insidansı 1/2000 olarak bildirilmektedir. Genellikle pubertede başlayan hastalık,

1. GİRİŞ Keratokonus, korneanın inflamatuar olmayan bir süreçte ortaya çıkan incelmesi sonucunda konik bir şekil (ektazi) almasıdır. Genel popülasyonda insidansı 1/2000 olarak bildirilmektedir. Genellikle pubertede başlayan hastalık, 3. ve 4. dekatlara kadar ilerleme gösterebileceği gibi, yaşamın herhangi bir anında ilerlemesinin durabileceği de bildirilmiştir. Keratokonus, korneanın incelmesi neticesinde irregüler astigmat, miyopi ve ektazi gelişmesine neden olarak görme kalitesinde şiddetli azalmaya neden olmaktadır. 1-5 Keratokonus tedavisinde çeşitli yöntemler kullanılmıştır: sert kontakt lensler, intrakorneal halkalar, epikeratoplasti, excimer laser fotorefraktif keratektomi (PRK), parsiyel penetran keratoplasti (PPK) ve anterior lameller keratoplasti (ALK) teknikleri. Bu tedavi seçenekleri refraktif kusuru düzelterek görme kalitesini artırmakta, ancak hiçbiri keratokonus patogenezini etkilememekte ve hastalığın ilerlemesine engel olamamaktadır, hatta keratokonus tedavisi için kullanılan yöntemlerin bir kısmı hastalığın ilerlemesini tetiklemektedir. 6 2003 yılında Wollensak ve arkadaşları tarafından keratokonus patogenezini etkileyerek hastalığın ilerlemesini engelleyen, riboflavin ve ultraviyole-a (UV-A) ile korneal kollajenin çapraz bağlarını artırmaya yönelik yeni bir teknik bildirilmiştir. 7 UV-A ışınları ile aktive edilen riboflavin, korneal kollajenin birbirleri ile olan bağlarını kuvvetlendirerek korneal stabilizasyona neden olmakta ve korneal ektazinin progresyonunun durmasını, hatta gerilemesini sağlamaktadır. 6-10 1

Tavşan ve domuz gözlerinin kullanıldığı, geniş kapsamlı deneysel çalışmalarda bu tekniğin uygulandığı kornealarda, uygulanmayan kornealara göre gerilim ve torsiyon kuvvetlerinde %70 oranında artış izlenmiştir. Uygulanan UV- A dozlarının riboflavin ile beraber kullanıldığında endotele, lense veya retinaya toksik etkisinin bulunmadığı ve başka bir komplikasyona yol açmadığı gösterilmiştir. 10-20 Bu teknik, korneal kollajen çapraz bağlama (KKÇB) ile korneal kollajenler arası bağların kuvvetlenmesini sağlamakta, keratokonus hastalığının ilerlemesini durdurmakta ve keratokonus patogenezine yönelik ilk tedavi metodu olarak umut vermektedir. Yapılan uzun takip süreli klinik çalışmalarda, KKÇB ile tedavi edilen gözlerin %90 ından fazlasında keratokonus progresyonunun durdurulduğu bildirilmiştir. 21-23 Bildirilen orjinal KKÇB metodunda, işlemin etkin olması için kornea epitelinin santral 7-9 mm çaplı kısmının tam kat uzaklaştırılması gerektirmektedir. 6, 7, 24 Tam kat epitel uzaklaştırılmasının doğal sonucu olarak işlem sonrası hastalarda ağrı ve batma şikayetleri uzun süre devam etmekte ve korneanın önemli bir bariyeri olan epitelin kaldırılmış olması da ciddi enfeksiyöz komplikasyonların gelişmesine neden olabilmektedir. 25-29 Tam kat epitel debridmanı gerçekleştirmeden KKÇB uygulanabilmesi, bu tedavi yönteminin konforunu ve güvenliğini artırarak keratokonus tedavisine önemli bir katkı sağlayacaktır. Bu çalışmanın amacı UV-A ve riboflavin ile korneal kollajen çapraz bağlama tedavisinde kullanılan tam kat kornea epitel uzaklaştırılmasına alternatif yöntemler geliştirilmesidir. 2

2. GENEL BİLGİLER Bu bölümde, KKÇB uygulamasının temel tedavi amacı olan keratokonus ile ilgili güncel bilgiler ve tedavi yöntemlerine yer verilecektir. KKÇB uygulamasının diğer potansiyel uygulamaları Tablo 1 de incelenebilir. Bölüm 2.2 de KKÇB tekniği ile ilgili detaylı bilgi aktarılacaktır ve bölüm 2.3 de bu çalışmanın amacı bildirilecektir. Tablo 1. Korneal kollajen çapraz bağlama için potansiyel endikasyonlar. Keratokonus Pellusid marjinal dejenerasyon İatrojenik keratektazi (laser in situ keratomileusis sonrası) Keratektazinin önlenmesi (refraktif cerrahi öncesi) Büllöz keratopati Mikrobiyal keratit Korneal stromal ülserasyon Keratoplasti öncesi donör doku modifikasyonu Ortokeratolojiye yardımcı olarak 2.1. Keratokonus 2.1.1. Keratokonus Tanımı Keratokonus, inflamatuar olmayan stromal incelme sonucu korneanın konik bir şekil almasıdır. Korneal incelme; miyopi, irregüler astigmat ve ektaziye yol açarak hafif veya şiddetli görme kalitesinde bozulmaya neden olur. 3 Başlangıçta sadece bir gözde izlense de sonuçta iki gözü de etkileyen ilerleyici bir hastalıktır. 2.1.2. Keratokonus Epidemiyolojisi Klasik olarak keratokonus puberte ile birlikte başlar ve 3-4. dekada kadar ilerlemesini sürdürür. Nadiren hayatın herhangi bir döneminde başlayabilir. Sıklıkla izole bir klinik durum olarak izlense de diğer hastalıklarla birlikteliği 3

bildirilmiştir. En sık Down sendromu, Leber in konjenital amorozisi ve bağ dokusu hastalıkları ile birlikteliği gösterilmiştir. Atopi, göz kaşıma ve sert kontakt 2, 3, 30 lens kullanımı bu hastalık ile yüksek oranda birliktelik göstermektedir. Literatürde bildirilen keratokonus insidansı 100.000 kişide 50 ile 230 arasında değişiklik göstermekle birlikte yaklaşık 1/2000 olduğu kabul edilmektedir. 1, 3-5 Keratokonus tüm etnik gruplarda kadın-erkek ayrımı olmaksızın izlenmektedir. 2.1.3. Klinik Özellikler Keratokonus semptomları, hastalık derecesine bağlı olarak, ileri derecede değişkendir. Erken hastalık durumunda hiç semptom izlenmezken, ileri hastalıkta görüntü distorsiyonu ile birlikte ciddi görme kaybı izlenebilir. Neyse ki keratokonus hastalığında hiç bir zaman mutlak körlük gelişmez. Bulgular da hastalığın şiddetine bağlı olarak değişkendir. Tablo 2 de keratokonus hastalığının bulguları verilmiştir. Tablo 2. Keratokonus bulguları. Dış bulgular Munson bulgusu Rizutti fenomeni Biyomikroskopi bulguları Stromal incelme Arka stres çizgileri (Vogt striae) Demir halkası (Fleischer halkası) Skar (epitelyal veya subepitelyal) Retroiluminasyon bulguları Retinoskopide makaslama Yağ damlası bulgusu (Charleaux) Korneal Topografi Bulguları Lokalize artmış yüzey gücü İnferior- süperior dioptrik asimetri Horizontal meridyenin alt ve üstünde dik aksların relatif asimetrisi 4

