HERBİSİTLERE DAYANIKLI TRANSGENİK BİTKİLERİN GELİŞTİRİLMESİ ÖZGE ÇELİK HALİÇ ÜNİVERSİTESİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK BÖLÜMÜ
Kültür bitkilerinde Hastalık Hayvansal zararlılar gibi çeşitli etmenlerin meydana getirdiği ürün kayıpları ele alındığında yabancı otların etkisinin en yüksek seviyede olduğu gözlenmektedir.
Dünya bazında yabancı ot ve hastalık etmenlerinin oluşturduğu kayıplar (milyon ton) Ürün çeşidi Elde edilen ürün Yabancı ot kayıpları Hastalık kayıpları Hububat 433.903 54.349 50.589 Sebzeler 201.691 23.718 31.137 Meyveler 66.567 2.462 12.825 Bağlar 50.697 7.909 16.937
Başlıca amaç, yabancı otların oluşturdukları olumsuz etkileri ekonomik zarar seviyesinin altında tutmaktır. Yabancı ot mücadelesinde kulanılan başlıca yöntemler Mekanik savaş yöntemleri: Çapalama, elle yolma, toprak işleme ve su altında bırakma Fiziksel savaş yöntemleri: Isı ve ışınlardan yararlanma Biyolojik savaş yöntemleri: Bir canlı populasyonunu, bakteriler, böcekler, balıklar ve mantarlar gibi diğer canlı organizmalar aracılığıyla azaltmak için kullanılan yöntemler Kimyasal savaş yöntemleri: Sentetik veya doğal yabancı ot öldürücüler (herbisitler) kullanılarak yürütülen mücadele yöntemleri
Herbisit olarak kullanılan bir kimyasalın ticari açıdan herbisit olarak nitelendirilebilmesi için şu faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. Geniş bir yabancı ot populasyonuna karşı etkin olması Kültür bitkisine, memelilere ve omurgasız canlılara karşı toksik etki göstermemesi Toprakta kalıcılığının kısa olması Üretim maliyetinin düşük olması
Herbisitler, hedef olan bitkiye zarar verdiklerinden dolayı, bitki üzerinden beslenen ve barınan tün canlıları olumsuz etkilemektedirler. Herbisitler genellikle bitkilere özgün biyokimyasal yoları etkilerler (örn: fotosentez aktivitesi). Bunun dışında değişik etki mekanizmaları olan farklı grup herbisitler mevcuttur.
Herbisitlerin Etken Maddeleri ve Etki Mekanizmaları Etkili Madde Etkilediği Sistem Hedef Protein Sulfonilurea Alifatik aminoasit sentezi Asetolaktat sentaz Imidazolinon Alifatik aminoasit sentezi Asetolaktat sentaz Gliosat Aromatik aminoasit sentezi 5-enolpürivil-şikimat-3- fosfat sentaz (EPSPS) Phosfinotrisin (PPT) Glutamin sentezi Glutamin sentaz Triazin Fotosistem II Q B proteini Bromoxinil Fotosistem III Q B proteini Bipiridilumlar Fotosistem I Ferrodoksin Fenoksiasetik asitler (2,4-D)?? Dinitroanilinler Hücre bölünmesi Tübülin Bipiridilumlar, paraquat, diquat Fotosistem I Elektron transfer sistemi
Kullanılan herbisitin yabancı otlara maksimum zararı verirken, kültür bitkisini ise minimum seviyede etkilemesi istenmektedir. Kültür bitkilerine herbisitlere karşı dayanıklılık kazandırılması yönünde yapılan çalışmalarda başlıca 3 değişik strateji izlenilmektedir. 1)Hedef molekülün modifikasyonu 2)Hedef molekülün fazla üretimi 3)Etken maddenin detoksifikasyonu
İlk ikisinde herbisitin etkilediği hedef molekülün aktif maddeden korunmasına yönelik olup, son stratejide ise aktif maddenin farklı bir bileşiğe çevrilerek etkenliğinin ortadan kaldırılması amaçlanmaktadır.
Hedef Molekülün Modifikasyonu Hedef genin kültür bitkisinden izolasyonu Hedef genin maniplasyonu Maniplasyonu yapılan genin, gen aktarım vektörlerine klonlanması Vektör aracılığıyla hedef genin bitki hücrelerine aktarımı Transgenik bitkilerin rejenerasyonu ve seçimi
HEDEF MOLEKÜLÜN FAZLA ÜRETİMİ Herbisite dayanıklı organizmanın belirlenmesi Hedef genin bu organizmadan izolasyonu Hedef genin gen aktarım vektörlerine klonlanması Vektör aracılığıyla hedef genin bitki hücrelerine aktarımı Transgenik bitkilerin rejenerasyonu ve seçimi
Bu strateji kullanılarak ALS genleri ile sulfonilurea tipi herbisitlere dayanıklı transgenik bitkiler geliştirilerek tarla denemeleri yapılmıştır (Brande ve Miki, 1993). Aynı strateji fotosistem II Q B proteinini etkileyen triazin tipi herbisitler için de uygulanmıştır. Triazine dayanıklı yabancı otlardan ve syanobakterilerden izole edilen psba geni tütüne aktarılarak atrazine dayanıklı bitkiler elde edilmiştir (Smeda ve ark., 193).
Farklı bir uygulama, memelilerde ilaçları metabolize eden P450 monooksigenaz enziminin sentezinden sorumlu genin tütüne aktarılması ile herbisite dayanıklılık kazandırılmasıdır. Son uygulanan strateji ise hedef molekülün yapısı, aktarılan sentetik RNA/DNA molekülleri ile değiştirilmektedir. Bu strateji kullanılarak immidazolün bazlı herbisitlere dayanıklı transgenik mısır bitkileri geliştirilmiştir.
