ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ İlknur SOLMAZ BAZI KARPUZ GENOTİPLERİNİN SSR ve SRAP MARKÖRLERİ İLE KARAKTERİZASYONU ve FUSARIUM SOLGUNLUĞU (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) NA DAYANIMLARININ KLASİK ve MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI KARPUZ GENOTİPLERİNİN SSR ve SRAP MARKÖRLERİ İLE KARAKTERİZASYONU ve FUSARIUM SOLGUNLUĞU (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) NA DAYANIMLARININ KLASİK ve MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI İlknur SOLMAZ DOKTORA TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu Tez.../.../...Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza...... İmza..... İmza... Prof. Dr. Nebahat SARI Doç Dr. Yıldız AKA KAÇAR Doç. Dr. Şener KURT I. DANIŞMAN II. DANIŞMAN ÜYE İmza... Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ÜYE İmza...... Doç. Dr. Halit YETİŞİR ÜYE Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2006D28 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ DOKTORA TEZİ BAZI KARPUZ GENOTİPLERİNİN SSR VE SRAP MARKÖRLERİ İLE KARAKTERİZASYONU VE FUSARIUM SOLGUNLUĞU (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) NA DAYANIMLARININ KLASİK VE MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI İlknur SOLMAZ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Nebahat SARI II. Danışman : Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Yıl : 2010, Sayfa: 140 Jüri : Prof. Dr. Nebahat SARI Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Doç. Dr. Şener KURT Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ Doç. Dr. Halit YETİŞİR Bu çalışmada, Çukurova Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü karpuz genetik kaynak koleksiyonunda yer alan toplam 93 genotip arasındaki genetik çeşitlilik SSR ve SRAP markörleri ile değerlendirilmiştir. Araştırmada, 14 SSRprimeri ve 31 SRAP primer kombinasyonu kullanılmıştır. En yüksek polimorfizm oranı, % 100 ile SSR markörlerinden elde edilmiş ve bunu % 97.3 ile SRAP markörleri izlemiştir. Moleküler karakterizasyon sonucu elde edilen verilerle yapılan kümeleme (cluster) analizlerine göre Türkiye nin değişik bölgelerinden toplanan Citrullus lanatus var. lanatus alt türüne ait karpuz genotiplerinin genetik olarak birbirine yakın olduğu ve birlikte kümelendiği tespit edilmiştir. Bu sonuç temel koordinat analizleri ile de desteklenmiştir. Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na karşı dayanımın klasik yöntemle değerlendirilmesiyle elde edilen ortalama hastalık oluşum düzeyi, ırk 0 için % 25.9, ırk 1 için % 39.4 ve ırk 2 için ise % 67.0 olarak bulunmuştur. 1 no lu ırk için RAPD primeri OPP01 ile yapılan moleküler taramada 700 bp bandı, yalnızca Kar 26 ve PI 482293 genotiplerinde elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Citrullus lanatus, Polimorfizm, Moleküler markörler, Genetik kaynaklar, Fusarium oxysporum f.sp. niveum I

ABSTRACT PhD. THESIS CHARACTERIZATION OF SOME WATERMELON GENOTYPES BY SSR AND SRAP MARKERS AND EVALUATION FOR FUSARIUM WILT (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) WITH MOLECULAR AND CLASSICAL TECHNIQUES İlknur SOLMAZ DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Nebahat SARI Supervisor II : Assoc. Prof. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Year : 2010, Pages:140 Jury : Prof. Dr. Nebahat SARI Assoc. Prof. Dr. Yıldız AKA KAÇAR Assoc. Prof. Dr. Şener KURT Assoc. Prof. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ Assoc. Prof. Dr. Halit YETİŞİR In this study, the genetic diversity of 93 genotypes selected from the watermelon genetic resource collection of Horticulture Department in Çukurova University was evaluated by SSR and SRAP markers. Fourteen SSR primers and 31 SRAP primer combinations were used in the experiment. The highest polymorphism with 100 % was obtained from SSR markers, followed by SRAP markers with 97.3 %. According to cluster analysis performed using molecular characterization data set, it was determined that watermelon genotypes collected from the different regions of Turkey of which belong to Citrullus lanatus var. lanatus subspecies were genetically close and grouped together in the same cluster. This result was supported by principle coordinate analyses as well. The mean disease incidence obtained by classical method to evaluate the resistance to fusarium wilt (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) was 25.9 % for race 0, 39.4 % for race 1 and 67.0 % for race 2. In the molecular analyses for determining resistance to race 1 with the RAPD primer OPP01, 700 bp band was recorded only in Kar 26 and PI 482293. Key Words: Citrullus lanatus, Polymorphism, Molecular markers, Genetic resources, Fusarium oxysporum f.sp. niveum II