2.1.4. Etiyoloji ve Patogenez Keratokonus patogenezi ile ilgili çok yoğun biyokimyasal ve epidemiyolojik çalışmalar yapılmış olmasına rağmen altta yatan biyokimyasal ve etiyolojik temeller çok az anlaşılabilmiştir. Keratokonusta korneanın incelmesi yapısal elemanların kaybolması sonucu meydana gelmektedir ancak nasıl geliştiği anlaşılamamıştır. Teorik olarak korneanın incelmesi, normalden daha az kornea lameli oluşundan, her lamelde daha az kollajen fibrili oluşundan, kollajen fibrillerinin daha yakın temaslarından veya bu üç faktörün kombinasyonu sonucunda meydana gelebilir. 31 İlk yapılan biyokimyasal çalışmaların sonucunda keratokonuslu hastaların kornealarında kollajen yapısının farklı olmadığı ortaya çıkmıştır. 32 Keratokonuslu kornealarda yapılan biyokimyasal çözümlemeler ve immünohistokimyasal çalışmalarda, kornea stromasının kaybının, proteazların ve diğer katabolik enzimlerin artışı ile 33 veya proteinaz inhibitörlerinin azalmış seviyeleri ile açıklanabileceği öne sürülmüştür. 34 Wilson ve arkadaşları kornea epiteli ve endotelinin interlökin-1 (IL-1) ürettiğine bununla birlikte keratositlerde de IL-1 reseptörü bulunduğuna dikkat çekmişlerdir. Aynı çalışmada IL-1 in keratositlerde apoptoza neden olduğunu bildirerek IL-1 yolunun keratokonusun patogenezinde rolü olabileceğini öne sürmüşlerdir. 35 Daha önceki çalışmalarda keratokonus hastalarının keratositlerinde normal kornealara göre artmış IL-1 reseptörlerinin varlığı bildirilmiştir. Buradan yola çıkarak, artmış IL-1 reseptör miktarının keratositleri epitel ve endotelden salınan IL-1 e duyarlı hale getirebileceği ve bu durumun zaman içerisinde keratositlerde apoptoza neden olarak stromal 5

incelmeye yol açabileceği öne sürülmüştür. 35 Bu hipotez; mikrotravmanın epitelden IL-1 salınımını artırdığı göz önünde bulundurulursa, keratokonusun göz kaşıma, kontakt lens kullanımı ve atopi ile ilişkisini de açıklamaktadır. 36 Apoptozun regülasyonu ile ilgili farklı bozukluklarda da epitelyal mikrotravma olmaksızın keratokonus gelişebileceği öne sürülmüştür. 35 Klinik gözlemler, topografik çalışmalar ve keratokonus hastalarının ailelerinin segregasyon analizleri keratokonus hastalığında genlerin majör bir rol oynadığını göstermektedir. 37, 38 Göz kaşıma ve sert kontakt lens kullanımı gibi çevresel faktörler, genetik olarak duyarlı kişilerde hastalığın ilerlemesine neden olabilmektedir. Hastalığın heterojen yapısı, değişik genetik alt tiplerinin olduğunu ve klasik mendel genetiği yasalarının tüm ailelere uygulanamayacağını ortaya koymaktadır. Günümüze kadar keratokonus nedenini anlamak adına çok az yol katetmiş olmamıza rağmen moleküler genetik alanındaki gelişmeler, sonuçta keratokonus için yüksek riskli kişilerde hastalığın ilerlemesini durduracak bir gen tedavisi bulunması yönünde ilerlemektedir. 2.1.5. Keratokonus Tedavisi Keratokonus tedavisinde sert kontakt lensler, intrakorneal halkalar, epikeratoplasti, excimer laser PRK, PPK ve ALK teknikleri uygulanmaktadır. Bu tekniklerin tümünün amacı korneanın ektazisi sonucu ortaya çıkan görme kalitesindeki azalmanın düzeltilmesidir. Yukarıda bahsedilen hiçbir teknikte keratokonusta semptom ve bulgulara neden olan ektazinin ilerlemesini durdurmaya yönelik bir işlem yapılmamaktadır. 6

Sert kontakt lens uygulamaları hafif ve orta şiddette keratokonus hastalarında başarıyla uygulanarak görme kalitesi artırılabilmektedir ancak bazı yayınlarda kontakt lensin epitel travmasına neden olarak keratokonusun ilerlemesine neden olduğu bildirilmektedir. 6 Kornea içi halkalar, her ne kadar görme kalitesini artırmanın yanında keratokonus ilerlemesini biyomekanik bir bariyer oluşturarak durduruyor gibi görünse de uzun dönem takiplerde hastaların %35 inden fazlasında hastalık seyrinde ilerleme izlenebilmektedir. Bu oran ileri evre keratokonus hastalarında daha yüksektir. Ek olarak, cerrahi bir işlem olması nedeniyle belirli komplikasyonları ve riskleri bulunmaktadır. 39 Excimer laser ile PRK uygulaması özellikle skarı bulunan, düzensiz yüzeye sahip, hafif- orta şiddette keratokonus hastalarında uygulanmıştır. Her ne kadar olumlu sonuçlar bildirilmişse de, keratosit apoptozunu indükleyebileceği ve hastalığın ilerlemesine olumsuz etkisi olabileceği için bu tedavi seçeneğine 40, 41 dikkatli yaklaşılmaktadır. Keratokonuslu hastaların ortalama %20 si keratoplasti ihtiyacı duymaktadırlar. 2, 6 Penetran veya lameller keratoplasti yöntemleri de keratokonus hastalığının patogenezine yönelik tedaviler değildir. Hastalıklı korneanın donör ile değiştirilmesi veya desteklenmesi esasına dayanan majör oküler cerrahilerdir. Günümüzde tekniklerin gelişmesi ile komplikasyon oranları oldukça azalmış olsa da, enfeksiyon ve rejeksiyon gibi büyük riskleri olan keratoplasti teknikleri halen son seçenek olarak kullanılmaktadır. 7

Son 10 yılda keratokonus tedavisinde yeni bir teknik geliştirilmiş ve bu teknik, hastalığın ilerlemesini durdurarak bu alanda bir çığır açmıştır. Bölüm 2.2 de Korneal Kollajen Çapraz Bağlama (Cross-linking) adı verilen bu teknik detaylı olarak anlatılacak ve çalışmamızın temelini oluşturan dezavantajlarından bahsedilecektir. 2.2. Riboflavin ve UV-A ile Korneal Kollajen Çapraz Bağlama 2.2.1. Tarihçe Spoerl ve arkadaşlarının 1998 yılında Dresden üniversitesinde yapmış oldukları çalışma ile ektatik kornea hastalıklarının tedavisinde KKÇB nin kullanımı ilk defa gündeme gelmiştir. 42 Bu çalışmada 160 domuz gözünde gluteraldehid, formaldehid, UV ışık ve korneayı ışığa duyarlı hale getiren bir madde (riboflavin) çeşitli dozlarda ve sürelerde uygulanmıştır. Bu uygulamalarla kollajen çapraz bağlarının gelişmesi sağlanarak, korneanın gerinim kuvvetinin önemli ölçüde artırılabildiği gösterilmiştir (Şekil 1, Resim 1). Bu çalışmadan sonra, ilk KKÇB fikrini öne atan grup olan Dresden Üniversitesi Göz Kliniği nden Wollensak ve arkadaşları 2003 yılında riboflavin ve UV-A kullanılarak yapılan KKÇB metodunun etkinliğini ve güvenilirliğini tavşan ve domuz gözlerinde göstererek, endoteli koruyarak KKÇB yi 10, 19, 20 gerçekleştiren uygun doz ve süreyi belirlemişlerdir. 8

Şekil 1. Riboflavin ve UV-A varlığında ortaya çıkan reaktif oksijen radikallerinin kollajen zincirlerindeki lizin uçlarında çapraz bağlanmayı sağlaması. 13 Resim 1. Üstte, KKÇB uygulanmış domuz korneasında izlenen sertleşme etkisi ile kornea eğriliğinin korunduğu izlenmekte, altta ise tedavi edilmemiş kontrol korneasının ileri derecede eğilerek eğriliğini tamamen kaybettiği izleniyor. 7 9

