1 HIZLI YÖNTMLR Doç. Dr. Serap COŞANSU AKDMİR
2 1. lektrik İmpedans Yöntemi İlk kez 1890 yıllarında kullanılmaya başlanmıştır. Kanda bazı patojen bakterilerin meydana getirdiği elektriksel değişimler üzerinde çalışılmıştır. Bu yöntemde mikrobiyel gelişme sonucu besiyerinin elektrik impedansında meydana gelen değişimler sisteme entegre edilen paslanmaz çelik elektrotlarla ölçülür.
3 Mikrobiyel gelişme sırasında büyük moleküller daha küçük ve aktif moleküllere dönüşür. Gelişme belirli bir seviyeye geldiğinde mikroorganizmaların ürettiği metabolitler nedeniyle ortamın elektrik impedansı belirli bir seviyeye ulaşır. lektrik impedans yönteminde mikrobiyel gelişme sonucu elektrik impedansta meydana gelen değişimin ölçülebilir seviyeye ulaştığı nokta saptanır. Bu nokta impedans saptama süresi (IDT: Impedans Detection Time) olarak adlandırılır.
4
IDT üzerine etkili faktörler: Kullanılan besiyeri İnkübasyon sıcaklığı lektrot tipi Mikrobiyel metabolizma Mikroorganizmaların başlangıç sayısı Generasyon süresi 5
6 İmpedans; iletkenlik (conductance) ve kapasitans (capasitance) olmak üzere iki bileşenden oluşur. lektrik impedans yönteminde kullanılan ve elektriksel değişimi ölçmek için kullanılan cihazlar: Bactometre Malthus BacTrac RABIT (Rapid Automated Bacterial Impedance Technique)
7 Bactometre Computer, Printer, ve inokülasyon kabininden oluşur. Aynı anda 128 örneğin impedans, kapasitans ve iletkenlik olmak üzere üç farklı elektriksel değişimi ölçebilir.
8 BacTrac Genel olarak bactometreye benzer, ancak elektrot düzenlemesi, elektrotların yerleşimi ve analiz edilebilen örnek sayısı farklıdır.
lektrik impedans yönteminde kullanılan cihaza bağlı olarak toplam impedans, iletkenlik ve kapasitans ayrı ayrı saptanabilir. Kullanılan gıda ve besiyeri kompozisyonunda bu üç sinyalden en uygun olanı seçilerek sonuç hesaplanır. Örneğin mayalar yükü fazla olan iyonlar üretmezler ve genellikle iyonize olmayan metabolitler üreterek iletkenlikte minimum (%2) kapasitansta ise yüksek (%20) değişime neden olurlar. Bu nedenle maya gelişiminin ölçüsü olarak ya kapasitans ya da indirekt iletkenlik ölçümü kullanılır. 9
10 lektrik impedans yönteminin avantajları 1. Standart plak sayım yöntemlerine göre çok daha hızlıdır (Maya sayımı standart kültürel yöntemle 3-5 gün, elektrik impedans yöntemi ile 24-35 saat) 2. Klasik sayım yöntemlerine göre daha ekonomiktir. 3. Cihazlar bilgisayara bağlı, kullanımı kolay ve pratiktir. Bu nedenle insan kaynaklı hata olasılığı çok düşüktür. 4. Aynı anda çok sayıda örnek analize alınabilir.
11 lektrik impedans yönteminin gıda mikrobiyolojisinde kullanımı: İşletmeye gelen hammaddenin kalitesinin saptanması İşleme sırasında mikrobiyolojik kontrol Son ürün kontrolü ve raf ömrünün saptanması İşletmede uygulanan sanitasyonun değerlendirilmesi
12 2. ATP-BİYOLÜMİNSANS Biyolüminesans olayı doğada ateş böcekleri, tuzlu su balıkları ile diğer bazı deniz canlıları, mantarlar ve bazı bakterilerde görülür. Canlı tüm hücreler ATP molekülü içerir ve bu molekül bir substratenzim kompleksi yani Lüsiferin-Lüsiferaz kullanılarak belirlenebilir. Bu enzim ateş böceği Photinus pyralis' in kuyruğunda bulunur. ğer bakteri hücrelerindeki ATP düzeyinin sabit olduğu kabul edilirse, reaksiyon sırasında salınan ışığın miktarı bakteri sayısı ile orantılıdır.
