T.C FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BALIKLARDA SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDAN SAVUNMA SİSTEMİ Hacı Bayram GÖKHAN DOKTORA SEMİNERİ SU ÜRÜNLERİ YETİŞTİRİCİLİĞİ ANABİLİM DALI ELAZIĞ, 2007 1
1. GİRİŞ: Hayvansal protein kaynağı olarak, hem kolay hem de ucuz sağlanabilen besinlerin başında su ürünleri gelmektedir. Özellikle balık eti, insanlar için besin değeri ve protein kalitesi bakımından çok önemli bir yere sahiptir. Ayrıca omega 3 yağ asitleri ve antioksidanlar bakımından oldukça zengin olmasından dolayı diyetlerde önemli bir yeri vardır. Balıklar doğada olduğu kadar, yetiştiricilik ortamları veya laboratuvar gibi yapay ortamlarda da birçok stres faktörlerine (Çevre kirliliği, hastalıklar, balık hastalıklarının tedavisinde kullanılan ilaçlar, balık boylama, taşıma ve aşılama, balıkların elle tutulması, balıkların sağımları esnasında zedelenmesi, tek yönlü beslenme) maruz kalırlar. Stres cevabı tüm canlı organizmalarda hayati bir öneme sahiptir. Yetiştiricilikte ekonomik kayıplara neden olan bu olumsuzlukların yaşanmaması için; kaliteli su, yeterli besin, uygun çevre ve su stoku temin edilmesi, koruyucu önlemler alınarak hastalıkların önüne geçilmesi ve balığın ürkmesine neden olacak davranışlardan kaçınılması ilk akla gelen önlemlerdir (Iwama ve diğ., 2004; Atamanalp ve Atılgan 2006). Balıkların antioksidan savunma mekanizmaları; konakçı dokusunda hasara neden olan etkenleri ortadan kaldıran veya yayılmasını sınırlayan, enfeksiyonun meydana gelmesini engelleyen ya da enfeksiyona karşı vücudun cevap vermesini sağlayan faktörlerin birçoğunu içine almaktadır. (McDowell 1989; Blazer 1992). Canlıların birçoğunda olduğu gibi balıklar da yaşamlarını sürdürebilmek için oksijene ihtiyaç duyarlar. Moleküler oksijen aminoasitlerin katabolizması, ilaçların detoksifikasyonu ve steroid hormonların sentezi gibi spesifik metabolik yollar için önemlidir. Bu reaksiyonlarda diğer oksidazlar (oksijeni suya veya hidrojen perokside indirgeyen enzimler) ve oksijenazlar (oksijeni, okside olan moleküle bağlayan enzimler) görev alırlar (Yanbeyi, 1999). Oksijenin dış yörüngesine bir veya daha fazla eşleşmemiş elektron eklenmesiyle bu molekül güçlü bir toksine, yani bir serbest oksijen radikaline dönüşür. Bu bileşikler de son yörüngelerinde eşlenmemiş elektron içerdikleri için kolayca diğer moleküllerle reaksiyona girerek onları tahrip edebilen bileşikler oluştururlar ve organizmada çok etkili bir hasar meydana getirirler (Slater, 1984; Oyanagui, 1991; Frei, 1994; Yanbeyi, 1999). Bugün, oksijenin canlılardaki toksik etkisinin "oksijen radikalleri" olarak adlandırılan ve oksijenin metabolizması sırasında oluşan reaktif türlerden kaynaklandığı bilinmektedir. Oksijenin kısmi olarak redüksiyonu sonucu oluşan çeşitli reaktif oksijen türevleri (ROS) hücre kompanentleri için toksik etkiye sahiptir Aerobik yaşamın normal bir bağlamı olan oksidatif reaksiyonlar sonucunda ortaya çıkan reaktif oksijen türleri, DNA, proteinler, karbonhidratlar ve lipitler gibi makro moleküler hücresel yapılara kovalent bağlanarak yapısal hasar meydana getirir. Bu yüzden reaktif oksijen türevlerinin meydana getirdiği oksidatif hasara, oksidatif stres adı 2
verilir. Ksenobiyotiklerin metabolizması sonucu fazlaca reaktif oksijen türevleri (ROS) oluşur ve kronik çevresel kirlilik nedeniyle akuatik organizmalar genelde aşırı oksidatif strese maruz kalır (Ariza ve diğ.,1999). Balıklar diğer omurgalılardan farklı olarak ya günlük ya da mevsimsel sıcaklık ve oksijen değişikliğine maruz kaldıkları için kararsız çevre şartlarına uyum sağlayan metabolizmaya sahiptirler. Bu savunma mekanizması da diğer omurgalılardan farklı değildir ve hem enzimatik olan hem de enzimatik olmayan yapıları kapsar (Borazan-Özkurt, 2006). Akuatik organizmalarda türler arasında nicelik açısından farklılıklar olmasına rağmen antioksidan enzimlerin varlığı bilinmektedir. Antioksidan enzimler, hücre hemostazisinde rol oynar. Antioksidanlar vücutta çeşitli yollarla oluşan serbest radikallerin doku ve hücrelere verdiği zararları önlemeye yardımcı olur. Oksijen radikallerinin etkisiyle ortaya çıkabilecek oksidatif hasarları önlemek amacıyla canlı sistem tarafından gerçekleştirilen pek çok korunma mekanizması vardır. Bunlar intrasellüler ve ekstrasellüler olmak üzere iki gruba ayrılır (Ames ve ark., 1993; Halliwell, 1999; Yanbeyi, 1999). İlk ve temel antioksidan savunma, enzimatik olarak yapılmaktadır. En önemli intrasellüler enzimlerin; Süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz ve katalaz olduğu bilinmektedir. Sonraki savunma hattı ise ekstrasellüler nonenzimatik antioksidanlar tarafından oluşturulur. Bunlar; E vitamini, C vitamini, β-karoten, transferrin, seruloplazmin, albumin, haptoglobin, ubikinon (koenzim Q lo ) gibi bileşiklerdir (Halliwell ve Gutteridge, 1999; Bast ve ark., 1997; Yanbeyi, 1999). 3
2. SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDAN SAVUNMA SİSTEMİ İLE İLİŞKİSİ Serbest radikaller canlıdaki hücreleri parçalayarak yaşlanmaya ve hastalıklara yol açan tahrip edici molekülerdir. Eşleşmemiş elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar. Ancak Fe +3, Cu +2, Mn +2 ve Mo +5 gibi geçiş metalleri de ortaklanmamış elektronlara sahip oldukları halde serbest radikal olarak kabul edilmezler, fakat serbest radikal oluşumuna neden olurlar. Çünkü Fe +3 veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu (Şekil 2. 1. A), süperoksit radikalinin (O 2 ) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu (Şekil 2. 1. B), en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (HO ) oluşturur. Serbest radikaller pozitif yüklü (katyon), negatif yüklü (anyon) veya elektriksel olarak nötral olabilir. (A) (B) Şekil 2. 1. Fenton reaksiyonu (A) ve Haber-Weiss reaksiyonu (B) sonucu serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (HO ) oluşması (Altınışık, 2006). Serbest radikaller organizmada kanser, kalp krizi, felç, ateroskleroz, diyabet vb. gibi hastalıklara neden olmaktadır. Serbest radikaller temel olarak oksijen kaynaklı olan süperoksit, hidrojen peroksit, hidroksil radikali, hipoklorik asit, azot dioksit, ozon ve lipit 4
