Moleküler biyolojide kullanılan yöntemler-6 Rekombinant DNA teknolojisi (Moleküler Klonlama 1 2 Rekombinant DNA Farklı organizmalardan elde edilen DNA parçalarının birleştirilmesi ile oluşturulan DNA moleküllerine rekombinant DNA denir. Rekombinant DNA teknolojisi Doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan genellikle farklı biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin genetik mühendisliği teknikleriyle kesilmesi ve birleştirilmesi işlemlerini kapsayan bir teknolojidir. Moleküler klonlama (gen klonlaması) da denir. Bedensel hücre çekirdeği aktarımı (nüklear transfer): Moleküler klonlamadan farklıdır. Burada bedensel hücre çekirdeği, yumurta çekirdeğine transfer edilir. Bu işlemler sonucu Rekombinant DNA elde edilir. Transgenik organizma=genetiği değiştirilmiş organizma (GDO): yabancı gen bulunduran organizma 3 4 Gen klonlamanın aşamaları Moleküler klonlamada herhangi bir kaynaktan alınan çift zincirli bir DNA parçası bir vektöre yerleştirilir ve uygun bir konak içerisine sokulur. Burada çoğaltıldıktan sonra hedef organizmaya transfer edilir Restriksiyon enzimleri, DNA ligaz, PCR in vitro rekombinasyonda kullanılan önemli öğelerdir. 1) Kaynak DNA nın parçalanması ve izolasyonu Kullanılacak DNA, bir organizmanın toplam genomik DNA sı Bir RNA kalıbından ters transkriptaz ile sentezlenen DNA PCR ile çoğaltılmış gen veya genler olabilir. Eğer DNA genomik kaynaklı ise, ilk olarak uygun büyüklükte parçalar karışımı elde etmek için restriksiyon enzimleri ile kesilir. 5 6 1
2) DNA parçalarının DNA ligaz ile bir klonlama vektörüne bağlanması (Ligasyon) Klonlama vektörleri, genellikle plazmit veya virüslerden elde edilmiş, bağımsız replikasyon yapabilen ve gen replikasyonu için kullanılan küçük genetik elementlerdir. ligasyon DNA kaynağı ve vektör aynı restriksiyon enzimi ile kesilerek iki molekül oluşan yapışkan uçlarla birleşir. Yapışkan uçların tutunmuş çiftindeki kırık olan fosfodiester bağlarını birleştirmek için DNA ligaz kullanılır. (DNA ligaz 5 fosfat grubunu 3 OH grubuna bağlanmasını sağlar.) Klonlama vektörleri tipik olarak in vitro koşullarda yabancı DNA nın vektörün kesme bölgesine eklenmesine olanak verecek şekilde tasarlanır ve kesme işlemi vektörün replikasyonuna etki etmeyecek şekilde yapılır. 7 8 Klonlama vektörleri Vektörler, klonlamada yabancı genleri taşımada ve konak organizmaya yerleştirmede kullanılan özel DNA lardır. Replike olma yeteneğinde olmalıdırlar. Konak genomundan bağımsız olarak izole edilebilmelidirler. Klonlama işleminin takip edilebilmesi için seçicilik sağlayan bir marker gen de bulundurmalıdırlar (Antibiyotik direnç geni gibi) Konak: Gen klonlamasının yapıldığı mikroorganizma. Genellikle E. Coli kullanılır. Büyük fragmentli DNA parçalarını çalışmak için S. Cerevisiae de kullanılıabilir. Ayrıca Bacilllus subtilis de kullanılabilmektedir. Plazmitler Hücre içinde kromozomal DNA dan ayrı olan halkasal yapıdaki DNA lardır. Bakterilerde doğal olarak bulunur. Ökaryotlarda ise nadiren bulunur (S. Cerevisiae). Plazmitler konak kromozomundan bağımsız replikasyon yaparlar. Kendi replikasyonları için gerekli genlerin dışında konaklarına bazı özellikler kazandıran çeşitli genleri de taşırlar (genellikle antibiyotik ve çeşitli metallere direnç genleri) plazmitlerin çoğu doğal vektörlerdir (türler arasında Yatay gen transferi sağlar). Küçük genleri klonlamakta kullanılır (1-20 kb) 9 10 Diğer vektörler Plazmitlerin klonlama vektörü olarak kullanılmalarının nedenleri: 1) Küçük olmaları DNA nın izolasyonunu ve manipülasyonunu kolaylaştırır. 