ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Sığır, Koyun ve Piliç Etlerinde Staphylococcus aureus un Varlığı ve Moleküler Karakterizasyonu Proje Yürütücüsü: Haydar ÖZDEMİR Yardımcı Araştırmacı: Erhan KEYVAN Proje Numarası: 12A3338002 Başlama Tarihi: 05. 03. 2012 Bitiş Tarihi: 05. 06. 2013 Rapor Tarihi: 06. 09. 2013 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara- 2013

2 Sığır, Koyun ve Piliç Etlerinde Staphylococcus aureus un Varlığı ve Moleküler Karakterizasyonu Özet: Bu çalışma sığır, koyun ve piliç etlerinde Staphylococcus aureus un varlığı ile izolatların bazı fenotipik ve genotipik özelliklerini belirlemek amacıyla yapılmıştır. Çalışmada Ankara da marketlerde satışa sunulan ve her birinden 75 er adet olmak üzere alınan toplam 225 adet sığır, koyun ve piliç eti örnekleri materyal olarak kullanılmıştır. Sığır, koyun ve piliç eti örneklerinde koagulaz-pozitif stafilokoklar sırasıyla % 17.3, % 34.6 ve % 54.6 düzeyinde, Staphylococcus aureus ise aynı örneklerde sırasıyla % 14.6, % 30.6 ve % 45.3 düzeyinde saptanmıştır. Çalışmada izole edilen toplam 146 adet koagulazpozitif stafilokok suşundan 114 ü yapılan identifikasyon testleri sonucu S. aureus olarak tanımlanmıştır. Aynı şekilde, klasik teknikte S. aureus olarak belirlenen suşların tümü PCR tekniğinde S. aureus olarak teyit edilmiştir. Toplam 114 adet S. aureus suşunun hiçbirisinde meca geni saptanamazken, 88 inin (% 77.1) enteretoksijenik özellikte olduğu tespit edilmiştir. Enterotoksijenik stafilokoklardan 56 sı (% 49.1) SEA, 12 si (% 10.5) TSST-1, 12 si (% 10.5) SEH, 8 i (% 7.0) SED, 8 i SEJ, 6 sı (% 5.2) SEI, 2 si (% 1.75) SEC ve SEG tipi enterotoksin genine sahip oldukları tespit edilmiştir. Özellikle klasik enterotoksin tiplerinin (SEA, SEB, SEC, SED, SEE, TSST-1) yanında, 28 adet (% 24.5) S. aureus suşunun yeni adlandırılan SEG, SEH, SEI ve SEJ tipi enterotoksin genine sahip olduklarının tespit edilmiş olması stafilokokal gıda intoksikasyonları bakımından önemlidir. Aynı şekilde yapılan antibiyotik dirençlilik test sonuçlarına göre, S. aureus suşlarının yüksek düzeyde başta Ampisilin (% 70.1) olmak üzere Tetrasikline (% 47.3), Eritromisine (% 33.3), Sefoksitine (% 22.8) ve Oksasiline (% 15.7) dirençli bulunduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, başta piliç etleri olmak üzere koyun ve sığır eti örneklerinde S. aureus yüksek düzeyde bulunmuştur. S. aureus suşlarının çoğu enteretoksijenik özellikte olup, özellikle 28 i klasik enterotoksinlerin dışında, yeni adlandırılan enterotoksin genlerine sahiptir. Ayrıca suşların çoğu 1 ve/veya 1 den fazla antibiyotiğe karşı dirençli bulunmuştur. Bu nedenle sağlıklı et üretimi ve halk sağlığının korunması için üretimin tüm aşamalarında etkin HACCP sisteminin uygulanmasının önemli olacağı görüşüne varılmıştır. Anahtar sözcükler: Et, S. aureus, mec A, enterotoksin, PCR.

3 Prevalence and molecular characterization of Staphylococcus aureus in beef, sheep and chicken meat. Abstract: The aim of this study was to investigate the presence of Staphylococcus aureus in beef, sheep and chicken meat and identify the phenotypic and genotypic characterization of the isolates. A total of 225 samples (75 beef, 75 sheep and 75 chicken meat) were used that purchased at different retail markets in Ankara. Coagulase positive-staphylococci (CPS) were found in beef, sheep and chicken meat 17.3%, 34.6%, 54.6%, respectively. Staphylococcus aureus was found in beef, sheep and chicken meat 14.6%, 30.6%, 45.3%, respectively. Within 146 CPS isolates 114 of them were identified by spesific tests as S. aureus. All these S. aureus isolates were also confirmed by PCR assay. All 114 analysed S. aureus strains were negative for meca genes in PCR analysis, of the 88 isolates (77.1%) were found enterotoxigenic. Most of the isolated enterotoxigenic strains produced 56 (49.1%) SEA, 12 (10.5%) TSST-1, 12 (10.5%) SEH, 8 (7.0%) SED, 8 (7.0%) SEJ, 6 (5.2%) SEI, 2 (1.75%) SEC and SEG type enterotoxin. Additionally to this classical stphylococal enterotoxin types (SEA, SEB, SEC, SED, SEE, TSST-1), in 28 (24.5%) of the S. aureus isolates, new staphylococcal enterotoxins (SEG, SEH, SEI, SEJ) were determined which important for staphylococal food intoxications. All strains, tested for antibiotic resistance. The highest resistance rate was observed to ampicilline (70.1%) and tetracycline (47.3%), followed by erythromycine (33.3%), cefoxitine (22.8%) and oxacilline (15.7%). The results indicated that the presence of high counts of S. aureus were identified in beef, sheep and especially chicken meat. Most of the S. aureus strains were found enterotoxigenic and of the 28 isolates were contained new staphylococal enterotoxin. Besides most of the strains were found resistant to one or more antibiotics tested. For this reason, healthy meat production and the protection of public health at all stages of production with the implementation of an effective HACCP system, it is thought to be an importance. Key words: Meat, S. aureus, meca, enterotoxin, PCR.