TEŞEKKÜR Doktora tez konumun belirlenmesinde ve bu araştırmanın her aşamasında yardım ve desteğini esirgemeyen, akademik çalışmalarım boyunca beni yönlendiren ve her zaman daha iyiye ulaşmam için beni motive eden, zorluklar karşısında çözümcü, bilgide daima paylaşımcı olan değerli bilim insanı Danışman Hocam Sayın Prof. Dr. Nebahat SARI ya sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarım kapsamında bana moleküler genetik laboratuvarının kapılarını sonuna kadar açan, her türlü imkanı seferber eden, değerli bilgi ve tecrübeleriyle daima destek olan ikinci danışman Hocam Sayın Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR a saygı ve teşekkürü borç bilirim. Tez çalışmamın her aşamasında değerli katkılarıyla beni yönlendiren değerli Tez İzleme Komitesi üyeleri hocalarım Sayın Doç Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ye ve Sayın Doç. Dr. Şener KURT a en içten saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Doktora tezimin her aşamasında bana yardımcı olan, değerli desteğini ve katkılarını esirgemeyen Hocam Sayın Doç. Dr. Sedat SERÇE ye teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışması boyunca yardımını gördüğüm ve her zaman sorularıma sabırla yanıt veren Hocam Sayın Doç. Dr. Halit YETİŞİR e teşekkür ederim. Laboratuvar çalışmalarım boyunca yardımlarını esirgemeyen arkadaşlarım Dr. Muharrem YILMAZ a ve biyolog Özhan ŞİMŞEK e teşekkür ederim. Son olarak tüm yaşantım boyunca bana daima manevi ve maddi olarak destek olan Sevgili Aileme sonsuz teşekkürler. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ I ABSTRACT II TEŞEKKÜR..... III İÇİNDEKİLER..... IV ÇİZELGELER DİZİNİ.... VII ŞEKİLLER DİZİNİ...... VIII SİMGELER ve KISALTMALAR.......... X 1. GİRİŞ.... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR...... 13 2.1. Karpuzlarda Yapılan Moleküler Karakterizasyon Çalışmaları... 13 2.2. Farklı Kabakgil Türlerinde SSR Markörleri ile Yapılan Karakterizasyon Çalışmaları 22 2.3. Kabakgil Türlerinde ve Farklı Türlerde SRAP Markörleri ile Yapılan Karakterizasyon Çalışmaları... 30 2.4. Karpuzlarda Fusarium Solgunluğu Üzerine Yapılan Çalışmalar... 35 3. MATERYAL ve METOD...... 43 3.1. Materyal... 43 3.2. Metod... 51 3.2.1. Moleküler Karakterizasyon Çalışmaları... 51 3.2.1.1. DNA İzolasyonu... 51 3.2.1.2. DNA Kalitesi ve Kantitesinin Belirlenmesi... 55 3.2.1.3. SSR Analizleri............ 55 3.2.1.3.(1). SSR Analizleri PCR Çalışmaları.. 55 3.2.1.3.(2). PCR Çalışmalarında Kullanılan SSR Primerleri... 56 3.2.1.3.(3). Li-Cor için Poliakrilamid Jel Hazırlığı. 57 3.2.1.3.(4). Li-Cor Elektroforez Koşulları.. 57 3.2.1.4. SRAP Analizleri.... 59 3.2.1.4.(1). SRAP Analizleri PCR Çalışmaları... 59 3.2.1.4.(2). PCR Çalışmalarında Kullanılan SRAP Primerleri... 61 IV

3.2.1.4.(3). Agaroz Jel Elektroforez ve Jel Görüntüleme... 62 3.2.1.5. Primerlerin Polimorfizm Oranlarının Belirlenmesi.... 63 3.2.1.6. Benzerlik İndeksleri ve Dendrogramların Oluşturulması... 64 3.2.2. Karpuz Genotiplerinin Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımlarının Klasik ve Moleküler Yöntemlerle Araştırılması... 65 3.2.2.1. Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Klasik Yöntemle Araştırılması.. 65 3.2.2.1.(1). İstatistiksel Analiz.... 66 3.2.2.2. Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp niveum) na Dayanımın Moleküler Yöntemle Araştırılması 68 3.2.2.2.(1). DNA Amplifikasyonu...... 68 3.2.2.2.(2). RAPD Agaroz Jel Elektroforezi...... 69 3.2.2.2.(3). Sonuçların Değerlendirilmesi........ 69 4. BULGULAR ve TARTIŞMA...... 71 4.1. Moleküler Çalışmalar........ 71 4.1.1. SSR Analizleri........ 71 4.1.1.1. Karpuz Genotiplerinin SSR Tekniği ile Karakterizasyonunda Polimorfizmin Değerlendirilmesi 71 4.1.1.2. SSR Analizleri Sonucu Elde Edilen Benzerlik İndeksinin Değerlendirilmesi. 80 4.1.1.3. SSR Analizleri Sonucu Elde Edilen Dendrogramın Değerlendirilmesi... 82 4.1.1.4. SSR Verileriyle Yapılan Temel Koordinat Analizinin Değerlendirilmesi... 89 4.1.2. SRAP Analizleri...... 91 4.1.2.1. Karpuz Genotiplerinin SRAP Tekniği ile Karakterizasyonunda Polimorfizmin Değerlendirilmesi... 91 4.1.2.2. SRAP Analizleri Sonucu Elde Edilen Benzerlik İndeksinin Değerlendirilmesi... 97 V

