Daha Önce Yapılm lmış Örnek Bir Çalışma Lisans Bitirme Çalışması
BİTİRME ÇALIŞMASI ENDEMİK ANZER YAYLASI ÇİÇEĞİ OLAN Dactrylorhiza euxina var. markowitschii BİTKİSİNİN ÖZÜTLERİNİN ANTİOKSİDAN VE ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ Esra ÖZÇAVDAR Mine CENGİZ Ayşegül YILDIRIM
GİRİŞ Son yıllarda tıbbi bitkiler ve bunlardan elde edilen aktif maddeler üzerindeki çalışmalar ve bunlara karşı olan ilgi çok artmıştır. Bunun başlıca sebepleri şunlardır: 1. Özellikle az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerin ucuz bir tedavi olanağı elde etmek istemeleri. 2. Bitkisel ilaçların fazla bir yan etkileri bulunmaması. 3. Bazı ilaçların bitkisel kaynaklardan daha ucuza ve kolay elde edilmeleri. 4. Sentetik bileşikler genellikle tek etkiye sahipken, bitkisel ilaçların birkaç etkiye birden sahip olmaları.
BİTKİLERİN TIBBİ AMAÇLA KULLANIMI Tıbbi Bitkilerin Tanınması Bitkilerin bilimsel olarak Latince iki kelimeden oluşan ismi bulunur. Teşhisi için iki yol: 1. Üniversitelerin herbaryumlarındaki bitki örnekleri ile karşılaştırmak 2. Flora denilen kitaplar yardımıyla tayin etmek Tıbbi Bitkilerin Yetiştirilmesi Tıbbi bitkilerin yetiştirilmesinin faydaları: 1. Küçük bir araziden çok miktarda drog elde edilmesi, 2. Ürünün toplanmasının kısa sürede yapılabilmesi, 3. Toplamadan sonra kurutmaya kolaylıkla geçilmesi, 4. Saf drog elde edilebilmesi, 5. Gerek verim gerekse etkili maddesi yüksek drog veren elverişli ırkların yetiştirilmesinin mümkün olması
Drogların Hazırlanması Tıbbi bitkilerin drog olarak kullanılan kısımları: yaprak, çiçek, tohum, kök, kabuk, sap v.s. Etkili drog elde etmek ve saklamak için: Toplama şekli ve zamanı Kurutma şekli ve sıcaklığı güneşte kurutma, gölgede kurutma, camekan içinde kurutma veya sıcak hava ile enzimlerin en tesirli olduğu 3550 C aralığının üstünde ya da altında Saklama şekli ve şartları
Tıbbi Bitkilerin Etki ve Kullanılışları Drog: Eczacılık, kimya ve boya endüstrisinde kullanılan bitkisel, hayvansal veya madensel ilkel maddelere verilen bir isimdir. İlaç: Hastalıkları iyi etmek ve etkileri ortadan kaldırmak için kullanılan, hastalar tarafından alınabilir hale getirilmiş, drog ve drog karışımlara ilaç (deva) denilir. Veriliş yolları Etki maddeleri Etki düzeni Atılma
Örnek Uygulamalar Yüksük otu bitkisin yapraklarından ve tohumlarından çıkarılan dijitalin glikozitlerinden kalp ilacı Naneden elde edilen mentol ile okaliptüs yapraklarından elde edilen okaliptol solunum antiseptiği Ginkgo biloba ekstraktı özellikle beyinde kan dolaşımını artırdığı için yaşlılıkla ilgili hafıza problemlerinin azaltılmasında Ginseng kalp performansını artırmakta ve yaşlılık etkilerini azaltmakta Licorice kökleri antitüberküloz etkili Commiphora mukul bitkisi şişmanlık ve kan yağ ve kolesterol seviyeleri ile mücadelede
OKSİDATİF STRES Oksidatif stres oksijen kullanan metabolik yollardan kaynaklanmaktadır ve prooksidan / antioksidan sistemler arasındaki dengenin bozulması neticesinde ortaya çıkmaktadır. Sonuç olarak ta bir çok biyomolekül hasar görmektedir: Karbohidratlar Nükleik asitler Proteinler Lipidler
SERBEST RADİKALLER Dış yörüngelerinde eşleşmemiş bir elektrona sahip ve genellikle elektriksel açıdan yüksüz atom yada moleküllerdir. Elektron alıcı (yükseltgen) ya da elektron verici (indirgen) özelliklere sahiptirler. Başlıca sigara, alkol ve lipit metabolizması ürünleri, virüsler, güneş ışınları, X ışınları ve kozmik ışınlar, sanayi atıkları, otomobil egzoz gazları, ozon, ağır metaller, kirli su ve havadan oluşabilmektedir. Aynı zamanda aktive olmuş fagositler, antineoplastikler ve stres sonucu biyolojik olarak üretilirler.