4 II. Amaç ve Kapsam Staphylococcus aureus önemli gıda kaynaklı bir patojen olup, toplum sağlığı ve hastane kaynaklı infeksiyonlar açısından da halk sağlığını tehdit etmektedir (Pesavento, 2007). Etken patojen bir bakteri olmasına rağmen, sağlıklı insanların burun ve deri mukozalarında da normal olarak bulunur (Kluytsman ve ark.,1997). Pastörizasyonda uygulanan ısı-zaman parametrelerinde S. aureus yıkımlanmasına karşın, enterotoksinleri ısıya dirençli olduğundan yıkımlanmazlar (Le Loir ve ark., 2003). S. aureus çeşitli toksik etkili protein yapısında maddeler üretir. Bunlar toksik şok sendrom toksin (TSST-1), eksfoliatif toksin ile gıda intoksikasyonlarına neden olan enterotoksinlerdir. S. aureus enterotoksinleri farklı tiplerde olup, bunlar SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI ve SEJ olarak adlandırılır (Stephan ve ark., 2001; Kuzma ve ark., 2003). S. aureus un gıda intoksikasyonları dışında halk sağlığı açısından önemli diğer bir özelliği de, değişik antibiyotiklere karşı tekli veya çoklu direnç geliştirmesidir. Özellikle sentetik bir penisilin olan metisilinin, beşeri hekimlikte tedavi amacıyla kullanımıyla birlikte S. aureus suşlarının, bu antibiyotiğe süratle direnç geliştirmeye (MRSA; Methicillin- Resistant S. aureus) başladıkları bildirilmiştir. S. aureus un çok sayıda değişik suşları bulunmakta olup, epidemiyolojik çalışmalarda bu suşların alt tiplendirmeleri yapılarak doğada yayılımı ve nedenleri belirlenebilmektedir. Mikroorganizmalarda tiplendirme çalışmaları fenotipik ve genotipik özelliklerin belirlenmesi ile yapılmaktadır. S. aureus un fenotipik özelliklerinin belirlenmesinde koloni morfolojisi, mikroskobik görünüm, üreme koşulları, katalaz test, koagulaz tipi, biyotiplendirme ve antibiyotik dirençliliği sıklıkla kullanılan testlerdendir. Genotipik olarak ise değişik enterotoksin, diğer toksin ve koagulaz genleri ile suşlar arası akrabalık derecelerinin belirlenmesine ilişkin yapılan analizleri içermektedir (Scherrer ve ark. 2004; Peles ve ark. 2007; Akineden ve ark. 2008). Yapılan birçok çalışmada (Normanno ve ark., 2007; Pesavento ve ark., 2007; Van Loo ve ark., 2007; Pu ve ark., 2009) değişik hayvan türlerine ait etlerin değişik düzeyde S. aureus ile kontamine olduğu bildirilmiştir. Bu kapsamda, Pesavento ve ark., (2007) tarafından 176 adet et örneğinde (sığır, kanatlı, domuz) yapılan çalışmada, örneklerin 42 tanesinin S. aureus yönünden pozitif bulunduğu bildirilmiştir. Araştırmacılar ayrıca 42 adet S. aureus suşundan,

5 28 inin test edilen 12 değişik antibiyotikten en az birine dirençli bulunduğunu saptamışlardır. Aynı şekilde, De Boer ve ark. (2009) tarafından yapılan başka bir çalışmada ise analiz edilen toplam 2217 adet (sığır, domuz, koyun-kuzu, piliç, hindi, av hayvanı) et örneğinin 264 ünde (% 11.9) MRSA suşu izole edildiği bildirilmiştir. Pu ve ark. (2009) ise 90 nı domuz, 30 u sığır eti orijinli çiğ et ürünlerinde yaptıkları çalışmada domuz eti orijinli ürünlerin % 45.6 nın, sığır eti orijinli ürünlerin ise % 20 sinin S. aureus ile kontamine olduğunu saptamışlardır. Araştırmacılar ayrıca çalışmalarında izole edilen 6 adet metisiline dirençli S. aureus izolatından 5 inin domuz, 1 inin ise sığır eti orijinli olduğunu ve suşların Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) tekniği kullanılarak yapılan akrabalık yakınlığı analizinde, 2 farklı tipte olduğunu saptamışlardır. Benzer şekilde Van Loo ve ark. (2007) tarafından Hollanda da yapılan