Yapılan hayvan çalışmaları ışığında, 2003 yılında keratokonus hastalarındaki riboflavin ile uygulanan KKÇB sonuçlarını bildiren ilk klinik çalışmalar da yine Wollensak ve arkadaşları tarafından yayınlanmıştır. 7, 9 22 hasta üzerinde uygulanan çalışmalarında ortalama 2 dioptriye ulaşan keratometrik değer düzelmesi izlenmiş ve 4 yıla ulaşan takip sürelerinde keratokonusta ilerleme izlenmediği bildirilmiştir. 7 2010 yılında Caporossi ve arkadaşları, minimum takip süresinin 4 yıl olduğu 44 keratokonus hastasını içeren bir çalışma yayınlamışlardır. Bu randomize olmayan faz II klinik çalışma sonuçları da KKÇB nin uzun dönemde ek komplikasyonlara neden olmaksızın keratokonus ilerlemesini durdurabildiği yönündedir. KKÇB uygulanan gözlerin tamamında keratokonus progresyonunun durduğu bildirilirken, KKÇB uygulanmayan gözlerin %65 inde keratokonusta ortalama 1,5 Dioptri ilerleme olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, KKÇB uygulanan gözlerde en iyi düzeltilmiş görme keskinliği ve düzeltilmemiş görme keskinliklerinde de artış izlendiği bildirilmiştir. 43 Bu çalışmalardaki metodlar, ufak değişikliklerle halen standart KKÇB uygulaması olarak bir çok oftalmolog tarafından kullanıldığı için önem arz etmektedir. 2.2.2. Standart Teknik Wollensak ve arkadaşlarının 2003 yılında tarif ettikleri KKÇB tekniği aşağıda detaylı bildirilmiştir 7 : Lokal anestetik damla uygulamasını takiben santral 7 milimetre çaplı alanda kornea epiteli künt bıçak yardımıyla kazınmıştır. Işığa duyarlılaştırıcı madde olarak %0,1 riboflavin solüsyonu (10 ml %20 lik dextran T-500 solüsyonu 10

içerisinde 10 mg riboflavin-5-fosfat) ışınlamadan 5 dakika önce başlanacak ve ışınlama süresince 5 dakikada bir damlatılacak şekilde kornea yüzeyine uygulanmıştır. Işınlama öncesi riboflavin uygulaması sırasında, riboflavinin kornea stromasına yayılmasının önemine dikkat çekilmiştir. Işınlama 2 adet UV diyodu (370nm; Roithner Lasertechnik, Viyana, Avusturya) kullanılarak yapılmıştır. Voltaj ayarlaması için bir regülatör kullanılmıştır. Enerji kaynağı olarak 3 adet 1,3 V pil kullanılmıştır. Her tedaviden önce uygulanması istenen ışınlama miktarı olan 3 mw/cm 2 bir UV-A ölçer (LaserMate-Q; LASER 2000, Wessling, Almanya) ile 1 cm uzaklıktan kontrol edilmiştir. Gerek olduğu takdirde enerji ayarlaması bir potansiyometre yardımıyla gerçekleştirilmiştir. Hastanın korneası 1 cm uzaklıktan UV-A diyotları (370 nm) ile 3mW/cm 2 şiddetinde 30 dakika boyunca ışınlanmıştır. Bu ışınlama prosedürü ile toplam doz 5,4 J/cm 2 olmaktadır. Bu işlem esnasında endotel güvenliği açısından, kornea kalınlığının 400µ üzerinde olduğundan emin olunması gerektiği şiddetle tavsiye edilmektedir. 2.2.3. Teknikte Gelişmeler Takip eden 3 yılda yeni klinik çalışma literatürde izlenmemiştir. Orjinal çalışmadan sonraki ilk klinik çalışma 2006 yılında Caporossi ve arkadaşları tarafından yapılmıştır. 44 Teknik temelde aynı olmakla birlikte, kullanılan cihazda küçük bir değişiklik yapılarak güç kaynağı olarak pil yerine alternatif akım kullanılmıştır. Güç kaynağındaki bu değişiklik, takip eden yıllarda piyasaya sürülen cihazların temelini oluşturmuştur. 2007 yılında Dresden ekibinin yayınladığı bir derlemede, standart prosedürdeki UV-A ışınlaması öncesinde epitel uzaklaştırılması sonrası, 5 dakika 11

süre ile uygulanan %0,1 riboflavin uygulamasının süresi artırılarak daha iyi ve yaygın riboflavin difüzyonuna izin verecek şekilde, 30 dakika süre ile uygulanması gerekliliği bildirilmiştir. 13 Chen ve arkadaşları, alternatif olarak kornea içi halkalarla (Intacs) birlikte KKÇB işlemini uygulamışlar ve hasta konforunu artırmak için kornea epitelini uzaklaştırmamışlardır. Intacs ile birlikte KKÇB uygulanan 13 gözde, sadece Intacs uygulanan 12 göze göre istatistiksel olarak daha iyi sonuç aldıklarını bildirmişlerdir. 45 Epitel kaldırılmadan uygulanan bu teknik, KKÇB için oldukça önemli bir gelişme olabilirdi. Hem hasta konforu artmış olacak hem de epitel açıklığına bağlı gelişmesi muhtemel enfeksiyöz komplikasyonların önüne geçilmiş olacaktı. Ancak henüz epitel uzaklaştırılmadan KKÇB uygulaması preklinik çalışmalarla desteklenmemişti ve elde yaygın klinik uygulamalar için yeterli veri yoktu. Hayes ve arkadaşları preklinik çalışmalar olmaksızın, epitel kaldırmadan KKÇB uygulamasının klinikte kullanılmasının ne kadar tehlikeli olduğunu anlamış ve 36 domuz gözünde epitel varlığı ve riboflavin penetrasyonunu incelemişlerdir. 46 Bu çalışmada sonuç olarak epitel uzaklaştırılmadan, parsiyel epitel hasarı veya sadece tetracaine gibi lokal anestetik ajanların uygulanması ile kornea stromasına yeterli riboflavin penetrasyonunun gerçekleşmediği gösterilmiştir. Bu çalışmayı takiben epitelin KKÇB işlemine etkisini inceleyen çeşitli preklinik çalışmalar bildirilmiştir. 11, 46-49 Bu preklinik çalışmalarda benzalkonyum klorür, parsiyel epitel abrazyonu, %20 konsantrasyonda 40 saniye alkol uygulaması sonrası riboflavin ve UV-A ile KKÇB gerçekleştirilmiştir. Tüm 12

çalışmalarda epitelin tamamen uzaklaştırılmadığı durumlarda kısmi bir çapraz bağlama izlense de, düzensiz riboflavin penetrasyonuna ve muhtemelen epitelin UV-A absorpsiyonuna bağlı olarak KKÇB yetersiz olmaktadır. Bu preklinik çalışmalara rağmen başka çalışmalarda da Intacs ile birlikte veya Intacs olmaksızın farklı epitel uygulamaları ile transepitelyal KKÇB uygulanan klinik çalışmalar literatürde izlenmektedir. 50, 51 Leccisotti ve arkadaşları yapmış oldukları çalışmada, standart prosedürden farklı olarak UV-A ışınlama öncesi uzun süreli (3 saat) benzalkonyum klorür, etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) gibi epitel bütünlüğünü bozacağı düşünülen maddeleri transepitelyal olarak uygulamışlardır. Ancak sonuçlar literatürdeki standart prosedür sonuçları kadar başarılı olmamıştır. 51 Preklinik çalışmalardaki başarısız ve klinik çalışmalardaki yetersiz sonuçlara rağmen KKÇB tekniklerinde, epitel uzaklaştırılmadan çapraz bağlamanın gerçekleştirilebilmesi hedef olarak alınmıştır. Bunun nedeni hasta konforunun artırılmasının yanı sıra son dönemde literatürde daha sık bildirilen 25, 28, 52-54 enfeksiyöz komplikasyonlardan uzaklaşabilmektir. 2.3. Amaç Bu çalışmanın amacı, UV-A ve riboflavin ile korneal kollajen çapraz bağlama tedavisinde kullanılan tam kat kornea epitel uzaklaştırılmasına alternatif yöntemler geliştirilmesidir. Bu sayede, keratokonus hastaları için patogeneze yönelik ilk tedavi seçeneği olan KKÇB nin; hasta konforunu ön planda tutacak şekilde erken rehabilitasyona izin vererek, enfeksiyöz komplikasyonlardan uzak, daha güvenli olacak şekilde geliştirilmesi amaçlanmaktadır. 13