İkinci stratejide, bitkilerdeki hedef molekül bazı genetik maniplasyonlar sonucu daha fazla üretilmektedir. Böylece, herbisit aktif maddesinin varlığında bile hedef molekülün sorumlu olduğu hücresel fonksiyonlar yerine getirilebilmektedir. Bu yöntemle petunyada yapılan çalışmada EPSPS aktivitesi 20 kez arttırılarak glifosata tolerans sağlanmıştır. Darıdan izole edilen EPSPS geni buğdaya aktarılarak elde edilen kallus dokusunun glifosata dayanıklılık gösterdiği bildirilmiştir.
Son strateji ise, bitkiye herbisitin aktif maddesini detoksifiye eden yeni bir enzim sentezlettirilmesidir. Bu amaçla, detoksifikasyon yapan enzimin sentezinden sorumlu gen bitkilere aktarılmakta, bu sayede de herbisitin aktif maddesi hedef molekülü etkileyemeyen bir bileşiğe çevrilmekte, dolayısıyla molekül de herbisitin varlığında bile normal hücresel işlevini yürütebilmektedir. Bitkilere 2,4-D detoksifikasyonunu mümkün kılan bakteri orijinli monooksigenaz enzimi sentezlettirilerek bu herbisite dayanıklı tütün ve pamuk bitkileri geliştirilmiştir (Lyon ve ark., 1989).
Gram pozitif toprak bakterileri olan Streptomyces hyproscopicus ve Strepromyces viridochromogenos suşları fosfonotrisil-alanil-alanin yapısında bir tripeptid üretir. Bu bileşik Bialafos adında bir antibiyotiktir. Bialafos, hücre içinde peptidaz aktivitesi ile hidrolizi sonucu ortaya çıkan fosfinotrisin (PPT), glutamin aminoasidinin bir analoğu olup aminoasit biyosentezinde rol alan glutamin sentetaz (GS) enziminin rakip inhibitörüdür. PPT, bakteri, bitki ve hayvan hücrelerinde GS enzimlerini inhibe edebilir ve bu nedenle etkili bir herbisit olarak kullanılmaktadır.
GS enzimi, glutamik asit ile amonyumun tepkimeye girerek glutamini oluşturduğu tepkimeyi katalizleyen bir enzimdir. Bitkilerde GS enzimi, nitratın indirgenmesi, aminoasit degradasyonu ve fotorespirasyon sonucu ortaya çıkan NH 4* nın asimilasyonunu sağlayan tek enzimdir GS aktivitesi durduğunda hücrelerde NH4* birikimi gözlenmekte ve bu da hücrelerde dolayısıyla bitki üzerinde kısa sürede ölümcül etki yapmaktadır.
PPT, toprak bakterileri tarafından metabolize edilebildiğinden çevrede yaratabileceği toksik etkiler minimal seviyede kalmaktadır.
PPT ye DAYANIKLI TRANSGENİK BİTKİ GELİŞTİRİLMESİ PPT nin kontrakt etkili total herbisit olması, yani seçiciliğinin olmaması yaygın olarak kullanımını etkileyen en önemli faktördür. Bu nedenle PPT ye dayanıklılık gösteren kültür bitkilerinin geliştirilmesi yönünde birçok çalışma gösterir. 1)GS enziminin miktarının arttırılması 2)PPT nin hücre içindeki detoksifikasyonunun sağlanması
Bialafos, Streptomyces hyproscopicus ve Strepromyces viridochromogenos suşları tarafından üretilmektedir. Bu suşlarda, PPT nin biyokimyasal sentez yolları detaylı olarak incelenmiştir. Biyosentezin 10. kademesindeki enzim, hem biyosentezin devamını sağlamakta hem de PPT yi asetilasyon youyla etkisiz hale getirmektedir. Bu suşlar kendilerini ürettikleri antibiyotiğin öldürücü etkisinden korunmak amacıyla PPT detoksifikasyonunu mümkün kılan fosfinotrisin N-asetiltransferaz (PAT) enzimini sentezlenmektedir. PAT enziminin sentezinden sorumlu olan bar ve pat genleri sırası S. hyperuscipicus ve S. nhardocchromogenes suşlarından izole ve karakterize edilmişlerdir.
Her 2 gen aminoasit dizileri açısından %85, nükleotid dizileri seviyesinde ise %87 homoloji göstermekte, 183 aminoasitlik proteinler sentezlemekte ve PPT yi asetile edebilmektedirler. Bar geninden sentezlenen PAT enzimi, 22-23 kda ağırlığında bir enzimdir.
GEN AKTARIM ÇALIŞMALARI PPT ye dayanıklı transgenik bitki eldesinde pat geni ile karşılaştırıldığında bar geni daha çok çalışma yapılmaktadır. Hedef bitkilere bar geni aktarılmakta ve üretilen transgenik çeşitler PPT yi detoksifiye eden BAR enzimini sentezleyebildiklerinden dolayı, herbisite maruz kaldıklarında PPT den etkilenmemektedirler.
Bugüne kadar PPT ye dayanıklı tütün, domates, patates, şeker pancarı, buğday, A.thaliana, çeltik, mısır, arpa, bezelye ve karanfil elde edilmiştir. Farklı gen aktarım yöntemleri kullanılmakta ve farklı promotör ve terminatör bölgeleri kullanılmıştır. Genellikle kullanılan promotörler, karnabahar mozaik virüsü 35S sentezini kontrol eden promotördür.