4.1.2.3. SRAP Analizleri Sonucu Elde Edilen Dendrogramın Değerlendirilmesi... 98 4.1.2.4. SRAP Verileriyle Yapılan Temel Koordinat Analizinin Değerlendirilmesi... 102 4.2. Karpuz Genotiplerinin Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımlarının Klasik ve Moleküler Yöntemlerle Araştırılması...... 104 4.2.1. Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Klasik Yöntemle Araştırılması... 104 4.2.2. Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. niveum) na Dayanımın Moleküler Yöntemle Araştırılması... 110 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER... 115 KAYNAKLAR... 119 ÖZGEÇMİŞ... 138 EK 1. SSR benzerlik indeksi... 139 EK 2. SRAP benzerlik indeksi 140 VI

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Çizelge 3.2. Çizelge 3.3. Çizelge 3.4. Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Çizelge 3.7. Çizelge 3.8. Çizelge 4.1. Çizelge 4.2. Çizelge 4.3.. Çalışmada kullanılan bitkisel materyal.. DNA izolasyonunda kullanılan tampon çözeltisinin içeriği.. SSR analizleri PCR reaksiyon koşulları...... Çalışmada kullanılan SSR primerlerinin ismi, sekansı, beklenen bant büyüklüğü (bp) ve referans çalışmaları... SRAP analizleri PCR reaksiyon koşulları SRAP analizlerinde kullanılan forward (İleri) primerleri... SRAP analizlerinde kullanılan reverse (Geri) primerleri... RAPD analizi PCR reaksiyon koşulları... SSR primerlerinin amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam allel sayısı (adet), polimorfik allel sayısı (adet), allel büyüklükleri (bp) ve polimorfizm oranı (%)... SRAP primerlerinin amplifikasyonu sonucu elde edilen toplam bant sayısı (adet), polimorfik bant sayısı (adet), bant uzunluk aralıkları (bp), polimorfizm oranı (%)... Karpuz genotiplerinin Fusarium oxysporum f.sp. niveum un 0, 1 ve 2 no lu ırklarına karşı reaksiyonları.. 44 52 56 58 60 61 62 68 72 92 106. VII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Şekil 3.2. Şekil 3.3. Şekil 3.4. Şekil 3.5. Şekil 3.6. Şekil 3.7. Şekil 3.8. Şekil 3.9. Çalışmada kullanılan genotiplerin olgun meyve resimleri A: DNA izolasyonu amacıyla yaprak örneği alınan genç fideler; B: Yaprak örneklerinin alüminyum folyoya sarılması; C: Örneklerin - 196 o C de sıvı azota daldırılması; D: -85 o C de muhafazası DNA izolasyon aşamaları A: Porselen havanda sıvı azotla öğütülmüş yaprak örnekleri; B: Örneklerin tüplere aktarılması; C: Ekstraksiyon çözeltisinin eklenmesi; D: Örneklerin 65 o C de bekletilmesi; E: Örneklerin homojenizasyonu; F: Santrifüj işlemi; G: Tüplerin ters çevrilerek pelletin kurutulması; H: Pelletin TE içerisinde çözülmesi.. A: DNA kalite ve kantitesinin ölçümlerinde kullanılan spektrofotometre aleti; B: Spektrofotometrede DNA kalite ve kantitesinin okunması. A: Poliakrilamid jelin döküleceği camlar; B: Jel donduktan sonra tarağın jel içerisine yerleştirilmesi; C: Jel aparatının cihaza yerleştirilmesi; D: Poliakrilamid jelin yüklenmesi... PCR Hazırlık aşamaları A: PCR bileşenlerinin 1.5 ml lik tüp içerisinde hazırlanması; B: PCR bileşenlerinin vortex ile karıştırılması; C: PCR bileşenlerinin santrifüj yardımıyla homojenizasyonu; D: Tüplerin PCR a yerleştirilmesi... Agaroz jel elektroforez ve jel görüntüleme aşamaları; A: Agaroz jelin hazırlanması; B: Jelin dökülmesi; C: PCR ürünlerinin agaroz jele yüklenmesi; D: Jel görüntüleme sistemi % 1.7 Agoroz jelde koşularak elde edilmiş 100 bp büyüklüğündeki DNA markörü... Fusarium inokulumunun hazırlanması ve uygulanmasına ait resimler; A: Petri kapları içerisinde PDA ortamında geliştirilen Fusarium izolatları; B: Gelişen kolonilerin ortam yüzeyinden steril 46 52 54 55 59 60 62 64 VIII

