Genital Chlamydial İnfeksiyonlarda Polimeraz Zincir Reaksiyon (PCR) unun Tanı Değeri

Genital Chlamydial İnfeksiyonlarda Polimeraz Zincir Reaksiyon (PCR) unun Tanı Değeri Meral ÜRÜNSAK*, Erol AKAN*, Mehmet S. SERİN*, İbrahim ÜRÜNSAK**, Hüseyin ÖKSÜZ*, Fatih KÖKSAL* * Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı ** Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, ADANA ÖZET Bu çal flma Chlamydial endoservikal infeksiyonlar n tan s nda indirekt ve direkt EIA (Enzym Immunosorbent Assay) ile 16S rrna-pcr' n (PCR: Polimeraz Zincir Reaksiyon) tan de erini karfl laflt rmak amac yla yap lm flt r. Endoservikal flikayeti sebebiyle jinekoloji poliklini ine baflvuran 186 kad ndan al nan toplam 372 endoservikal sürüntü ile 186 serum örne i çal flmaya dahil edilmifltir. Endoservikal örneklerin 32 sinde (%18) PCR ile, 28 inde (%15) ise EIA yöntemi C. trachomatis tespit edildi. Ancak örneklerin 33 ü (%17.7) kullan lan metodlardan en az biri ile pozitifti. Serum örneklerinin 48 inde (%25.8) pozitif cevap ald k. Bu bulgular C. trachomatis in tan s nda PCR' n (%96.9) EIA dan (%84.8) daha duyarl (%97-%75) oldu unu göstermektedir. Anahtar Kelimeler : C. trachomatis, PCR, 16S rrna SUMMARY The Diagnostic Value of Polimerase Chain Reaction (PCR) in Genital Chlamydial Infections This study was performed to compare the PCR 16S rrna with direct and indirect EIA (immünosorbent assay) methods in the diagnosis of endocervical Chlamydial infection. From 186 women attending to the out patients gynecology clinic for endocervical disease, a total of 372 endocervical samples and 186 sera samples were collected. C. trachomatis were found in 32 (17.2%) of endocervical samples by PCR and in 28 (15%) of samples by EIA. Thirty-three (17.7%) of the samples were positive by at least one used method. Serum antibody responses were confirmed in 48 (25.8%) of all sera samples by indirect EIA. These data suggests that PCR is more sensitive (96.9%) than EIA for (84.8%) detection C. trachomatis in endocervical specimens. Key Words : C. trachomatis, PCR, 16S rrna Flora 1997;4:273-277 273

Ürünsak M, Akan E, Serin MS, Genital Chlamydial İnfeksiyonlarda PCR'ın Tanı Değeri GİRİŞ C.trachomatis cinsel yolla buluşan hastalıkların en önemli etkenlerinden birisidir. Özellikle D-K serotipleri kadınlarda sıklıkla üretrit, servisit, endometrit, salpinjit ve pelvisin iltihabi hastalıklarına sebep olurlar. Kronik infeksiyonlar veya sık tekrarlayan reaktivasyon ve reinfeksiyonlar ile tubal oklüzyona bağlı olarak gelişen infertilite ve servikal neoplaziler gibi ciddi irreversible komplikasyonlara yol açabilir (1,2). Bu sebeple C. trachomatis in yol açtığı genital infeksiyonlarda erken tanı ve tedavi son derece önemlidir. Ancak, infeksiyonların büyük bir kısmının asemptomatik oluşu veya spesifik semptomların olmayışı tanının klinik bulgulardan çok laboratuvar sonuçları üzerine kurulmasına yol açmaktadır. Klasik laboratuvar tansında ya örneklerdeki C. trachomatis in (3,4) hücre kültürlerinde üretilmesi