YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (YPSK) HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) 1
Kromatografi nedir? Kromatografi, karışımlardaki çeşitli maddeleri birbirinden ayırmaya ve böylece kalitatif ve kantitatif analize olanak veren bir seri ayırma yöntemleri tekniğidir. Tüm kromatografik uygulamalarda bir "sabit faz" ve bir "hareketli faz" bulunur. Bir karışımdaki maddeler sabit faz üzerinden hareketli faz yardımı ile sürüklenirken farklı hızlarla göç ederler. Maddelerin göç etme hızları farklı olması, her bir maddenin sabit faz üzerinde gruplaşarak ilerlemesine neden olur. Böylece karışım içindeki maddeler birbirinden ayrılırlar. 2
Kromatografinin keşfi Kromatografi ilk kez 1906 yılında Rus botanikçi Mikhail Tswett tarafından kullanılmıştır. Klorofil, karoten, ksantofil gibi yaprak pigmentlerini içeren bir çözeltiyi petrol eteri ile birlikte kalsiyum karbonatla doldurulmuş bir cam kolondan geçirerek, pigmentlerin birbirinden ayrılmasını sağlamıştır. Farklı renkteki pigmentler ayrılarak kolonda renkli bölgeler halinde gruplar oluşturduğu için bu yönteme renkli fotograf anlamına gelen chroma-tography adını vermiştir. Numune : Yaprak pigmentlerini içeren çözelti Analit : Pigmentler (klorofil, karoten, ksantofil) Sabit faz : Kalsiyum karbonat Hareketli faz : Petrol eteri 3
Kromatgorafide sabit ve hareketli faz Kromatografik ayrımda birbiriyle karışmayan iki faz söz konusudur. Karışımdaki maddeler hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçer. Yani hareketli faz bir taşıyıcı görevi görürü. Karışımdaki maddelerin hareketli ve sabit faza olan ilgileri birbirlerinden farklıdır. Hareketli faza ilgisi yüksek olan maddeler kolonu çabuk terkeder, yani göç hızları yüksektir. Sabit faza ilgisi yüksek olan maddeler ise sabit faz üzerinde daha çok zaman geçirecekleri için kolonu daha geç terkederler. Göç hızları düşüktür. Karışımdaki maddelerin hareketli ve sabit fazla girdikleri etkileşim, ayrılma mekanizmasını belirler. (Adsorbsiyon, dağılma) 4
Adsorbsiyon kromatografisi Kromatgorafinin prensibi, sabit fazın üzerinden sürekli olarak akan bir hareketli fazın içindeki maddelerin, hareketli faz ve sabit faza olan ilgilerine göre birbirlerinden ayrılmaları ve kolonu farklı zamanda terketmeleridir. Sabit fazın katı olduğu kromatografik sistemlerde, sabit faz bir adsorban görevi görür. Hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçen maddelerin bazıları sabit faz üzerine adsorbe olurlar, adsorbe olmayalar ise hareketli fazla birlikte sürüklenirler. Hareketli faz sürekli bir akışa sahip olduğu için, adsorbe olan maddeler de bir süre sonra sabit fazı terkederek sürüklenirler. Böylece adsorbana ilgileri farklı olan maddeler farklı zamanlarda sabit fazı terkeder ve ayrılmış olurlar. Sabit fazın bir katı olduğu kromatgorafik sistemlerde ayrılma prensibi adsorbsiyondur. Maddeler adsorbana tutunma güçlerine göre farklı hızlara sahiptirler. 5