13 Lüsiferaz + Lüsiferin + ATP Lüsiferaz-Lüsiferin-AMP + PP Lüsiferaz-Lüsiferin-AMP + O 2 Oksilüsiferin + CO 2 + AMP + IŞIK ATP-Biyolüminesans tekniği ile mikrobiyel yükün ölçülmesi; Tüm canlı hücrelerin ATP içermesi, Tüm mikroorganizmalarda hücredeki ATP miktarının belirli bir aralıkta olması, Saf reaktifler ve duyarlı lüminometre kullanmak suretiyle ATP' nin çok düşük konsantrasyonlarda bile belirlenebilmesi esasına dayanır. Saf reaktif ve hassas lüminometre kullanılarak 0.1 pikogram (10-12 g) düzeyindeki ATP saptanabilir. Bu miktar yaklaşık 100 adet bakteri hücresine karşılık gelir.
14 1. AŞAMA: Ortama ATP yi açığa çıkaracak bir madde ilave edilerek mikroorganizma içindeki ATP nin açığa çıkması sağlanır. 2. AŞAMA: Açığa çıkan ATP ile lüsiferaz reaksiyona girer ve ışık oluşur. BD Monolight 3010C Luminometer
Çiğ sütte ATP-Biyolüminesans ile bakteri yükünün belirlenmesi 15
16 3. Bakteriyel Biyolüminesans Biyolüminesans bakteriler özellikle denizde bulunmaktadır. Vibrio, Photobacterium, Shewanella (Altermonas) ve Photorhabdus (Xenorhabdus) olmak üzere dört cinse ait 11 tür tanımlanmıştır. Bunlardan sadece Photorhabdus karasal olup diğerleri denizde bulunur. Lüsiferaz enzimi karışık fonksiyonlu bir oksidaz olup redükte Flavinmononükleotidi (FMNH 2 ) ve uzun zincirli aldehiti FMN, su, yağ asidi ve mavi-yeşil ışık (490 nm) verecek şekilde okside eder.
Lux operonu 17 Biyolüminesans bakteriyel sistemler üzerindeki pek çok çalışma Photobacterium ve Vibrio ile gerçekleştirilmiştir. LuxA ve luxb genlerine ilave olarak, lux operonu yağ asidi redüktazın alt ünitelerini kodlayan luxc, luxd ve Lux olmak üzere üç farklı yapısal gen daha içerir.
18 Patojenlerin ve indikatör mikroorganizmaların aranmasında bakteriyel biyolüminesansın uygulanması Bakteriyel biyolüminesanstan sorumlu lux genleri konukçu spesifikliği olan fajlara aktarılabilir. Bakteriyofaj hücre içi metabolizmadan yoksun olduğundan ışık üretemez. Ancak, konukçu bakterinin faj tarafından enfekte edildiğinde, faj genleri ile birlikte lux genleri de ifade edilir.
Yayılan ışığın miktarı enfekte edilen bakterinin sayısı ile orantılı olup, yöntemin spesifikliği fajın spesifikliğine bağlıdır. 19
20 4. İmmünolojik Yöntemler İmmünoloji: Bağışıklık Bilimi İmmün Yanıt: konukçu organizmanın kendi kalıtsal yapısına yabancı maddeleri tanıması, karşı koyması ve onları nötralize veya metabolize ederek yanıt verme özelliği Bağışık yanıt mekanizmasının en önemli özelliği kendine yabancı maddeleri tanıyıp ayırt edebilmesi ve bu maddeleri tekrar tanıyabilmesidir.
21 İmmün yanıt sonucunda iki temel olay meydana gelir: Konukçuda oluşturulan antikorlar, yabancı madde yani antikorla uyarılan B lenfositlerinin başkalaşması sonucu meydana gelen plazma hücreleri tarafından oluşturulurlar. Bu şekilde oluşan yanıta humoral yani sıvısal bağışıklık adı verilir. T lenfositlerinin başkalaşması ile oluşan ve üzerlerinde spesifik hücre reseptörleri bulunan lenfoblastların oluştuğu yanıttır. Bu tip yanıta ise hücresel bağışık yanıt adı verilir.