çalışmada, analiz edilen 79 adet sığır ve domuz orijinli et ürünü örneğinin 36 sının S. aureus yönünden pozitif bulunduğu ve suşlardan 2 sinin ise MRSA olduğu saptanmıştır. Yine Normanno ve ark. (2007) tarafından, 1634 adet et ve süt ürünü örneği üzerinde yapılan çalışmada, örneklerin 209 unda (% 12.8) S. aureus izole edildiği bildirilmiştir. Araştırmacılar izolatların 125 inin enterotoksijenik karekterde olduğunu ve izolatların doğal kaynağının % 50.4 düzeyinde insan, % 23.2 nin koyun, % 7.2 sinin sığır, %1.6 sının kanatlı ve % 17.6 sının ise konakçıya spesifik olmadığını bildirmişlerdir. Araştırmacılar aynı çalışmalarında, S. aureus izolatlarından % 68.8 inin en az bir antibiyotiğe karşı direnç geliştirdiğini ve insan orijinli izolatların ise diğer izolatlara göre çoklu antibiyotik dirençliliği gösterdiklerini tespit etmişlerdir. Pereira ve ark. (2009) yaptıkları çalışmada, değişik gıdalardan izole edilen 148 adet Koagulaz pozitif stafilokok izolatından % 69 unun bir veya birden fazla enterotoksin geni taşıdığını tespit etmişlerdir. Benzer şekilde Rosec ve Gigaud da (2002) değişik gıdalardan izole ettikleri 332 adet S. aureus suşlarının PCR tekniği ile yapılan analizlerinde % 57 sinin hem klasik (SEA, SEB, SEC, SED ve SEF) enterotoksin genlerini hem de yeni tanımlanan enterotoksin genlerini (seg, seh, sei, sej) içerdiklerini rapor etmişlerdir.

6 Kitai ve ark. (2005) tarafından yapılan başka bir çalışmada ise, incelenen toplam 444 adet piliç eti örneklerinden 292 sinin (% 65.8) S. aureus ile kontamine olduğu ve izole edilen 714 suşdan 2 sinin metisiline dirençli olduğunu ve bunların 2 sinin de insan orijinli olduğu bildirilmiştir. Türkiye de benzer konuda Gündoğan ve ark. (2005) tarafından yapılan çalışmada ise, sığır, kuzu ve piliç eti örneklerinden izole edilen 80 adet S. aureus izolatından % 67.5 nin metisiline dirençli olduğu, piliç eti orijinli izolatlarda ise metisiline dirençliliğin % 76.4 düzeyinde bulunduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada; 1) Sığır, koyun ve piliç etlerinde klasik kültür tekniği ile S. aureus varlığının belirlenmesi, 2) Klasik yöntemle S. aureus olarak belirlenen suşların PCR tekniği ile doğrulanması, 3) İzolatların bazı antibiyotiklere karşı direncinin belirlenmesi, 4) İzolatlarda klasik ve yeni tanımlanan stafilokokal enterotoksin genleri (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei) ile toksik şok sendrom toksin-1 geni (tst), meca ve nuc genlerinin PCR tekniği ile saptanması amaçlanmıştır. III. Materyal ve Yöntem Bu çalışmada, farklı zamanlarda Ankara da marketlerde satışa sunulan sığır, koyun ve piliç eti örneklerinin her birinden 75 er adet olmak üzere, alınan toplam 225 adet örnek materyal olarak kullanılmıştır. Piliç eti örnekleri 25 er adet but, kanat ve göğüs eti olarak alınmıştır. Örneklerden sığır ve koyun etleri doğranmış formda (kuşbaşı), piliç eti örnekleri ise satışa sunulduğu orijinal paketlerden alınmış olup, daha sonra alınan örnekler analiz amacıyla soğuk zincirde laboratuara (30-45 dak.) getirilmiştir. Örneklerin Mikrobiyolojik Analizlere Hazırlanması: Analiz amacıyla laboratuvara getirilen yaklaşık 200 g her bir et örneğinden, aseptik koşullarda homojen olarak 10 ar gram tartılıp üzerine 90 ml peptonlu su ilave edilmiş ve karışım 2-3 dakika süreyle stomacherde homojenize edilmiştir. Homojenizasyonu takiben, karışımdan gerekli desimal dilüsyonlar hazırlanarak, mikrobiyolojik ekimlerde kullanılmıştır (Baumgart, 2007).