Partisyon kromatografisi Bazı sistemlerde ise inert bir katı üzerine kaplanmış bir sıvı sabit faz görevi görür. Bu sistemlerde sabit faz bir sıvıdır. Hareketli faz ve sabit faz birbiriyle karışmaz ve numune içindeki maddeler her iki fazda da çözünürler. Çözünen maddeler hareketli ve sabit fazda farklı oranlarda dağılırlar. Hareketli fazda daha çok dağılan maddeler sabit faz üzerinden hızlıca akıp giderken, sabit fazda daha çok dağılan maddeler daha yavaş hareket ederler. Böylece farklı maddeler farklı göç hızlarına sahip oldukları için birbirlerinden ayrılırlar. Sabit fazın bir sıvı olduğu kromatografik sistemlerde ayrılma prensibi dağılma (partisyon) dur. Maddeler iki sıvı arasındaki dağılma oranlarının farklılığına göre farklı hızlara sahiptirler. 6
Kromatografinin sınıflandırılması Ayrılma mekanizmasına göre (Sabit faz tipine göre) 1. Adsorbsiyon kromatografisi (Sabit faz katı) 1. Sıvı-katı kromatgorafisi (hareketli faz sıvı) 2. Gaz-katı kromatgorafisi (hareketli faz gaz) 2. Dağılma (partisyon) kromatografisi (Sabit faz sıvı) 1. Sıvı-sıvı kromatografisi (hareketli faz sıvı) 2. Gaz-sıvı kromatografisi (hareketli faz gaz) Hareketli faz tipine göre 1. Sıvı kromatografi 1. Sıvı-katı kromatografisi 2. Sıvı-sıvı kromatografisi 2. Gaz kromatografisi 1. Gaz-katı kromatografisi 2. Gaz-sıvı kromatografisi Uygulama biçimine göre 1. Düzlemsel kromatografi 1. Kağıt kromatografisi 2. İnce tabaka kromatografisi 2. Kolon kromatografisi 1. Gaz kromatografisi 7 2. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi
Yüksek basınçlı sıvı kromatgorafisi Yüksek basınçlı sıvı kromatografisinde, paslanmaz çelikten bir kolon, yüzeyi sıvı bir tabaka ile kaplanmış silika partiküllerle doldurulmuştur. Bu yüzden HPLC partisyon prensibine göre çalışan bir sıvı-sıvı kromatgorafi sistemidir. Kolon içindeki partikül boyutları çok küçüktür ve kolonda çok fazla partikül sıkıştırılarak doldurulur. Sabit fazın bu kolondan geçişi bir pompa sistemiyle sağlanır. Böylece hareketli fazın ve numunenin kolondan geçişi hızlandırılmış olur. Numune içindeki analitler hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçerken fizikokimyasal özelliklerine göre sabit faza ya da hareketli faza farklı ilgi gösterirler. Bu yüzden bazı analitler kolonu çabuk terkederken, sabit faza ilgisi yüksek olan maddeler kolonu daha geç terkederler. Kolondan çıkan maddeler uygun bir dedektörle izlenerek kolondan çıkış zamanları ve kolonu terkeden miktarları tespit edilir. 8
Yüksek basınçlı sıvı kromatgorafisi YPSK genel olarak 5 kısımdan oluşur Pompa Enjektör Kolon Dedektör Kaydedici 9
Yüksek basınçlı sıvı kromatgorafisi Pompa sistemi, hareketli fazın kolon içinde yüksek basınçla hareket etmesini sağlar. Enjektör, küçük hacimleki numunenin, hareketli fazla karıştırılarak kolona verilmesini sağlar. Kolon ayrımın gerçekleştiği kısımdır. Genelde paslanmaz çelikten bir kolonun içi kullanı amacına uygun partiküllerle doldurulması ile üretilir. Birbirlerinden ayrılarak kolonu terkeden maddeler dedektöre girerler. Dedektör bu maddelerin kolonu ne zaman terkettiklerini ve konsantrasyonlarını tespit eder. Dedektörün algıladığı sinyaller bilgisayar ortamında anlamlı sayısal değerlere ve grafiklere çevrilerek kaydedilir. Kaydedici, analiz sonuçlarını dedektör cevabını zamana karşı grafiğe geçirilerek «kromatogram» olarak saklar. 10