Şekil 4.1. Şekil 4.2. Şekil 4.3. Şekil 4.4. Şekil 4.5. Şekil 4.6. Şekil 4.7. Şekil 4.8. Şekil 4.9. Şekil 4.10. spatül yardımıyla sıyrılması ve tülbentten süzülmesi; C: Thoma lamı üzerine spor süspansiyonun pipetle damlatılması; D: Spor süspansiyon yoğunluğunun mikroskop altında incelenmesi; E: İnokulum enjekte edilecek fide köklerinin spatül yardımıyla yaralanması; F: Otomatik pipetle 5 ml spor süspansiyonunun fidelere tek tek enjekte edilmesi Cgb4765 SSR primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü... ASUW19 SSR primerine ait poliakrilamid jel görüntüsü... SSR markörleri ile elde edilen dendrogram... SSR verileriyle yapılan temel koordinat analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafik... me1em11 SRAP primer kombinasyonuna ait agaroz jel görüntüsü... me1em6 SRAP primer kombinasyonuna ait agaroz jel görüntüsü... SRAP markörleri ile elde edilen dendrogram... SRAP verileriyle yapılan temel koordinat analizi sonucu elde edilen iki boyutlu grafik... Barnes (1972) tarafından geliştirilen hastalık değerlendirme skalası A: 0; hiçbir hastalık belirtisi göstermeyen sağlıklı bitkiler, B: 1; bodurlaşma gösteren bitkiler, C: 2; sararma gösteren bitkiler, D: 3; nekrozlaşma gösteren bitkiler, E: 5; ölü bitkiler... RAPD primeri OPP01 ile yapılan tarama sonucu elde edilen agaroz jel görüntüleri... 67 72 73 84 90 93 93 100 103 105 111 IX

SİMGELER ve KISALTMALAR AFLP bp cdna CFU cm CTAB dk DNA EDTA EST EtOH FON g ha HCI ISSR ITS Kar Kg ma MgCI 2 ml mm ng NaCI NTSYS PDA PCR POGP : Amplified Fragment Length Polymorphism : Base Pair : Chloroplast Deoxyribonucleic Acid : Colony Forming Unit : Cantimorgan : Cetytrimethylamoniumbromide : Dakika : Deoxyribonucleic Acid : Etylendiamintetraaceticacid : Expressed Sequence Tags : Ethanol : Fusarium oxysporum f.sp. niveum : Gram : Hektar : Hidroklorikasit : Inter Simple Sequence Repeats : Internal Transcribed Spacer : Karpuz : Kilogram : Miliamper : Magnezyumklorür : Mililitre : Milimolar : Nanogram : Sodyumklorür : Numerical Taksonomy and Multivariate Analysis System : Patates Dekstroz Agar : Polymerase Chain Reaction : Peroxidase Gene Polymorphism X

PI : Plant Introduction RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RGA : Resistant Gene Analog RNAase : Ribonuclease rpm : Revolution Per Minute SAS : Statistical Analysis Systems SC : Similarity Coefficient SCAR : Sequence Characterized Amplified Region sn : Saniye SNP : Single Nucleotide Polymorphism SRAP : Sequence Related Amplified Polymorphism SSR : Simple Sequence Repeats TAE : Tris-Acetate Taq : Thermus aquaticus TBE Tampon : Tris/Borate/EDTA (buffer) TE : Tris-EDTA (buffer) TEMED : Tetrametil-Etilendiamin UPGMA : Unweighted Pair-Group Method Analysis UPOV : International Union For The Protection of New Varieties of Plants USDA : United States Department of Agriculture UV : Ultraviolet V : Volt µl : Mikrolitre µm : Mikromolar o C % : Yüzde : Santigrad Derece XI

