CROSSMATCH ELISA YÖNTEMİ

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "CROSSMATCH ELISA YÖNTEMİ"

Emel Adem
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 CROSSMATCH ELISA YÖNTEMİ Uzm.Dr.Mustafa BALCI Transplantasyon İmmünolojisi ve Doku Tiplendirme Laboratuvarı Sorumlu Hekimi TRANSMED ÖZEL TIP LABORATUVARI ANKARA

2 Humoral Alloreactivity Pre Tx Preformed Ab s Post Tx De novo Ab s historic current de novo time 2

3 The Cell Surface Is a Jungle HLA Non-HLA Non-HLA 3

4 ANTİ-HLA ALLOANTİKORLARI PRA Transfüzyon, Gebelik, Daha önceden organ nakli yapılmış kişilerde Anti-HLA antikorları oluşma riski vardır. Anti-HLA antikorlarının organ alıcısında transplantasyondan veya re-transplantasyondan önce tayini ve tanımlanması önemlidir. 4

5 LCM Hücresel Yöntemler; NIH-CDC AHG-CDC Flow Sitometri Solid Faz Yöntemler ELISA Luminex-DSA 5

6 ELISA Crossmatch Luminex-DSA gibi solid faz immünoassay tekniğidir. Hücresel yöntemlere alternatif olarak yakın dönemde kullanıma girmiştir. 6

7 7

8 ELISA YÖNTEMİ İLE HLA ANTİKOR ANALİZİ Bağlanan serbest HLA Molekülleri Serumdaki Anti-HLA IgG Antikoru ELISA kuyucuğu Anti-Human (Enzim Konjugatı) E Substrat Renk Gelişimi 4. Enzim substratı eklenir Positive kuyucuklarda renklenme ELISA okuyucuda okunur 8

Anti-Human (Enzim Konjugatı) E Substrat Renk Gelişimi 4.

9 ELISA Crossmatch Testinde Kullanılan Yöntemler 9

10 Test stripleri ve kontrol stripleri istenilen sayıda belirlenebilir. 10

11 Class I ve Class II ELISA crossmatch için farklı plaklar kullanılmaktadır. 11

12 İlk aşamada lenfositlerin izolasyonu ve hucre sayım işlemleri yapılır. 12

13 Kullanılacak T ve B lenfositlerin sayımı yöntemin standardizasyonu için gereklidir. Kullanılacak hücre suspansiyonları periferik kan veya dalaktan elde edilebilir. 13

14 ELISA Crossmatch ELISA işleminden önce donor hücreleri ile organ alıcısının serumu karşılaştırılır. Donor HLA antigenlerine karşı organ alıcısında antikorlar var ise özgül bağlanma olacaktır. Bu aşamadan sonra hücrelere lizis işlemi uygulanır. Elde edilen hücre lizatları çalışmada kullanılacaktır. 14

Donor HLA antigenlerine karşı organ alıcısında antikorlar var ise özgül

15 ELISA Crossmatch Kullanılacak ELISA plakları; mause anti-human, class I ve Class II antijenlerine özgü monoklonal antikorlarla önceden kaplanmış durumdadır. Hasta serumundaki özgül antikorlarla bağlanmış durumdaki donor HLA molekülleri, ELISA plaklarına kaplanmış olan antikorlar tarafından yakalanır.(lizat) Bağlanmayanlar yıkama işlemi ile uzaklaştırılır. 15

Hasta serumundaki özgül antikorlarla bağlanmış durumdaki donor HLA molekülleri, ELISA

16 16

17 ELISA Crossmatch Sonraki aşamada bir enzimle(hrp) işaretli goat antihuman IgG antikorlar(konjugat) ortama eklenir. İnkübasyon süresi sonunda tekrar yıkama işlemi yapılır. Devamında ortama kullanılan enzimin substratı eklenir ve substrat enzim tarafından renkli bir ürüne dönüştürülür. Bu aşamada kimyasal reaksiyon durdurulur ve optik dansite değerleri ELISA okuyucusunda okunur. 17

Devamında ortama kullanılan enzimin substratı eklenir ve substrat enzim tarafından renkli bir

18 18

19 OD ÖLÇÜMÜ, HESAPLAMALAR, DEĞERLENDİRME Negatif kontrollerin OD değerlerinden Class-I ve Class-II için ayrı ayrı sınır değerleri(cut-off ) hesaplanır. Cut-off üstü değerler pozitiftir. Pozitif sonuç donor spesifik HLA Class I ve/veya Class II IgG yapısındaki antikorların varlığına işaret eder. Ölçülen OD değerleri antikor DSA titresi ile doğru orantılıdır. Pozitif sonuç klinik olarak risk faktörü kabul olarak edilmelidir.(kontraendikasyon değildir). Yöntem üreticilerin geliştirdiği analizör ile de çalışılarak değerlendirilebilmektedir.. 19

Pozitif sonuç donor spesifik HLA Class I ve/veya Class II IgG yapısındaki antikorların varlığına işaret eder.

