Deneysel Çal şma/experimental Report Radyasyonun Akciğerlerde Oluşturduğu Oksidatif Hasar Üzerine Melatoninin Etkisi Fehmi ÖZGÜNER*, Ünal ŞAHİN**, Ahmet KOYU*, Halis KÖYLÜ*, Ayhan AKÇALI***, Sadettin ÇALIŞKAN* * Süleyman Demirel Üniversitesi T p Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dal ** Süleyman Demirel Üniversitesi T p Fakültesi, Göğüs Hastal klar Anabilim Dal *** Isparta Devlet Hastanesi, ISPARTA ÖZET Amaç: Radyasyon etkisi ile dokularda serbest radikaller oluşmakta ve bu toksik ürünlere bağlı olarak akciğerlerde oksidatif hasarlar meydana gelebilmektedir. Bu çalışma, iyonize radyasyonunun akciğerlerde oluşturduğu oksidatif hasarın azaltılması üzerine melatoninin etkisini araştırmak amacıyla yapıldı. Yöntem: Çalışmada 30 adet sıçan kullanıldı. Bu hayvanlar 3 gruba ayrıldı. Birinci gruptaki (n=10) hayvanlara sadece radyoterapi dozlarında radyasyon uygulandı. Radyasyon uygulaması için içerisinde 6 bölme olan 50x50 cm ebatlarındaki bir alan oluşturuldu. Radyoterapi Co-60 teleterapi cihazı ile 32 cgy/dk'lık doz 15 dk süreyle ve 14 saat arayla iki fraksiyon halinde toplam 960 cgy olacak şekilde yapıldı. İkinci gruptaki hayvanlara (n=10) radyasyon ve 25 mg/kg melatonin intraperitoneal yolla uygulandı. Üçüncü grup ise (n=10) kontrol grubunu oluşturdu. Bulgular: Lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olan malondialdehit düzeyleri radyasyon alan grupta radyasyon+melatonin alan gruba ve kontrol grubuna göre daha yüksekti. (nmol/ml olarak; akciğer dokusu için sırasıyla, 88.40±6.8, 65.22±5.8, 59.55±4.3; kan için sırasıyla 69.18±7.10, 51.77±7.30, 46.43±5.70) (p<0.01). Antioksidan enzim düzeylerinin karşılaştırılmasında, süperoksit dismutaz düzeylerinde gruplar arasında istatistiksel düzeyde anlamlı fark yoktu (p>0.005). Glutatyon peroksidaz düzeyleri ise hem akciğer dokusunda hem de kanda radyasyon alan grupta diğer gruplara göre anlamlı düzeyde daha düşüktü (IU/ml olarak; akciğer dokusu için sırasıyla 1453±177, 1738±156, 1588±188; kan için sırasıyla 1388±143,1787±133, 1498±177) (p<0.05). Yorum: Bulgularımız radyasyon etkisiyle oluşan oksidatif hasar üzerine melatoninin koruyucu etkisinin olduğunu göstermektedir. Sonuç olarak, radyasyon uygulamalarında oluşan yan etkilerin önlenmesinde melatonin kullanımının gündeme gelebileceği söylenebilir. Anahtar Kelimeler: Melatonin, radyasyon, serbest radikal hasarı SUMMARY Effect of Melatonin on Ionizing Radiation-Induced Oxidative Damage in the Lungs Objective: Ionizing radiation results free radical induced oxidative damage in different tissues especially in lungs via generating some toxic products. This study was performed to investigate the protective effect of melatonin on due to against to oxidative damage caused by ionizing radiation. 85
Özgüner F, Şahin Ü, Koyu A, Köylü H, Akçalı A, Çalışkan S Method: The animals were divided into three groups. A total dose of 960 cgy radiation was applied in 2 fractions with 14 hours interval to the first group (n=10) by Co-60 teleterapy unit. Second group (n=10) was exposed to radiation with same way and given 25 mg/kg melatonin intraperitoneally and third group was left as controls. Results: MDA levels, a marker of lipid peroxidation, were found to be increased in ionizing radiation exposed group as compared to ionizing radiation+melatonin treated group and controls (nmol/ml for lung tissue, 88.40±6.8, 65.22±5.8, 59.55±4.3 respectively; for blood 69.18±7.10, 51.77±7.30, 46.43±5.70 respectively) (p< 0.01). There was no statistically significant difference in SOD levels between three groups. Activity of GSH- Px, an