1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ 1. GİRİŞ Karpuz [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. ve Nakai], Cucurbitaceae familyasının ekonomik öneme sahip en önemli türlerinden birisidir. Citrullus cinsinin taksonomisi ile ilgili pek çok çalışma (Whitaker ve Davis, 1962; Fursa, 1972; Jeffrey, 1975; Whitaker ve Bemis, 1976) yapılmış olmakla birlikte, son yıllarda Afrika, Asya ve Akdeniz in sıcak bölgelerinde yetişen 4 diploid (n=11) tür içerdiği kabul edilmektedir (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Jarret ve Newman, 2000; Levi ve ark., 2001a; Wehner, 2008). Dünya da tropik ve subtropik bölgelerde yetiştirilen C. lanatus (Thunb.) Matsum. ve Nakai, Citrullus cinsi içerisinde en fazla çeşitlilik gösteren tür olup (Maynard, 2001), kültür formu C. lanatus var. lanatus ve yabani form olan C. lanatus var. citroides (L.H. Bailey Mansf.) alt türlerini içermektedir (Whitaker ve Bemis, 1976; Bates ve Robinson, 1995; Robinson ve Decker-Walters, 1997; Wehner, 2008). Tüm dünyada ticari olarak yetiştiriciliği yapılan karpuzlar, C. lanatus var. lanatus alt türüne ait olup. çekirdekli ve çekirdeksiz (triploid) tiplere sahiptir. Meyveleri boyut, şekil ve kabuk özellikleri bakımından oldukça zengin bir çeşitlilik göstermektedir. Meyvelerde boyut; mini, küçük, orta, büyük ve çok büyük, şekil; yuvarlak, oval, eliptik ve silindirik, kabuk; düz ya da çizgili, kabuk rengi; yeşilin farklı tonlarında (koyu, orta, açık) ve gri, çizgiler; açık veya koyu yeşil zemin üzerine geniş, orta ve dar, et rengi; beyaz, sarı, turuncu ve kırmızı olabilmektedir. Taze meyve olarak tüketilebildiği gibi, küçük parçalar halinde meyve salatalarında, meyve suyu ve şekerleme sanayiinde ve kabukları da turşu yapımında kullanılır. Yenilebilir tohumları çerez olarak tüketilebilir (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Wehner, 2008). C. lanatus var. citroides (L.H. Bailey Mansf.) citron, citron kavunu, konservelik kavun olarak bilinir. Yabani ilkel formlarına Güney Afrika da rastlanmakla birlikte, kültürel yetiştiriciliği de yapılmaktadır. Kabukları turşu, konserve ve reçel yapımında kullanılmakta ve meyvelerinden de hayvan yemi olarak yararlanılmaktadır (Laghetti ve Hammer, 2007). Beyaz veya açık yeşil olan meyve 1

1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ eti tatsız ve acıdır. Tohumları haşlanarak veya un haline getirilerek tüketilir (Robinson ve Decker- Walters, 1997). Acı elma ve acı kabak olarak bilinen C. colocynthis (L.) Schrad, Kuzey ve Batı Afrika ya özgü, kuraklığa dayanıklı, çok yıllık yabani bir tür olup, Güneybatı Asya ve Akdeniz in kumsal bölgelerinde de yetişmektedir (Zamir ve ark., 1984; Burkill, 1985; Jarret ve ark., 1997; Robinson ve Decker-Walters, 1997). Günümüzde Afrika nın Sahra-Arap fitocoğrafik bölgesinde ve Akdeniz de yaygın durumdadır (Dane ve ark., 2007). C. colocynthis, bitkisel organlarının boyutları bakımından C. lanatus tan farklıdır (Mohr, 1988). Çiçekleri, yaprakları, meyveleri ve tohumları küçüktür. Zayıf ve tüylü gövdesi, derin 3-7 loblu, tüylü, 5-10 cm uzunluğundaki yaprakları ve uçuk sarı çiçekleri bu türün karakteristik özellikleridir. Bir bitki yaklaşık 7-10 cm çapa sahip, yeşil zemin üzerine sarı çizgili 15-30 arasında meyve verir (Robinson ve Decker-Walters, 1997). Meyve eti sıkı, beyaz ve acı olup yenilmemektedir, ancak meyvelerden üretilen colocynth maddesi ilaç sanayiinde kullanılmaktadır. Değerli bir yağ kaynağı olan ve acı olmayan tohumları, öğütülerek ekmek yapımında kullanılmakta ve Afrika da pişirilerek tüketilmektedir (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Dane ve ark., 2007). Çok yıllık C. ecirrhosus Cogn. (Meeuse, 1962) ve tek yıllık C. rehmii De Winter (De Winter, 1990) Namibya çöllerinde yetişen endemik türlerdir (Levi ve ark., 2005; Dane ve Liu, 2007). Praecitrullus fistulosus (Stocks) Pangolo, Hindistan ve Pakistan da yetişen bir tür olup, birçok araştırıcı tarafından (Whitaker ve Davis, 1962; Khoshoo ve Vij, 1963; Singh, 1990) farklı bir Citrullus olarak değerlendirilmektedir. Her ne kadar morfolojik özellikleri Citrullus türleriyle benzerlik gösterse de kromozom sayısı bakımından (2n=2x=24) farklıdır (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Levi ve ark., 2005). Günümüzde, kültürü yapılan karpuzun atası konusunda çelişkiler hala devam etmektedir. Bazı araştırıcılar karpuzun çok yıllık C. colocynthis den türediğini, bazıları da C. lanatus var. citroides in karpuzun yabani atası olduğunu düşünmektedirler (Maynard, 2001; Wehner, 2008). Dane ve Liu (2007) ise kültür ve yabani formaların her ikisinin de ortak bir atadan geldiğini ve bu atanın 2