3. GEREÇ ve YÖNTEM Araştırma, Gazi Üniversitesi Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Laboratuvarında, Gazi Üniversitesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı nda ve Gazi Üniversitesi Patoloji Anabilim Dalı nda gerçekleştirilmiştir. 3.1. Alınan Proje Desteği ve Etik Kurul Onayı 01-2008/45 numaralı Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi desteği ile yapılmıştır. G.Ü.ET-09.050 numaralı ve Farklı Epitel Kazıma Yöntemleri ile Korneal Kollajen Çapraz Bağlama (Cross-linking) Sonrası Korneal Histolojik Değişiklikler başlıklı araştırma projesi kapsamında Gazi Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul onayı alınmıştır. 3.2. Kullanılan Hayvanların Özellikleri Çalışmada 2,5-3,0 kg ağrılığında, sağlıklı, 18 dişi Yeni Zelanda tavşanı kullanılmıştır. Tavşanların sağ gözlerine farklı epitel uygulamaları sonrası korneal kollajen çapraz bağlama (KKÇB) gerçekleştirilmiştir. Tavşanlardan dördünün sol gözleri kontrol grubu olarak kullanılmıştır ve KKÇB uygulanmaksızın iki farklı epitel uygulaması gerçekleştirilmiştir. KKÇB öncesi kornea epiteline uygulanan işlemlere göre tavşanlar 3 gruba ayrılmıştır (Bölüm 3.3.2). 3.3. Tedavi Prosedürü 3.3.1. Anestezi Genel anestezi için 35 mg/kg %10 luk ketamin hidroklorür (Alfamine, Alfasan, Hollanda) ve 5 mg/kg xylazin hidroklorür (Alfazyne, Alfasan, Hollanda), intramüsküler yolla uygulanmıştır. Topikal anestezi için benzalkonyum klorür içeren proparakain hidroklorür damlaları (Alcaine, Alcon, Belçika) tedavi 14

prosedürüne başlamadan 5 dakika önce 3 damla olacak şekilde işlemin yapılacağı sağ gözlere ve kontrol amaçlı sol gözlere uygulanmıştır. 3.3.2. Epitel Uygulamaları Epitel işleme prosedürleri kontrol gruplarında 2 farklı şekilde, çalışma gruplarında 3 farklı şekilde uygulanmıştır. Grup K1: Bir numaralı kontrol grubu. KKÇB uygulanmaksızın, benzalkonyum klorür içeren proparakain hidroklorür damlaları 5 dakika boyunca toplam 5 damla olacak şekilde uygulanmıştır. Grup K2: İki numaralı kontrol grubu. KKÇB uygulanmaksızın, kornea epitelinin santral 7,5 mm çaplı kısmını içine alacak şekilde metal havuz yerleştirilmiştir. 60 saniye, %48 konsantrasyonda etanol uygulanmış ve takiben epitelin dökülmesini kolaylaştıracak kazıma işlemi gerçekleştirilmemiş, epitel kendi haline bırakılmıştır. Grup 1 (Standart tedavi): Dört tavşanın 4 gözü dahil edilmiştir ve standart tedavi grubu olarak belirlenmiştir. Santral 7,5 mm çapında kornea alanında künt uçlu halkasal bıçak kullanılarak tam kat epitel uzaklaştırılması sonrası KKÇB gerçekleştirilmiştir. Grup 2 (Laser grubu): Dört tavşanın 4 gözü dahil edilmiştir. Laser grubu olarak belirlenmiştir. Excimer laser ile (Esiris, Schwind, Almanya) transepitelyal 20 mikron ablasyon ile kornea epitel tabakası inceltilmesi sonrası KKÇB uygulanmıştır. (Resim 2) 15

Resim 2. Excimer laser ile 20 mikron transepitelyal ablasyon işlemi öncesi. Grup 3 (Alkol grubu): On tavşanın 10 gözü alkol (etanol) grubu olarak belirlenmiştir. Kornea epitelinin santral 7,5 mm çaplı kısmını içine alacak şekilde metal havuz yerleştirilmiştir (Resim 3). Böylece havuz içerisine uygulanan alkolün gözün başka bölgelerine sızmaması ve etkinin sadece santral 7,5 mm çapındaki alana kısıtlı kalması planlanmıştır. Alkol uygulamasını takiben epitelin dökülmesini kolaylaştıracak kazıma işlemi gerçekleştirilmemiş, epitel kendi haline bırakılmıştır. Grup 3 te iki tavşana %18 konsantrasyonda 60 saniye, iki tavşana %24 konsantrasyonda 30 saniye, iki tavşana %24 konsantrasyonda 60 saniye, iki tavşana %50 konsantrasyonda 60 saniye, iki tavşana %96 konsantrasyonda 60 saniye olacak şekilde alkol uygulamaları gerçekleştirilmiştir. Resim 3. Alkol uygulaması için kullanılan 7,5 mm çapındaki metal havuz. 16

3.3.3. Riboflavin Solüsyonu KKÇB işlemi sırasında UV-A duyarlı ajan olarak gerekli olan %0,1 konsantrasyonundaki riboflavin solüsyonu, 10 mg riboflavinin 10 ml %20 lik Dextran T-500 içerisinde çözülmesi ile elde edilmiştir. Sterilizasyon ve taneciklerden arındırma amacıyla laminar akım cihazında 0,2 mikronluk por filtreden geçirilmiştir. Güneş ışığından korumak ve solüsyonun özelliğini kaybetmemesi için UV filtrasyonu özelliği bulunan renkli cam flakonlarda, +4 C sıcaklıkta saklanmıştır. (Resim 4) Resim 4. %0,1 riboflavin solüsyonunun laminar akım altında hazırlanışı. 3.3.4. Korneal Kollajen Çapraz Bağlama Epitel uygulamalarını takiben %0,1 riboflavin solüsyonu, yeterli korneal stromal penetrasyonu sağlamak için, 30 dakika boyunca 5 dakikada bir damla kornea yüzeyine damlatılmıştır. Takiben, 2 adet 370 nm UV-A diyodu (Roithner Lasertechnik, Viyana, Avusturya) kullanılarak kornea yüzeyinden 1 cm uzaklıktan 17

30 dakika ışınlama yapılmıştır (3 mw/cm 2 ışınlama, 5,4 J/cm 2 ). Işınlamanın kalibrasyonu bir UV-A ölçer yardımıyla sağlanmıştır (UV Light Meter YK- 35UV, Lutron, Taipei). Işınlama sırasında her 5 dakikada bir damla riboflavin solüsyonu, kornea yüzeyi hiç kuru kalmayacak şekilde damlatılmıştır (Resim 5). Resim 5. Riboflavin solüsyonu uygulanmış tavşan, UV-A ölçer ve UV-A diyotları. 3.4. Doku Hazırlanması ve Histopatolojik İnceleme KKÇB sonrası 24. saatte tavşanlara yüksek doz intravenöz genel anestetik madde uygulanarak ötenazi gerçekleştirilmiştir. Gözler, enükleasyonu takiben %10 formalin solüsyonu içerisinde 24 saat saklanarak, ışık mikroskopisi incelemeleri için hazırlanan 4 µ ince parafin kesitler hematoksilen & eozin ile boyanmıştır. Preparatlar, ışık mikroskobu (Olympus, Hamburg, Almanya) kullanılarak çeşitli büyütmelerde incelenmiş ve fotoğraflanmıştır (x20- x1000). 18

4. BULGULAR Tedavi gruplarındaki histopatolojik değişiklikler Tablo 3 te gösterilmiştir. Benzalkonyum klorür içeren lokal anestetik maddenin (Alcaine, Alcon, Belçika) topikal uygulandığı tavşanların (K1 grubu, n=2) sol gözlerinin histopatolojik incelemesinde 4-5 sıra epitel, normal dağılım gösteren keratositler ve sağlıklı endotel tabakası izlenmiştir (Resim 6). 60 saniye süre ile %48 konsantrasyonda etanol uygulanan ve sonrasında KKÇB uygulanmayan K2 grubunda, 24. saatin sonunda epitelin döküldüğü ve 80 mikronu geçmeyen keratosit kaybı olduğu izlenmiştir (Resim 7). Standart tedavi grubunda (Grup 1) tüm gözlerde histopatolojik olarak epitel olmadığı ve ortalama %75 derinlikte (~300 µ) yaygın keratosit apoptozu olduğu izlenmiştir (Resim 8). Endotel sağlıklı olarak görüntülenmiştir. Stromada ödem izlenmiştir. Transepitelyal ablasyon grubunda (Grup 2) epitel tabaka sayısında azalma izlenirken (1-3 sıra epitel tabakası), hiç bir kesitte keratosit apoptozuna rastlanmamıştır (Resim 9). Endotel tüm kesitlerde sağlıklı olarak görüntülenmiştir. Grup 3 te (alkol grubu) farklı konsantrasyon ve sürelerde farklı etkiler izlenmiştir (Tablo 3). %18 konsantrasyonda 60 saniye alkol uygulanan gözlerde epitel bütünlüğü ve canlılığı normal izlenirken, minimal epitelyal düzleşme izlenmiştir, stromada keratosit apoptozu izlenmemiştir (Resim 10). 19