peroksit gibi metabolitlerdir. Bu serbest radikallerin oluşumuna çevresel toksinler, çeşitli ilaçlar, hava kirliliği, sigara, alkol, radyasyon, aşırı alınmış oksijen, çözücüler, petrokimya ürünleri, işlenmiş gıdalarda bulunan bazı maddeler neden olmaktadır. Ayrıca hücre mitokondrisinde enerji üretildiği zaman yan ürün olarak serbest radikaller oluşabilir. Bağışıklık sisteminde yabancı organizmaları yok etmek için metabolizma kendisi serbest radikal üretir. Serbest radikaller ile mücadelede üç grup savunma hattı vardır. Bunlar hücre içi enzim sistemi, hücre dışı savunma sistemi, dışardan alınan besinler yani antioksidanlardır (Ames ve diğ., 1993; Frei,1994; Augustin ve diğ., 1997; Klebanoff, 1998; Babior, 2000; Öner, 2004). Antioksidanlar serbest radikaller için kolay bir elektron hedefi oluşturur. Bağlanan iki serbest radikali birleştirerek nötralize edebilme özeliğine sahip bir enzime taşınana kadar radikalle istikrarlı bir yapı oluşturur. Eğer serbest radikaller nötralize edilmezlerse vücutta DNA mutasyonları, hücre ölümleri ve hastalıkları gibi çok ciddi hasarlara neden olabilirler (Thompson, 2004). Bu hasarlardan bazıları: hücre membranı proteinlerini yıkarak hücreleri öldürmek, membran lipit ve proteinlerini yok ederek hücre membranını sertleştirip hücrenin fonksiyonunu engelleme, nükleer membranı yararak nükleustaki genetik materyale etki edip DNA 'yı kırılma ve mutasyonlara açık hale getirmek, bağışıklık sistemindeki hücreleri yok ederek bağışıklık sistemini zayıflatmaktır. 2. 1. Moleküler Oksijen Canlılar için oksijenin önemli iki temel fonksiyonu vardır. Bunlar; a) Canlı organizmayı oluşturan moleküllerin yapısına katılması, b) Besin kaynağı olan maddelerin yapısındaki ana elementlerden birisi olmasıdır. Moleküler oksijen kendi başına hiçbir canlıda toksik etkili değildir, ancak hücrede metabolize edilirken bazı toksik ana ürünlere dönüşür. Oksijenin tek elektron ile tam olmayan indirgenmesi sonucu reaktif türleri olan oksijen radikalleri oluşur ve bu radikaller oksijenin toksik etkilerinin tamamından sorumludur (Tekkes, 2006). 5
Moleküler oksijenden su oluşuncaya kadar oluşan radikallerin başlıcaları; Süperoksit anyon radikali, hidroksil radikali, tekli oksijen, hidrojen peroksit, hidroperoksit ve peroksit radikalidir (Şekil 2. 2). O 2 Moleküler oksijen Süperoksit radikali (süperoksit anyonu) H 2 O 2 Hidrojen peroksit H 2 O + HO Hidroksil radikali H 2 O Su Şekil 2. 2. Moleküler oksijenden su oluşuncaya kadar oluşan radikaller (Altınışık, 2006). 6
2. 2 Reaktif oksijen türleri (ROS) Reaktif oksijen türleri, çeşitli serbest radikallerin oluştuğu serbest radikal zincir reaksiyonlarını başlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller (R ), peroksit radikalleri (ROO ), alkoksi radikalleri (RO ), organik peroksitler (ROOH), hidroperoksi (ROO - ) tiyil radikalleri (RS ), sülfenil radikalleri (RSO ), tiyil peroksit radikalleri (RSO 2 ) gibi çeşitli serbest radikallerin oluşumuna neden olurlar (Altınışık, 2006). 2. 2. 1 Süperoksit Radikalleri Moleküler oksijenin tek elektron indirgenmesi sonucu oluşan ve oksijen metabolizmasında en sık karşılaşılan, genellikle ilk olarak meydana gelen, ana oksijen radikali diye bilinen oksijen radikalidir. Mitokondriyal oksijenin yaklaşık % 4'ü solunum zinciri reaksiyonlarındaki elektron akışı ile süperoksit, hidrojen peroksit, tekli oksijen, hidroksil radikali gibi reaktif oksijen türlerini oluşturarak eksik redüksiyona uğramaktadır (Altınışık, 2006). Temel halde moleküler oksijen dış orbitallerinde eşleşmemiş bir elektron içerir. Bu dış orbitallerin her biri birer elektron daha kabul edebilir. Orbitallerin tek elektron alması ile süperoksit anyonu, iki elektron alması ile peroksil anyonu oluşur. Süperoksit radikali bir oksitleyici gibi davranarak bir elektron daha alabilir, böylece oluşan peroksil anyonu ortamdan iki proton alarak hidrojen peroksiti oluşturabilir Süperoksit radikali aldığı tek elektronu tekrar vererek oksijene oksitlenebilir ve böylece bir indirgeyici olarak davranabilir. Veya iki süperoksit radikali birbiri ile etkileşerek biri oksitlenirken diğeri indirgenir ve böylece hidrojen peroksit ve moleküler oksijen meydana gelir. O 2 - + H + HO 2 - HO 2 - + O 2 - + H + H 2 O 2 + O 2 O 2 - + O 2 - + 2H + H 2 O 2 + O 2 Süperoksit radikallerin ortamdan temizlendiği bu tepkimeye "dismutasyon tepkimesi" denir. Eğer bu tepkimede katalizör olarak süperoksit dismutaz enzimi varsa tepkime kendiliğinden dismutasyondan 10 9 kez daha hızlı gerçekleşir. Reaksiyon sonucu açığa çıkan hidrojen peroksit, hücrede antioksidan enzim olarak bilinen katalaz ve glutatyon peroksidaz enzimleri ile parçalanarak zararlı etkisi ortadan kaldırılır. 7
Hücrelerin normal koşullarda süperoksit üretmelerinin yanı sıra bazı çevresel etkenler de bu radikalin hücrede fazla miktarda yapımına neden olurlar. Bu etkenlerin başında bazı kimyasal bileşikler ve ilaçlar ile yüksek enerjili ışınlar (radyasyon) gelir. Süperoksit radikalleri; a) Flavin veya demir-sülfür merkezleri içeren proteinler olmak üzere pek çok enzimatik tepkimelerde b) Bazı oksidaz ve hidroksilaz tepkimelerde c) Mitokondride elektron transportu sırasında d) Çeşitli biyolojik moleküllerin oto oksidasyonunda e) Fagositozda olduğu gibi çeşitli hücrelerin özgül fonksiyonları sırasında, üretilen bir oksijen metabolitidir. Süperoksit radikalinin amaçlı olarak üretildiği fagositozda, fagosite edilen partikülü parçalamak için, glikoz ve oksijen tüketimi artar. Fagositoz yapan hücrelerde (nötrofil, eozinofil ve makrofajlar) normalin 10 15 katına çıkan oksijen tüketimi, oksijenin fagozom zarındaki NADPH oksidaz tarafından süperoksit üretiminde kullanılmasının sonucudur (Babior, 2000). Süperoksit radikali, hidrojen peroksit ile tepkimeye girerek hidroksil radikali ve tekli oksijen oluşturabilir. O 2 - + H 2 O 2 O 2 + HO - + HO olur. veya diaçil peroksitlerle olduğu gibi, diğer tepkimelerle tekli oksijen yapımına neden O 2 - + HO - 1 O 2 + HO 2O 2 + R-C-O-O-C-R 1 O 2 + 2RC00 - Oluşan bu radikaller, diğer radikal tepkimeleri başlatırlar ve süperoksitin kendisinden çok daha reaktif ve toksik etkilidirler. (Yıldız, 2001). 2. 2. 2 Hidroksil Radikali (HO ) Süperoksit dismutaz bulunmayan bir ortamda süperoksit üretilirse, kısa süre için bile olsa, süper oksit birikimi olur ve kendi dismutasyon ürünü olan hidrojen peroksit ile tepkimeye girerek hidroksil radikali ve tekli oksijenin üretimine neden olur (Yıldız, 2001). Demir şelatı - O 2 + H 2 O 2 HO - + HO + 1 O 2 8