1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ Namibya da yetişen endemik bir tür olan Citrullus ecirrhosus olabileceğini bildirmişlerdir. Citrullus türlerinin tümünün orijini Afrika olup, özellikle Güney Afrika da en yüksek düzeyde çeşitlilik görülmektedir. Çin, ikincil gen merkezidir, ayrıca Hindistan da da bazı yakın akraba formlar bulunmaktadır. Orta Doğu ve Akdeniz e yakın bölgelerin eski yerel genotiplerin ve yabani formların toplanabileceği yerler olduğu bilinmektedir (Robinson ve Decker-Walters, 1997; Wehner, 2008). Karpuz yetiştiriciliğinin Orta Doğu ve Afrika da uzun bir geçmişi vardır. Karpuz, 4000 yıldır Mısır da oldukça önemli bir sebzedir. 10. yy da Çin ve Rusya da yetiştirilmeye başlanmış ve yeni dünya ile tanışması 16.yy da İspanyollar sayesinde olmuştur (Robinson ve Decker-Walters, 1997). Kalp krizini ve bazı kanser türlerini önlemede son derece yararlı bir karetenoid olan likopen yönünden zengin olan karpuzun üretimi, geçtiğimiz yüzyıl boyunca düzenli olarak artmıştır (Güner ve Wehner, 2004). Dünya da 3.694.595 ha alanda 95.292.051 ton karpuz üretilmektedir. Türkiye, 139.000 ha alanda 4.002.285 ton luk karpuz üretimi ile Çin in ardından ikinci sırada yer almaktadır. Karpuz üretiminde önemli rol oynayan diğer ülkeler ise, İran (3.400.000 ton), Brezilya (1.950.000 ton) ve ABD (1.793.000 ton) dir (Anonymous, 2008a). Türkiye de 1.436.181 ton ile Akdeniz Bölgesi, bu bölgede ise 820.000 ton ile Adana üretimde lider durumdadır (Anonymous, 2008b). Bitki genetik kaynakları, yerel çeşitler olarak nitelendirilen köy populasyonları; bunların yabani akrabaları, kullanılmayan eski çeşitler ve kalıtsal özellikleri net olarak belirlenmiş hatlardan oluşmaktadır. Özellikle yabani türlerin korunması, gelecekte yapılacak olan bitki ıslahı çalışmaları için son derece önemlidir. Bu değerli kaynaklar bulundukları yörelerde çevresel ve diğer baskılarla azalma, hatta yok olma tehlikesiyle karşı karşıyadır. Genetik kaynakların korunması, geleceğin bitkisel üretiminin, dolayısıyla insanlığın geleceğinin güvence altına alınması bakımından zorunludur (Tan, 2003). Bitki genetik kaynakları; klasik ıslah yöntemleri için çeşitli özelliklere sahip başlangıç materyalleri sağlamasının yanında, içerdikleri genetik çeşitlilik nedeniyle son yıllarda hızla ilerleme kaydeden biyoteknoloji alanında da üstün nitelikli bitki 3

1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ çeşitlerinin geliştirilmesi için gerekli hammadde niteliğindedir. Günümüzde birçok yeni çeşit geliştirilmiş olmasına rağmen, hastalık ve zararlılara dayanıklılığın iyileştirilmesi konusunda çalışmaların devam etmesi gerekmektedir (Levi ve ark., 2001a). Kültür çeşitleri, gen yapıları bakımından homojen hale gelmiş olup, ilkel formlara ve yabani akrabalarına oranla çok daha az genetik çeşitlilik içermektedir. Yabani türler ise, geniş bir genetik tabanı olan ve kültür bitkilerinin ileride çıkabilecek sorunlarının giderilmesinde ya da bitkilere yeni özelliklerin kazandırılmasında önemli birer kaynak oluşturan gen depolarıdır (Özgen ve ark., 1995). Genetik kaynağın değeri, en kısa sürede yarar sağlanabilmesi ve en uzun süre korunabilmesine bağlıdır (Kresovich ve McFerson, 1992). Bitkisel gen kaynaklarının korunmasında ve ıslah programlarında daha etkin biçimde kullanılmasında başarı, materyalin cins ve tür özelliklerinin sistematik biçimde belirlenmesine, bu konudaki kayıtların ayrıntılı bir biçimde tutulmasına, materyaldeki genetik değişimin izlenmesine ve kullanım için gerekli olan özelliklerin saptanmasına bağlıdır. Genetik kaynaklardan etkin bir şekilde yararlanabilmek için germplazm içerisindeki çeşitliliğin araştırılması gerekmektedir (Che ve ark., 2003). Genetik kaynakların karakterizasyonu; morfolojik, agronomik ve genetik olarak yapılabilir. Morfolojik karakterizasyon güvenilir, kolay ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Günümüzde genetik kaynakların karakterizasyonu büyük ölçüde morfolojik karakterizasyona dayanmaktadır. Kullanımını sınırlayan önemli faktörler, canlı bitkiye ihtiyaç duyması ve gerek değerlendirmeyi, gerekse de bilgi paylaşımını zorlaştıran çevre şartlarından etkilenmesidir (Ferreira, 2005). Büyük alanlarda deneme kurmanın zor olması ve yüksek maliyet nedenleriyle agronomik karakterizasyon, büyük germplazmların değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılamamaktadır. Agronomik karakterler genellikle polimorfik yapıda olduğundan çevreden önemli ölçüde etkilenirler (Ferreira, 2005). Bu nedenle genetik değişiklikleri izlemenin önemi büyüktür. Genetik karakterizasyonda kullanılan moleküler tekniklerin, çevresel koşullardan etkilenmemesi, analizin bitkinin herhangi bir parçasında ya da büyüme döneminde yapılabilmesi, analiz 4