2) Bağımsız replikasyon orijinlerinin olması 3) Çoklu kopya halinde bulunmaları, hücrede birkaç kopya halinde bulunabilirler. 4) antibiyotik direnç geni gibi seçilebilir işaretlerinin bulunması, plazmit içeren klonların saptanmasını ve seçilmesini kolaylaştırır Faj λ Plazmit vektörlerden daha büyük fragmentleri klonlamak için kullanılır. Kosmidler: Büyük genleri klonlamakta kullanılır (37-52 kb). Plazmit ve bakteriyofajların özellikleri kullanılarak oluşturulmuş plazmit-bakteriyofaj λ Yapay maya kromozomlar (YAC) 200-3000kb lık DNA ları klonlamakta kullanılır Bakteriyel yapay kromozomlarıı (BAC) Genom projelerinde kullanılır Ti Plazmiti (Agrobacterium tumefaciens e ait plazmit) bitkilere gen transferinde kullanılır. 11 12 2
Bakteriyel transformasyon 3) Klonlanmış DNA nın bir konak organizmaya transferi (transformasyon) Test tüpü içinde içinde hazırlanmış rekombinant DNA bir konak organizmaya aktarılır ve orada replike olur. Klonlama vektörleri için konakl mikroorganizmaların sahip olması gereken özellikler Yüksek miktarlarda klonlanmış DNA elde etmek için ideal bir konak pahalı olmayan bir kültür ortamında hızlı bir şekilde büyüyebilmelidir. bakterilerdeki transformasyon yöntemleri Konak hücre Ca 2+ iyonları ile muamele edilerek yabacı DNA yı (vektör) hücre içeni alma yeteneği kazanır. Elektroporasyon: Hücrede düşük akımda elektrik şoku uygulanır. Hücre zarında delikler oluşur ve yabancı DNA yı içine alır. Patojenik olmamalıdır. DNA yı içine alabilmeli Vektörün replikasyonunu yürütebilecek uygun enzimlere sahip olmalı Klonlama için en uygun konaklar, kolay çoğalabilen ve yapıları iyi bilinen mikroorganizmalardır. Bakteriler: E.coli Bacillus subtilis Maya: Saccharomyces cerevisiae dir. 13 14 Seleksiyon: Gen transferinin yapılan hücrelerin belirlenmesinde vektörlerde bulunan işaret genlerinden yararlanılır. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan yöntemler: Antibiyotik direnci: Bütün plazmitlerde bulunan ampisiline, tetrasikline veya kanamisine direnç sağlayan genlerden biri bulunur. Transformasyon yapıldıktan sonra rekombinant hücreler antibiyotik içeren besiyerinde geliştirilir. Transformasyon gerçekleşen hücreler antibiyotikli besiyerinde gelişir. Yapılamayanlar ise gelişmez. Gelişme varsa transformasyon yapılmıştır. Lac Z geni: E. coli de β-galaktozidazı kodlayan gendir. Besiyerinde bu enzimin substratı olan x-gal. Besiyerinde gelişen mavi koloniler lac Z geni içerir. Beyaz koloniler ise klonlanmış olan kolonilerdir. vektör konak mikroorganizmaya yerleştirildikten sonra rekombinant hücreler çoğalma ortamında inkübe edilir. Ampisilin ve kimyasal bir boya içeren nutrient agarlı petrilere ekim yapılarak rekombinant hücreler inkübe edilir. 15 16 Bitkilerdeki transformasyon yöntemleri Gen tabancası (Partikül tabancası) kullanılarak istenilen genin hedef hücre veya dokuya süratle fırlatılması. 