%24 konsantrasyonda alkol uygulanan gözlerde 30 saniye ve 60 saniye uygulamalar arasında fark izlenmemiştir. Her iki uygulama süresinde de (30 sn ve 60 sn) %24 konsantrasyondaki alkolün 24. saatte epitel dökülmesine neden olduğu ancak buna rağmen stromada keratosit kaybının olmadığı izlenmiştir (Resim 11). %48 ve üzerindeki alkol konsantrasyonlarında ise 60 saniye uygulama ile 24. saatin sonunda epitelin dökülmüş olduğu ve yaygın keratosit kaybı olduğu izlenmiştir (Resim 12). Endotel hayatiyeti gösterilirken, stromal ödem de izlenmiştir. Epitel Stroma ve canlı keratositler Endotel Resim 6. Sadece benzalkonyum klorür içeren damla damlatılan tavşan gözünden elde edilen, normal sınırlarda histolojik bulgular izlenen tavşan korneası. 20

~50-80µ keratosit kaybı epitel hattı canlı keratositler Resim 7. Sadece 60sn, %48 etanol uygulaması ile 80 mikron derinliğe kadar keratosit kaybı. ~300µ keratosit apoptozu Canlı epitel yok Canlı keratositler & endotel Resim 8. Standart tedavi grubunda (Grup 1) total epitel uzaklaştırılması uygulanmış bir tavşan gözünün histopatolojik incelemesi. Kornea epitelinin olmadığı, yaygın keratosit apoptozu olduğu ve derin stromada canlı keratositler ve canlı endotel hücreleri izlenmekte. 21

Tek sıra epitel tabakası Canlı keratositler Resim 9. Excimer laser ile transepitelyal ablasyon uygulanan grupta (Grup 2) 24. saatin sonundaki histopatolojik incelemede tek sıra epitel tabakası izlenmesine rağmen tüm stroma katlarında canlı keratositler izlenmekte. Epitelde minimal düzleşme ile birlikte 4 sıra canlı epitel hücreleri Canlı keratositler Resim 10. Grup 3 te, %18 konsantrasyonda 60 saniye etanol uygulanan gözlerde 24. saatin sonunda normale yakın epitel tabakası ile birlikte tüm stromada keratositlerin canlı olarak kaldığı gözlenmekte. 22

24. saatte epiteli dökülmüş kornea Canlı keratositler Resim 11. Grup 3 te, %24 konsantrasyonda 60 saniye etanol uygulanan gözlerde 24. saatin sonunda canlı epitel izlenmemesine rağmen tüm stromada keratositlerin canlı olarak kaldığı gözlenmekte. Canlı epitel bulunan periferik kornea Epitelsiz santral 7,5mm Canlı keratositler ~300µ keratosit kaybı Resim 12. %48 konsantrasyonda 60 saniye alkol uygulanan gözlerde epiteli uzaklaşmış olan santral 7,5mm çapındaki alanda keratosit kaybı olduğu izlendi. 23

Tablo 3. Tedavi gruplarının genel özellikleri Epitel Stroma Endotel Canlılık Keratosit Canlılık Tavşan No Göz Grup Alkol (%/ sn) Tabaka sayısı ve bütünlük apoptozu (% Derinlik) Ödem ve bütünlük 1 OS K1-4-5 Var 0 Yok Var 2 OS K1-4-5 Var 0 Yok Var 3 OS K2 %48/ 60sn 0 Var 10 Yok Var 4 OS K2 %48/ 60sn 0 Var 15 Yok Var 1 OD 1-0 Yok 50 Var Var 2 OD 1-0 Yok 50 Var Var 3 OD 1-0 Yok 75 Var Var 4 OD 1-0 Yok 75 Var Var 5 OD 2-1 Var 0 Var Var 6 OD 2-3 Var 0 Var Var 7 OD 2-2 Var 0 Yok Var 8 OD 2-2 Var 0 Yok Var 9 OD 3 %18/ 60sn 4 Var 0 Yok Var 10 OD 3 %18/ 60sn 4 Var 0 Yok Var 11 OD 3 %24/ 30sn 0 Yok 0 Var Var 12 OD 3 %24/ 30sn 0 Yok 0 Var Var 13 OD 3 %24/ 60sn 0 Yok 0 Yok Var 14 OD 3 %24/ 60sn 0 Yok 0 Yok Var 15 OD 3 %48/ 60sn 0 Yok 90 Var Var 16 OD 3 %48/ 60sn 0 Yok 50 Var Var 17 OD 3 %96/ 60sn 0 Yok 50 Var Var 18 OD 3 %96/ 60sn 0 Yok 50 Var Var K1 : Kontrol grubu (Sadece benzalkonyum klorür içeren lokal anestetik topikal uygulaması) K2 : Kontrol grubu (Sadece 60 saniye, %48 konsantrasyonda etanol uygulaması) Grup 1 : Standart tedavi grubu Grup 2 : Transepitelyal ablasyon grubu Grup 3 : Alkol grubu OD: Sağ göz OS: Sol göz Sn: saniye 24

5. TARTIŞMA Riboflavin ve UV-A kullanılarak KKÇB uygulaması keratokonus ve refraktif cerrahi sonrası gelişen ektazinin ilerlemesini durdurabilecek ilk tedavi seçeneğidir. 6 Bu tedavi seçeneğinde riboflavin ve UV-A varlığında ortaya çıkan reaktif oksijen radikalleri, kollajen zincirlerindeki lizin uçlarında çapraz bağlanmayı sağlayarak, kornea gerinim kuvvetini artırmakta ve ektazi ilerlemesini durdurmaktadır. 13 Işığa duyarlılaştırıcı ajan (riboflavin) uygulanmadan, sadece UV radyasyon ile ilişkili keratosit hasarı Pitts ve arkadaşları tarafından çalışılmıştır. 365nm dalga boyunda UV-A için geri dönüşümsüz kornea hasarı doz sınırını 42,5 J/cm 2 olarak bildirmişlerdir. 55 Bu yüksek UV-A dozu, riboflavin gibi bir ışığa duyarlılaştırıcı varlığında ileri derecede azalarak 1,35 7,2 J/cm 2 aralığına kadar düşebilmektedir. 56 Bu işlem sırasında riboflavin, kornea stromasına yayılarak, korneanın UV-A absorpsiyonunu %95 artırmakta ve endoteli UV-A hasarından koruyarak anahtar rol oynamaktadır. 13, 16, 19, 56 Yapılan çalışmaların tamamına yakınında riboflavinin kornea stromasına difüzyonunu sağlamak için 6, 7, santral 7-9 milimetrelik alanda epitel kaldırılarak işlem gerçekleştirilmektedir. 9, 10, 13, 17, 20, 23, 24, 44, 46, 49, 56-69 Epitelin kaldırılması KKÇB işlemi için gerekli gibi görünmesine rağmen, işlem sonrası erken dönemde hasta rahatsızlığı (epitel kaldırılması sonucu ortaya çıkan batma ve ağrı nedeniyle) ve enfeksiyöz komplikasyonlar nedeniyle (epitel kaldırılması sonucu önemli bir savunma bariyerinin ortadan kaybolması nedeniyle) transepitelyal KKÇB yi savunan ve klinik uygulamalarda kullanan yazarlar da mevcuttur. 11, 45, 50, 51 Transepitelyal KKÇB metodunda, epitel kaldırılmaksızın epitele toksik maddeler (benzalkonyum 25