22 Antijen Bağışık yanıt verebilecek düzeyde gelişmiş canlılara verildiğinde bağışık yanıt oluşumuna yol açan ve bu yanıt sonucu ortaya çıkan antikor ve duyarlı hücre reseptörleriyle in vitro (hücre dışı) veya in vivo (hücre içi) koşullarda özgül olarak birleşebilme yeteneğindeki maddelerdir. İmmün yanıta yani antikor üretimine yol açan molekül ile antikorun bağlandığı hedef molekülü birbirinden ayırt etmek için immünojen ve antijen terimleri ayrı ayrı kullanılır. İmmunojen: İmmün yanıt meydana getirme yeteneğindeki herhangi bir madde Antijen: Özgün bir bağışık yanıt oluşturan ve oluşan bağışık yanıt ile in vivo ve in vitro koşullarda reaksiyona giren maddeler
23
Doğal immünojenler genellikle 1000 ve normalde 5000 Da üzerinde molekül ağırlığa sahip makromoleküllerdir. Yalnızca iki grup madde doğal olarak immünojeniktir: proteinler ve polisakkaritler Proteinlerin çoğu iyi antijeniktir, buna karşın polisakkaritler zayıf antijeniktirler. Oligosakkaritler, lipitler ve nükleikasitler immün yanıt oluşturmazlar. Ancak taşıyıcı bir proteine örneğin sığır serum albümine (BSA) bağlandıklarında bağışık yanıt oluştururlar ve kendilerine karşı oluşturulan antikorla özgül olarak birleşebilirler. Bu tip vücutta antikor sentezini uyarmayan ancak bir proteinle birleştiklerinde antikor oluşumuna neden olan ve kendisine karşı meydana gelmiş antikorla in vitro koşullarda protein olmadan- spesifik olarak birleşme yeteneğinde olan maddelere hapten adı verilir (örn: digitoksin, aflatoksin). 24
25 Buna göre antijen; Bir toksin molekülü, Çözülebilir bir protein, Veya virüs, bakteri, küf hücresi vb antijenik maddeleri bünyesinde toplayan kompleks bir partikül olabilir. Bir immünojende organizmaya verildiğinde immün yanıt oluşturan ve oluşan antikorla spesifik olarak birleşebilen ve antijen-antikor reaksiyonlarının özgüllüğünü belirleyen immünolojik aktif özel bölgeler veya gruplar bulunur. Bu gruplar antijenik determinantlar veya epitop olarak adlandırılır.
Antikorlar Konukçuda bağışık yanıt sonucunda antijenlere karşı oluşturulan ve bu antijenlerle özgül olarak birleşebilen protein yapısındaki maddelerdir. Globüler yapıda olduklarından immünoglobülinler (Ig) olarak da adlandırılır. Kanın serum proteinlerinin gamma (γ) globülin fraksiyonunda yer alırlar. ğer immün yanıt oluşmuş serum örneği elektroforeze tabi tutulursa immünoglobülin fraksiyonunda dolayısıyla da γ-globülin fraksiyonunda artış gözlenir. 26
27 İmmünoglobülinler molekül ağırlıklarına ve işlevlerine göre 5 sınıfa ayrılırlar: IgG, IgM, IgA, IgD ve Ig Bunlar içinde IgG bağışık yanıt sonucunda en fazla oluşturulandır. IgG - Gamma heavy chains IgM - Mu heavy chains IgA - Alpha heavy chains IgD - Delta heavy chains Ig - psilon heavy chains
28 Fab: Fragment antigen binding (ANTİJN BAĞLAYAN PARÇA) Fc: Fragment crystallizable (KRİSTALİZ OLABİLN PARÇA)
29 Antijenle antikorun birleşmesi, antijendeki spesifik determinantlar (epitop) ile antikorun birleşme yanları (paratop) arasında gerçekleşir. Bu birleşmede kovalent bağlar rol almaz. Kovalent olmayan hidrojen bağı, iyon bağları, hidrofob vb bağlar yer alır. Antijenlerin çoğu genellikle çok valanslıdır yani çok determinantlıdır (multivalan özellik). Bir antijen organizmaya verildiğinde her bir determinantına uygun antikorların oluşumuna neden olur: poliklonal antikorlar Hibridoma tekniği ile elde edilen monoklonal antikorlar bu antijenik determinantlardan yalnızca birine karşı oluşturulmuş antikorları içerirler.
30 Antijen-antikor arasındaki spesifik ve duyarlı reaksiyonlar antijen ve antikorların saptanması ve miktarının belirlenmesinde çok sayıda uygulamaya temel oluşturur. Serum kullanılarak yapılan ve bu nedenle serolojik test olarak adlandırılan bu teknikler antijen ve antikorların in vitro belirlenmesinde kullanılır. Aglütinasyon İmmunopresipitasyon İmmünodifüzyon Radioimmunoassay (RIA) nzim immunoassay vb.