Radikal tepkimeleri basitçe üç basamakta meydana gelir: Zincir Başlaması : X X 2 X Zincir Gelişmesi : R H + X R + H X R + X X R X + X Zincir Sonlanması: R + X R X R + R R R X + X X X
Radikaller, oksijen içerip içermediğine göre, serbest oksijen radikalleri (SOR) ve oksijen içermeyen radikaller olarak ikiye ayrılırlar. Moleküler oksijen biradikal dir. Serbest Radikalin ve Radikal Üreten Türün Adı Hidrojen radikali Süperoksit radikali Hidroksil radikali Hidrojen peroksit Singlet oksijen Perhidroksi radikali Simgesi H O 2 OH H 2 O 2 O 1 2 HO 2 Kimliği Bilinen en basit radikal Oksijen metabolizmasının ilk ara ürünü En toksik (reaktif) oksijen metaboliti radikali Reaktivitesi çok düşük, moleküler hasar yeteneği zayıf Yarılanma ömrü kısa, güçlü oksidatif form Lipidlerde hızlı çözünerek lipid peroksidasyonunu artırmaktadır Peroksil radikali ROO Perhidroksile oranla daha zayıf etkili, lipidlere lokalize olma yeteneği Triklorometil radikali CCl 3 CCl 4 metabolizması ürünü, karaciğerde üretilen bir radikal Tiyil radikali Alkoksil radikali Azot monoksit Azot dioksit RS RO NO NO 2 Sülfürlü ve çiftlenmemiş elektron içeren türlerin genel adı Organik peroksitlerin yıkımı ile üretilen oksijen metaboliti L argininden in vivo üretilir NO'in oksijen ile reaksiyonundan üretilir
ANTİOKSİDANLAR Radikallerle oldukça çabuk reaksiyonlara girerek otooksidasyon veya peroksidasyonun ilerlemesini önleyen maddeler ise antioksidan olarak tanımlanırlar. Antioksidan mekanizmalar: 1. Radikal metabolit üretiminin önlenmesi, 2. Üretilmiş radikallerin temizlenmesi (radikallerin detoksifikasyonu) 3. Hücre deformasyonunun onarılması 4. Sekonder radikal üreten zincir reaksiyonlarının durdurulması 5. Endojen antioksidan kapasitesinin artırılması
ANTİOKSİDAN AKTİVİTE TAYİN YÖNTEMLERİ MDA Oluşumunun İnhibisyonu Yöntemi İndirgeme Kuvveti (FRAP Yöntemi) Tiyosiyanat Metodu Floresans Sönme Zamanı Metodu ile Antioksidan Aktivite Tayini Toplam Antioksidan Güç (TAR) Tayin Metodu Oksijen Radikali Absorbans Kapasitesi (ORAC) Yöntemi Trolox Eşdeğeri Antioksidan Kapasite (TEAC) Yöntemi Toplam Fenolik Madde Tayini Fenolik bileşiklerin Folin reaktifi ile alkali ortamda renkli kompleks oluşturur ve oluşan mormenekşe renkli kompleksin 700 nm'de maksimum absorbansının ölçülür. Yöntem aslında bir antioksidan tayin yöntemidir. DPPH Radikali Temizleme Aktivitesi DPPH radikali (2,2difenil1pikrilhidrazil) 517 nm de maksimum absorbans oluşturmaktadır. Antioksidanlarla muamele, DPPH tan kaynaklanan mor rengin şiddeti azalarak absorbansın düşüşüne sebep olacaktır. DPPH konsantrasyonunu yarıya düşüren numune miktarı µg/ml cinsinden belirlenmekte ve IC50 değeri olarak ifade edilmektedir.
