame 50/06 4 + Gebe Değil 10. 123.Zehra 30/97 13 + Gebe Değil 11. 1.All Most 18/00 10 + Gebe Değil 12. 51.Ş.Havva 89/04 6 + Gebe 13. 25.Mahide 26/99 11 + Gebe Değil 14. 47.Kırşemsa 102/03 7 + Gebe Değil 15. Ekoletta 15 + Gebe Değil 16. 85.Matra 115/04 6 + Gebe Gebelik Oranı % 50,0 25,0

30 Çizelge 3.3. Ovulasyondan önce ve sonra 1200 x 10 6 sperma dozu ile tohumlanan 3. grup kısraklarda gebelik durumu Sıra Kısrağın Adı Tohumlama Zamanı Gebelik No Oulasyondan Ovulasyondan Durumu Yaş Önce Sonra 1. 56. Mesrure 8-97 13 + Gebe Değil 2. Elasay 70.K.Irak 41-03 7 + Gebe Değil 3. Safigül 68. Seyyare 14-00 10 + Gebe 4. 29. Sapha 25-95 5 + Gebe Değil 5. 21.Oyuncu 4-97 13 + Gebe Değil 6. 47. Mencule 78-90 10 + Gebe Değil 7. 48. Şahide 9-94 16 + Gebe 8. Sahragülü 35.Sahra 5-00 10 + Gebe 9. 14.Zafire 46-93 17 + Gebe Değil 10. Sultannur 36.T.Nur 17-00 10 + Gebe Değil 11. 41.Necme 14-97 13 + Gebe 12. 35.Sapha 43-97 13 + Gebe Değil 13. Şekerpare 38. T.Nur 44-04 6 + Gebe 14. Sahibe 81. Matra 60-99 11 + Gebe Değil 15. 121.Zehra 50-96 14 + Gebe 16. Sevilcan 40.Sübeyhi 61-02 18 + Gebe Değil Gebelik Oranı % 37,5 37,5