7 S. aureus un izolasyon ve identifikasyonu: Bu amaçla hazırlanan karışımdan Baird Parker Agar a (BP, Oxoid, CM0275, supplement ) ekim yapılarak, plaklar 35 0 C de 24-48 saat süre ile inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası besi yerinde üreyen gri-siyah renkte tipik ve atipik kolonilerden 5 adet seçilerek, EDTA koagulaz plazma (Oxoid, R21052) ile tüpte koagulaz testi yapılmıştır. Bunu takiben, koagulaz testi pozitif olan koloniler, Gram boyama, katalaz test, Dnase aktivitesi, hemolitik özellikler (ß-hemoliz), clumping faktör (Staphylase test kit, Oxoid, DR0595) ve mannitol fermentasyon testi yönünden analiz edilmiş ve bu test sonuçları pozitif olan koloniler S. aureus olarak değerlendirilmiştir (Anon., 2003). S. aureus şuşlarının PCR ile doğrulanması: Fenotipik olarak S. aureus olarak belirlenen suşlar daha sonra, PCR tekniği ile doğrulanmıştır. Bu amaçla öncelikle Akineden ve ark. (2008) uyguladığı yönteme göre, izolatlar lizostafin (10mg/ml) ile 37 0 C de 1 saat süre ile muamele edilip, enzimatik olarak (DNeasy Tissue Kit, Qiagen, Germany) DNA ekstraksiyonları yapılmıştır. Ekstraksiyon işlemlerini takiben, stafilokoklara özgü 16SrRNA ve S. aureus a spesifik nuc geni sekansını oluşturan primer çiftleri kullanılarak, amplifikasyon işlemleri yapılmış ve PCR ürünleri % 2.5 lik agaroz jel elektroforezde yürütülerek, bu gene özgü DNA bantları UV transiluminatör yardımıyla görüntülenerek değerlendirme işlemleri yapılmıştır (Brakstad ve ark. 1992). Antibiyotik direncinin belirlenmesi: PCR tekniği ile S. aureus olarak doğrulanan suşların, antimikrobiyel duyarlılık testleri NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standarts, 2003) tarafından bildirilen yöntem esas alınarak, Mueller-Hinton Agar da (Oxoid, CM0337) ampisilin (10µg), oksasilin (1µg), tetrasiklin (30µg), gentamisin (10µg), eritromisin (15µg), sefoksitin (30µg), kloramfenikol (30µg), sülfametoksazol-trimetoprim (25µg) ve vankomisin (30µg) antibiyotik diskleri kullanılarak yapılmıştır. S. aureus suşlarının enterotoksin genleri (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej),toksik şok sendrom toksin-1 geni (tst) ve mec A geninin PCR tekniği ile saptanması: S. aureus suşlarının enterotoksin genleri (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej), toksik şok sendrom toksin-1 geni ve meca genleri PCR tekniği ile saptanmıştır. Bu amaçla, öncelikle izolatlardan DNA ekstraksiyonu yapıldıktan sonra, farklı toksinler için değişik araştırmacılar (Mehrotra ve

8 ark. 2000; McLauchin ve ark. 2000; Monday ve Bohach, 1999) tarafından belirtilen primer çiftleri kullanılarak, Lovseth ve ark. (2004) önerdiği protokole göre amplifikasyon işlemleri yapılmıştır. Amplifikasyon işleminde Tablo 2.5.5.1 de belirtilen değişik toksin tipi genlerini kodlayan primer çiftleri kullanılmıştır. Amplifikasyon işlemini takiben PCR ürünleri % 2.5 lik agaroz jel elektroforezde yürütülerek, bu genlere özgü DNA bantları UV transiluminatör yardımıyla görüntülenerek, değerlendirmeleri yapılmıştır. Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan S. aureus a ait enterotoksin, TSST-1 ve meca genlerini kodlayan primer dizilimleri. Gen Primer sekansı (5-3 ) Amplikon büyüklüğü (bp) Referans sea seb Primer 1: GGT TAT CAA TGT GCG GGT GG Primer 2: CGG CAC TTT TTT CTC TTC GG Primer 1: GTA TGG TGG TGT AAC TGA GC 102 Mehrotra ve ark. (2000) 164 Mehrotra ve ark. (2000) Primer 2: CCA AAT AGT GAC AG TTA GG sec sed see seg seh sei sej tst meca Primer 1: AGA TGA AGT AGT TGA TGT GTA TGG Primer 2: CAC ACT TTT AGA ATC AAC CG Primer 1: CCA ATA ATA GGA GAA AAT AAA AG Primer 2: ATT GGT ATT TTT TTT CGT TC Primer 1: AGG TTT TTT CAC AGG TCA TCC Primer 2: CTT TTT TTT CTT CGG TCA ATC Primer 1: TGC TAT CGA CAC ACT ACA ACC Primer 2: CCA GAT TCA AAT GCA GAA CC Primer 1: CGA AAG CAG AAG ATT TAC ACG Primer 2: GAC CTT TAC TTA TTT CGC TGT C Primer 1: GAC AAC AAA ACT GTC GAA ACT G Primer 2: CCA TAT TCT TTG CCT TTA CCA G Primer 1: CAT CAG AAC TGT TGT TCC GCT AG Primer 2: CTG AAT TTT ACC ATC AAA GGT AC Primer 1: ACC CCT GTT CCC TTA TCA TC Primer 2: TTT TCA GTA TTT GTA ACG CC Primer 1: ACT GCT ATC CAC CCT CAA AC Primer 2: CTG GTG AAG TTG TAA TCT GG 451 Mehrotra ve ark. (2000) 278 Mehrotra ve ark. (2000) 209 Mehrotra ve ark. (2000) 704 McLauchin ve ark. (2000) 495 McLauchin ve ark. (2000) 630 McLauchin ve ark. (2000) 142 Monday ve Bohach (1999) 326 Mehrotra ve ark. (2000) 163 Mehrotra ve ark. (2000)

9 Referans suşlar: Çalışmada pozitif kontrol olarak aşağıda belirtilen suşlar kullanılmıştır. S. aureus (Oxoid, MSSA Strain, ATCC 25923), S. aureus (Oxoid, MRSA Strain, ATCC 43300) ile Dr. Ömer Akineden den (Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Justus- Liebig Universität, Gießen-Almanya) temin edilen farklı enterotoksijenik özellikteki (SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ ve TSST-1) suşlar. IV. Analiz ve Bulgular Bu çalışmada her birinden 75 er adet olmak üzere alınan toplam 225 adet sığır, koyun ve piliç eti örnekleri materyal olarak kullanılmıştır. Çalışma kapsamında İncelenen sığır, koyun ve piliç eti örneklerinde koagulaz-pozitif stafilokoklar sırasıyla % 17.3, % 34.6 ve % 54.6 düzeyinde, Staphylococcus aureus ise aynı örneklerde sırasıyla % 14.6, % 30.6 ve % 45.3 düzeyinde saptanmıştır. Piliç eti örnekleri içerisinde S. aureus en fazla kanat eti örneklerinde olmak üzere but ve göğüs etlerinde sırasıyla, % 52.0 (39/75), % 46.6 (35/75) ve % 25.3 (19/75) düzeylerinde bulunmuştur. Tüm örneklerde koagulaz-pozitif stafilokoklar ile S. aureus un bulunuşu Tablo 2 de gösterilmiştir. Tablo 2: Sığır, koyun ve piliç etlerinde koagulaz-pozitif stafilokoklar ile S. aureus un bulunuşu. Örnek tipi Örnek sayısı Pozitif koagulaz-pozitif örnek sayısı (%) S. aureus pozitif örnek sayısı (%) Sığır eti 75 13 (17.3) 11 (14.6) Koyun eti 75 26 (34.6) 23 (30.6) Piliç eti 75 41 (54.6) 34 (45.3) Çalışmada izole edilen toplam 146 adet koagulaz-pozitif stafilokok suşundan 114 ü yapılan identifikasyon testleri sonucu S. aureus olarak tanımlanmıştır. Aynı şekilde, klasik teknikte S. aureus olarak belirlenen suşların tümü PCR tekniğinde S. aureus olarak teyit edilmiştir. Ancak koagulaz-pozitif suşlardan Dnase, ß-hemoliz ve Staphylase testi pozitif olup, sadece mannitol fermentasyon testi negatif bulunan ve bu yönüyle S. aureus yönünden şüpheli olarak ayrılan 9 adet suş, PCR tekniğinde S. aureus olarak saptanmıştır. Fenotipik olarak izole edilen 114 adet S. aureus suşundan 109 unun (% 95.6) kanlı agarda sarı renkte pigment oluşturduğu, 93 ünün (% 81.5) lesitinaz pozitif, 112 sinin (% 98.2) β-hemoliz oluşturduğu ve 111 inin (% 97.3) ise Staphylase pozitif özellikte olduğu belirlenmiştir.