20 Presizyon Değerleri: Class I Pozitif Sonuçlar Levey-Jennings kontrol grafiği 20

21 Presizyon Değerleri: Class I Negatif Değerler 21

22 ELISA Crossmatch Yönteminin Avantajları Canlı hücre ve kompleman gerektirmez. Değerlendirme objektiftir ve ölçüme dayanır. Standardize bir yöntemdir, test sonuçları tekrarlanabilir, öncekilerle kıyaslanabilir. Test sonucu elde ölçülen optik dansite değerleri var olan DSA titresini yarı kantitatif olarak verir. 22

23 ELISA Crossmatch Dezavatajları Ön işlemler zaman alıcı ve toplam çalışma süresi diğer yöntemlere kıyasla daha uzundur. Fonksiyonel bir yöntem değildir. Non-HLA ve IgM yapısındaki DSA antikorları göstermez. Test sırasında donor HLA moleküllerinde denatürayon ve bükülme sonuçları etkileyebilir. Klinik sonuçları açısından yeterli gözlem ve deneyim bulunmamaktadır. 23

24 TESTİN YORUMLANMASINDA DİKKATE ALINMASI GEREKEN NOKTALAR Aynı hastanın diğer antikor test sonuçları ile tutarlı olmalıdır, Allo-immünizasyon (re-trans, eş ve çocuktan anneye, PRA ve/veya XM pozitifliği, önceki transplantasyonlardaki HLA uyumsuzlukları) Cross-reaktivite, Proinflamatuar. HLA-moleküllerinde denaturasyon (yalancı pozitiflik, yalancı negatiflik) İnterferanslar sonuçları etkileyebilir. 24

25 DENATÜRASYON SF tutunan HLA molekülleri bükülmesi iki risk taşır; 1-Yalancı pozitiflik Denatüre antigenler üzerindeki epitoplar klinik olarak anlamsız olabilir. 2-Yalancı negatiflik Var olan HLA antikorları bükülmüş HLA molekülüne tutunamaz. 25

26 SOLİD FAZ YÖNTEMLERDE İNTERFERANS İki grup madde reaksiyonun gücünü azaltabilir veya arttırabilir. 1-Serumda doğal olarak bulunan maddelerle interferanslar; IgM ve immün kompleksler C1 HLA-E (HLA sınıf-i molekülleri ile çapraz reaksiyon) 2-Eksojen kaynaklı maddelerle interferanslar; -IVIG -ATG -Protezom İnhibitorleri ( bortezomib, eculizumab) -C5 inhibitor 26

27 İNTERFERANSIN KANITLARI NC de yüksek reaktivite, PC de düşük reaktivite, Özel tedavi veya bir immün olay olmadığı halde, aynı hastaya ait ardışık örneklerde, reaktivitede ani değişiklikler, Test sonuçlarının CDC ve FCXM test sonuçları ile uzlaşmaması, Oto- reaktivite. 27

28 CROSSMATCH TEMELİNDE ANTİKOR ARACILI RED VEYA ERKEN GRAFT KAYBININ DEĞERLENDİRİLMESİ CDC crossmatch testlerinde donör reaktif, anti-hla IgG antikorların varlığı YüKSEK RİSK kategorisindedir. Hastanın geçmişinde CDC crossmatch testlerinde pozitiflik saptanmış olması orta derecede risk olarak değerlendirilir. 28

29 29

30 30

31 Organ Transplantasyonunda Antikor Tarama ve Crossmatch Yöntemleri (Trait ve ark.transplantation 2013) Yöntem TX öncesi tarama TX öncesi XM Yorum TX sonrası Yorum CDC/CDC modifiye HAR veya erken AMR u önler -/+ Donor hücresi gereklidir FC/FC modifiye HAR veya erken AMR u önler + Donor hücresi gereklidir ELISA tarama HLA antikorlarını saptar -/ + Duyarlı olmayan hastalarda Yararlı ELISA tanımlama HLA antikorlarını tanımlar ++ Antikor düzeyini belirler LUMUNEX Tarama HLA antikorlarını saptar -/+ Duyarlılığı düşük LUMUNEX Tanımlama LUMUNEX SAB HLA antikorlarını tanımlar ++ Duyarlılığı düşük HLA antikorlarını kapsamlı olarak tanımlar +++ Lokus ve allel spesifik 31

32 Organ Transplantasyon Türüne Göre Antikor Tarama ve Crossmatch Yöntemleri (Tait ve ark. Transplantasyon 2013) Organ TX öncesi tarama Genel Yöntemler İlave Yöntem (SPI-SAB) XM Yorum Böbrek +++ SPI+CDC/FC Tüm hastalar CDC/FC/vXM HAR veya AMR u önler Kalp +++ SPI+CDC/FC Tüm hastalar CDC/FC/vXM HAR veya AMRu önler Akciğer +++ SPI+CDC/FC Tüm hastalar CDC/FC/vXM HAR veya AMR nun önleme Karaciğer + SPI+CDC/FC Pankreas/ adacık +++ SPI+CDC/FC Tüm hastalar CDC/FC/vXM HAR veya AMR nun önleme Barsak +++ SPI+CDC/FC Tüm hastalar CDC/FC/vXM HAR veya AMR nun önleme 32

33 Gerek canlı gerekse kadavral nakillerde organ; -En iyi HLA uyumu -XM negatif veya vxm negatif olan adaylara nakledilmeli. Nakil sonrası dönemede antikor takibi; Alıcının humoral yanıtını izlemek İmmünsüppresif tedavinin optimizasyonu. 33

34 Teşekkürler

Benzer belgeler

Anti-HLA Antikorlar ve Transplantasyon

Anti-HLA Antikorlar ve Transplantasyon ne zaman, ne yapmalı? Prof.Dr. Ali ŞENGÜL Medicalpark Antalya Hastane Kompleksi İmmünoloji bölümü Anti-HLA Ab Oluşumu Gebelik Transfüzyon Transplantasyon İyi HLA