antioxidant enzyme, was found to be decreased in ionizing radiation exposed group as compared to ionizing radiation+melatoninin treated group and controls (IU/ml; for lung tissue 1453±177, 1738±156, 1588±188 respectively; for blood 1388±143, 1787±133, 1498±177 respectively) (p<0.05). Conclusion: These data illustrate that melatonin has protective effect on ionizing radiation induced oxidative damage in lungs. So, it is suggested that, melatonin may be used in such radiologic applications to prevent the side effects of gamma radiation in tissues. Key Words: Melatonin, radiation, free radical damage GİRİŞ Günümüzde radyasyon gerek tan sal amaçlarla, gerekse tedavi amac yla yayg n olarak kullan lmaktad r. Birçok tümoral hastal ğ n tedavisinde radyoterapi uygulanmakta, hastanelerin radyodiyagnostik merkezlerinde, dokular n görüntülenmesinde konvansiyonel radyografi teknikleri yayg n olarak kullan lmaktad r. Dokular n tolere edebileceği maksimum radyasyon dozuna tolerans dozu denir. Bu doz aş ld ğ nda ağ r hatta öldürücü komplikasyonlarla karş laş l r. Ovaryum ve testisin germ hücreleri ile birlikte hemopoetik sistem, gastrointestinal sistem mukozas, deri epidemisinin radyoterapiye hassasiyeti yüksektir. Karaciğer, akciğerler, böbrekler ve baz endokrin bezlerin hassasiyeti orta derecede, kas, kemik, bağ dokusu ve sinir sisteminin hassasiyeti ise düşüktür (1,2). Radyoterapinin farkl dozlarda dokulara etkisini tam olarak değerlendirmek, direkt olarak dokular n absorbe ettiği dozu ölçmek mümkün olmad ğ ndan zordur. Radyoterapinin hücrede moleküler seviyede direkt ve indirekt etkileri vard r. Direkt etkisi hücre nükleusundaki atomlar n iyonizasyonuylad r. Daha önemli olan indirekt etkisi ise nükleusta serbest radikal (SR) oluşturarak yapt ğ etkidir. X ş nlar su ile reaksiyona girerse SR iyonlar üretilir. SR iyonlar yüksek oranda reaktif olup kromozomlarda k r lmaya ve genetik defekte sebep olurlar. Melatonin (N asetil-5-methoksitriptamin) pineal bez taraf ndan üretilen yüksek lipofilik özellikli bir hormondur. Bu özelliği ile dokularda bütün membranlar rahatl kla geçip tüm hücresel düzeylerde antioksidan etkiler gösterebilmektedir. Oksidatif hasardan korunmada melatonin ilk rolü oynayabilir. Bu özellikleriyle melatonin bilinen en güçlü endojen antioksidand r. Dokularda ve vücut s v lar nda birçok antioksidan enzimatik defans sistemleri de vard r. Bunlar aras nda en önemlileri olan glutatyon peroksidaz (GSH-Px) hidroksil radikalini (OH) suya metabolize eden bir enzimdir. Melatonin GSH-Px enzimini stimüle eder, böylece bütün dokularda hem doğrudan, hem de GSH-Px aktivitesinde yapt ğ stimüle edici etkisiyle dolayl olarak antioksidan etkiler ortaya koyar (3-9). Bu çal şmada, t pta s kl kla kullan lan radyoterapi dozunun etkisiyle s çanlar n akciğerlerde ve kanda oluşabilecek olan serbest radikallerin neden olduğu hasarda, melatoninin antioksidan etkileri araşt r ld. MATERYAL ve METOD Araşt rmada Swiss-Albino türü, ortalama 180-220 g ağ rl ğ ndaki 30 adet erkek yetişkin s çan kullan ld. Hayvan laboratuvar m zda üretilen s çanlar çal şma boyunca 12 saat ayd nl k ve karanl k siklusunda tutuldu. Hayvanlar palet s çan yemi ve su ile beslendi. Çal şmaya al nan 30 adet s çan, herbiri 10 hayvandan oluşan 3 gruba ayr ld. İlk gruptaki hayvanlara, içerisinde 6 bölme olan 50x50 cm ebatlar ndaki alanda, 32 cgy/dk l k doz 15 dk süreyle ve 14 saat arayla iki kez uygulanarak, toplam 960 cgy olmak üzere radyoterapi dozunda radyasyon verildi. Bunun için Co- 60 cihaz kullan ld (10). İkinci gruptaki hayvanlara yine ayn dozda radyasyon ve melatonin uygulamas yap ld. Bu gruptaki hayvanlara radyasyondan 2 saat 86