10 Benzer şekilde izole edilen S. aureus suşlarının bazı genotipik özelliklerini belirlemek amacıyla yapılan testler sonucu, 114 adet suşun başta meca geni olmak üzere, SEB ve SEE tipi enterotoksin oluşumunu kodlayan genlere sahip olmadıkları saptanmıştır. Ancak 114 adet suşdan 56 sında SEA, 2 sinde SEC, 8 inde SED, 2 sinde SEG, 12 sinde SEH, 6 sında SEI, 8 nde SEJ ve 12 sinde ise TSST-1 tipi enterotoksin genine rastlanılmıştır. Bunlara ilişkin sonuçlar Tablo 3 de gösterilmiştir. Tablo 3: İzole edilen S. aureus suşlarının enterotoksijenik özellikleri ve oranları. Enteretoksijenik suş sayısı (%) Sahip olduğu enterotoksin geni 56 (49.1) SEA 2 (1.7) SEC 8 (7.0) SED 2 (1.7) SEG 12 (10.5) SEH 6 (5.2) SEI 8 (7.0) SEJ 12 (10.5) TSST-1 n=114 Özellikle klasik enterotoksin tiplerinin (SEA, SEB, SEC, SED, SEE, TSST-1) yanında, 28 adet S. aureus suşunun yeni adlandırılan (SEG, SEH, SEI ve SEJ) enterotoksin genlerine sahip oldukları tespit edilmiştir (Şekil 1). Şekil 1: S. aureus suşlarının enterotoksin genlerinin Multiplex PCR tekniği ile saptanması. M=marker; 1, 2, 3, 4, 5: örneklerden izole edilen S. aureus suşları; seb, seh, sei, seg: pozitif kontrol, mix: pozitif kontrollerin miks karışımı. 4 ve 5 nolu örnek sei ve seh yönünden pozitif. 3 nolu örnek seh yönünden pozitif. Bu çalışmada yeni adlandırılan enterotoksin tiplerinin tespit edilmiş olması stafilokokal gıda intoksikasyonları bakımından önemlidir. Ayrıca yapılan literatür taramalarında Türkiye de sığır, koyun ve piliç eti orijinli S. aureus suşları tarafından oluşturulan ve yeni adlandırılan

11 enterotoksin tiplerine ilişkin bir bilgiye rastlanılmamış olup, konuyla ilişkili bulgular Türkiye de bir ilki taşımaktadır. SEA tipi enterotoksin genine sahip 56 adet suşdan sadece 2 sinin SEA nın yanı sıra SEH tipi enterotoksin genine sahip olduğu belirlenmiştir. Aynı şekilde SED tipi enterotoksin genine sahip 8 suşun ise aynı zamanda SEJ tipi enterotoksin genine sahip olduğu belirlenmiş olup, suşlardan 2 sinin ise 4 farklı tip (SEC, SEG, SEI ve TSST-1) enterotoksin genine sahip oldukları belirlenmiştir. SEA tipi enterotoksin genine sahip olan 56 suşdan 7 sinin (% 12.5) sığır eti orijinli, 25 inin (% 44.6) koyun eti orijinli, diğer 24 ünün (% 42.8) ise piliç eti orijinli olduğu tespit edilmiştir. Aynı şekilde 12 adet SEH tipi enteretoksin genine sahip suşların tümünün piliç eti orijinli olmasına karşın, 8 adet SEJ ve SED tipi enteretoksin genine sahip suşların ise koyun eti orijinli olduğu tespit edilmiştir. Antibiyotik dirençliliği yönünden yapılan analizler sonucunda ise 114 S. aureus suşundan 80 i (% 70.1) Ampisiline, 54 ü (% 47.3) Tetrasikline, 38 i (% 33.3) Eritromisine, 26 sı (% 22.8) Sefoksitine, 18 i (% 15.7) Oksasiline, 14 ü (% 12.2) Gentamisine, 6 sı (% 5.2) Kloramfenikole ve 4 ü (% 3.5) sülfametoksazol-trimetoprime dirençli bulunmuş olmasına karşın, suşların hiçbiri Vankomisine dirençli bulunmamıştır. Toplam 114 adet S. aureus suşlarının farklı antibiyotiklere dirençlilik oranları Tablo 4 de gösterilmiştir. Tablo 4: İzole edilen S. aureus suşlarının farklı antibiyotiklere dirençlilik oranları. Dirençli suş sayısı (%) Dirençli olduğu antibiyotik 80 (70.1) Ampisilin 54 (47.3) Tetrasiklin 38 (33.3) Eritromisin 26 (22.8) Sefoksitin 18 (15.7) Oksasilin 14 (12.2) Gentamisin 6 (5.2) Kloramfenikol 4 (3.5) Sülfametoksazol-trimetoprim 0 (100.0) Vankomisin n=114 Aynı şekilde çalışmada izole edilen 114 adet S. aureus suşundan 18 i (% 15.7) sadece 1 antibiyotiğe karşı dirençli bulunmasına karşın, 40 ı (% 35.0) 2 antibiyotiğe, 12 si (% 10.5) 3 antibiyotiğe, 12 si (% 10.5) 4 antibiyotiğe, 6 sı (% 5.2) 5 antibiyotiğe ve yine diğer 12 si ise (% 10.5) farklı 7 antibiyotiğe karşı dirençli bulunmuştur. Aynı şekilde antibiyotik dirençliliğini belirlemek amacıyla yapılan testler sonucunda, 114 adet S. aureus suşundan 36 sının (% 31.5) Eritromisine, 18 nin (% 15.7) Kloramfenikole ve 4 ünün ise (% 3.5)