ANTİMİKROBİYAL MADDELER Antimikrobiyal Maddelerin Genel Özellikleri Seçici toksisite Dar yada geniş spektrumlu antimikrobiyal maddeler Bazı bakteri ve mantar türleri tarafından oluşturulan, mikrobisid veya mikrobiyostatik etki gösteren maddelere antibiyotik denir. Antibakteriyel Maddenin Sınıflandırılması Antibakteriyel maddeler bakteriler üzerine beş farklı yoldan etki eder: 1) Hücre duvarı sentezinin inhibisyonu Betalaktam antibiyotikler, penisilinler, glikopeptid antibiyotikler 2) Sitoplazma zarının fonksiyon ve yapısının bozulması Polimksinler 3) Protein sentezinin inhibisyonu Amino glikozidler, tetrasiklinler, kloramfenikol, makrolid antibiyotikler 4) Nükleik asit sentez ve fonksiyonlarının bozulması Kinonlar, rifamisin, nitrofurantoin 5) Kimyasal yapılardaki benzerlik yolu ile metabolizmanın bozulması Sülfonamidler
Antibiyotiklere Duyarlılık Deneyleri Dilüsyon Yöntemi Difüzyon Yöntemi BİYOAKTİF FENOLİK BİLEŞİKLER Bitki fenolikleri arasında basit fenoller, fenolik asitler (benzoik asit ve sinnamik asit türevleri), kumarinler, flavonoidler, stilbenler, hidrolizlenebilir kandanse taninler, lignanler ve ligninler bulunur.
Dactylorhiza euxina var. markowitschii Bitkisi Dactylorhiza, salepgiller (Orchidaceae) familyasından, 30 kadar türü içeren orkide cinsi olup, Avrasya nın nemli çayırlarında, ayrıca Kuzey Afrika da, Alaska da ve Atlas Okyanusundaki adalarda yetişmektedir. Türkiye de özellikle Doğu Anadolu Bölgesinde yetişen bazı türlerinden salep elde edilmektedir. Çok yıllık yumrulu, 80 cm ye kadar boylanabilen bitkilerin, büyüklükleri değişkendir. Gövdeleri tektir ve dik duruşludur. Şerit şeklindeki yaprakları gövdeye sarmal dizilmiş, çiçek durumu silindirik yapıdadır. Bataklıklarda ve alpinik çayırlarda 3000 m ye kadar yetişebilmektedir. Çok yaygın bir bitkidir. Güzel bir görünüme sahip olup, yumruları dondurma yapımında kullanılmaktadır (Öztürk ve Özçelik, 1991). Erzurum yöresinde sulu ve nemli çayırlarda yoğun yayılış göstermektedir. Bu bitkinin Dactylorhiza euxina türü 730 cm boyunda 36 yaprağa sahiptir. Çayır orkidesi olarak bilinmektedir. Çiçekleri noktalı yada düz renkte olabilmektedir. Bu çalışmada kullanılan Dactylorhiza euxina var. markowitschii alt türü ise daha kısadır (520 cm) ve bazen karın altında çiçeklidir. Genellikle beneksiz çiçeklere sahiptir. Kafkaslar ve Kuzeydoğu Anadolu da yetişmektedir. Genellikle yüksek bölgelerde (1800 2200 m) yetişmektedir.
BİTKİNİN TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Örnek bitkiler Rizeİkizdere nin Anzer Yaylası ndan (1900 2100 m) toplanarak gölgede atmosferik şartlarda kurutuldu. İzolasyon Kısım Yaprak (55,41 g) Sap (67,64g) Çiçek (69,34 g) Kloroform ekstraktı A10YK (18,47 g) A10SK (22,60 g) A10CK (23,13 g) Metanol ekstraktı A10YM (18,01 g) A10SM (22,24 g) A10CM (22,72 g) Subuharı ile uçucu A10YU (18,38 g) A10SU (22,57 g) A10CU (23,07 g)
ESANSİYEL YAĞ ELDESİ Su buharı destilasyonu işleminin buharlaştırma ve yoğunlaştırma işlemlerinin tek düzenekte birleştirildiği Clevenger tipi sistem kullanılarak esansiyel yağlar (uçucu yağ) elde edildi. Toz haline getirilmiş bitkimizin A10YU, A10SU, A10CU numuneleri 2 litrelik balona konup üzerine 1 litre saf su ilave edildikten sonra ortalama 5 saat destilasyon sürdürüldü. Toplanan yağ hegzan ile çözülerek alındı ve konsantrasyonu belirlendi.