Hidroksil radikali, biyolojik sistemlerde oluşabilen en reaktif ve en toksik bileşiktir ve aşağıdaki tepkimelerle meydana gelir. I. İyonlaştırıcı radyasyonun suya etkisiyle II. Fenton tepkimesiyle III. H 2 O 2 'nin fotoliziyle IV. Ozona elektron transferiyle V. Radikal tepkimeleriyle oluşan diğer bir organik radikalin H 2 O 2 ile tepkimeye girmesiyle Oluşan hidroksil radikallerin verdiği tepkimeler aşağıdaki şekildedir (Altınışık, 2006); 1. Hidrojen çıkarma tepkimeleri ile organik radikal oluşturur. 2. Çift bağ içeren aromatik bileşiklere katılarak aromatik aminoasitlerin hidroksilasyonuna ve toksik etkili aldehitlerin oluşumuna neden olurlar. 3. Anorganik ve organik bileşiklerde elektron transfer tepkimelerine neden olur. 2. 2. 3 Tekli (Singlet ) Oksijen ( 1 O 2 ): Ortamda süperoksit birikmesi durumunda kendiliğinden dismutasyon ile oluşabilen bir radikaldir. Tekli oksijen, hidroksil radikali gibi çok reaktif olup çok düşük derişimlerde bile bütün canlılar için toksik etkilidir. Bu iki radikalin biyolojik moleküller ile tepkimeye girme 9
hızları moleküllerin difüzyonu limitine yakındır. Yine hidroksil radikali oluşumunda olduğu gibi özellikle Haber- Weiss tepkimesi ile oluşur (Kırşan, 2002 ). Tekli oksijenin oluşturduğu diğer tepkimeler ise şunlardır (Akkuş, 1999); 1. Süperoksit radikali ile hidroksil radikalinin etkileşmesi 2. Süperoksit radikalinin üretimi sırasında kendiliğinden dismutasyon 3. Fagositoz yapan hücrelerde fagositoz sırasında hidrojen peroksit ve halojen bağımlı miyeloperoksidaz (MPO) enzimiyle 4. Süperoksit radikalinin diaçilperoksitlerle etkileşmesiyle Bu tepkimeler in vivo ortamda gerçekleşir. 2. 2. 4 Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) : Hidrojen peroksit reaksiyona girdiği maddeye bağlı olarak yükseltgen veya indirgen olarak görev yapabilir. Zararlı oksijen radikallerinin oluşumundan sorumludur. Hidrojen peroksit, hücre membranlarından kolayca geçebilir ve uzun ömürlü bir oksidandır. Asıl üretim süperoksitin dismutasyonu ile olur. SOD 10
oluşturur. Bu tepkime ya kendiliğinden ya da süper oksit dismutaz varlığı ile gerçekleşir. H 2 O 2, kendi başına bir radikal olmadığı halde süper oksit ile tepkimeye sahip HO radikalini Bu tepkime katalizörle veya katalizörsüz gerçekleşebilir. (Fe +3 ) kullanılırsa oldukça hızlı gerçekleşir. Katalizör olarak demir Süperoksit radikali burada geçiş metalleri iyonlarını indirger. (Fe +3 haldeki geçiş metalleri hidrojen peroksit ile daha reaktiftir (Yıldız,2001). Fe +2 ) Bu 2. 2. 5 Lipid peroksit radikali (LOO ): Hücre zarında bulunan yağlı moleküller serbest radikaller tarafından hücuma uğradığında hücre zarındaki lipitlerden bir elektron alınır ve lipid peroksit serbest radikali meydana gelir. Çoklu doymamış yağ asitlerinin oksidasyonu (PUFA'nın oksidasyonu) ile yağ asidi radikali (L ) oluşur. Bu radikal oksijenle hızla reaksiyona girerek lipid peroksit radikali (LOO ) meydana gelir. Bu radikal ise zincirleme tepkimenin taşıyıcısıdır ve başka bir yağ asidini (LH) oksitleyerek yeni bir zincir tepkimesi başlatır. Açığa çıkan lipid hidroperoksit (LOOH) yıkılarak reaktif radikalleri ve aldehitler oluşur (Tekkes, 2006). Lipid peroksidasyonu sırasında oluşan aldehitlerden malondialdehit ve 4-hidroksi-nonenal oluşum yerlerinden kolayca difuz edilerek hücrenin diğer bölümlerinde hasara yol açar (Yıldız, 2001). 11
Metal iyonlarının serbest radikal reaksiyonlarındaki asıl önemi lipid peroksidasyonundaki etkileriyle ilgilidir. Geçiş metalleri lipid peroksidasyonunu başlatmaktan çok, sentezlenmiş olan lipid hidroperoksitlerinin parçalanmalarını ve lipid peroksidasyonunun zincir reaksiyonlarını katalize ederler. Böylece daha az zararlı olan radikalleri daha zararlı hale getirirler (Yıldız, 2001). 2. 2. 6 Hipoklorik asit (HOCl): Bağışıklık sistemine ait hücreler dış kaynaklı saldırganlara karşı hücuma geçtiklerinde doğal olarak oluşturulan hipoklorik asit, hidrojen peroksit ve klorun bir araya gelmesiyle oluşur ve yıkıcı özelliktedir. Hipoklorik asit (klorlu beyazlatıcılarda bulunan bir madde), hem proteinler ve onların yapı taşları (aminoasitler) için hem de DNA'daki kodlamayı oluşturan nükleotid bazları için bilhassa tahrip edicidir (Kırşan, 2002). 2. 2. 7 Nitrik oksit (NO ): Nitrik oksit hem fizyolojik hem patofizyolojik süreçlerde önemli bir role sahip serbest radikaldir. Nitrik oksit sentezi bazı hücrelerde bir reseptöre bir stimülatörün bağlanmasına veya nöronlarda bir sinir uyarısına yanıt olarak meydana gelir. Nitrik oksit, muskarinik veya histamin reseptörleri gibi çeşitli reseptörlerin aktivasyonu sonucu L-arjinin ve oksijenden, nitrik oksit sentaz (NOS, EC 1.14.13.39) etkisiyle sentezlenir. Nitrik oksit Fe-S proteinlerinden demiri çıkararak yerine kendisi bağlanır, böylece Fenton reaksiyonunu stimüle eder ve bu mekanizma ile karsinogeneziste rol oynar (McSorley, 1998). Nitrik oksitin süperoksit dismutaz enzimiyle yarışmaya girmesi ve süperoksit radikaliyle etkileşmesi sonucu peroksinitrit oluşur. Böylece nitrik oksitin fizyolojik etkisi inhibe edilir, oksidatif etkisi ortaya çıkar (McSorley, 1998; Altınışık, 2006). Peroksinitrit, nitrik oksit toksisitesinin başlıca sorumlusudur. Peroksinitritin proteinlere doğrudan zararlı etkileri vardır ve azot dioksit (NO 2 ), hidroksil radikali, nitronyum iyonu (NO + 2 ) gibi toksik ürünlere dönüşür. Peroksinitrit, nitrit (NO 2 ) ve nitrat (NO 3 ) oluşturmak üzere metabolize edilir. Nitrik oksit radikalinin stabil son ürünleri nitrit ve nitrattır. Plazma gibi çoğu vücut sıvısında nitritin çoğu nitrata dönüşür (McSorley, 1998). 12
2. 3. Fagositoz Olayı ve Serbest Radikallerle İlişkisi Fagositik sistem; bir mikroorganizma veya yabancı partikülün yakalanarak tahrip edilmesi veya vücuttan uzaklaştırılmasında en önemli ve erken savunma mekanizmalarından biridir. Nötrofiller ve makrofajlar balığın hücresel non-spesifik savunma mekanizmalarında önemli bir role sahiptirler. Fagositoz, solunumsal patlama adı verilen bir reaksiyonla ilişkilidir. Bu reaksiyon vücutta oksijen ve glikoz tüketiminin artmasıyla süperoksit radikalleri ve diğer oksijen metabolitlerinin şekillenmesi ile karakterizedir. Bu radikaller fagosite edilmiş mikroorganizmaları öldürmek veya hücre içi bakteri öldürücü reaksiyonlar için kullanılır. Aslında bu oksidan moleküller belirli bir düzeyde kaldıklarında, organizmanın yabancı maddeler ve enfeksiyöz ajanlara karşı önemli savunma moleküllerindendir. Aktive olmuş makrofajlar, nötrofiller ve eozinofillerde fagositoz sırasında da çeşitli serbest radikaller oluşur (Şekil 2. 3 ) (Babior, 2000; Altınışık, 2006). Şekil 2. 3. Aktive olmuş nötrofillerde fagositik patlama sonucu radikal oluşumu (Altınışık, 2006). Fagositik lökositler, opsonize mikroorganizmalar, C5a kompleman faragmanı, lökotrien B 4, bakteriyel orijinli N-formil oligopeptitler gibi partiküler veya çözünebilir bir uyarıcıyla uyarıldıklarında lizozomal komponentleri dışarıya vermeye başlarlar. Reaktif oksijen türlerinin oluşmasıyla birlikte mitokondri dışında oksijen tüketiminde bir patlama görülür. Fagosite edilmiş bakteri, solunumsal patlama ürünlerinin etkisiyle öldürülür (Şekil 2. 4). Ancak bu oksidan ürünler hücrelerin antioksidan savunma güçlerini aştığında normal konak hücrelere 13