1-2 um çapında metal partiküller aracılığıyla, bir ateşleme mekanizmasından yararlanılarak DNA hedef dokuya aktarılır. Yabancı DNA hücre içine girdikten sonra DNA bitki genomu ile birleşir. Elektroporasyon uygulanabilir. Mikroenjeksiyon: kapiler mikropipetler ile mikroskop altında gerçekleştirilir. Agrobacterium tumefaciens e ait Ti-plazmiti olarak adlandırılan büyük bir plazmit kullanılır. En basit yöntemdir. Genellikle bu yöntem kullanılır. Bitki yapraklarrı küçük parçalara ayrılır (1x1 cm) ve Agrobacterium tumefaciens içeren çözeltiye daldırılarak 10 dak bekletilir. Daha sonra antibiyotik içeren selektif besiyerinde geliştirilir. 17 18 3
Gen aktarılmış bir ürünün laboratuvardan ticarete sunuluncaya kadar değişik analizleri için ve testleri 10-16 yıllık bir süreyi kapsamaktadır. Rekombinant DNA teknolojisinin kullanım alanları TIP Rek DNA teknolojisinin en güçlü alanı insan proteinlerinin üretimidir. Memeli hücrelerinde bulunan birçok proteinin yüksek farmasötik değeri bulunmaktadır. Ancak bu proteinler normal dokularda oldukça düşük miktarlarda bulunurlar. Bu yüzden bunları saflaştırmak oldukça masraflıdır. Rekombinant mikroorganizmalarla bu proteinler üretilebilmektedir 19 20 Biyoteknolojinin ilk başarısı insülin hormonunun üretilmesidir. Geçmişte ticari olarak sığır veya domuz pankreasından izole edilen insülinin kullanılmasıyla insan diyabeti tedavi ediliyordu. Ancak, insana ait olmaya bu insülin yeteri kadar etkili olmamakta ve izolasyon yöntemi de karışık ve pahalıdır. Günümüzde insan insülin geninin bakterilere klonlanmasıyla bu sorun çözülmüştür. İnsülinden başka diğer memeli proteinleri de genetik mühendisliği yöntemleriyle üretilmektedir. Bunlar arasında özellikle kan pıhtılaşma mekanizması ve diğer kan işlemlerinde kullanılan çeşitli hormonlar ve proteinler bulunmaktadır. Örneğin, TPA (doku plazminojen aktivatörü) kan pıhtılarını çözen protein ve kan pıhtılaşmasını sağlayan proteinler (kan pıhtılaşma faktörleri), geçmişte toplanan kanlardan izole ediliyordu. Artık rek DNA teknolojisi ile üretilmektedir. 21 22 İnterferonlar: hayvan hücrelerinin viral enfeksiyonu veya bağışıklık aktivasyonu sonucunda üretilen proteinlerdir. Bunlar rek. DNA teknolojisi ile üretilerek kanser tedavisinde ve bağışıklık sistemi güçlendirilmesinde kullanılır. Bunların dışında pekçok protein ve enzim üretilmektedir GIDA ENDÜSTRİSİNDE REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ UYGULAMALARI Bitkilerde genetik modifikasyon uygulamaları Genetik modikifasyon uygulamaları bitkilerde verim artışı, Gıda ve ilaç üretimi için maliyet düşürme Herbisitlere dirençli bitki üretimi Böceklere ve diğer zararlılara dirençli bitki üretimi ve kullanılan kimyasalların azaltılması Makro ve mikromolekül yapılarında değişiklik Hasat sonrası kayıpların azaltılması Olumsuz çevre koşullarına dayanıklı bitki üretimi Gıdaların besin değerinin ve kalitesinin arttırılması 23 24 4