SOXHLET EKSTRAKSİYONU Ekstraksiyon, çözeltilerden veya katı karışımlardan bir maddeyi ayırmak, çözücünün ve istenmeyen safsızlıkların karışımlardan uzaklaştırmak için yapılan işlemdir. Katı maddelerin bir çözücüyle sürekli ekstraksiyonunun sağlanması için uygun bir düzenek Soxhlet Aygıtı dır. Kloroform nispeten apolar karakterde bir çözücü olup bitki bünyesindeki düşük polaritedeki organik bileşikleri ekstrakte etmek için kullanılmıştır. Bitkimizin A10YK, A10SK ve A10CK kodlu numuneleri yaklaşık 10 dakikada bir sifon yapacak şekilde ortalama 8 saat süreyle kloroformla ekstrakte edilmiştir. Metanol polar bir molekül olduğu için bitki bünyesindeki polar molekülleri ekstrakte etmede kullanılmıştır. Bitkinin A10YM, A10SM ve A10ÇM kodlu numuneleri yaklaşık 15 dakikada bir sifon yapacak şekilde ortalama 24 saat süreyle metanolle ekstrakte edimişlerdir.
ESANSİYEL YAĞ VE EKSTRAKTLARIN ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİ A10CU, A10SU ve A10YU hekzanda A10CK, A10YK ve A10SK kloroform:dmso (9:1) çözücüsünde A10CM, A10SM ve A10YM DMSO da çözüldü. DPPH Radikal Temizleme Aktivitesi DPPH radikali (2,2difenil1pikrilhidrazil)nin 100 µm lık metanolik çözeltisi soxhletle kloroform ve metanol ekstraklarında, 150 µm lık etanolik çözeltisi de esansiyel yağ numunelerinde kullanıldı. Eşit hacimde (750 µl) DPPH çözeltisi ve numune çözeltileri karıştırılıp oda sıcaklığında 50 dakika inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda DPPH ın maksimum absorbans verdiği 517 nm de absorbanslar okundu. Antioksidan aktivite absorbanslara karşılık gelen konsantrasyonlar grafiğe geçirilerek elde edilen grafiklerden bulunan IC 50 değerleri (mg/ml) cinsinden ifade edildi.
Metanol Ekstraktlarında Toplam Fenolik Madde Tayini Metot suda ve organik çözücülerde çözünmüş olan fenolik bileşiklerin folin reaktifleri ile alkali ortamda renkli kompleks oluşturması esasına dayanır. Oluşan mor menekşe renkli kompleks 700 nm de maksimum absorbans oluşturur. Toplam polifenolik madde tayininde yapılan pipetleme işlemleri: Kör Standart Test Distile su Standart (değişik konsantrasyonlarda) Numune (değişik konst.) Distile su 0.2 N Folin Reaktifi 0.1 ml 5 ml 0.5 ml 5 ml 0.5 ml Tüpler vorteks ile karış ıştırılıdı ve 3 dakika sonra %2 Na 2 CO 3 1.5 ml 1.5 ml 0.1 ml 700 nm'de köre karşı absorbans okundu 0.1 ml 5 ml 0.5 ml 1.5 ml
ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTE TAYİNİ Agar kuyucuk difüzyon yöntemi esansiyel yağların antimikrobiyal aktivitelerini belirlemede kullanılırken, Minimum inhibisyon konsatrasyonu (MIC) tayin yöntemi ise kloroform ve metanol ekstraktlarının antimikrobiyal aktivitelerini belirlemek üzere kullanılmıştır. Test edilen yedi bakteri: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Yersinia pseudotuberculosis ATCC 911, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus 702 Roma ve iki mayabenzeri mantar: Candida albicans ATCC 60193, Candida tropicalis ATCC 13803.
SONUÇLAR EKSTRAKT MİKTARLARI Numune Numune Kodu Ekstraksiyon Çözücüsü Numune Miktarı Ekstrakt Miktarı Eksrakt Yüzdesi Stok Çözelti Konsantrasyonu (mg/ml) Çözücü Yaprak A10YM Metanol 18,01 g 5,02 g %27,9 100,4 DMSO A10YK Kloroform 18,47 g 0,94 g %5,1 23,3 Kloroform A10YU Subuharı Dest. 18,38 g 8 mg 1 Hegzan Sap A10SM Metanol 17,24 g 5,75 g %33,3 114,9 DMSO A10SK Kloroform 22,60 g 0,47 g %2,1 8,2 Klorofrm A10SU Subuharı Dest. 22,57 g 4,5 mg 1 Hegzan Çiçek A10CM Metanol 22,72 g 7,40 g %32,6 37,0 DMSO A10CK Kloroform 23,13 g 1,07 g %4,6 7,2 Kloroform A10CU Subuharı Dest. 23,11 g 3 mg 1 Hegzan
ANTİOKSİDAN AKTİVİTELER DPPH Radikal Temizleme Aktiviteleri Artan numune konsantrasyonuna karşı 517 nm deki absorbanslar grafiğe geğirilerek elde edilen grafikler kullanılarak antioksidan kapasiteler kantitatif olarak ifade edilmiştir. Antioksidan aktivite numnunelerin IC 50 değerleri belirlenerek karşılaştırılmıştır. IC 50 başlangıç DPPH radikal konsantrasyonunu (kontrolün absorbansını) yarıya düşüren numune konsantrasyonudur ve genellikle mg/ml ya da mm olarak ifade edilmektedir.