31 Aglütinasyon testi Klasik immünolojik yöntemler antijen-antikor kompleksinin çökelmesine yol açan etkileşim üzerine kuruludur. Aglütinasyon testinde partiküler haldeki bakteri eritrosit gibi antijenlerin hücre yüzeylerindeki antijenik determinantların antikorla birleşerek ağ oluşturması, kümeleşmesi ve çökelti oluşturması esastır.
32 Aktif aglütinasyon: doğrudan antijen ve antikor aglutinasyonda rol oynar. Pasif aglütinasyon: antijen veya antikor polistiren, latex vb taşıyıcı bir madde üzerine immobilize edilmiş durumdadır. Bu testlerden örneğin latex aglütinasyon testi antikorların latex partiküller üzerine immobilize edilerek mikroorganizmaların identifikasyonunda ve mikrobiyel toksinlerin saptanmasında yaygın olarak kullanılır.
33 Lam üzerinde, tüpte veya mikro kuyucuklarda yapılabilir. Aglütinasyon testleri presipitasyon tekniğine göre daha duyarlı olmakla birlikte yarı kantitatif sonuç verir.
34 Presipitasyon testi sası aglütinasyona benzemekle birlikte farklı olarak direkt antijen yerine protein, hormon, toksin gibi çözünür antijenler veya antijenin çözünür fraksiyonu kullanılır. Tüp içinde sıvı ortamda veya katı ortamda uygulanır.
Sıvı ortam: dar çaplı küçük tüplerde antiserum antijen üzerine farklı oranlarda ilave edilir. Antijen antiserumla reaksiyona girerse iki sıvının temas yüzeyinde presipitasyon halkası oluşur. 35
Katı ortam: immünodifüzyon testi olarak da bilinir. Testin esası jel ortamında antijen ve antikorun birbirine doğru difüze olmaları ve birleşmelerine dayanır. n yaygın olarak kullanılanı çift-immünodifüzyon testidir. 36
Çift immünodifüzyon (Ouchterlony) Yöntemi 37 Belirli kalınlıkta dökülmüş yumuşak agara birbirinden belirli uzaklıkta ve çaplardaki kuyucuklara antijen ve antiserum konulur ve inkübe edilir. Birbirlerine doğru yayılan antijen ve antikorlar optimum konsantrasyonlarında birleştiği bölgede presipite olurlar ve presipitasyonun olduğu bölgede gözle görülür bantlar oluştururlar.
38 Bu yöntemle bilinen antiserumla bilinmeyen antijen veya tam tersi saptanabilir. Ayrıca, antiserum seri dilusyonlarının merkezdeki antijen kuyucuğu etrafındaki kuyucuklara konması ile antikorun titresi saptanabilir. Titre: Antikorun gücünü gösterir. Bu testte bant oluşumuna yol açan antikorun en düşük konsantrasyonudur. precipitation in gel - Ouchterlony precipitin method a positive result - the line of precipitate between two wells, central one with antigen and the well with a serum sample (upper right)
39
40 İşaretlenmiş antikorlarla yapılan immünoassayler Bu yöntemlerde antikor immünolojik özelliklerini kaybetmeden bir işaretleyici molekül ile işaretlenir. Burada kullanılan işaretleyici; Fluoresans bir boya ise FLUORSANS IMMUNOASSAY, Bir radyoizotopsa RADIOIMMUNOASSAY Bir enzim ise NZIM IMMUNOASSAY olarak adlandırılır.
İmmunoassay yöntemlerinde kullanılan işaretlendiricilerin karşılaştırılması Özellik Radyoizotoplar nzimler Fluoresans moleküller Duyarlılık İyi İyi Düşük İyi Lüminesans moleküller Örnekteki bazı maddelerle etkileşim Yok Mümkün Mümkün Mümkün Stabilite Düşük İyi İyi İyi Faz ayrımı İhtiyaç var Bazılarında gereklidir Bazılarında gereklidir Bazılarında gereklidir Maliyet Yüksek Düşük Düşük Düşük Sağlık riski yüksek yok yok yok 41
42 Fluoresans Immunoassay (FIA) İmmunofluoresans veya fluoresans antikor tekniği olarak da bilinir. sası; antikorun fluoresans özellikteki bir maddeyle işaretlenerek antijen-antikor birleşme reaksiyonunun UV mikroskobu altında belirlenmesidir. Bu amaçla; Fluorescein izotiyosiyanat (FITC) ve rhodamin B izotiyosiyanat (RITC) yaygın olarak kullanılır. Bu maddeler izotiyosiyanat ara bileşikleriyle antikorun Fc bölgesindeki amino gruplarına bağlanarak antikor-boya konjugatı oluştururlar.