klorür, EDTA vb.) içeren damlalar işlem öncesinde uygulanarak epitelyal sıkı bağlantıların gevşetilebileceği ve riboflavin penetrasyonu sağlanabileceği öngörülmektedir. Ancak bu konuda yapılmış hayvan çalışmaları intakt epitel tabakasının riboflavin difüzyonuna engel olduğu yönündedir. 46-49 Epitel hücreleri birbirlerine sıkı bağlantılar, desmozomlar, zonula occludens ve boş bağlantıların oluşturduğu hücrelerarası bağlantılar bağlıdır. Bu bağlantılardan ilk üçü epitel bağlantı kompleksi olarak isimlendirilirler. 70 Sıkı bağlantılar genel olarak, lateral hücre zarının apikal yüzeyinde hücreyi sararlar ve büyük moleküllere epitel geçirgenliğini kontrol eden paraselüler bir difüzyon bariyeri oluştururlar. Bu sıkı bağlantıların sadece korneanın epitel tabakasının en üst dizisinde bulunduğu bildirilmiştir. 71 Bu bilgiden yola çıkılarak, kornea stromasının riboflavin ile doyurulması için tüm epitelin uzaklaştırılması yerine, kornea yüzey epitelinin ortadan kaldırılmasının yeterli olabileceği fikri öne atılmıştır. Bu amaçla bir transepitelyal laser uygulaması çalışması Bakke ve arkadaşları tarafından 15 keratokonuslu hastanın gözlerine uygulanmıştır. Çalışmalarında, 35µ ablasyon ile bazal epitelin sağlam bırakıldığı epitel uygulaması sonrası kornea stromasına riboflavin difüzyonu için gereken zamanı ve KKÇB sonrası hasta konforunu değerlendirmişlerdir. Bazal tabakanın kaldığı 15 gözde ortalama 43 dakikada stromal riboflavin doyumuna ulaşılırken (ön kamarada riboflavin izlenerek karar verilmiştir), epitelin tamamen kaldırıldığı standart KKÇB uygulanan 15 gözde bu sürenin yaklaşık 30 dakika olduğu bildirilmiştir. İlginç olarak laser uygulanan gözlerde, KKÇB sonrası subjektif 26

ağrının istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde daha fazla olduğu gösterilmiştir. Böylece parsiyel epitel ablasyonunun tam kat epitel uzaklaştırmasından daha ağrılı bir cerrahi sonrası döneme sahip olduğu ortaya çıkmıştır ve bazal epitel tabakasının bırakılarak hasta rahatsızlığının azaltılması hipotezi çürütülmüştür. Çalışmalarında Bakke ve arkadaşları bu durumu açıklarken, sub-bazal epitelyal sinir pleksusunun korunması ve işlem süresinin daha uzun olması ile ilişkili olabileceğini bildirmişlerdir. 27 Yukarıda bahsedilen çalışmada, Bakke ve arkadaşları, 35µ transepitelyal laser ablasyonu ile sadece bazal tabakanın yerinde bırakıldığı durumda, KKÇB işleminin ağrıya ve riboflavin difüzyon süresine etkisini incelerken, KKÇB etkinliğini incelememişlerdir. 27 KKÇB nin riboflavin ve UV-A varlığında ortaya çıkan oksijen radikalleri ile sağlandığı 13 ve yine aynı işlem sırasında keratosit apoptozu 56, 69 izlendiği göz önünde bulundurularak, keratosit apoptozu, KKÇB nin dolaylı bir göstergesi olarak kabul edilmiştir. Bizim çalışmamızda, grup 2 deki tavşan gözlerinde 20µ transepitelyal ablasyon yapılarak bazal epitel tabakası korunmuş ve KKÇB sonrası histolojik olarak keratosit apoptozu incelenerek KKÇB etkinliği dolaylı olarak incelenebilmiştir. Grup 2 deki gözlerde sadece tek sıra bazal epitel hücre tabakası kalmış olmasına rağmen KKÇB işlemi sonrası 24. saatte yapılan histolojik incelemelerde hiç keratosit apoptozunun izlenmemiş olması önemli bir bulgudur (Resim 9). Bu bulgudan yola çıkarak bazal epitel tabakasının, sadece riboflavinin difüzyonunda gecikmeye neden olmadığı, aynı zamanda KKÇB nin dolaylı bir göstergesi olan keratosit apoptozuna da engel olduğu öne sürülebilir. Bu durum konuyla ilgilenen diğer 27

yazarların da dikkatini çekmiştir ve epitelin varlığının bir UV-A bariyeri olarak 42, 47, 72 değerlendirilmesine neden olmuştur. Bizim çalışmamızda, grup 2 deki histolojik sonuçlarımız da bu hipotezi desteklemekte ve sadece bazal epitel tabakasının olduğu durumda bile keratosit kaybına neden olabilecek UV-A ve riboflavin etkileşiminin gerçekleşmediği ve yeterli oksijen radikali oluşmadığı gösterilmektedir (Resim 9). Bazal epitel tabakasının riboflavin geçişini engellemesiyle, UV-A ışınlaması sırasında stromada hiç riboflavin bulunmadığı için apoptoz izlenmediği öne sürülebilir; ancak Bakke ve arkadaşlarının çalışmasında bazal epitel tabakasının riboflavin için tam bir bariyer olmadığı sadece stromal satürasyon süresini geciktirdiği bildirilmektedir (Standart tedavi- Transepitelyal ablasyon: 30 dakika- 43 dakika). 27 Sonuçta, gecikmiş de olsa riboflavin satürasyonu gerçekleşmektedir. Çalışmamızda, Bakke ve arkadaşlarının bildirmiş olduğu satürasyon gecikme süresi göz önünde bulundurulmamış ve tüm gruplara UV-A ışınlaması öncesi 30 dakika riboflavin solüsyonu uygulanmıştır. Bu fark göz önünde bulundurulsa bile, grup 2 de hiç keratosit apoptozu izlenmemiş olması anlamlı olarak değerlendirilmelidir. KKÇB için sadece riboflavin difüzyonu yeterli olsaydı, grup 2 de az da olsa keratosit apoptozu oluşması beklenirdi. Bu grupta hiç keratosit apoptozu izlenmemiş olması; riboflavinin stromaya difüzyonunun tek başına, UV- A ile etkileşime girerek KKÇB ve keratosit apoptozu için yeterli oksijen radikali üretmeye yeterli olmadığını ortaya koymaktadır. Bu sonuç aynı zamanda, tavşan kornea epitelinin, riboflavin varlığında, 370nm dalga boyunda UV bariyeri olarak görev yapıyor olabileceğini desteklemektedir. 28

Yapılan çalışmalarda ışığa duyarlılaştırıcı ajan olmaksızın UV radyasyonun kornea üzerindeki etkileri incelenmiştir. 280-290nm dalga boyunun altında UV radyasyonun tamamına yakınının epitel tarafından absorbe edildiği ve derin tabakalara geçmediği gösterilmiştir. 73-76 Oysa ki orta dalga boylu (300-320nm) UV radyasyonunda absorpsiyon, epitel ile sınırlı kalmamakta ve stroma ile lenste UV etkileri izlenmektedir. 73-76 Bu çalışmalara göre, ışığa duyarlılaştırıcı ajan ortamda bulunmadığında, 370nm dalga boylu UV-A radyasyonu epiteli rahatlıkla geçerek derin yapılara zarar verebilmektedir. 55, 73-76 Ancak unutulmamalıdır ki, yukarıda bahsedilen çalışmalar riboflavin gibi bir ışığa duyarlılaştırıcı olmadan yapılmıştır ve UV-A radyasyon dozu, KKÇB için kullanılan dozun çok üzerindedir. Ancak KKÇB uygulanan gözlerde riboflavin gibi bir ışığa duyarlılaştırıcı ajan kullanıldığı için bu çalışmalardaki değerlerin bire bir uyarlanması uygun değildir. Nitekim riboflavin, kornea stromasına yayılarak, korneanın UV-A absorpsiyonunu %95 artırmakta ve endoteli UV-A hasarından koruyarak anahtar 13, 16, 19, 56 rol oynamaktadır. Kornea yüzeyindeki riboflavin film rabakasının UV absorpsiyonuna etkisinin incelendiği bir çalışmada, %0,1 riboflavinin, %20 dextran T-500 içerisindeki çözeltisinin, metilselüloz içerisindeki çözeltisinin ve hipoosmolar sodyum klorür içerisindeki çözeltisinin, epiteli kazınmış domuz ve insan kornealarındaki absorpsiyon katsayıları incelenmiştir. 77 Standart tedavide kullanılan dextran T-500 içerisindeki %0,1 riboflavin çözeltisinin stabilitesinin en yüksek olduğu ve şimdiye kadarki doz çalışmalarının buna göre yapıldığı göz 29