HPLC de kullanılan dedektörler: Ultraviyole Floresans Kızılötesi Kırılma indisi Elektrokimyasal Kütle spektroskopi Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarak adlandırılır. Piklerin oluşturduğu grafiğe kromatogram adı verilir. Kromatgoramlar dedektör cevabını zamana karşı grafiğe geçirilmesi ile elde edilir. 11
HPLC ne amaçla kullanılır? HPLC uçucu olmayan kimyasal ve biyolojik bileşenlerin ayrımı için kullanılır. Örnek olarak İlaç etken maddeleri, aspirin, parasetamol, vb. Proteinler, yumurtanın beyazı veya kan proteinleri Poimerler gibi organik kimyasallar (polisitiren or polietilen) Gıdalardaki pestisit ve vitaminler Birçok doğal bileşen, ginseng, bitkisel ilaçlar, bitki ekstraktları Sıcaklık ile kararlılığını kaybeden bileşenler, trinitrotoluen (TNT), enzimler NOT: Eğer uçucu bir bileşik ile çalışacaksa (bir gaz veya petroldeki bir hidrokarbon türevi), Gaz kromatografi sistemi tercih edilmelidir. 12
HPLC nin uygulanışı İlaç endüstrisini baz aldığımızda, dozaj formlarında bulunan aktif bileşenin kalite kontrolü hayati önem taşımaktadır. Bir dozaj formunda etken madde/maddelerin yanında yardımcı maddeler ve etken ya da yardımcı maddelerin sentezlenmesinden veya bozunmasından kaynaklanan safsızlıklar da bulunur. Ar-ge ve kalite kontrol süreçlerinde bu karışımda bulunan maddelerin miktar tayininin yapılması gerekmekedir. 13
HPLC nin uygulanışı Bileşenlerin miktarlarının tayin edilmesi Bileşenler ayrıldıktan sonra, karışım içerisindeki bileşenlerin miktarlarının tayini için UV ışık kaynağından faydalanılır. Işığın madde tarafından absorblanması, madde miktarı ile orantılıdır. Örneğin madde miktarını 2 katına çıkarırsak, madde 2 kat daha fazla ışığı absorblayacak demektir. Dedektör ışığın yoğunluğunu ölçmekle görevlidir. Işık geçişindeki azalma dedektörde bir cevap oluşturur ve buna da pik denir. 14
İzokroatik ve gradient akış Bir deney esnasında, pompa değişmeyen, sabit bir akış sağlıyorsa bu sisteme isokratik sistem denir. Fakat hareketli fazın bileşiminde analiz esnasında değişimler gerçekleşirse çalışılan sisteme gradient sistem adı verilir. İzokratik akış Çözücü bileşimi hep sabittir Basit ayrımlar için idealdir Kalite kontrol departmanlarında sıklıkla tercih edilir. Gradient Hareketli faz bileşimi zamanla değişim gösterir. Kompleks karışımların ayrımı için idealdir. Bilinmeyen karışımlarda metod geliştirmek için tercih edilir. 15
HPLC de temel olarak iki ayrım şekli vardır. Ters faz Sabit faz: Apolar Hareketli faz: Polar (su, tampon, metanol, asetonitril vb) Düz faz Sabit faz: Polar Hareketli faz: Apolar (hekzan, oktanol vb) 16
Ters faz ve düz faz Normal-faz tekniğinde polarlığı en az olan bileşen kolondan ilk önce çıkar; hareketli fazın polarlığı arttıkça elüsyon zamanı azalır. Ters-faz tekniğinde ise aksine, polarlığı en çok olan bileşik kolondan ilk önce çıkar ve hareketli fazın polarlığı arttıkça elusyon zamanı artar. 17
Kaynaklar Principles of Instrumental Analysis, D.A. Skoog, D.M. West, II. Ed. 1981 Analitik Kimya II, F. Onur, A.Ü. Eczacılık Fakültesi Yayınları No. 101, 2011 Analitik Kimya Pratikleri Kantitatif Analiz, F. Onur (Ed.), A.Ü. Eczacılık Fakültesi Yayınları No. 111, 2014 18