zarar verirler ve çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynarlar (Klebanoff, 1998; Babior, 2000). Şekil 2. 4. Nötrofillerde oksijene bağımlı bakteri öldürme aktiviteleri (Çay 1995). Fagositlerin uyarılması, heksoz monofosfat yoluyla glukozun oksidasyonunda artışa yol açar. Solunum patlaması sırasında elektron vericisi olarak NADPH kullanılır ve moleküler oksijenin süperoksit radikaline indirgenmesi sonucu NADP + üretimi artar ve heksoz monofosfat yolu aktive olur. Heksoz monofosfat yolunun aktivasyonuna neden olan NADP + nin diğer kaynağı hidrojen peroksidin detoksifikasyonundan sorumlu olan glutatyon peroksidaz-glutatyon redüktaz sistemidir (Şekil 2. 5) (Altınışık, 2006). Şekil 2. 5. Glutatyon peroksidaz-glutatyon redüktaz sistemi (Altınışık, 2006). 14
Nötrofiller ve monositlerin primer lizozomal granüllerinde Fe-hem içeren miyeloperoksidaz enzimi bulunur. Çeşitli uyarıcıların etkisiyle fagositler miyeloperoksidaz içeren granüllerini ekstrasellüler aralıktaki fagositik vakuol içine boşaltırlar. Miyeloperoksidaz, hidrojen peroksit varlığında klorür, iyodür ve bromürün oksidasyonunu katalizleyerek hipoklorik asit (HOCl), hipoiyodik asit (HOI) ve hipobromik asit (HOBr) oluşturur. Bu bileşikler ve bunların tuzları güçlü oksidanlardır, biyolojik olarak önemli moleküllerle reaksiyona girerek mikroorganizmayı etkileyen toksik ajanlar meydana getirirler (Babior, 2000). Fagositin kendisi de reaktif oksidanların zarar vermelerine karşı hassastır. Bununla birlikte kendilerini oksidanlarına karşı koruyabilirler. Fagositlerin antioksidan sistemleri, süperoksidi hidrojen perokside dönüştüren süperoksit dismutaz, hidrojen peroksidi suya indirgeyen katalaz, hidrojen peroksidi detoksifiye edici glutatyon peroksidaz-glutatyon redüktaz sistemi, antioksidan vitaminlerden -tokoferol (E vitamini) ve askorbik asit (C vitamini) gibi antioksidanlardır (Çay, 1995; Babior, 2000). Nötrofillerden toksik ajanların sızıntısı veya sekresyonu, yakın hücrelere zarar verir. Fagosit kaynaklı oksidanlar ototoksik, immünosupresif ve mutajenik etkiler gösterirler. Bu nötrofillerden ortama salıverilen serbest radikaller doku hasarını hızlandırırlar. 2. 3. 1 Fagositoz Olayında Antioksidanların Fonksiyonu Fagositoz da nötrofil ve makrofajlar tarafından ortama salınan maddeler bakteri öldürücü etki gösterirler. Ancak bunlar belirli düzeyin üzerinde oluşur veya E ve C vitamini gibi antioksidanlar yetersiz olursa bu radikaller hücrenin ya da organizmanın yapı elemanları olan protein, lipid, karbonhidrat, nükleik asit ve yararlı enzimlerini bozup zararlı etkilere yol açarlar. Özellikle fagositik hücrelerin tahribine neden olurlar. Bu nedenle E vitamini oluşan radikalleri bloke ederek fagositoz olayının başlamasında ve devam etmesinde büyük önem arz etmektedir (Çay, 2005). 15
3. SERBEST RADİKALLERİN NEDEN OLDUĞU HASARLAR Serbest radikaller tek bir hücrede tahribat yapabildikleri gibi, fizyolojik sistemlerin tümünde de ciddi tahribat oluşturabilir. Bunlar, proteinler arasında çapraz bağlantılar kurarak kitleler meydana getirebilir, tüm bedenin esnek ve hareket yeteneğini azaltabilirler. Serbest radikaller; kalp, beyin ve diğer organlara besin sağlayan damarları daraltarak ve neticede tamamen tıkayarak tahribata neden olabilir. Serbest radikallerin hücrede meydana getirdiği hasarlar Tablo 3. 1 de gösterilmiştir (Yanbeyi, 1999). Tablo 3. 1. Serbest radikallerin hücredeki başlıca zararlı etkileri (Yanbeyi, 1999). Doymamış yağlar Karbonhidratlar Etkilediği bileşikler Etki sonucu meydana gelen reaksiyonlar Kolesterol ve yağ asitlerinde oksidasyon Lipidlerde çapraz bağlanmalar Organel ve hücrelerde çapraz bağlanmalar Polisakkaritlerin depolimerizasyonu Nükleik asit bazları Nükleik asitler Kükürtlü amino asitler Proteinler Hidroksilasyonlar Mutasyonlar, kimyasal modifikasyonlar Şekerlerde benzer reaksiyonlar Tek ve çift iplikçik kırılmaları Proteinlerde çapraz bağlar Baz içermeyen bölgeler Protein denatürasyonu ve çaprazlanma Enzimlerde inhibisyon Peptid zincirlerinde kopma Denatürasyon 3. 1. Serbest radikallerin Karbonhidratlar üzerine etkileri Hidrojen peroksit ve okzoaldehitler monosakkaritlerin oto oksidasyonu sonucu açığa çıkarlar ve bu maddeler diabette önemli rol oynarlar. Kanser ve yaşlanma olaylarında ise özellikle okzoaldehitler etkili olurlar. Bunlar DNA, RNA ve proteinlere çapraz bağlar oluşturarak bağlanabilme özelliklerine sahiptirler. Bu nedenle antimitotik etki gösterirler. Jyothi ve Narayan (1999) Clarias batrachus üzerinde yaptıkları bir çalışmada bazı pestisitlerin balıkların serumlarında karbonhidrat metabolizmasında düzensizliklere sebep olduğunu ve kan glikoz seviyesinde değişikliklerin meydana geldiğini belirtmişlerdir. 16
3. 2. Serbest radikallerin Proteinler Üzerine Etkileri Proteinler serbest radikallere karşı lipidlerden daha az hassastır. Etkilenme dereceleri içerdikleri aminoasit kompozisyonuna bağlıdır. Doymamış bağ ve sülfür içeren amino asitlerden (triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metiyonin, sistein gibi) meydana gelmiş proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenir. Serbest radikallerin meydana getirdiği hasar sonucunda proteinlerde parçalanma, çapraz bağlanmalar ve proteinlerin agregasyonu meydana gelir. Yapıları bozulan proteinler normal fonksiyonlarını meydana getiremezler (Akkuş, 1995). Enzimler protein yapısında olduklarından enzim aktivitelerinde değişiklikler meydana gelir. Kanda oksijenin taşınmasında görev alan hemoglobinin yapısını oluşturan Hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görür. Özellikle oksihemoglobin (Hb- Fe +2 O 2 ) süperoksit radikali veya hidrojen peroksit ile reaksiyona girerek methemoglobin (Hb- Fe +3 ) oluşur (Rice-Evans ve diğ., 1991; Akkuş, 1995; Dikici, 1999). 3. 3. Serbest radikallerin DNA üzerine etkileri Serbest radikallerin etki ettiği önemli merkezlerden birisi de DNA'dır. Bunlar DNA'nın onarım mekanizmasına etki ederek hasar verirler (Yıldız, 2001). Hidroksil radikali ve tekli oksijen gibi radikaller nükleik asitlerle kolaylıkla tepkimeye girerler. Özellikle hidroksil radikali nükleik asitlerde hidrojen çıkarma veya katılma tepkimeleri verir. Nötrofillerin aktivasyonundan kaynaklanan hidrojen peroksit hücre zarından kolaylıkla geçerek çekirdek DNA'sında hasar meydana getirir. Hücre disfonksiyonuna ve zaman zaman hücre ölümüne bile neden olabilir. Tekli oksijen radikali; güçlü bir oksitleyicidir. Bu yüzden yüksek elektron yoğunluğu içeren guanin molekülü ile daha kolay reaksiyon verir (Thompson, 2004). DNA ya bağlı metal iyonları ile hidrojen peroksitin DNA üzerinde reaksiyonlaşmasından oluşan hidroksil radikalleri, radikal temizleyicileri tarafından uzaklaştırılamazsa radikal temizleyicilerinin oluşturduğu radikaller de DNA ya hasar verebilmektedir (Burçak ve Andican, 2004; David ve diğ., 2004). Serbest radikaller, üretimi tamamlanmış hücre kısımlarına hücum ederek hücre işlevini bozabilirler; haberci RNA ve transfer RNA'ya hücum ederek üretim sürecini bozabilirler; en 17