gibi izolasyon bazlı veya örneklerdeki Chlamydial antijenlerin gösterilmesi amacıyla floresan veya enzim konjuge antikorların kullanıldığı, direkt floresan antikor (DFA) ve enzim immonosorbent assay (EIA) gibi immünolojik bazı tanı yöntemleri kullanılmaktadır (2,5-8). Bu tekniklerin spesifiteleri %100 e kadar çıkmasına rağmen sensitiviteleri çok tecrübeli laboratuvarlarda bile %65-95 oranlarında kalmıştır (5,9,10). Hasta serumlarındaki spesifik antikor cevabının araştırıldığı serolojik testler de oldukça düşük spesifite ve sensitivite sergiledikleri için daha çok epidemiyolojik amaçlı olarak kullanılmışlardır. Son yıllarda klasik tanı yöntemlerine alternatif olarak moleküler biyolojik bazlı gen-prob hibridizasyon, PCR ve LCR gibi teknikler kullanılmaya başlanmış, gen prob tekniğinin sensitivitesi klasik metodların üzerine çıkamamıştır (6,10). Oysa üretral ve endoservikal akıntı veya sürüntü örnekleri ile idrar ve sinoviyal sıvı gibi her türlü klinik örnekte uygulanabilen PCR ve LCR yöntemi ile klasik yöntemlere göre çok daha sensitif ve spesifik sonuçlar alınmaktadır (4,5,9,11-13). C. trachomatis e ait 75 kb lik plazmid DNA sı ile genomik DNA daki major dış membran proteinini (MOMP) kodlayan OMP-1 geni, rrna yı kodlayan 16S rrna geni ve sisteinden zengin proteinleri kodlayan gen bölgelerindeki spesifik DNA parçalarının amplifikasyonunu hedefleyen bu yöntemlerle klinik örnekteki 1 fgr-10 pgr hedef DNA yı bir başka ifade ile 0.1-1 ifu Chlamydial cisimciği tespit edebilmek mümkündür (2,6,9,14,12). Bu çalışmada endoservikal örneklerde 16S rrna genini hedef alan primerlerin kullanıldığı PCR yönteminin, Chlamydial antijenlerin tespiti amacı ile kullanılan EIA testine göre tanı değerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Ayrıca Chlamydial genital kolonilazyon ile anti-chlamydial antikor cevabı arasındaki pozitif korelasyon oranı incelenmiştir. MATERYAL ve METOD Çalışmaya Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı na endoservikal akıntı, genital kaşıntı ve yanma şikayetleri ile başvuran servisit tanısı konmuş 186 kadına ait endoservikal akıntı ve venöz kan örnekleri dahil edildi. Endoservitisten birisi EIA diğeri de PCR yöntemi ile değerlendirilmek üzere çift eküvyon yardımı ile örnek alındı. Chlamydial antijenlerin tespiti için kullanılan EIA, Scholl-Diagnostik-(FCHL- 100), firması tarafından ticari olarak sağlandı. PCR yönteminde C. trachomatis in 16S rrna genine ait 398 bp lik spesifik parçayı hedef alan primerler kullanıldı. Hasta serumlarındaki anti-c. trachomatis IgG türü antikorlar da EIA (Eurogenetics) metodu ile değerlendirildi. EIA testleri üretici firma uyarıları dikkate alınarak çalışıldı. PCR yöntemi üç aşamada gerçekleştirildi: 1- DNA nın ekstraksiyonu: 16S rrna-pcr yöntemi ile değerlendirilecek olan sürüntü örnekleri 400 µl distile su (DS) içersine alınarak değerlendirilene kadar -20 C de saklandı. Çalışmanın başlangıcında 13.000 x g de 10 dk santrifüj edilen örneklerden üstteki sıvı uzaklaştırıldıktan sonra çökelti DNA ekstraksiyon için içerisinde proteinaz-k bulunan 400 µl tamponda süspanse edildi. Presipitasyonda fenol kloroform ve soğuk etanol yöntemi uygulandı. Presipitant 200 µl jelatinsiz PCR tamponu (10 mm Tris-HCl.pH 8.8, 50 mm KCI, 2.5 mm MgCl 2 ) içinde tekrar süspanse edildi. 