önünde bulundurularak bu çözeltinin standart tedavide kullanılması gerektiği bildirilmiştir. 77 Aynı zamanda insan ve domuz kornealarının UV absorpsiyonunun riboflavin film tabakası varlığında belirgin olarak arttığı izlenmiştir. İnsan kornealarında ortalama absorpsiyon katsayıları riboflavin film tabakası yok iken 19,66±3,83/cm olarak bulunmuş, riboflavin film tabakası varlığında ise 56,36±4,80/cm olduğu izlenmiştir. Absorpsiyon katsayısındaki bu artış riboflavin film tabakasının tek başına UV geçişini ne kadar azalttığını göstermektedir. 77 Epitel tamamen uzaklaştırıldığında sadece riboflavin film tabakasının etkisi bu kadar önemli iken, epitel varlığında stromanın UV absorpsiyonunun ne olduğu halen bilinmemektedir. Yüzeyel epitel ablasyonunun KKÇB uygulaması için yetersiz olduğu görüldükten sonra, etanol yardımıyla epitel bağlantı kompleksinin gevşetilmesi sağlanarak epitel öldürülmeden KKÇB uygulamasının gerçekleştirilebileceği hipotezi öne sürüldü ve %18 konsantrasyonda etanolün 60 saniye uygulanması ile araştırmaya devam edildi. Samaras ve arkadaşları, altı tavşan gözüne %20 konsantrasyonda 40 saniye alkol uygulayarak yaptıkları spektrofotometrik çalışmada alkol uygulanan gözlerin transmisyon spektrumunun kontrol grubundan farklı olmadığını yani riboflavin geçişine izin vermediğini bildirmişlerdir. 48 Ancak epitelin ve keratositlerin durumu histolojik olarak araştırılmamıştır. Çalışmamızda, %18 lik etanolün 60 saniye uygulaması sonrası 24. saatte histolojik olarak minimal epitel düzleşmesi dışında bir değişiklik izlenmemiştir (Resim 10). Bu bulgu sonrasında alkol konsantrasyonu artırılarak çalışmaya 30

devam edilmiştir (Tablo 3). %24 ve üzerindeki konsantrasyonlarda 24. saatte epitel canlılığı ve bütünlüğü kalmazken sadece %48 ve üzerindeki alkol konsantrasyonlarında KKÇB ile ilişkili keratosit apoptozu izlenmiştir (Resim 11, 12). Bu bulgulardan yola çıkarak, %24 konsantrasyondaki alkol, her ne kadar 24. saatte epitel dökülmesine neden oluyorsa da işlem sırasında epitelin bariyer özelliklerini azaltmadığından keratosit apoptozu izlenmediği öne sürülebilir. %48 ve üzerindeki alkol konsantrasyonlarında ise epitelin hayatiyeti işlem sırasında kaybolduğu için keratosit apoptozunu sağlayacak sonuca ulaşılmış olmaktadır. Bu çalışmadaki, alkol uygulamalarında ortaya çıkan bulgular ışığında, alkol ile epitel sıkı bağlantılarının gevşetilerek KKÇB uygulamasının klinik uygulamalar açısından anlamlı olmadığı izlenmiştir. Keratosit apoptozunu sağlayan alkol süresi ve konsantrasyonunda epitel hayatiyeti kalmadığı için bu çalışmanın amacı olan epitel uzaklaştırmadan KKÇB uygulamasının gerçekleştirilebilmesine imkan sağlamayacağı ortaya konulmuştur. 31

6. SONUÇ Excimer laser ile kısmi epitel ablasyonu ile epitelin yüzeyel tabakalarının uzaklaştırılmasının veya %24 konsantrasyona ve 60 saniyeye kadar etanol uygulamasının UV-A ve riboflavin ilişkili keratosit apoptozu ve dolaylı olarak korneal kollajen çapraz bağlama için yetersiz olduğu izlenmiştir. Sadece yüksek ve toksik etanol konsantrasyonlarının riboflavin ve UV-A geçişine izin vererek keratosit apoptozuna neden olduğu görülmüştür ancak bu durum klinikte kullanım için uygun değildir. Bu çalışmanın sonucunda, tam kat epitel uzaklaştırılmasının, başarılı korneal kollajen çapraz bağlama (cross-linking) tedavisi için gerekli olduğu ortaya konulmuştur. 32

7. KAYNAKLAR 1. Kennedy R. H., Bourne W. M.Dyer J. A., A 48-year clinical and epidemiologic study of keratoconus. Am J Ophthalmol, 1986. 101(3): 267-273. 2. Rabinowitz Y. S., Keratoconus. Surv Ophthalmol, 1998. 42(4): 297-319. 3. Krachmer J. H., Feder R. S.Belin M. W., Keratoconus and related noninflammatory corneal thinning disorders. Surv Ophthalmol, 1984. 28(4): 293-322. 4. Duke-Elder S. Leigh AG., System of Ophthalmology. Diseases of the outer eye. Vol. 8. London: Henry Kimpton; 1965 5. Hofstetter H. W., A keratoscopic survey of 13,395 eyes. Am J Optom Arch Am Acad Optom, 1959. 36(1): 3-11. 6. Wollensak G., Crosslinking treatment of progressive keratoconus: new hope. Curr Opin Ophthalmol, 2006. 17(4): 356-360. 7. Wollensak G., Spoerl E.Seiler T., Riboflavin/ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol, 2003. 135(5): 620-627. 8. Kaufman H. E., Strengthening the cornea. Cornea, 2004. 23(5): 432. 9. Wollensak G., Sporl E.Seiler T., [Treatment of keratoconus by collagen cross linking]. Ophthalmologe, 2003. 100(1): 44-49. 10. Wollensak G., Spoerl E.Seiler T., Stress-strain measurements of human and porcine corneas after riboflavin-ultraviolet-a-induced cross-linking. J Cataract Refract Surg, 2003. 29(9): 1780-1785. 11. Yuen L., Chan C.Boxer Wachler B. S., Effect of epithelial debridement in corneal collagen crosslinking therapy in porcine and human eyes. J Cataract Refract Surg, 2008. 34(11): 1815-1816; author reply 1816. 12. Wollensak G., Iomdina E., Dittert D. D.Herbst H., Wound healing in the rabbit cornea after corneal collagen cross-linking with riboflavin and UVA. Cornea, 2007. 26(5): 600-605. 13. Spoerl E., Mrochen M., Sliney D., Trokel S.Seiler T., Safety of UVAriboflavin cross-linking of the cornea. Cornea, 2007. 26(4): 385-389. 14. Wollensak G., Aurich H., Pham D. T.Wirbelauer C., Hydration behavior of porcine cornea crosslinked with riboflavin and ultraviolet A. J Cataract Refract Surg, 2007. 33(3): 516-521. 15. Kohlhaas M., Spoerl E., Schilde T., Unger G., Wittig C.Pillunat L. E., Biomechanical evidence of the distribution of cross-links in corneas treated with riboflavin and ultraviolet A light. J Cataract Refract Surg, 2006. 32(2): 279-283. 16. Spoerl E., Wollensak G., Dittert D. D.Seiler T., Thermomechanical behavior of collagen-cross-linked porcine cornea. Ophthalmologica, 2004. 218(2): 136-140. 17. Spoerl E., Wollensak G.Seiler T., Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion. Curr Eye Res, 2004. 29(1): 35-40. 33