tehlikelisi, bizzat DNA'ya hücum edebilir ve tüm hücre faaliyetlerinin temelinde yer alan zekâyı değiştirebilir (URL 5). Eğer DNA'nın bizzat kendisi tahrip olursa genlerden birisinin işlevi bozulabilir. Eğer, yer değiştirme (translokasyon) ve çıkarmalarla (delesyon) A, T, G ve C dizilimi değişecek olursa, gen, bir veya daha fazla yanlış aminoasidin kodu haline gelir. Yanlış bir dizilim içeren bir protein üretebilir. Bu durumda ilgili gene bu protein bağlanarak küçük bir sorun olduğu gibi büyük bir felakete sebep olabilir. Zarar görmüş bir genin, işleyişini tamamen durdurması da mümkündür. Böylece hücrenin faaliyetlerinden birisi ortadan kalkmış olur. Serbest radikal etkisi sonucu DNA ve kromozomlarda kırılma (Şekil 3. 1A) meydana gelir. Süperoksit üretimi özellikle mitokondride fazla olduğundan mitokondriyal DNA daha fazla hasar görür (Şekil 3.1B). A B Şekil 3. 1. DNA hasarı sonucunda çoklu kromozom kırıkları (A) ; DNA da tek ve çift yönlü kırıkların oluşması (B) ( URL 6). DNA yakınlarında sentezlenen hidroksil radikalleri pürin ve piridin bazlarına saldırarak mutasyonlara sebep olurlar. Oksidatif stresten en çok etkilenen bazlar, DNA'daki guanin ve sitozindir. Deoksiguanozindeki 8 nolu karbona bir oksijen atomunun bağlanması ile 8-18
hidroksiguanozın oluşur. Bu bileşik fizyolojik ph'da 8-oxo guanozine dönüşür ki bu da DNA'da anormal baz dizilişine ve böylece mutasyonlara neden olur. Bu reaksiyona guaninin hidroksilasyonu denir (Şekil 3. 2). Guanindeki halka yapısının açılması DNA replikasyonunu durdurur ve bu bileşiğin DNA'yı tamir edici enzimler tarafından ortadan kaldırılması yeni hatalara sebep olur (David ve diğ., 2004; URL5; URL 6). Şekil 3. 2. Guaninin hidroksilasyonu (Yıldız, 2001). Serbest radikaller, her iki kolu da aynı anda tahrip edebilir ya da çift sarmalın polimer iskeletini parçalayabilirler. Ayrıca, tüm DNA'nın etrafında proteinlerden oluşmuş sarmalayıcı bir bulut vardır. Bu moleküllerin, DNA'yı hareket ettirdiği ve çekirdek içinde moleküllerin taşınması için yollar oluşturduğu düşünülmektedir. Serbest radikaller, DNA'yı saran bu proteinler arasında çapraz bağlar oluşturarak onları etkisiz hale getirebilir ve DNA'nın işlevini kısıtlayabilir (Halliwell, ve Gutteridge, 1999). Tüm organizmalarda, normal metabolizma ve çevresel ajanlara maruz kalma sonucunda reaktif oksijen türleri oluşur. Reaktif oksijen türlerinin DNA ya etkisi sonucunda çok çeşitli DNA hasar ürünleri meydana gelir. Günümüzde 8-hidroksi deoksiguanozin (8OHdG) oksidatif DNA hasarının göstergesi olarak kabul edilmektedir. En fazla oluşan oksidatif DNA lezyonlarından biri olan 8OHdG, DNA replikasyonu sırasında G/C, T/A transversion mutasyonuna neden olur. ROS oluşum hızının hayvanlarda yaşam süresi ile ters ilişkili olduğu saptanmıştır ( Zastawny ve diğ., 1995). 19
3. 3. 1 DNA nın Onarım mekanizması Aerobik organizmaların, mutasyonlardan korunabilmeleri ve yaşamlarını devam ettirebilmeleri için DNA onarım enzimlerinin mutlaka doğru fonksiyon yapmaları gereklidir. Düşük düzeylerde oksidatif DNA hasarı minimal hata riski ile etkin bir şekilde onarılabilmektedir. Ancak, DNA onarım enzimleri ve DNA polimerazın oksidatif stres altında hasara uğraması sonucu doğru replikasyon ve transkripsiyon yapılamaz. Onarım tamamlanıncaya kadar, hücreler genellikle bölünmelerini durdurarak kendilerini korurlar. DNA'daki oksidatif hasar yüksek düzeylere ulaştığında ise hücre ölümü (apoptozis) gerçekleşir (Şekil 3. 3) (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Doku kültür ortamının Fe +3 ve Cu +2 iyon konsantrasyonunun arttırılması ile oksidatif DNA baz hasarının arttığı ve hidrojen peroksite maruz bırakılan hücrelerde bakır ve/veya demir şelatörlerinin (deferoksamin) kullanılmasının DNA daki oksidatif hasarı önlediği gösterilmiştir (Zastawny ve diğ., 1995). DNA nın oksidatif hasardan korunması için demir şelatörleri ve radikal temizleyicilerinin birlikte kullanılmalarının önemli fayda sağladığı öne sürülmüştür (Halliwell, ve Gutteridge, 1999). Şekil 3. 3. Sağlıklı ve hastalıklı hücrelerde DNA hasarı ve onarımının mekanizması (Halliwell, ve Gutteridge, 1999). 20
3. 4. Hücre Zarı ve Membran Lipidleri Üzerine Etkileri Tüm biyolojik zarlar, çoklu doymamış yağ asitleri ile amfipatik lipidler ve zar proteinlerinin birleşmesinden oluşur. (Şekil 3. 4) Lipid peroksidasyonu (LPO), çoklu doymamış yağ asitlerinin radikaller ile oksidasyonu sonucu başlayan ve oto katalitik zincir reaksiyonları şeklinde uzayan, lipid peroksitlerinin aldehit türevleri, hidrokarbon radikalleri ve uçucu bazı ürünlere çevrilmesi şeklinde sonlanan süreçtir (Şekil 3.5) (Gutteridge, 1995; Yanbeyi, 1999; Dikici, 1999; Murray ve diğ., 1996). Şekil 3. 4. Hücre zarının yapısı (Koolman ve Roehm, 2005). Lipid peroksidasyonu ile meydana gelen membran hasarı geri dönüşümsüzdür. Lipid peroksidasyonu, membranlara yakın bölgelerde ortaya çıkan hidroksil radikalinin membran fosfolipidlerinin yağ asidi yan zincirlerine saldırmasıyla oluşur (Craig ve diğ., 1986; Akkuş, 1995; Yanbeyi, 1999). Lipid peroksidasyonu reaksiyonu ya toplayıcı antioksidan reaksiyonlarla sonlandırılır ya da oto katalitik yayılma reaksiyonları ile devam eder. Serbest radikaller hücre membranının stabilizasyonunu ortadan kaldırarak hızlı hücre ve doku bozulmalarına neden olur (Gutteridge, 1995; Dikici, 1999). 21