2- Amplifikasyon: Jelatinsiz PCR tamponu ile sulandırılan her örnekten 10 mikrolitre alınarak içerisinde PCR çalışma tamponu bulunan 0.5 ml lik epondorf tüplerine aktarıldı. PCR çalışma tamponu 10 mm Tris-HCL ph 8.8, 50 mm KCl, 2.5 mm MgCl 2, 0.2 mm dntpmix, 25 pmol P1 (5-'GA- AGGCGGTTAATACCCGCTG-3'), 25 pmol P2 (5'- GATGGGGGTTGAGACCATCC-3') PCR çalışma tamponu primerler, 2 Ü Taq polimerazdan oluşturuldu. Karışım MJ research (PTC-150) tipi mini termal Cycler cihazında denatürasyon için 94 C de 1 dakika, annealing için 42 C de 2 dakika ve elongasyon için 74 C de 3 dakika bekletildi. Bu siklus 35 kez tekrarlandı. 3- Amplifikasyonun tespiti: Amplifikasyon ürünleri %2 agaroz jelde yürütüldü. Jel etidyum bromid ile boyanarak UV-transiliminatöründe incelendi. 274 Flora 1997;4:273-277

Genital Chlamydial İnfeksiyonlarda PCR'ın Tanı Değeri Ürünsak M, Akan E, Serin MS, Molekül ağırlığı hesaplamalarında Øx174/hinfI DNA marker'ı kullanıldı. BULGULAR Chlamydial endoservikal infeksiyonlarda 16S rrna-pcr yönteminin endoservikal örneklerdeki Chlamydial antijenleri tesbite yönelik hazırlanmış EIA yöntemine göre tanı değerini tesbit amacı ile planlanan çalışmada değerlendirilen 186 klinik örnekten 33 ünde (%17.7) en az bir yöntemle genital Chlamydial kolonizasyonun varlığı tesbit edilmiştir. Bu örneklerden 27 si (%84.3) hem 16S rrna PCR hem de EIA yöntemi ile pozitif bulunmuştur. Böylece en az iki yöntemle pozitif bulunan 33 olguya ait örnek referans olarak alındığında PCR'ın 32 (%97) örnekte pozitif olduğu ve sensitivitesinin %97 ye ulaştığı buna karşılık 28 örnekte pozitif sonuç elde edilen EIA nın sensitivitesinin de %84.6 olarak tesbit edildiği görülmüştür. Ayrıca yine en az bir yöntemle antijen pozitif olgularda 28 örneklik 21-39 yaş grubunda yoğunlaştıkları görülmüştür (Tablo 1). Genital kolonizasyon ile anti-chlamydial immün cevap arasındaki ilişkiyi tesbit amacıyla hastalardan elde edilen serum örneklerinin anti-chlamydial IgG yönünden değerlendirilmesi sonucu 48 (%25.8) örneğin seropozitif olduğu görülmüştür. Seropozitif olguların sadece 16 sında (%45) PCR ve/veya EIA yöntemi ile genital Chlamydial kolonizasyon tesbit edilmiştir (Tablo 2). Her üç test sonuçlarının yaş gruplarına göre karşılaştırmalı değerlendirilmesi yapıldığında endoservikal örneklerde Chlamydial kolonizasyon tesbit edilemeyen seropozitif olguların 40> yaş grubunda %30 luk bir oranla yoğunlaşmalarına karşılık antijen ve antikor pozitif 16 olgunun 13 ünün 21-39 yaş grubunda yer aldığı görülmüştür (Tablo 2). TARTIŞMA C. trachomatis infeksiyonlarının tanısında uzun süre hücre kültüründe izolasyon yöntemi altın standart olarak kabul edilmiş ve bu amaçla McCoy Hela 229, Hep-2, MCI-H-292 ve WI 38 gibi hücre dizileri