43 Yöntem direkt ve indirekt olmak üzere iki şekilde uygulanır. Direkt yöntem: Antijen, örneğin bakteri içeren örnek bir lam üzerine tespit edilir. Preparat üzerine fluoresan bir boya ile işaretli antikorlar eklenir ve inkübe edilir. İnkübasyonu takiben yıkanır ve UV mikroskop altında incelenir. ğer antijenle antikor reaksiyona girmişse boyayla işaretli antikorlar antijenle birleşecek ve yıkama ile uzaklaşmayacaktır.
44 Indirekt yöntem: Direkt yönteme göre daha hassastır. Hazırlanan preparat üzerine önce işaretlememiş birincil antikorlar konur ve inkübe edilir. Yıkamanın ardından birincil antikorlara karşı hazırlanmış ve işaretlenmiş antikorlar ilave edilir ve inkübe edilip yıkanır. ğer antijen-antikor reaksiyonu varsa birincil antikorlar antijene bağlanacak ve sonradan ilave edilen ikincil işaretli antikorlar da işaretsiz antikorlara bağlanacaktır.
45 nzim Immunoassay (IA) Bu yöntemde antikor fluoresan boya yerine bir enzim ile işaretlenir ve enzim aktivitesinin renk reaksiyonuna göre ölçülmesi sonucu antijenantikor reaksiyonu saptanır. n yaygın kullanılan şekli LISA (nzym Linked Immunosorbent Assay) dır.
46 LİZA TİPLRİ İndirekt LİZA Direkt LİZA Yarışmasız LİZA Sandviç LİZA Yarışmalı LİZA
Direkt and Indirekt LISA Direkt LISA Indirekt LISA Slides by Mathias Bader and Simon Loew 47
Direkt LISA Slides by Mathias Bader and Simon Loew 48
Antibody is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antigen Specific antigen binds if contained Slides by Mathias Bader and Simon Loew 49
Remove test fluid and unbound antigen Binding of antigen is strong enough to withstand rinsing Slides by Mathias Bader and Simon Loew 50
Remove test fluid and unbound antigen Binding of antigen is strong enough to withstand rinsing Slides by Mathias Bader and Simon Loew 51
Slides by Mathias Bader and Simon Loew 52
Add enzyme labeled antibody Labeled antibody binds to antigens Slides by Mathias Bader and Simon Loew 53
Wash sample to remove unbound antibodies Slides by Mathias Bader and Simon Loew 54
Wash sample to remove unbound antibodies Slides by Mathias Bader and Simon Loew 55
Wash sample to remove unbound antibodies Slides by Mathias Bader and Simon Loew 56
Add substrate Measure color change Pozitif Negatif Slides by Mathias Bader and Simon Loew 57
Direct and Indirect LISA Direct LISA Indirect LISA Slides by Mathias Bader and Simon Loew 58
Indirect LISA Antigen is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antibody Slides by Mathias Bader and Simon Loew 59
Antigen is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antibody Slides by Mathias Bader and Simon Loew 60
Antigen is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antibody Wash sample Slides by Mathias Bader and Simon Loew 61
Antigen is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antibody Wash sample Slides by Mathias Bader and Simon Loew 62
Slides by Mathias Bader and Simon Loew 63
Add secondary antibody Primary antibody binds to secondary anitbody Slides by Mathias Bader and Simon Loew 64
Add secondary antibody Wash unbound antibodies Slides by Mathias Bader and Simon Loew 65
Add secondary antibody Wash unbound antibodies Slides by Mathias Bader and Simon Loew 66
Add secondary antibody Wash unbound antibodies Slides by Mathias Bader and Simon Loew 67
Add substrate Measure color change Positive Negativ Slides by Mathias Bader and Simon Loew 68
Direct vs. Indirect LISA Advantages of Indirect LISA: Immunoreactivity of primary antibody is not affected by labeling Wide variety of secondary antibodies available on the market Signal amplification (several epitopes) Advantages of Direct LISA: Quick methodology only one AB Cross-reactivity of second AB eliminated Slides by Mathias Bader and Simon Loew 69
Immobilized Antigen vs. Sandwich Immobilized Antigen: Mainly used for antibody detection Sandwich LISA: Mainly used for antigen detection Slides by Mathias Bader and Simon Loew 70
71 SANDWICH LISA LISA tekniği ile antijen aranmasında kullanılan direkt yöntem sandwich yada çift antikor yöntemi olarak da bilinir. 1. Aranılan antijene karşı oluşturulmuş antikor katı bir taşıyıcı yüzeye absorbsiyonla veya kovalent olarak bağlanır.