1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ sayısının zamanla ve materyalle sınırlı olmaması, analizin bitkinin çok küçük örneklerinde yapılabilmesi, DNA analizleri ile stabilitenin en duyarlı biçimde belirlenebilmesi ve cansız örneklerde de karakterizasyonun yapılabilmesi gibi olumlu özelliklerinin yanında; geniş bir genetik tarama için uygun olmaması, sonuçların genomun çok küçük bir bölümünü karakterize etmesi ve agronomik önemi olan genlerin analizinde istenilen düzeye gelinmemiş olunması gibi olumsuz özellikleri de vardır (Özgen ve ark., 2000). Gen bankalarında muhafaza edilen bitkisel genetik kaynakların ıslah programlarında etkin bir şekilde kullanımı sınırlı olmakla birlikte, bu bankalarda depolanan materyal sayısı sürekli bir artış göstermektedir. Bu çelişkinin ana nedeni olarak germplazm karakterizasyonunun yavaş yapılması gösterilebilir. Moleküler markör teknolojisi sayesinde aynı materyalin gen bankasına girişi engellenir, genotiplerin tam olarak parmakizi oluşturulur, germplasm içerisindeki çeşitlilik ve genetik ilişkiler belirlenerek, büyük koleksiyonlarda allelik zenginliğin önemli bir kısmını en az örnekle temsil edebilen çekirdek (core) koleksiyonlar oluşturulur. Bu çekirdek koleksiyonlarda yer alan materyallerde agronomik öneme sahip karakterler açısından daha detaylı bir fenotipik değerlendirme yapılabilir (Dodds ve Watanabe, 1990; Ferreira, 2006). Böylece muhafaza edilen genetik kaynakların ıslah programlarında kullanım olanakları artar. Karpuzlarda yapılan klasik taksonomi çalışmalarında kullanılan meyve şekli, meyve kabuk rengi, tohum şekli ve tohum rengi gibi morfolojik karakterler bazı genotiplerin ayrımında yeterli olmamakla birlikte (Che ve ark., 2003), birçoğu çevresel koşullar tarafından düzenlenmekte veya etkilenmektedir (Provvidenti, 1994). Tek lokus ile idare edilen morfolojik özellikler, değişik çevre koşullarında ifade edilebildiği sürece genetik markör olarak kullanılabilir. Kodominant morfolojik markörler seleksiyonla genetik tepkiyi önceden bildirse de çevresel ve genetik (epistasis) faktörlerden etkilenirler (Staub ve ark., 1996). Protein ya da DNA da bulunan polimorfizme dayanan moleküler markörlerin geliştirilmesi; taksonomi, filogeni, ekoloji, genetik ve bitki ıslahı alanlarında yürütülen çalışmaları büyük oranda kolaylaştırmaktadır. Bitki dokusuna ve çevresel 5