Şekil 3. 5. Lipid peroksidasyonunun kimyasal yolu (Murray ve diğ.., 1996). 3. 5. Damar Tıkanıklığı (Ateroskleroz) Düşük yoğunluklu lipoproteinlerin (LDL) peroksidasyonunun atherosklerozise neden olduğu bilinmektedir. Kan damarlarındaki bu daralma, arteriyel kan basıncının düşmesine ve hastalığın diğer belirtilerinin oluşmasına neden olur (Kırşan, 2002). Ateroskleroz, atar damar duvarlarının bozulması ile başlar. Serbest radikaller atar damar çeperini döşeyen hücrelerin zarlarındaki lipidlere saldırır. Hücre zarları tahribata uğradıkları için bütünlüklerini kaybederler. Makrofajlar harap olmuş hücreleri yok etmek için olay yerine gelir ve hücreler arasındaki açıklığı kapatır. Bu makrofajlar hasar görmüş LDL' leri yuttuğu için damar çeperlerinde çizgiler halinde yağ birikimleri oluşmaya başlar. Bu yağ birikimleri kalınlaştıkça trombositler bu biyolojik atıklara takılırlar. Trombositler aşırı bir kümeleşme eğilimi gösterecek olursa damarlardaki kan akışını engelleyen pıhtılar oluşur. Bir başka serbest radikal mekanizması trombositlerin atar damar duvarlarındaki istenmeyen bu kümelenme eğilimini arttırır (Şekil 3.6) (Kırşan, 2002; Koolman ve Roehm, 2005). 22
Şekil 3. 6. Atardamar çeperini döşeyen hücrelerin zarlarındaki lipitlerde meydana gelen ateroskleroz olayı (Koolman ve Roehm, 2005). 3. 6. Katarakt Göz, aşırı miktarda serbest radikal etkisine maruz kalan bir organdır. Gözde yüksek konsantrasyonlarda antioksidan enzimler, serbest radikal tutucuları ve süper oksit üretimi inhibitörleri bulunur (Yıldız, 2001). Gözün ışığa duyarlı retina tabakasında rodopsin pigmenti vardır. Rodopsin, retina üzerine gelen ışığın etkisiyle retinal ve opsine ayrılır. Bu sırada oluşan uyarı, görme siniri aracılığı ile beyine iletilir ve görme olayı meydana gelir. Retinal gibi ışığa duyarlı maddelerin oksijenle etkileşimi sonucu tekli oksijen meydana gelir. Retina hem ışığın fotoreseptörler ve retinal pigment epitelyumu üzerine olan direkt etkileri hem de termal hasar ve buna eşlik eden inflamasyondan dolayı, ışığın zararlı etkilerine maruz kalır. Çünkü retinada H 2 O 2 üreten fotosensitize edici ajanlar ile serbest radikallerden oldukça etkilenen çoklu doymamış yağ asitlerinden fazla miktarda bulunur (FSBI, 2002). Katarakt balıklarda da sık gözlenen hastalıklardandır. Atlantik salmonu ve deniz levreklerinde katarakt problemlerinde artış görülmektedir. Bu da davranışsal olarak yem tüketimini azaltmakta ve büyümeyi yavaşlatmaktadır. Katarakt oluşumunda birkaç faktörün etkili olduğu bilinmektedir. Bunlar arasında, çevre şartları, histidin ve metiyonin aminoasidi ile çinko eksikliği, toksinler, genetik yatkınlık travmatik nedenler ve parazitler sıralanabilir (FSBI, 2002; Arda ve diğ.,2005). 23
4. BALIKLARDA ANTİOKSİDAN SAVUNMA SİSTEMİ Balıklarda bağışıklık sisteminin yanı sıra bir de antioksidan savunma sistemi bulunmaktadır. Oksidatif stresle ilişkili olarak stresin bağışıklık sistemi üzerine pek çok etkisinin olduğu hem memelilerde hem de balıklarda pek çok çalışma ile ortaya konmuştur. Aşırı stok yoğunluğu, ani sıcaklık değişimleri gibi stres faktörlerine maruz kalındığında, B- lenfositleri ve kandaki nötrofil sayısında bir artma olduğu gözlenmiştir. Oksidanların üretilmesi ve giderilmesi arasındaki denge bozulduğu zaman oksidatif hasar oluşur (Şekil 4. 1) (Cheung ve diğ., 2001; Öğüt, 2005). Balıkların kas dokularında bulunan en önemli prooksidanlar; yapısında hem olan ve olmayan pigmentler, kompleks demir, ferritin, mitokondri-sarkoplazmik retikulum enzim sistemi, NADH (nikotinamid adenin dinüleotid hidrojenaz) ve lipoksijenaz'dır. Antioksidanlar ise; suda çözünen süperoksit dismutaz, katalaz, Fe-tutucular, askorbat, glutatyon peroksidaz, E vitamini, C vitamini, ubiquinol ve karotenoitler'dir. Özellikle çok doymamış yağ asitleri (PUFA), proteinler, DNA ve bazı renk pigmentleri, prooksidanların etkisi altındadır. Balıklar diğer omurgalılardan farklı olarak ya günlük ya da mevsimsel sıcaklık ve oksijen değişikliğine maruz kaldıkları için kararsız çevre şartlarına uyum sağlayan metabolizmaya sahiptirler. ((Filho, 1996; Orbea ve diğ.,2000; Abele ve Puntarulo, 2004; Öğüt, 2005; Piner, 2005; Borazan Özkurt, 2006; URL1; URL3). Şekil 4. 1. Oksidanların üretilmesi ve giderilmesi arasındaki denge bozulduğu zaman oksidatif hasar oluşur (Cheung ve diğ., 2001). 24
4. 1. Deniz Balıkları ve Tatlı Su Balıklarında Kirliliğin Biyobelirteçleri ve Antioksidan Sistemle İlişkisi Oksijenin canlılardaki toksik etkisi, ksenobiyotiklerin ve oksijenin metabolizması sırasında oluşan reaktif oksijen türlerinden kaynaklanmaktadır. Oluşan reaktif oksijen türleri nedeniyle sucul organizmalar genelde aşırı derecede oksidatif strese maruz kalır (Borazan Özkurt, 2006). Deniz ve tatlısu balıkları karşılaştırdığında; deniz balıklarının karaciğer katalaz aktivitesi tatlı su balıklarından düşüktür. Bunun sebebi, denize göre tatlı suyun daha asidik yapıda olması ve yüksek hidrojen peroksit konsantrasyonuna bağlanır. Süperoksit dismutaz aktivitesinin deniz balıklarının karaciğer dokusunda tatlı su balıklarına göre daha yüksek bulunması, denizin alkalinitesinin ve süperoksit radikalleri konsantrasyonunun yüksek olmasıyla açıklanır (Filho, 1996; Kolaylı ve Keha, 1999; Şahan ve diğ., 2003; Piner, 2005; Yılmaz ve diğ., 2005). Karışık fonksiyonlu oksidaz (MFO) sistemi, pek çok substratı hidroksile ederek ve suda çözünür hale getirerek redükte glutatyona, glukuronik aside ve sülfatlara bağlanarak atılmasını sağlar. Bu sistemin substratları endojen ve eksojen olarak iki kategoride toplanır. Eksojen substratlar; hemen hemen bütün ilaçlar, benzen içeren organik çözücüler, etanol, aseton, bazı mantar toksinleri, antibiyotikler, kemoteropatik ajanlar, bitkisel terpenler, antioksidanlar, polisiklik hidrokarbon ve halojenli hidrokarbon içeren çevre kirleticileridir (Ariza ve diğ., 1999; Cheung ve diğ., 2001; Yüksek, 2006). PAH (Polisiklik aromatik hidrokarbonlar) bileşikleri midyelerde, katalaz düzeyini düşürürken, kirletici miktarına bağlı olarak glutatyon peroksidaz ve süperoksit dismutaz düzeyleri artar. Organik kirleticilerden TCDD (2,3,7,8 tetraklorodibenzo-p-dioksin) ile kirlenmiş sulardaki alabalıklarda karaciğer süperoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz düzeyleri daha yüksektir (Palace ve diğ. 1998; Borazan Özkurt, 2006). Metaller, deniz kirliliğine neden olan kontaminantlar arasında en büyük kısmı oluştururlar. Teknolojik gelişmelere paralel olarak son yıllarda düzeyleri daha da artmıştır. Özellikle midye, istiridye gibi bazı yumuşakçalar denizlerdeki metal kirliliğinin tespitinde biyoindikatör öneme sahiptir. Bu organizmalar aquatik sistemdeki metalleri çekerek, bünyelerinde biriktirirler (Mercan, 2004; Zoriia ve diğ., 2005). Sublethal derişimde deneysel malationa maruz bırakılan balıklarda katalaz, glutatyon peroksidaz ve süperoksit dismutaz gibi antioksidan enzim düzeylerindeki değişimler, histopatolojik değişimlerden çok daha erken oluşur. Malationa maruz kalan balıklarda katalaz aktivitesinde önemli düzeyde azalma meydana gelirken, diğer iki enzimde artış gözlenir (Rosety, 2005). 25