kullanılmıştır. Ancak %100 spesifiteye sahip olan bu yöntemin sensitivitesi yapılan çeşitli çalışmalarda %60-85 oranları arasında bildirilmiştir (3,7,10,12,15,16). Klinik örneklerde Chlamydial ci- Tablo 1. Endoservikal Örneklerde EIA ve PCR Yöntemi ile Chlamydia trachomatis Antijeni ve/veya 16S rrna Genomu Pozitif Bulunan Örneklerin Yaş Grubuna Göre Dağılımı. Yaş Grupları Çalışma < 20 21-39 40 > Toplam grubu Sayı % Sayı % Sayı % Sayı % EIA - - 1 0.77 - - 1 0.5 PCR - - 4 3.1 1 5 5 27 EIA+PCR 3 8.3 23 17.7 1 5 27 15 Toplam 3 8.3 28 21.6 2 10 33 38.06 Tablo 2. C. trachomatis Anti-IgG Seropozitif 48 Kadının EIA ve 16S rrna Sonuçlarının Korelasyonu. Yaş Grupları Çalışma < 20 21-39 40 > Toplam grubu Sayı % Sayı % Sayı % Sayı % Antijen (-) 5 13.9 21 16.2 6 30 32 17.2 Antijen (+) PCR - - 2 1.5 1 5 3 1.6 ELISA - - - - - - - - PCR+ELISA 2 5.6 11 8.5 - - 13 7 Toplam 7 19.5 34 26.2 7 35 48 25.9 Flora 1997;4:273-277 275

Ürünsak M, Akan E, Serin MS, Genital Chlamydial İnfeksiyonlarda PCR'ın Tanı Değeri simcikleri tespite yönelik EIA testi için sensitivite oranları %58.2-92, DFA için de %90-98 arasında bulunmuştur (7,12). Chlamydial kriptik plazmid ile genomik DNA daki OMP-1 ve 16S rrna geni üzerindeki spesifik dizileri hedef alan pirimerlerin kullanıldığı PCR yöntemleri ile Chlamydial tanıda sensitivite %92-98 oranlarına çıkmıştır. Amplifikasyonda hedef DNA nın ve kullanılan primerlerin uzunluğu, G-C miktarı 3 terminal uç, annealing ısısı, ortamdaki MgCl 2 dntp ve Taq polimeraz enzim konsantrasyonları gibi faktörlere bağlı olarak değişebilen sensitivite oranlarında belirleyici faktörün hedef dizi ve bu dizinin bir cisimcikteki kopya adedi olduğu bildirilmiştir. Bu sebeple bir cisimcikte 7-10 kopyası olan kriptik plazmidi hedef alan PCR yöntemleri genomda 2-3 kopyası bulunan 16S rrna ve tek kopyaya sahip olan OMP1 gen dizilerini hedef alan PCR yöntemlerinden daha sensitif bulunmuştur. Ancak bazı suşların infeksiyonların seyri süresince plazmidi yitirmesi veya plazmid taşımayan suşların bulunması ihtimali nedeni ile plazmid bazlı PCR çalışmalarında yalancı negatif sonuçların görülebileceği belirtilmiştir (6,14,15). Buna karşılık tek kopyaya sahip OMP-1 genini hedef alan PCR çalışmalarının sensitiviteleri kadar, kullanılan primerlerin bazı insan hücre DNA dizileri ile nonspesifik olarak bağlanabildikleri ve agaroz jelde farklı baz uzunluğuna sahip back-ground bandların ortaya çıkabileceği, bunlarında spesifikliği düşürdüğü bildirilmiştir (6). Buna karşılık genomda 2-3 kopyaya sahip oluşu, tedavi sonrası hücre kültürü ve DFA yöntemleri ile eş zamanlı olarak negatifleşmesi nedeni ile 16S rrna-pcr yönteminin arzu edilen sensitiviteye yakın ve prognostik önemi olan bir yöntem olduğu ileri sürülmüştür. Biz endoservikal infeksiyon klinik tanısı almış 186 kadına ait sürüntü örneklerinin 33 ünde 16S rrna-pcr ve/veya EIA ile Chlamydial kolonizasyon tespit ettik. Bu olgu sayısını ölçü olarak aldığımızda, 32 olguda pozitif sonuç veren 16S rrna- PCR'ın %1 oranla 28 olguda pozitif olan EIA'ın % oranına göre daha yüksek sensitivite sergilediğini tespit ettik. 