1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ faktörlere bağımlı olmamaları ve bitki gelişiminin erken aşamalarında dahi kullanılabilmeleri, moleküler markörlerin çok yararlı araçlar olduğunu göstermektedir (Espósito ve ark., 2007). Moleküler markörler, germplasm içerisindeki çeşitliliğin araştırılması, genotipler arasındaki genetik yakınlıkların ortaya çıkarılması, çeşitlerin tanımlanması, tohum saflığının belirlenmesi, sistematik çalışmaları, genetik kaynak koleksiyonlarının bazı spesifik genler bakımından taranması ve genom haritalamasında etkin bir şekilde kullanılmaktadır. Böylece klasik bitki ıslahı sürecinde karşılaşılan sorunların çözümünde bitki ıslahçılarına yeni ufuklar açmaktadırlar (Kumar, 1999; Levi ve ark., 2001a). Karpuz genetik kaynak koleksiyonlarında genetik çeşitlilik ve filogenetik ilişkilerin belirlenmesinde biyokimyasal markörler kullanılmış, ancak test edilen izoenzimlerin çoğunun monomorfik olduğu tespit edilmiştir (Navot ve Zamir, 1987; Biles ve ark., 1989). Genetik çeşitliliğin belirlenmesinde enzim sistemlerinin etkin şekilde kullanılamamasının nedeni, enzim sisteminin sınırlı sayıda ve izoenzimlerle elde edilen varyasyonun da kısıtlı olmasıdır (Che ve ark., 2003). Protein markörleri ile karşılaştırıldığında DNA markörleri (RAPD, SSR, AFLP vb.), diğer türlerde olduğu gibi karpuzlarda da genetik çeşitliliğin araştırılmasında daha etkin ve güvenilirdir (Jarret ve ark., 1997; Levi ve ark., 2001a; Levi ve ark., 2001b; Che ve ark., 2003; Levi ve ark., 2004). DNA markörleri hibridizasyona dayalı markörler (RFLP) ve PCR a dayalı markörler (RAPD, SSR, AFLP, SRAP vb.) şeklinde iki grupta incelenebilir, ancak günümüzde PCR a dayalı markörlerin kullanımı daha yaygındır. PCR ın geliştirilmesi ile birlikte varyasyonun moleküler karakterizasyonunda modern devrim başlamıştır. Southern blotting olarak da adlandırılan RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markörü, hibridizasyona dayalı ko-dominant bir markör sistemidir (Sambrook ve ark., 1989). Türler arasındaki farklılıkları kolayca belirleyebilmesi ve aynı tür içerisinde etkili olması avantajken, fazla miktarda DNA ya gereksinim duyması, pahalı olması, fazla zaman ve işgücü gerektirmesi olumsuz özellikleridir (Aka-Kaçar, 2001). RFLP, karpuzlarda genetik çeşitliliğin tanımlanmasında (Dane 6

1. GİRİŞ İlknur SOLMAZ ve ark., 2004, Levi ve ark., 2005; Dane ve Liu, 2007) ve haritalama çalışmalarında (Hashizume ve ark., 1996; 2003) kullanılmıştır. Zorluk, güvenilirlik, maliyet ve bilgi üretme bakımından birbirinden farklı olan PCR a (Polymerase Chain Reaction) dayalı her bir markör sisteminin (RAPD, AFLP, SSR vb.) avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır (Lee, 1995; Rafalski ve ark., 1996). RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniği, Williams ve ark. (1990) tarafından geliştirilmiş olup, düşük maliyetli ve kolay uygulanabilir olmasının yanı sıra, tekrarlanabilirliğinin zor olması ve dominant kalıtım özelliği gibi dezavantajlara sahiptir. Karpuzlarda genetik çeşitliliğin belirlenmesinde, filogenetik ilişkilerin araştırılmasında ve genetik haritaların oluşturulmasında kullanılmıştır (Hashizume ve ark., 1996; Lee ve ark., 1996; Hawkins ve ark., 2001; Levi ve ark., 2001a; 2001b; 2001c; 2006; 2007; Solmaz ve ark., 2010). ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats) tekniği, uygulama bakımından RAPD tekniğine benzemekle birlikte, bu yöntemin dezavantajlarını gidermek üzere geliştirilmiştir. Tekrarlanabilirliği RAPD tekniğinden yüksek, maliyeti ise AFLP tekniğinden daha düşüktür (Zietkiewicz ve ark., 1994; Reddy ve ark., 2002). ISSR tekniği karpuzlarda genetik çeşitliliğin araştırılmasında (Levi ve ark., 2004) ve haritalama (Hashizume ve ark., 2003; Levi ve ark., 2006) çalışmalarında kullanılmıştır. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), yüksek tekrarlanabilirlik oranı nedeniyle oldukça fazla uygulama alanı bulmuştur (Vos ve ark., 1995). Polimorfizm oranı çok yüksek olan bu markör tekniği, kuruluş aşamasında oldukça maliyetlidir. En önemli dezavantajı, sistemin optimizasyonunun zor olmasıdır (Li ve Quiros, 2001). Karpuz genotipleri arasındaki polimorfizmin araştırılmasında (Che ve ark., 2003; Levi ve ark., 2004; 2007; Nimmakayala ve ark., 2009), çeşitler arasındaki filogenetik ilişkilerin belirlenmesinde ve genetik haritaların oluşturulmasında (Levi ve ark., 2006) başarıyla kullanılmıştır. Mikrosatellit DNA dizinleri, ökaryatik genomlar için mükemmel bir polimorfizm kaynağıdır. SSR (Simple Sequence Repeat), polimorfizm seviyesi düşük olan türlerde genetik çeşitliliğin araştırılmasında, çeşit tayininde ve genetik 7