12 Gentamisine karşı yarı düzeyde dirençli oldukları saptanmıştır. Ampisiline dirençli bulunan suşlardan 44 ü piliç eti, 34 ü koyun eti orijinli olmasına karşın, tetrasikline dirençli bulunan suşlardan 36 sının koyun, 18 inin ise piliç eti orijinli olduğu belirlenmiştir. V. Sonuç ve Öneriler Bu çalışmada, S. aureus başta piliç ve koyun etleri olmak üzere sığır eti örneklerinde yüksek düzeyde bulunmuştur. Özellikle gıda intoksikasyonları bakımından, izole edilen S. aureus suşlarından çoğunun enteretoksijenik özellikte olması önemlidir. Ayrıca enteretoksijenik özellikteki bu suşlardan, 28 inin klasik enterotoksinlerin dışında yeni adlandırılan enterotoksin genlerine sahip olduklarının tespiti, halk sağlığı bakımından çok önemlidir. Aynı şekilde suşların çoğu 1 ve/veya 1 den fazla antibiyotiğe karşı dirençli bulunmuştur. Dolayısıyla bu veriler doğrultusunda sığır, koyun ve piliç etlerinin stafilokokal gıda intoksikasyonları açısından potansiyel risk taşıyabileceği, bu nedenle de halk sağlığının korunması için et üretiminin tüm aşamalarında etkin HACCP sisteminin uygulanmasının önemli olacağı sonucuna varılmıştır. VI. Geleceğe İlişkin Öngörülen Katkılar Bu çalışmada izole edilip, bazı fenotipik ve genotipik karakterizasyonu yapılan S. aureus suşları muhafaza edilerek, ileride yapılması düşünülen epidemiyolojik ve benzeri araştırmalarda kullanılacaktır. Ayrıca proje bütçesi ile kurulan laboratuar geleceğe yönelik çalışmaların yürütülmesinde önemli rol oynayacak olup, nitekim kurulan laboratuarda Anabilim Dalında doktora eğitimi gören öğrencilerin tez çalışmaları için de hizmet vermeye başlamıştır. Buna ilaveten, şu an sonuçların SCI, SCI-Expanded kapsamında yer alan uluslar arası dergilerde yayımı için yazım işlemleri devam etmekte olup, sonuçların yayınlanmasından sonra, çalışmanın benzer konuda yapılacak çalışmalara bilimsel olarak katkıda bulunacağı düşünülmektedir. VII. Sağlanan Altyapı Olanakları ile Varsa Gerçekleştirilen Projeler Sağlanan altyapı olanakları ile proje konusu dışında ilave bir proje gerçekleştirilmemiştir.

13 VIII. Sağlanan Altyapı Olanaklarının Varsa Bilim/Hizmet ve Eğitim Alanlarındaki Katkıları Proje başvuru formunda açıklandığı üzere, sağlanan alt yapı olanakları ile Anabilim Dalı nda yeni bir moleküler mikrobiyoloji laboratuarı kurulmuştur. Dolayısıyla kurulan bu laboratuarın bundan sonra hem öğrencilerin eğitim-öğretiminde hem de bilimsel çalışmalarda önemli katkıları olacaktır. IX. Kaynaklar 1-Akineden, Ö., Hassan, A. A., Schneider, E., Usleber, E. (2008). Enterotoxigenic properties of Staphylococcus aureus isolated from goats milk cheese. Int. J. Food Microbiol. 124, 211-216. 2-Anon. (2003). ISO (International Standart Office, 6888-1). Microbiology of food and animal feedingstuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species). 3-Baumgart, J. (2007). Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln. Behr s Verlag, Hamburg. 4-Brakstad, O. G., Aasbakk, K., Maeland, J. A. (1992). Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. J. Clin. Microbiol. 30 (7), 1654-1660. 5-De Boer E., Zwartkruis-Nahuis J.T.M., Wit B., Huijsdens X.W., De Neeling A.J., Bosch T., Van Oostrem R.A.A., Vila A., Heuvelink A.E. (2009). Prevalence of methicilin-resistant Staphylococcus aureus in meat. Int. J. Food Microbiol., 134, 52-56. 6-Gündogan, N., Citak, S., Yucel, N., Devren, A. (2005). A note on the incidence and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus isolated from meat and chicken samples. Meat Sci. 69, 807-810. 7-Kitai, S., Shimizu, A., Kawano, J., Sato, E., Nakano, C., Uji, T., Kitagawa, H. (2005). Characterization of methicillin-resistant S. aureus isolated from retail raw chicken meat in Japan. J. Vet. Med. Sci. 67 (1), 107-110. 8-Kluytmans, J., Van Belkum, A., Verbrugh, H. (1997). Nasal carriage of Staphylococcus aureus: Epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clin. Microbiol. Rev.10, 505-520. 9-Kuzma, K., Malinowskie, E., Lassa, H., Klosswska, A. (2003). Detection of genes for enterotoxins and toxic shock syndrome toxin-1 in Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. Bulletin of the Veterinary Research Institute in Pulawy, 47, 419-426. 10-Le Loir, Y., Baron, F., Gautier, M. (2003). Staphylococcus aureus and food poisoning. Genet. Mol. Res. 2, 63-67. 11-Lovseth, A., Loncaveric, S., Berdal, K.G. (2004). Modified multiplex -PCR method for detection of pyrogenic exotoxin genes in staphylococcal isolates.j.clin.microbiol.42,3869-72.