Akuatik türlerde biyobelirteçler, stres faktörlerinin tayininde çok önemli rol oynamaktadır. Çevresel kirliliğin en çok kullanılan biyobelirteçleri; antioksidan enzimler, stokrom P 450 monooksijenazlar, glutatyon, malondialdehit ve karmaşık fonksiyon oksidaz sistemi faz II enzimleridir (Borazan Özkurt, 2006). Asetilkolinesteraz aktivitesi organofosforlu ve karbamatlı insektisit kirliliğinin ölçümünde yüksek spesifiteye sahip biyobelirteçtir. Katalaz ve lipid peroksidasyonu oksidatif stres belirtecidir. Glutatyon S-transferaz aktivitesi ise organik bileşikler ve metal kirliliği ile ilgilidir (Narbonne, 2005). Denizlerdeki kirlenmenin göstergesi olarak biyobelirteçlerin kullanımı giderek yaygınlaşmaktadır. Bu amaçla hem omurgalı deniz canlıları hem de omurgasızlar kullanılmaktadır. Son yıllarda deniz kabuklularının biyobelirteç çalışmalarında kullanımı artmıştır. Omurgalılarda, ethoxyresofurin dealkylation (EROD) miktarındaki artışın saptanması o bölgedeki kalıcı kirliliğin bir göstergesi kabul edilir (Sarkar ve diğ., 2006). 26
4. 2. Antioksidanların Genel Etki Mekanizmaları Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler (Şekil 4. 2) (Bragadottir, 2001; Altınışık, 2006). 1) Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme antioksidanların toplayıcı etkisidir. Antioksidan enzimler ve küçük moleküller bu tip etki gösterirler. 2) Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme antioksidanların bastırıcı etkisidir. Vitaminler ve flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler. 3) Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki antioksidanların zincir kırıcı etkisidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler. 4) Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması antioksidanların onarıcı etkisidir. Şekil 4. 2. Genel olarak antioksidanların hücredeki fonksiyonları (Altınışık, 2006). 27
4. 3. Antioksidanların Sınıflandırılması 4. 3. 1 Endojen Antioksidanlar 4. 3. 1. 1. Enzim olan endojen antioksidanlar Balıklarda antioksidan enzimlerin aktiviteleri, diğer omurgalı hayvanlarınkine benzemekle beraber balık türlerine, balığın cinsiyetine, büyüklüğüne, su sıcaklığına, sudaki oksijen düzeyine, sudaki kirleticilerin bulunmasına, hastalıklar gibi nedenlere bağlı olarak değişebilir. 4. 3. 1. 1. 1. Süperoksit dismutaz (SOD) Süperoksit dismutaz (EC 1.15.1.1, EC-SOD) süperoksit serbest radikalinin hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen antioksidan enzimdir. SOD 2 O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Balıklarda süperoksit dismutazın iki izomer tipi bulunmaktadır. Cu-Zn SOD sitozolde bulunur, Cu ve Zn içerir, dimerik yapıdadır, siyanidle inhibe edilir. Mn SOD mitokondride bulunur, Mn içerir, tetramerik yapıdadır, siyanidle inhibe olmaz. Genel olarak hücrede en bol bulunan izomer sitozolik Cu-Zn SOD'dır. Fe-SOD balıklarda bulunmaz. Kofaktör olarak demir içermesi dışında Mn-SOD'a benzer. Çevreden gelen radikallere karşı koruyucu fonksiyon görür (Yıldız, 2001). Süperoksit dismutazın fizyolojik fonksiyonu oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit serbest radikalinin lipid peroksidasyonu gibi zararlı etkilerine karşı korumaktır. Süperoksit dismutaz, fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler öldürülmesinde de rol oynar. Süperoksit dismutaz aktivitesi, yüksek oksijen kullanımı olan dokularda fazladır. Süperoksit dismutazın hücre dışı aktivitesi çok düşüktür (Ihara ve diğ.,2005; Lushchak ve Bagnyukova, 2006). Soğuk bölgelerde yaşayan balıklarda süperoksit dismutaz aktivitesi sıcak bölgelerde yaşayan balıklara oranla daha fazladır (Abele ve diğ., 2004). Bakır sülfat ile muamele görmüş balıklarda toplam süperoksit dismutaz ve Mn SOD aktivitesinde azalma görülür (Varanka ve diğ., 2001). Oreochromis niloticus un böbreklerindeki süperoksit dismutaz aktivitesi 8 U/ mg protein, kas dokusunda 2 U/mg protein, solungacında 1 U/mg protein iken sazanların karaciğerindeki süperoksit dismutaz aktivitesi 0,17 0,23 U/mg proteindir. (Üner ve diğ., 2004; Yılmaz ve diğ. 2006), 28
4. 3. 1. 1. 2. Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) Glutatyon peroksidaz sitozolde bulunur, dört selenyum atomu içerir, tetramerik yapıdadır. Glutatyon peroksidaz (glutatyon:h 2 O 2 oksidoredüktaz, EC 1.11.1.9), hidroperoksitlerin indirgenmesinden sorumlu enzimdir. Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz (PLGSH-Px) adı verilen bir enzim monomerik yapıdadır ve esas olarak membran fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere indirger. Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz membrana bağlı en önemli antioksidan olan E vitamini yetersiz olduğunda membranı peroksidasyona karşı korur. Glutatyon peroksidazın fagositik hücrelerde de önemli fonksiyonları vardır. Diğer antioksidanlarla birlikte glutatyon peroksidaz, solunum patlaması sırasında serbest radikal peroksidasyonu sonucu fagositik hücrelerin zarar görmesini önler. Glutatyon peroksidaz eritrositlerde oksidatif strese karşı en etkili antioksidandır (URL 1; URL 4). Oreochromis niloticus da glutatyon peroksidaz aktivitesi solungaçta 1,6 U/mg protein, böbrekte 1,2 U/mg protein, karaciğer dokusunda 0,17 U/mg protein, kas dokusunda 0,4 U/mg protein dir (Oruç ve Üner 2000; Üner ve diğ. 2004). 4. 3. 1. 1. 3. Glutatyon redüktaz Glutatyon redüktaz, glutatyon peroksidaz vasıtasıyla hidroperoksitlerin indirgenmesi sonucu oluşan okside glutatyonun tekrar indirgenmiş glutatyona dönüşümünü katalize eder (Altınışık, 2006). 29
Glutatyon Redüktaz GSSG + NADPH + H + 2 GSH + NADP + Balık türlerine göre farklılık göstermesine rağmen Oreochromis niloticus un karaciğer dokusunda glutatyon redüktaz aktivitesi 0,017 U/mg protein düzeyindedir (Oruç ve Üner, 2000). 4. 3. 1. 1. 4. Glutatyon S-Transferazlar (GST) Glutatyon S-transferazlar (GST, EC 2.5.1.18) her biri iki alt birimden oluşmuş bir enzim ailesidir. Glutatyon S-transferazlar, başta araşidonik asit ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere lipid peroksitlerine karşı selenyum-bağımsız glutatyon peroksidaz aktivitesi göstererek bir antioksidan savunma mekanizması oluştururlar. ROOH + 2 GSH GST GSSG + ROH + H 2 O Glutatyon S-transferazlar katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahiptirler. Bunlar hem detoksifikasyon yaparlar hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri vardır. Glutatyon S-transferazlar, karaciğerde sitokrom P450 enzim sistemi tarafından reaktif ara ürünlere dönüştürülen yabancı maddelerin daha az reaktif konjugatlara dönüşümünü katalizlerler. Balıklarda Glutatyon S-transferaz, en yüksek aktivitede dil balığında 2400 nmol/min/mg iken, yayın balığında 1900 nmol/min/mg, koho salmonunda 400 nmol/min/mg dır (Dautremepuits ve diğ. 2004; Trute ve diğ. 2007 ). 4. 3. 1. 1. 5. Katalaz (CAT) Katalaz (H 2 O 2 :H 2 O 2 oksidoredüktaz, EC 1.11.1.6) yapısında dört tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Katalaz esas olarak peroksizomlarda daha az olarak sitozolde ve mikrozomal fraksiyonda bulunur. Katalaz hidrojen peroksidi suya ve oksijene parçalar. Katalaz 2 H 2 O 2 2H 2 O +O 2 Granulomatöz hücrelerde katalaz, hücreyi kendi solunumsal patlamasına karşı koruma işlevini de görür. Hücrede oluşan hidrojen peroksidi hidroksil serbest radikali oluşumunu önlemek için ortadan kaldırır (Atif ve diğ., 2006). 30