önce melatonin (Sigma Chemical Co) 25 mg/kg dozunda, 1/90 oran nda haz rlanan etanol serum fizyolojik kar ş m nda çözülerek intraperitoneal yolla verildi. Üçüncü gruptaki s çanlar ise kontrol grubunu oluşturdu. Radyoterapi dozunda radyasyon verilmesinden 6 saat sonra tüm s çanlar dekapite edildi. Toplanan kan örnekleri ikiye ayr ld. Bir örnek santrifüj edilerek serum ayr ld ve malondialdehit (MDA) çal şmas için haz rland. Diğer örnek sitratl tüplere al n p süperoksit dismutaz (SOD) ve GSH-Px çal şmas için haz rland. Ayr ca kanlar topland ktan sonra hayvanlara torakotomi yap larak akciğerleri doku MDA düzeyi çal şmas yap lmak üzere ç kar ld. SOD aktivitesi Sun Yöntemi yle çal ş ld (11). Bu metotta ksantin-ksantin oksidaz kompleksi superoksit radikali üretir. Süperoksit radikalleri nitrobluetetrazolium (NBT) ile reaksiyona girerek formazan oluşturur. SOD aktivitesi bu reaksiyonun 560 nm de inhibisyon derecesi ile ölçülür. NBT reaksiyon h z nda %50 lik inhibisyona yol açan enzim miktar, bir SOD ünitesi olarak tan mland (1 ml eritrosit sedimentindeki ünite miktar ). GSH-Px aktivitesi Paglia ve Valantine Metodu yla belirlendi (12). Bu metotta. GSH-Px, hidroperoksid varl ğ nda glutatyonun oksidasyonunu katalize eder. Okside glutatyon, glutatyon redüktaz ve NADPH varl ğ nda redükte forma çevrilirken, NADPH, NADP+ ye oksitlenir. 340 nm deki absorbans düşüşü GSH-Px aktivitesiyle orant l d r. GSH-Px aktivitesi mililitre eritrosit sedimenti baş na IU olarak tan mland. Akciğerlerde MDA düzeylerini belirlemek için akciğer dokular homojenizatörle homojenize edildi. 1 ml homojenat al n p üzerine 0.5 ml TCA eklendi. 10000 devirde 10 dk santrifüj edildi. Süpernatandan 1 ml al n p 0.5 ml %70 lik tiobarbitürik asit ile kar şt r ld. Ağ zlar kapal olarak 30 dk kaynat ld. Buz içinde 2 dk soğutulduktan sonra 532 nm de absorbanslar okundu. Sonuçlar nmol/ml olarak verildi. Plazma MDA düzeyi TBARS olarak ölçüldü (13). İstatistiksel analiz için, bilgisayar ortam nda SPSS program yla Mann- Whitney-U testi ve varyans analizi kullan ld. BULGULAR Tablo 1. Gruplara ait kan ve doku MDA seviyeleri (nmol/ml olarak). Radyasyon Radyasyon+Melatonin Kontrol (n=10) (n=10) (n=10) Akciğer dokusu 88.40±6.8* 65.22±5.8** 59.55±4.3 Kan MDA 69.18±7.1* 51.77±7.3** 46.43±5.7 *p<0.001, **p>0.001 Tablo 2. Gruplara ait antioksidan enzimlerin doku ve kan seviyeleri. Radyasyon Radyasyon+Melatonin Kontrol (n=10) (n=10) (n=10) Akciğer dokusu 181.0±29.3* 192±24.8* 188±27.3 SOD (U/ml) Kan 141.1±27.1* 151.2±28.3* 146.4±25.7 SOD (U/ml) Akciğer dokusu 1453± 177 1738±156** 1588±188 GSH-Px (IU/ml) Kan GSH-Px 1388±143 1787±133** 1498±177 (IU/ml) *p>0.05, **p<0.05 Gruplar n doku ve kan MDA düzey1eri Tablo 1 de gösterilmiştir. MDA düzeyleri, radyasyon uygulanan, radyasyon+melatonin uygulanan ve kontrol gruplarla karş laşt r ld. Radyasyon uygulanan grupta MDA düzeyi, melatonin verilen grupla ve kontrol grubuyla karş laşt r ld ğ nda, anlaml ö1çüde yüksek bulundu (p<0.001). Radyasyon+melatonin verilen grup kontrol grubuyla karş laşt r l nca, istatistiksel olarak anlaml olmayan bir art ş tespit edildi (p> 0.05). Gruplara ait antioksidan enzim düzeyleri Tablo 2 de gösterilmiştir. SOD düzeylerinde gruplar aras nda istatiksel olarak bir fark bulunmad (p>0.05). GSH-Px düzeylerine bak ld ğ nda; radyasyon uygulanan grupta GSH-Px de belirgin bir azalma varken, radyasyon+melatonin uygulanan grupta ise anlaml art ş görüldü (p<0.05). TARTIŞMA Melatonin bilinen en güçlü endojen antioksidand r (3,8,10,14,15). Birçok hastal kta serbest radikallerin rol oynad ğ art k yayg n olarak bilinmektedir. Melatoninin tümör büyümesi üzerine inhibitör etkisi eksperimental çal şmalarda gösterilmiştir (16). Ayr ca insanlarda endokrin tümörlerde melatoninin interlökin-2 ile birlikte kullan m n n tümör gerilemesi üzerine etkili olduğunu gösteren çal şmalar mevcuttur (17,18). Nikishkin ve ark. radyoterapi s ras nda enzimatik ve nonenzimatik antioksidan duzeyinin azald ğ göste- 87