14 12-McLauchin, J., Narayanan, G.L., Mithani, V., O Neill, G. (2000). The detection of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. J. Food Prot. 63, 479-488. 13-Mehrotra, M., Wang, G., Johnson, W.M. (2000). Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome toxin 1 and methicillin resistance. J. Clin. Microbiol.38(3), 1032-1035. 14-Monday, S.R., Bohach, G.A. (1999). Use of multiplex PCR to detect classical and newly described pyrogenic toxin genes in staphylococcal isolates. J. Clin. Microbiol.37(10), 3411-3414. 15-NCCLS.(2003). Performance standards for antimicrobial approved Standard-eighth edition.m2-a8. Volume 23. No.1. disk susceptibility tests; 16-Normanno, G., Corrente, M., La Salandra, G., Dambrosio, A., Quaglia, N.C., Parisi, A., Greco, G., Bellacicco, A.L., Virgilio, S., Celano, G.V. (2007). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in foods of animal origin product in Italy. Int. J. Food Microbiol. 117, 219-222. 17-Peles, F., Wagner, M., Varga, L., Hein, I., Rieck, P., Gutser, K., Kereszturi, P., Kardos, G., Turcsanyi, I., Beri, B., Szabo, A. (2007). Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine milk in Hungary. Int. J. Food Microbiol. 118, 186-193. 18-Pereira, V., Lopes, C., Castro, A., Silva, J., Gibbs, P., Teixeira. (2009). Characterization for enterotoxin production, virulence factors, and antibiotic susceptibility of staphylococcus aureus isolates from various foods in portugal. Food Microbiol. 26, 278-282. 19-Pesavento, G., Duccib, B., Comodo, N., Lonostro, A. (2007). Antimicrobial resistance profile of Staphylococcus aureus isolated from raw meat: A research for methicilin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Food Control, 18, 196-200. 20-Pu, S., Han, F., Ge, B. (2009). Isolation and characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from Louisiana retail meats. Appl. Environ. Microbiol. 75 (1), 265-267. 21-Rosec, J. P., Gigaud, O. (2002). Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France. Int. J. Food Microbiol. 77 (1-2), 61-70. 22-Scherrer, D., Corti, S., Muehlherr, J. E., Zweifel, C., Stephan, R. (2004). Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulk-tank milk samples of goats and sheep. Vet. Microbiol. 101, 101-107. 23-Stephan, R., Annemuller, C., Hassan, A.A., Lammler, C. (2001). Characterization of enterotoxigenic Staphylococcus aureus strains isolated from bovine mastitis in north-east Switzerland. Veterinary Microbiology, 78, 373-382. 24-Van Loo I.H.M., Diederen B.M.W., Savelkoul P.H.M., Woudenberg J.H.C., ROosendaal R., Van Belkum A., Toom N.L., Verhulst C., Van Keulen PH.J., Kluytmans A.A.J.W. (2007). Methicilin-resistant Staphylococcus aureus in meat products, the Netherlands. Emerg. Infect. Dis., 13, 1753-1755.

15 X. Ekler a. Mali Bilanço ve Açıklamaları Yürütücüsü bulunduğum 12A3338002 nolu alt yapı projesinin ön görülen bütçesi toplam 75.000.T.L (yetmişbeşbin) olup, bu rakamın 30.000 T.L si (otuzbin) ile tüketime yönelik mal ve malzemelerin temini, 45.000 T.L si (kırkbeşbin) ile kurulacak laboratuar için gerekli mamul mal alımlarının (mikrosantrifüj, elektroforez güç kaynağı ve cihazı, transilluminatör, termocycler, vorteks ve otomatik pipetler) satın alınması öngörülmüştü. Tüketime yönelik mal ve malzemeler için toplam 26. 848 T.L.(Yirmialtıbin sekizyüzkırksekiz), mamul mal alımları için toplam 29. 319 T.L.(Yirmidokuzbin üçyüzondokuz) harcanmış olup, proje için öngörülen toplam 75. 000 T.L. den, 56.168 T.L.(Ellialtıbin yüzaltmışsekiz) harcanmıştır. Proje bütçesinde ise toplam 18.831 T.L.(Onsekizbin sekizyüzotuzbir) kalmıştır. Proje çalışmaları kapsamında temin edilen tüm tüketime yönelik mal ve malzemeler çalışmalarda kullanılmış olup, mamul mal alımları kapsamında satın alınan makine ve teçizat ile Anabilim Dalı nda yeni bir laboratuar kurulmuştur. b. Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar Bu alt yapı projesi gereği öngörülen bütçe ile satın alınan makine ve teçizat ile Anabilim Dalı nda yeni bir moleküler mikrobiyoloji laboratuarı kurulmuştur. Dolayısıyla kurulan bu yeni laboratuar bundan sonra Anabilim Dalı nda eğitim-öğretim, bilimsel araştırmalar ve rutin gıda analizlerinde (mikrobiyolojik, serolojik) kullanılacaktır. c. Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (Varsa kesim III de yer alamayan analiz ayrıntıları)