İlk transgenik bitki domatestir (Flavr Savr) Ekim alanları 1996 yılında 1.7 milyon hektar 2008 yılında 125 milyon hektara çıkmıştır. Günümüzde en çok ekimi yapılan transgenik bitkiler soya, mısır, pamuk ve kolzadır. Ticari olarak, daha çok çiftçiyi doğrudan ilgilendiren herbisitlere, böceklere, virüslere dayanıklılık gibi özelliklerin aktarılmış olduğu ürünlerin ekimi yaygındır. En çok üretimi yapan ülkeler ABD, Arjantin, Brezilya, Kanada, Hindistan, ve Çin Halk Cumhuriyetidir. 25 26 Herbisitlere ve bitki zararlılarına dirençli bitki üretimi Herbisit direnci bitkiye genetik olarak aktarılır ve böylece artık zehirli kimyasallar tarafından öldürülemez. Bitkinin kendine zarar vermeksizin, ürünü tehdit eden birçok yabancı otun tek işlemde ortadan kaldırılmasına olanak sağlar. Viral enfeksiyonlara karşı direnç: bir virüsün kılıf proteinini kodlayan gen bitkilere aktarılır. Kılıf proteini içeren bitki, kılıfsız viral partikülleriyle çatışmakta ve bu da virüsün replikasyonunu bozmaktadır. Böcek direnci: Bacilllus thruringensis in toksik proteinlerini kodlayan genler aktarılır. Bu toksin güve ve tırtıllara etkilidir. Çok sayıda ilaçlama yapılması zorunluluğu ortadan kalkar. 27 28 İşleme kalitesinin arttırılması Hasat sonrası kaliteyi geliştirmeye yönelik gen aktarımları. Hastalıklara direnç ve hücre duvarı stabilitesini arttırarak raf ömrünü uzatmak gibi Flavr Savr domatesi FDA tarafından onaylanan ilk GDO dür. Raf ömrünü uzatmak amacıyla üretmiştir. Etilen üretim geni kontrol edilerek veya poligalakturonaz enzimi baskılanarak pektin yıkımı önlenerek raf ömrü uzatılmaktadır. Olgunlaşmanın yavaşlatılması veya geciktirilmesi, çilek, ahududu, şeftali gibi ürünlere de yapılmaktadır. Besin değerinin Artırılması Patateste nişasta biyosentezinin arttırılması, nişasta içeriğinin değiştirilmesi Patates ve tahıllarda Lisin, tirozin metiyonin, sistein gibi zorunlu aminoasitlerin miktarlarının arttırılması Yağ metabolizmasının genetik modifikasyonu ile yağ asitlerinin doymuşluk derecelerinin değiştirilmesi Kanolada laurik asit içeriği arttırılarak bu ürün kısmi hidrojene olmuş bitkisel yağ olarak şekerlemelerde kullanılmaktadır. 29 30 5
Pirincin β-karoten miktarı arttırılarak A vitaminince zenginleştirilmesi sağlanmıştır (Altın pirinç-golden rice) Çeşitli uygulamalarda (kızartma gibi) istenen özelliklerden biri oleik asit miktarının linoleik ve linolenik asitten fazla olmasıdır. Soya fasulyesinin doymuş yağ asit içeriği azaltılıp, oleikasit içeriği arttırılmış ve böylece soya yağına başka işlemlere gerek kalmadan daha iyi kızartma stabilitesi kazandırılmıştır. Fotosentez için gerekli bir pigment olan β-karoten bitkinin sadece yeşil dokusunda bulunur, bitkinin fotosentez yapmayan tohumlarında bulunmaz Tohum hücrelerinin β-karoten üretebilmesi için pirinç bitkisinin genomuna B- karoten sentezinde görev alan 3 gen aktarılmış ve pirinçte β- karoten üretimi gerçekleştirilmiş. 31 32 İlaç aşı ve hormon üretimi Tarımsal biyoteknolojinin bir diğer uygulama alanı da bitkiler yardımı ile ilaç aşı ve hormon üretimidir. Bu alandaki çalışmalar deneysel aşamadadır. Patates, kanola, tütün ve mısır bitkilerinde kuduz, veba ve hepatit hastalıklarına karşı aşıların üretilmesi üzerinde denemeler yapılmaktadır. Böylece bu hastalıkların az gelişmiş ülkelerde yayılmasının önlenmesi mümkün olabilecek hem de yüksek maliyetli geniş ölçekli aşı kampanyalarına gerek duyulmayacaktır. Genetik modifiye mikroorganizmalar M.o lardan işlem yardımcıları, gıda katkı maddeleri vb eldesinde uzun yıllardır endüstriyel boyutta yararlanılmaktadır. M.o ların endüstride tercih edilmelerinin başlıca nedenleri hızlı çoğalmaları, üretimlerinde yüksek sıcaklık, basınç veya güçlü kimyasallara gereksinim duyulmaması ve atık/yan ürünler üzerinde gelişebilmeleridir. Ayrıca atıklar üzerinden değerlendirildiğinde atıkların biyobozunur olması nedeniyle m.o lar ekolojik açıdan da kimyasal yöntemlere göre avantaj sağlamaktadır. 