Bütün numunelerin DPPH yöntemine göre IC 50 değerleri 0.8 0.74 IC50 (mg/ml) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.397 0.423 0.428 0.3 0.232 0.2 0.1 0.12 0.125 0.102 0.117 0 A10YM A10SM A10CM A10YK A10SK A10CK A10YU A10SU A10CU
Metanol Ekstraktlarında Toplam Polifenol Miktarları Polarite seçiminden dolayı bitkiden elde edilen numunelerden sadece metanol ekstraktlarında fenolik bileşenler araştırılmış, aynı zamanda bir antioksidan kapasite belirteci olan FolinCiocalteu yöntemi uygulanmıştır. Standart olarak kateşin kullanılmış, kateşinin verdiği absorbanslar grafiğe geçirilerek standart grafik elde edilmiştir. 16 14 13.9 12 10.9 %Polifenol 10 8 9.1 6 4 2 0 A10YM A10SM A10CM D. euxina var. markowitschii bitkisinin yaprak (A10YM), sap (A10SM) ve çiçek (A10CM) kısmının toplam polifenolik madde miktarları
ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELER Uçucu yağlarda antimikrobiyal aktivite tarama sonuçları: Numune Mikroorganizmalar ve İnhibisyonŞiddeti Ec Kp Yp Pa Ef Sa Bc Ca Ct A10YU + A10SU + A10CU + Hekzan Kontrol Ceftazidime +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Triflucan +++ +++ Sonuçlar inhibisyon alanının çapı cinsinden ifade edildi: (): < 5.5 mm; (+): 5.510 mm; (++): 1115 mm; (+++): 16 mm. Ec: Escherichia coli ATCC 25922, Kp: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Yp: Yersinia pseudotuberculosis ATCC 911, Pa: Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Ef: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bc: Bacillus cereus 702 Roma, Candida albicans ATCC 60193, Ceftazidime: standart antibakteriyel, Triflucan: standart antifungal.
Ekstraktların minimum inhibisyon konsantrasyonu yöntemine göre antimikrobiyal aktivite tarama sonuçları: Numune A10YM A10SM A10CM A10YK A10SK A10CK Amp. Flu. Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu (MIC) (µg/ml) Ec Kp Yp Pa Ef Sa Bc Ca Ct 50 50 50 50 50 50 25 50 25 25 25 25 25 50 25 25 25 25 25 25 100 100 100 100 25 50 100 100 100 50 100 100 25 >100 >100 100 50 100 100 25 >100 >100 8 32 >128 32 32 2 2 2 <1 Ec: Escherichia coli ATCC 25922, Kp: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Yp: Yersinia pseudotuberculosis ATCC 911, Pa: Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Ef: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bc: Bacillus cereus 702 Roma, Candida albicans ATCC 60193. Amp.: Ampicillin (standart antibakteriyel), Flu.: Fluconazole (standart antifungal). (): no activity (1 mg /ml). MIC: Numunenin mikroorganizmanın üremesini tamamen durdurabildiği minimum konsantrasyon.
DEĞERLENDİRME Genel olarak metanolik ekstraksiyon kloroformlu olana göre daha fazla miktarda ekstrakt elde edilmesini sağlıyor Bütün numuneler iyi antioksidan aktivite gösterdiler Metanolik ekstraktların hepsi fenolik antioksidanlar açısından zengin Usansiyel yağlar (uçucular) sadece bir gıda patojeni olan Bacillus ceresus bakterisine karşı aktiviteye sahip Kloroform ve metanol ekstraktları Staphylococcus aureus ve Bacillus ceresus hariç test edilen diğer beş bakteriye karşı etkili Kloroform ve metanol ekstraktları test edilen iki mantara karşı da etkili Numuneler bazı mikroorganizmalara karşı standarttan daha iyi aktivite gösterdi Ekstraktların yüzlerce bileşiğin karışımı olduğunu düşünürsek, bileşenlerinin kullanılan standart antimikrobiyal maddelerden daha etkili olacağı ve bu nedenle de daha ileri araştırmanın yapılmaya değer olduğu anlaşılmaktadır.