16SrRNA-PCR yöntemi ile elde ettiğimiz sensitivite oranı bizimle aynı yöntemi kullanın Looffelhola, Mahony ve Thomas BJ nin %100, %78.5 ve %100 lük sensitivite oranları içindedir. Yine bu gruplar EIA için sensitivite oranlarını sırası ile %58.8, %67.8 ve %92 olarak belirtmişlerdir. EIA için verilen sensitivite sonuçları kullanılan antikorların mono veya poliklonal oluşu, kullanılan enzim substrat sisteminin sensitivitesi ve örneğin alınış yöntemi gibi faktörlere bağlı olarak oldukça farklı oranlar göstermektedir. Bizim EIA sensitivite oranımız da literatür oranları içerisindedir. Ancak, Chlamydial kolonizasyon, Chlamydial immünoloji ve Chlamydial patoloji arasındaki ilişki Chlamydial infeksiyon hastalıklar için gerçek standartların yaratılmasını güçleştirmektedir. Bilindiği gibi primer infeksiyonlarda veya takip eden 2.-3. ataklarda infeksiyon bölgesinden alınan örneklerde Chlamydial cisimcikleri göstermek veya izole etmek mümkün iken sık tekrarlayan reinfeksiyon veya reaktivasyonlarda Chlamydiaların tespit oranı azalmaktadır. Klinik tablo trahom, infertilite ve neoplaziler gibi ciddi komplikasyonlara doğru yönelse bile Chlamydialar lezyondan alınan örnekte tespit edilememektedir. Bu hastalarda tek pozitif bulgu sıklıkla hasta serumunda tespit edilen güçlü antikor cevabı olmaktadır. İleri yaş grublarında artan antikor cevabına rağmen düşük izolasyon veya kolonizasyon bulgu oranlarının nedenide budur. Nitekim bizim 21-39 yaş grubunda 16SrRNA-PCR ve EIA ile pozitif bulduğumuz olgu sayımız yoğunluğu oluştururken seropozitif ancak antijen negatif olgu yoğunluğumuz 40 üzerindeki yaş grubunda görülmüştür. Sonuç olarak antijen tespitine yönelik izolasyon, DFA, EIA ve PCR sonuçları Chlamydial kolonizasyonu veya infeksiyonu belirlemede birbirlerine göre üstünlükleri yönünden tartışılabilir. Ancak elde edilen sonuç her zaman gerçek Chlamydial infeksiyon hastalık oranını yansıtmayabilir. Buna karşılık Chlamydial infeksiyon hastalığın immünopatolojik esaslı olduğu gerçeğinden hareket edilirse hastada oluşan antikor cevabının kinetiği indirekt bir yöntem olmakla birlikte serolojik testlere değer kazandırır (17). Bizim sonuçlarımız 16S rrna-pcr yönteminin genital Chlamydial kolonizasyonu tespitte %97 lik oranla EIA nın %84 lük oranına göre daha sensitif olduğunu ve Chlamydial genital kolonizasyon ile antikor cevabı arasında %45 lik oranında bir uyum olduğunu göstermiştir. KAYNAKLAR 1. Patton DL, Wolner Hanssen P, Zeng W, et al. The role of spermatozoa in the pathogenesis of Chamydia trachomatis salpingitis in a primate model. Sexually Transmitted Dis 1993;20(4):214-9. 2. Viseidi Raphael P, Bobo L, Edward W, et al. Transmission of Chlamydia trachomatis among sex partners assessed by polymerase chain reaction. Infect Dis 1993;168:488-92. 3. Loeffelholz MJ, Lewinski CA, Silver SR,et al. Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens by PCR.Clin Microbiol 1992;30(11):2847-51. 4. Lucotte G, Petit MC, Francois MH, et al. Detection of Chlamydia trachomatis by use of PCR, Mol Cell Probes 1992;6(2):89-92. 276 Flora 1997;4:273-277