Özgüner F, Şahin Ü, Koyu A, Köylü H, Akçalı A, Çalışkan S rilmişlerdir (19). Green radyoterapinin MDA seviyesini art rd ğ n yay nlam şt r (20). Bizim çal şmam zda s çanlarda radyoterapi uygulamas hem kan hem de akciğer dokusunda MDA seviyesini art rm şt r. Lipidlerde serbest radikal hasar n n göstergesi olan MDA düzeyindeki anlaml art ş literatür ile uyumludur. Radyoterapi ile birlikte melatonin verilen grupta doku ve kan MDA düzeyi kontrol grubuna göre artma göstermiştir. Ancak bu art ş, sadece radyoterapi uygulanan gruba göre düşüktür, melatoninin antioksidan etkisiyle ilgili literatür çal şmalar yla uyumludur (4,5,7). Antioksidan savunma sisteminde yer alan SOD ve GSH-Px enzimlerinin radyoterapiden etkilenmeleri tart şmal d r. Green çal şmalar nda radyoterapi uygulamas n n uzun dönemde kan GSH-Px düzeyini anlaml ölçüde etkilemediğini ileri sürmüştür (21). Bizim çal şmam zda GSH-Px düzeyinde anlaml olmayan bir azalma varken, melatoninle birlikte radyoterapi uygulanan grupta anlaml ölçüde art ş mevcuttur. Çal şmam z Reiter in melatoninin GSH-Px sevivesini art rarak antioksidan etki gösterdiğini ifade eden çal şmas yla uyum göstermektedir (3). Çal şmam zda ayr ca, radyasyon ile birlikte melatonin uygulamas n n SOD düzeyini fazla etkilemediği görülmüştür. Dolay s yla melatonin uygulamas n n SOD düzeylerine önemli bir etkisinin olmad ğ ve gruplar aras nda belirgin bir farkl l ğ n bulunmad ğ söylenebilir. Şekil 1. Gruplara ait kan ve doku MDA düzeyleri. Radyoterapi ile birlikte antioksidan olarak E vitamini gibi baz antioksidanlar n etkileri de araşt r lm ş ve antioksidanlar n doku hasar n önleyici etkilerinin olduğu gösterilmiştir (22). Araşt rmac lar n bir k sm in vitro çal şmalar nda gama ş nlar n n lökositler üzerine etkilerini ortaya koymuşlard r (23). Bu anaşt rmac lar oral tek doz melatonin uygulamas n n radyasyonun etkisiyle lenfositlerde oluşan DNA hasar - n azaltt ğ göstermişlerdir. Radyasyonun SR oluşumuna neden olduğu ve böylece dokularda hasara neden olduğu da bir diğer çal şmada ortaya konulmuştur (24). Gamma radyasyonun etkisiyle ortaya ç kan SR lerin lenfositlerdeki genetik deformasyonun sorumlusu olduğu belirtilmiştir. Bu etkinin melatonin ile azalt ld ğ da gösterilmiştir. Bu durumda melatonin gibi antioksidanlar n radyasyonun kullan ld ğ t bbi alanlarda oluşabilecek istenmeyen etkilerin önlenmesinde gündeme geleceği aç kt r. Şekil 2. Gruplara ait enzimlerin kan ve akciğer düzeyleri. Sonuç olarak, t pta çok yayg n olarak kullan lan radyasyonun ve özellikle radyoterapinin etkisiyle ortaya ç kan SR lerin neden olduğu yan etkilerin azalt lmas nda melatonin veya diğer antioksidanlar n etkileriyle ilgili yeni çal şmalar n yap lmas na ihtiyaç vard r. KAYNAKLAR 1. Bomford CK, Kukler JH, Sherrif SB. Effects of radiation on normal tissues. Textbook of Radiotherapy. Churchill Livingstone, Singapore, 1993: 2. Bomford CK, Kunkler JH, Sherrif SB. Cervix, body of uterus, ovary, vagina, vulva, gestational trophoblastic tumours. Textbook of Radiotherapy. Churchill Livingstone, Singapore, 1993: 3. Reiter RJ. Interactions of the pineal hormone melatonin with oxygen-centered free radicals: A brief review. Brazilian J Med Biol Res 1993; 26: 1141-1155. 4. Cerutti PA, Trump BF. Inflammation and oxidative stress in carsinogenesis. Cancer Cells 1991; 3: 1-12. 5. Chevion M. A site-spesific mechanism for free radical induced biological damage: The essential role of redox-active transition metals. Free Radicals in Biology and Medicine 1988; 5: 27-37. 88