2. Daha sonra antijen saptanacak örnek ilave edilir ve inkübe edilir. 3. İnkübasyondan sonra yıkanır. 4. nzimle işaretli antikorlar ilave edilir, tekrar inkübasyon ve yıkama işlemleri yapılır. 2 4 3 5. nzimin substratı ilave edilir ve oluşan renk yoğunluğu spektrofotometrik olarak ölçülür. 72 5
73
74 LISA-sandwich A sandwich LISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
Indirekt LISA (antikorun belirlenmesi) 75
76 Yarışmalı LIZA (enzim-antijen konjugatı kullanılarak) Örnek antijeni ortamda sınırlı miktarda bulunan antikora bağlanmak için enzim-antijen konjugatına karşı yarışır. 1. İki ayrı set halinde antikorlar katı yüzeye bağlanır ve serbest antikorlar yıkanır. 2. Birinci sadece belirli konsantrasyonda enzim bağlı antijenle birlikte örnek antijeni ilave edilerek inkübasyona bırakılır. 3. Yıkanır ve işaretlemede kullanılan enzim spesifik substratla inkübasyona bırakılır.
77 4. İnkübasyon sonunda enzimatik reaksiyon durdurulur, enzim-substrat tepkimesi sonucu oluşan ürün konsantrasyonu kolorimetre veya florometre ile ölçülür. 5. İkinci sete örnek antijeni ilave edilmez ve kontrol olarak kullanılır. Birinci sette enzim substrat tepkimesi sonucu oluşan ürün konsantrasyonu örnekteki antijen konsantrasyonu ile ters orantılıdır.
78
79 Yarışmalı LİZA (nzim-antikor konjugatı kullanılarak) 1. antijenin katı yüzeye bağlanması (iki set halinde ) 2. yıkama 3. enzimle işaretlenmiş antikor ilavesi ve inkübasyon (Bu aşamadan önce birine örnek antijeni ilave edilir, diğeri kontrol olarak kullanılır) 4. yıkama 5. substrat ilavesi ve inkübasyon
Örnekte ne kadar az antijen varsa o kadar fazla enzim-antijen konjugatı antikorla bağlanır. nzim-substrat tepkimesi sonucu oluşan ürün konsantrasyonu örnekte bulunan antijen konsantrasyonu ile ters orantılıdır. 80
81
82
83
84 LISA için en yaygın kullanılan katı taşıyıcı destek ortamı veya matriks olarak polistiren veya PVC (polyvinyl chloride) den yapılan plastik tüpler yada yaygın olarak kullanılan 96 kuyucuklu microtiter plate lerdir. Ayrıca katı faz olarak polikarbonat kürecikler veya manyetik kürecikler de kullanılmaktadır. LISA testinde her inkübasyon aşamasından sonra antikorlar tarafından bağlanmayan analitler yıkama işlemi ile ayrılır. Matriks olarak kürecikler kullanıldığı durumda ise bağlanmayan analitler santrifüj veya manyetik alan kullanılarak ayrılır.
İşaretlemede en çok kullanılan enzimler: Alkalen fosfotaz (substratı: p-nitrofenilfosfat) Peroksidaz (substratı: etilbenzidin/h 2 O 2, fenilendiamin/h 2 O 2 ) β-galaktozidaz (substratı: nitrofenil- β-dgalatopiranosit) İşaretlemede kullanılan enzimlerin fluoresans veya chemiluminesans özellikteki substratları da kullanılabilir ve oluşan reaksiyon ürünleri fluorometrik veya kemiluminometrik olarak ölçülebilir. 85
Çoğu LISA testi 30 dk gibi kısa bir sürede sonuç verir. Salmonella ve Listeria monocytogenes gibi patojenlerin aranmasında kullanılabilir. Ancak duyarlılığı düşük olup örnekte hedef mikroorganizmanın sayısı 10 4-10 6 /ml olmalıdır. Bu nedenle ancak zenginleştirme işlemlerinden sonra uygulanabilir. Zenginleştirme işlemi hem LISA nın duyarlılığını artırır hem de refakatçi florayı elimine ettiği için çapraz reaksiyon riskini azaltır. 86