Katalaz sucul organizmaların antioksidan enzim çalışmalarında çok önemli bir yere sahiptir. Petrol kirliliği sonucu balıkların kas dokusundaki katalaz aktivitesi 5 U/mg protein, karaciğer dokusu katalaz aktivitesi ise 34 U/mg protein olurken (Avcı ve diğ., 2005) sazanlarda katalaz aktivitesi 0,1325 0,1713 k/ mg protein arasında değişir (Yılmaz ve diğ., 2006). 4. 3. 1. 1. 6. Mitokondriyal sitokrom oksidaz Mitokondriyal sitokrom oksidaz solunum zincirinin son enzimidir ve süperoksiti detoksifiye eder. 4 O 2 +4 H + + 4e - 2 H 2 O Bu reaksiyon fizyolojik şartlarda sürekli cereyan eden normal bir reaksiyondur, bu yolla besin maddelerinin oksidasyonu tamamlanır ve bol miktarda enerji üretimi (ATP) sağlanır. Ancak çoğu zaman süperoksit üretimi mitokondriyal sitokrom oksidaz enziminin kapasitesini aşar ve bu durumda diğer antioksidan enzimler devreye girerek süperoksitin zararlı etkilerine engel olurlar. 4. 3. 1. 2 Enzim Olmayan Endojen Antioksidanlar 4. 3. 1. 2. 1. Melatonin (Epifiz hormonu) Melatonin (MEL), karanlıkta pineal bezden salgılanan, uyku, üreme ve immünite gibi pek çok biyolojik fonksiyonun düzenlenmesinde rol oynayan bir hormondur. Melatonin, epifizde triptofan amino asidinden, serotonin üzerinden sentez edilir. Antioksidan enzim sentezini uyarmaktadır. En zararlı serbest radikal olan hidroksil serbest radikalini ortadan kaldıran çok güçlü bir antioksidandır ( Blanc ve diğ, 2003; Yazıcı ve Köse, 2004). Melatoninin bir antioksidan olduğu, literatürde ilk kez 1991 yılında Ianas ve arkadaşları tarafından öne sürülmüş ve daha sonra yapılan in vitro (Tan ve diğ., 1993; Pahkla ve diğ., 1998) ve in vivo (Yamamoto ve Tang, 1996) çalışmalarla desteklenmiştir. Günümüze kadar bilinen antioksidanların en güçlüsü olarak kabul edilmektedir (Şekil4. 3). Şekil 4. 3. Melatoninin kimyasal yapısı (Yazıcı ve Köse, 2004). 31
Melatoninin antioksidan özelliği üç ana başlık altında toplanabilir (Şekil 4. 4) (Reiter ve diğ., 2000; Yazıcı ve Köse, 2004): 1. Direkt antioksidan etki: Melatoninin HO, H 2 O 2, 1 O 2, HOCl, NO, ONOO - gibi oksidatif strese yol açabilen serbest radikalleri detoksifiye eder ve böylece onların biyomoleküller üzerindeki zararlı etkilerini önler (Reiter ve diğ., 2000). Melatonin'in antioksidan özelliği, yapısında bulunan pirol halkasından kaynaklanır. 2. Antioksidan Enzim Aracılığıyla Etki: Farmakolojik ve muhtemelen fizyolojik düzeylerdeki melatoninin, SOD, GSH-Px, GSSG-Rd, glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) ve g-glutamilsistein sentetaz gibi bazı antioksidan enzimlerin aktivitelerini arttırarak bu yolla oksidatif stresi baskılar (Reiter ve diğ., 2000). 3. Prooksidan Enzim Aracılığıyla Etki: Melatonin bazı prooksidan enzimleri inhibe ederek, serbest radikal oluşumunu azaltır ve bu yolla da antioksidan sistemi destekler (Reiter ve diğ., 2000). Şekil 4. 4. Melatoninin Antioksidan Özellikleri (Reiter, 2003). Melatoninin antioksidan olarak diğer bir özelliği lipofilik olmasıdır. Hücrenin hemen bütün organellerine ve hücre çekirdeğine ulaşabilir ve böylece çok geniş bir dağılımda antioksidan aktivite gösterir. Serbest oksijen radikalleri oluşturmak suretiyle kansere sebep olan safrolün DNA üzerine hasar oluşturucu etkisinin, melatonin tarafından çok etkili şekilde inhibe edildiği gösterilmiştir. Melatonin kanserin ilerleme ve gelişme safhalarını geciktirir (Reiter, 2003). 32
Gökkuşağı alabalıklarının eritrositlerindeki karbonik anhidraz enzimi üzerine melatonin çok etkilidir ve balıkların üreme döneminde balıklarda aşırı miktarda kullanılmaması gerekir. Çünkü melatonin eritrositlerde karbonik anhidraz enzimini inhibe eder (Hisar ve diğ.,2005). 4. 3. 1. 2. 2. Seruloplazmin Seruoplazmin hem bakır hem de demir metabolizmasında görevli antioksidandır. Seruloplazmin süperoksit dismutaza benzer mekanizmayla etki gösterir. Ferro demiri (Fe +2 ) ferri demire (Fe +3 ) yükseltgeyerek Fenton reaksiyonunu ve böylece hidroksil radikali oluşumunu inhibe eder. Bu protein, serbest radikalleri etkisizleştirmek için bir elektron vermeye istekli olan bir bakır molekülü içerir. Bu süperoksiti, hidroksil radikali, tekli oksijeni etkisiz hale getirir ve kan dolaşımındaki antioksidan aktivitenin hemen hemen %70 'ini gerçekleştirir. Yaralanmalardan sonra seruloplazmin düzeyleri yükselir. Bu da inflamasyon sonucu oluşan fazla miktardaki serbest radikale karşı savaş gerektiğinde, seruloplazminin indüklenebildiğini gösterir. Seruloplazmin, inflamasyon sırasında hücre ölümlerini engeller (Gürer, 2005). Askorbat serbest radikalleri, askorbik asitin, süperoksit ve hidroksil radikali ile reaksiyonu yolu ile de oluşabilir, ancak, değişken metallerin varlığında, özellikle bakır, oksidasyondan daha çok etkilenir. Bu oksidasyon, seruloplazmine bağlı olan bakır atomları ve albümin ile birleşmiş olan demir atomlarından oluşmuş katalitik redoks sistemi aracılığıyla gerçekleşir. Seruloplazminin temel fizyolojik fonksiyonları şunlardır (Gürer, 2005): A. Plazma ferooksidaz aktivitesi (Demir homeostazisinin sağlanması) B. Askorbat oksidaz aktivitesi C. Bakır transport ve depolanması D. Organik substratların yıkımı E. Antioksidan aktivite F. Prooksidan aktivite G. NO oksidasyonu H. Akut faz proteini Bakteri, virus veya diğer enfeksiyonlarda hastalığın erkenden tespit edilmesinde hayvanın seruloplazmin aktivitesi önemli ipuçları vermektedir. Bu testlerin sonucunda erkenden teşhis pratik bir yol olup tedavi edici veya koruyucu önlemler alınabilir. Yetiştiriciliği yapılan balıklarda seruloplazminin fizyolojik aktivitedeki etkisi hakkında bilgi oldukça azdır. Balıklarda seruloplazminin yaşa bağlı olarak azaldığı görülmektedir. Bu 33