6. Fridovich I. The biology of oxygen radicals. Science 1978; 201: 875-880. 7. Fridovich I. Biological effects of superoxide radical. Archives of Biochemistry and Biophysics 1985; 247: 1-11. 8. Poeggeler B, Reiter RJ, Tan D-X, Chen ID, Afauchester LC. Melatonin, hydroxyl radical- mediated oxidative damage and aging: A hypotesis. Journal of Pineal Res 1993; 14: 151-168. 9. Pierrefiche G, Topall G, Cowboin G, Henriet J, Laborit H. Antioxidant activity of melatonin in mice. Research Communications in Chemical Pathology and Pharmacology 1993; 80: 211-223. 10. Shank B. Techniques of Magne-Field Irradiation. Int J Rad Oncol Biol Phys 1989: 1925-1931. 11. Sun Y, Oberley LW, Ying L. A simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clin Chem 1988; 34: 497-500. 12. Paglia D, Valantine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erytrocyte glutathione peroxidase. J Jap Clin Med 1967; 70: 158-169. 13. Christie AK, James AN. Multiple anti-oxidants protect against protein and lipid oxidation in kidney tissue. Free Rad Biol Med 1996; 20: 165-173. 14. Hall vell B. Reactive oxygen species and the central nervous system. J Neurochem 1992; 59: 1609-1623. 15. Hardeland R, Reiter RJ, Poeggeler B, Fan D-X. The sign ficiance of the metabolism of the neurohormone melatonin: Antioxidative protection and formation of bioactive substances. Neuroscience and Biobehavioral Reviews 1993; 17: 347-357. 16. Blask DE, Hill SM. Melatonin and cancer: Basic and clinical aspects. Oxford Medical Publicatios. Oxford 1988; 128-173. 17. Barni S, Lissoni P, Cazzaniga M, Ardizzoia A, Mercgelli S, Fossati V, Fumagalli. L, Brivin P, Tancini G. A randomized study of low-dose subcutaneous interleukin-2 and melatonin versus supportive care alone in metastatic colorectal cancer patients progressing under 5-fluorouracil and folates. Oncology 1995; 52: 243-245. 18. Lissoni P, Barni S, Tancini C, Mainuni E, Piglia P, Maestroni GJ, Lewinski A. Immunoendocrine therapy with low-dose subcutaneous interleukin-2 plus melatonin of locally advanced or metastatic endocrine tumours. 1995; 52: 163-166. 19. Nikishkin IA, Sukolunskii VW, Kovaleva OV, Raspopova NI, Naumenko VK. Enzymes protecting the erithrocyte membrane during the combined exposure to antioxidant complex and acute irradiation. Radiobioligie 1992; 32: 738-742. 20. Green Stock CL. Redox process in radiation biology and cancer. Radiat Res 1981; 86: 196-211. 21. Green HJM, Meider C, De Vries EGE, Mulder NH. Red blood cell glutathione levels in lung cancer patients pretreated by radiation and continueously nfused carboplatin. Anticancer Res 1996; 16: 1033-1038. 22. Subrameniam S, Shyama S, Shyamola Devi CS. Protective effect of vitamin E against CMF-induced damage in small intestinal brush border membrane of rats. Indian Pharmacol 1994; 26: 213-237. 23. Vijayalaxmi, Reiter RJ, Meltz ML, Herman TS. Melatonin: Possible mechanisms involved its "radioprotective" effect. Mutat Res 1998; 404: 187-189. 24. Vijayalaxmi, Reiter RJ, Sewerynek E, Poeggeler, Leal BZ, Meltz ML. Marked reduction of radiation-induced micronuclei in human lymphocytes pretreated with melatonin. Radiat Res 1995; 143: 102-106. YAZIŞMA ADRESİ: Dr. Fehmi ÖZGÜNER P.K. 13 32100, ISPARTA 89