Genital Chlamydial İnfeksiyonlarda PCR'ın Tanı Değeri Ürünsak M, Akan E, Serin MS, 5. An QI, Gail R, Rosemary V, et al. Infection with a plasmid free voriant Chlamydia releated to Chlamydia trachomatis identified by using muptiple assays for nucleic acid detection. Clin Microbiol 1992;30:2814-21. 6. Roossendaal R, Walboomers JMM, Veltman OR, et al. Comparison of different primer sets for detection of Chlamydia trachomatis by the polymerase chain reaction. J Med Microbiol 1993;38:426-33. 7. Thomas BJ, Leod EJ, Robinson DT. Evaluation of sensivity of 10 diagnostic assays for Chlamydia trachomatis by use of a simple laboratory procedure. J Clin Pathol 1993;46:408-10. 8. Williams TW, Tyler SD, Gierche S, Pollard DR, McNicol P, Rozee KR. Comporison of polymerase chain reaction and chlamydial enzyme for the detection of Chlamydia trachomatis in clinical specimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1992;11(3):233-6. 9. Taylor R, Gilroy CB, Thomas BJ, et al. Detection of Chlamydia trachomatis DNA in joints of reactive arthritis patients by Polymerase Chain Reaction. Lancet 1992;340:81-2. 10. Roulston JE, Davis CH, Schmiel DH. Molecular characterization and outer membrane association of a chlamydia protein releted to the hsp 70 family of proteins. J Biological Chemistry 1993; 268(31):23139-47. 11. Gilroy CB, Thomas BJ, Taylor RD. Small numbers of Chlamydia trachomatis elementary bodies on slides detected by the polimerase chain reaction. J Clin Pathol 1992;45(6):531-2. 12. Palmer HM, Gilroy CB, Thomas BJ, et al. Detection of C. trachomatis by the Polymerase Chain Reaction in swabs and urine from men with non-gonococcal urethritis. J Clin Pathol 1991;44:321-5. 13. John W, Sellors MD, Jomes D, et al. Screenning uriner with a Leukocyte esterase strip and subsequent Chamydial testing of asemptomatic men attending primary care practitioners. Sexually Transmitted Dis 1993;152-7. 14. Lan j, Walboomers J.M.M, Roosendaal R, et al. Direct Detection and Genotyping of Chlamydia trachomatis in Cervical Scrapes by Using Polymerase Chain Reaction and Restriction Fragment Lenght Polymorphism Analysis. J Clin Microbiol 1993;31(5):1060-5. 15. Mahony JB, Luinstra KE, Sellors JW, et al. Comparison of plasmid-and Chromosome-Based Polymerase Chain reaction assays for detecting Chlamydia trachomatis nucleic acids. J Clin Microbiol 1993;31(7):1753-8. 16. Jaschek J, Charlatte A, Goydos LE, et al. Direct detection of Chlamydia trachomatis in Urine specimens from symptomatic and asymptomatic men by using a rapid polymerase chain reaction assay. J Clin Microbiol 1993;31(5):1209-12. 17. Köksal F. Chlamydial immünoloji. Arşiv, 1994; 3(3):273-84. Yazışma Adresi: Prof. Dr. Fatih KÖKSAL Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Balcalı - ADANA Makalenin Geliş Tarihi: 09.03.1997 Kabul Tarihi: 05.08.1997 Flora 1997;4:273-277 277