33 34 Genetik mühendisliği uygulamalarının bakteri küf ve mayaların özelliklerinin değiştirilerek m.o lar yardımıyla daha önce üretilmeyen maddelerin üretimi ve üretimlerin daha verimli ve ekonomik olması yönünden katkıları olmuştur. Rek DNA tek nin kullanımı özel gıda işleme koşullarına uygun yeni enzimlerin üretilmesini de mümkün kılmıştır. Bu enzimler, çeşitli kaynaklardan izole edilen m.o ların taranması veya bilinen enzimlerin modern protein mühendisliği teknikleriyle modifikasyonu ile üretilebilmektedir. Amilazlar ve lipazlar gibi gıda sanayi açısından önem taşıyan enzimler özel gıda uygulamalarına uygun olacak şekilde değiştirilebilmektedir. 35 36 6
Rek DNA teknolojisi ile üretilen ilk enzim 1988 de onay alan kimozin enzimidir. Buzağı şirdeninden elde edilen bu enzimin bulunabilirliğinin zor ve maliyetinin yüksek olması nedeniyle günümüzde Rek DNA teknolojisiyle bovin prokimozin geni aktarılmış m.o lar tarafından üretilmektedir. Bu genin E.coli, Kluyveromyces marxianus gibi m.o lara klonlanması ve biyoreaktörde üretilmelerinin ardından salgıladıkları enzimin ekstraksiyonu ve saflaştırılması sonucu kimozin elde edilmektedir. Bunun dışında gıda sanayinde fırıncılık ürünleri, alkollü içecekler, glikoz şurubu, ve diğer nişastalı ürünlerin üretiminde kullanılan a-amilaz, katalaz, lipaz, proteaz, ksilanaz gibi çok çeşitli enzimler rekombinant mikroorganizmlardan saf bir şekilde elde üretilebilmektedir. ABD de peynir üretiminin yaklaşık %60 ında bu enzim kullanılmaktadır Kimozin GRAS statüsünde bir enzimdir 37 38 Starter kültürlerin özelliklerinin geliştirilmesi Laktik asit bakterilerinin genetik modifikasyonu ile farklı süt ürünleri elde edilebilmekte, ürünlerin organoleptik özelliklerinin yanında besin değerleri de arttırılabilmektedir. Substratlardan yüksek oranda dönüşüm sağlanması, doğal inhibitör maddelerin (bakteriyosin) ve proteolitik enzimlerin üretimi laktik asit bakterilerinin modifikasyonu ile sağlanabilmektedir. Ekmek üretiminde kullanılan S. Cerevisiae da yapılan modifikasyonlarla maltaz ve maltoz permeaz enzimleri üretimi gerçekleştirilerek nişasta kullanımı arttırılmış Bakteriyofajlara dirençli kültür üretimi de gerçekleştirilebilmektedir. 39 40 Hayvanlarda genetik modifikasyon uygulamaları Hayvanların üreme performanslarının arttırılması Büyüme hızının arttırılması Hayvansal ürünlerin miktar ve kalitesinin arttırılması (sütün kazein, yağ, laktoz miktarlarının modifikasyonu) İnsan sağlığına yönelik olarak antikorlar ve bazı proteinler de hayvanlar vasıtasıyla üretilebilmektedir. Trangenik olarak yetiştirilen sığır, koyun ve keçilere önemli proteinlerin genleri aktarılarak bunları sütlerinde fazla miktarda üretmeleri sağlanır Balıklarda da büyüme hormonu geni aktarılarak hızlı büyüme gösteren balıklar elde edilmiştir. 41 42 7