18. Wollensak G., Wilsch M., Spoerl E.Seiler T., Collagen fiber diameter in the rabbit cornea after collagen crosslinking by riboflavin/uva. Cornea, 2004. 23(5): 503-507. 19. Wollensak G., Spoerl E., Wilsch M.Seiler T., Endothelial cell damage after riboflavin-ultraviolet-a treatment in the rabbit. J Cataract Refract Surg, 2003. 29(9): 1786-1790. 20. Wollensak G., Sporl E., Reber F., Pillunat L.Funk R., Corneal endothelial cytotoxicity of riboflavin/uva treatment in vitro. Ophthalmic Res, 2003. 35(6): 324-328. 21. Agrawal V. B., Corneal collagen cross-linking with riboflavin and ultraviolet - a light for keratoconus: results in Indian eyes. Indian J Ophthalmol, 2009. 57(2): 111-114. 22. Grewal D. S., Brar G. S., Jain R., Sood V., Singla M.Grewal S. P., Corneal collagen crosslinking using riboflavin and ultraviolet-a light for keratoconus: one-year analysis using Scheimpflug imaging. J Cataract Refract Surg, 2009. 35(3): 425-432. 23. Iovieno A., Oechsler R. A.Yoo S. H., Long-term results of collagen crosslinking with riboflavin and UVA in keratoconus. J Cataract Refract Surg, 2008. 34(10): 1616-1617; author reply 1617. 24. Mazzotta C., Traversi C., Baiocchi S., Sergio P., Caporossi T.Caporossi A., Conservative treatment of keratoconus by riboflavin-uva-induced cross-linking of corneal collagen: qualitative investigation. Eur J Ophthalmol, 2006. 16(4): 530-535. 25. Zamora K. V.Males J. J., Polymicrobial keratitis after a collagen crosslinking procedure with postoperative use of a contact lens: a case report. Cornea, 2009. 28(4): 474-476. 26. Angunawela R. I., Arnalich-Montiel F.Allan B. D., Peripheral sterile corneal infiltrates and melting after collagen crosslinking for keratoconus. J Cataract Refract Surg, 2009. 35(3): 606-607. 27. Bakke E. F., Stojanovic A., Chen X.Drolsum L., Penetration of riboflavin and postoperative pain in corneal collagen crosslinking: excimer laser superficial versus mechanical full-thickness epithelial removal. J Cataract Refract Surg, 2009. 35(8): 1363-1366. 28. Perez-Santonja J. J., Artola A., Javaloy J., Alio J. L.Abad J. L., Microbial keratitis after corneal collagen crosslinking. J Cataract Refract Surg, 2009. 35(6): 1138-1140. 29. Koller T., Mrochen M.Seiler T., Complication and failure rates after corneal crosslinking. J Cataract Refract Surg, 2009. 35(8): 1358-1362. 30. Hartstein J., Keratoconus that developed in patients wearing corneal contact lenses. Report of four cases. Arch Ophthalmol, 1968. 80(3): 345-346. 31. Klintworth GK, Degenerations, depositions and miscellaneous reactions of the ocular anterior segment. Pathobiology of Ocular Disease: A Dynamic Approach. New York: Marcel Dekker; 1994 34

32. Zimmermann D. R., Fischer R. W., Winterhalter K. H., Witmer R.Vaughan L., Comparative studies of collagens in normal and keratoconus corneas. Exp Eye Res, 1988. 46(3): 431-442. 33. Sawaguchi S., Yue B. Y., Sugar J.Gilboy J. E., Lysosomal enzyme abnormalities in keratoconus. Arch Ophthalmol, 1989. 107(10): 1507-1510. 34. Fukuchi T., Yue B. Y., Sugar J.Lam S., Lysosomal enzyme activities in conjunctival tissues of patients with keratoconus. Arch Ophthalmol, 1994. 112(10): 1368-1374. 35. Wilson S. E., He Y. G., Weng J., Li Q., McDowall A. W., Vital M., et al., Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Exp Eye Res, 1996. 62(4): 325-327. 36. Bron A. J.Rabinowitz Y. S., Corneal dystrophies and keratoconus. Curr Opin Ophthalmol, 1996. 7(4): 71-82. 37. Rabinowitz Y. S., Garbus J.McDonnell P. J., Computer-assisted corneal topography in family members of patients with keratoconus. Arch Ophthalmol, 1990. 108(3): 365-371. 38. Rabinowitz Y. S., Nesburn A. B.McDonnell P. J., Videokeratography of the fellow eye in unilateral keratoconus. Ophthalmology, 1993. 100(2): 181-186. 39. Kymionis G. D., Siganos C. S., Tsiklis N. S., Anastasakis A., Yoo S. H., Pallikaris A. I., et al., Long-term follow-up of Intacs in keratoconus. Am J Ophthalmol, 2007. 143(2): 236-244. 40. Ward M. A., Artunduaga G., Thompson K. P., Wilson L. A.Stulting R. D., Phototherapeutic keratectomy for the treatment of nodular subepithelial corneal scars in patients with keratoconus who are contact lens intolerant. Clao J, 1995. 21(2): 130-132. 41. Cennamo G., Intravaja A., Boccuzzi D., Marotta G.Cennamo G., Treatment of keratoconus by topography-guided customized photorefractive keratectomy: two-year follow-up study. J Refract Surg, 2008. 24(2): 145-149. 42. Spoerl E., Huhle M.Seiler T., Induction of cross-links in corneal tissue. Exp Eye Res, 1998. 66(1): 97-103. 43. Caporossi A., Mazzotta C., Baiocchi S.Caporossi T., Long-term results of riboflavin ultraviolet a corneal collagen cross-linking for keratoconus in Italy: the Siena eye cross study. Am J Ophthalmol, 2010. 149(4): 585-593. 44. Caporossi A., Baiocchi S., Mazzotta C., Traversi C.Caporossi T., Parasurgical therapy for keratoconus by riboflavin-ultraviolet type A rays induced cross-linking of corneal collagen: preliminary refractive results in an Italian study. J Cataract Refract Surg, 2006. 32(5): 837-845. 45. Chan C. C., Sharma M.Wachler B. S., Effect of inferior-segment Intacs with and without C3-R on keratoconus. J Cataract Refract Surg, 2007. 33(1): 75-80. 46. Hayes S., O'Brart D. P., Lamdin L. S., Doutch J., Samaras K., Marshall J., et al., Effect of complete epithelial debridement before riboflavin- 35

ultraviolet-a corneal collagen crosslinking therapy. J Cataract Refract Surg, 2008. 34(4): 657-661. 47. Wollensak G.Iomdina E., Biomechanical and histological changes after corneal crosslinking with and without epithelial debridement. J Cataract Refract Surg, 2009. 35(3): 540-546. 48. Samaras K., O'Brart D P., Doutch J., Hayes S., Marshall J.Meek K. M., Effect of epithelial retention and removal on riboflavin absorption in porcine corneas. J Refract Surg, 2009. 25(9): 771-775. 49. Baiocchi S., Mazzotta C., Cerretani D., Caporossi T.Caporossi A., Corneal crosslinking: riboflavin concentration in corneal stroma exposed with and without epithelium. J Cataract Refract Surg, 2009. 35(5): 893-899. 50. Ertan A., Karacal H.Kamburoglu G., Refractive and topographic results of transepithelial cross-linking treatment in eyes with intacs. Cornea, 2009. 28(7): 719-723. 51. Leccisotti A.Islam T., Transepithelial Corneal Collagen Cross-Linking in Keratoconus. J Refract Surg, 2010. 25: 1-7. 52. Sharma N., Maharana P., Singh G.Titiyal J. S., Pseudomonas keratitis after collagen crosslinking for keratoconus: case report and review of literature. J Cataract Refract Surg, 2010. 36(3): 517-520. 53. Rama P., Di Matteo F., Matuska S., Paganoni G.Spinelli A., Acanthamoeba keratitis with perforation after corneal crosslinking and bandage contact lens use. J Cataract Refract Surg, 2009. 35(4): 788-791. 54. Kymionis G. D., Portaliou D. M., Bouzoukis D. I., Suh L. H., Pallikaris A. I., Markomanolakis M., et al., Herpetic keratitis with iritis after corneal crosslinking with riboflavin and ultraviolet A for keratoconus. J Cataract Refract Surg, 2007. 33(11): 1982-1984. 55. Pitts D. G., Cullen A. P.Hacker P. D., Ocular effects of ultraviolet radiation from 295 to 365 nm. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1977. 16(10): 932-939. 56. Wollensak G., Spoerl E., Wilsch M.Seiler T., Keratocyte apoptosis after corneal collagen cross-linking using riboflavin/uva treatment. Cornea, 2004. 23(1): 43-49. 57. Kymionis G. D., Diakonis V. F., Kalyvianaki M., Portaliou D., Siganos C., Kozobolis V. P., et al., One-year follow-up of corneal confocal microscopy after corneal cross-linking in patients with post laser in situ keratosmileusis ectasia and keratoconus. Am J Ophthalmol, 2009. 147(5): 774-778, 778 e771. 58. Wollensak G., Histological changes in human cornea after cross-linking with riboflavin and ultraviolet A. Acta Ophthalmol, 2009. 59. Ashwin P. T.McDonnell P. J., Collagen cross-linkage: a comprehensive review and directions for future research. Br J Ophthalmol, 2009. 60. Tomkins O.Garzozi H. J., Collagen cross-linking: Strengthening the unstable cornea. Clin Ophthalmol, 2008. 2(4): 863-867. 61. Raiskup-Wolf F., Hoyer A., Spoerl E.Pillunat L. E., Collagen crosslinking with riboflavin and ultraviolet-a light in keratoconus: long-term results. J Cataract Refract Surg, 2008. 34(5): 796-801. 36