NVAZ V MANTAR HASTALIKLARININ M KOLOJ K TANISI

st T p Fak Derg 2007;70:23-28 J Ist Faculty Med 2007;70:23-28 www.itfdergisi.com DERLEME/REVIEW ARTICLE NVAZ V MANTAR HASTALIKLARININ M KOLOJ K TANISI MYCOLOGICAL DIAGNOSIS OF INVASIVE MYCOSES Y ld z YE ENO LU* ÖZET nvaziv mantar infeksiyonlar, günümüzde özellikle riskli konumdaki immünosupressif hastalar aç s ndan önemli bir morbidite ve mortalite nedeni olmaya devam etmektedir. nfeksiyonun çok h zl ilerlemesi ve tan mlanmas ndaki güçlükler sonucunda kesin tan ço unlukla otopsi esnas nda konur. Mortalitenin % 40-70 lere ulaflm fl olmas erken ve gerçekçi laboratuvar testlerine olan gereksinimin ne denli önemli oldu unu çarp c bir biçimde vurgulamaktad r. Bu derlemede invaziv mikoz etkeni olan/olabilen mantarlar ve laboratuvar tan testlerinden söz edilmifltir. Anahtar kelimeler: nvaziv mikoz, patojen mantar, f rsatç mantar, immünosupressif hasta, laboratuvar tan testleri ABSTRACT Nowadays, invasive mycoses still continue to be the most important cause of morbidity and mortality particularly in immunosuppressed patients. Due to quick progress and difficulty in defining the infection, definite diagnosis is possible mostly during autopsy application. It has strikingly been shown that fast and reliable laboratory tests have great importance for early diagnosis of the infection since the rate of mortality reached to 40-70%. In this article, the fungi that are or could be responsible agents of invasive mycoses and their laboratory diagnostic tests are reviewed. Key words: Invasive mycosis, pathogen fungi, opportunistic fungi, immunosuppressed patient, laboratory diagnostic tests NVAZ V M KOZDA ETKEN OLAN MANTARLAR nvaziv mantar infeksiyonlar, özellikle riskli konumdaki immunsupressif hastalarda morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. ntravenöz kataterler, hiperalimentasyon, mukokutanöz yüzeylerin mantar kolonizasyonu, akut pankreatit, genifl spektrumlu antibiyotiklerin afl r kullan m, akut hemodiyaliz, sitotoksik ve steroid tedavisi, organ transplantasyonu gibi risk faktörleri hastal k oluflumunu kolaylaflt r r. nfeksiyon çok h zl ilerledi i ve tan mlanmas nda güçlükler yafland için; kesin tan ço unlukla otopsi s ras nda konmaktad r (2,5,32). Günümüzde sistemik mantar infeksiyonlar nda mortalitenin % 40-70 lere ulaflm fl olmas, erken ve gerçekçi laboratuvar tan s n sa layan laboratuvar testlerine gereksinimin ne denli gerekli ve önemli oldu unu aç kça göstermektedir. Mikozlar n laboratuvar tan s, multidisipliner bir yaklafl m gerektirir. Mikolog, patolog, radyolog ve klinisyen (iç hastal klar, cerrahi ve çocuk hastal klar uzmanlar ) iflbirli inin sa lanmas, tan n n do rulu u, dolay s yla hasta aç s ndan çok önemlidir (1,5,8,16,17,22,28,29). Sistemik mantar infeksiyonu etkeni olan mantarlar iki ana grupta toplan r: 1- Gerçek patojenler 2- F rsatç patojenler Coccidioides immitis (koksidiyoidomikoz etkeni), Histoplasma capsulatum (histoplazmoz etkeni), Blastomyces dermatitidis (blastomikoz, K. Amerika blastomikozu etkeni), Paracoccidioides brasiliensis (parakoksidiyoidomikoz, G.Amerika blastomikozu etkeni) gerçek patojen; Candida (kandidoz etkeni), Aspergillus (aspergilloz etkeni), Cryptococcus neoformans (kriptokokkoz etkeni), Mucor (mukormikoz etkeni), Pneumocystis jiroveciii (pnömosistoz etkeni) f rsatç patojen mantarlard r. Trichosporon asahii, Geotrichum, Fusarium, Penicillium marneffei, Acremonium, Paecilomyces, Pseudallescheria boydii, dematiaceous (dematiyosiyöz) küfler gibi f rsatç mantarlar da seyrek olarak infeksiyona neden olabilirler. Hiyalen ve dematiyosiyöz küfler; ço unlukla akci er, paranazal sinüs infeksiyonlar ve fungemide; mayalar, fungemi, fokal lezyonlar ve meningoensefalitde etken olarak izole edilirler. Date received/dergiye geldi i tarih: 15.01.06 * stanbul Üniversitesi, stanbul T p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal, Çapa, stanbul ( letiflim kurulacak yazar: yegenoglu2002@yahoo.com) - 23 -

nvaziv mantar hastal klar NVAZ V M KOZ KUfiKUSUNDA LABORATUVARA SIKLIKLA GÖNDER LEN KL N K ÖRNEKLER VE EN FAZLA ZOLE ED LEN MANTARLAR Kan: C.albicans, C.tropicalis, C.parapsilosis, C.neoformans, H.capsulatum, C.lusitaniae, C.krusei, S.cerevisiae, C.zeylanoides, T.asahii, C.immitis, C.guillermondii, M.furfur; Beyin omurilik s v s : C. neoformans, C.albicans, C.parapsilosis, C.tropicalis, C.immitis, H.capsulatum; Genito üriner sistem örnekleri: C.albicans, C.glabrata, C.tropicalis, C.parapsilosis, Penicillium spp., C.krusei, C.neoformans, Saccharomyces, H.capsulatum, Cladosporium, Aspergillus, T.asahii, Alternaria; Solunum sistemi örnekleri: Mayalar(Cryptococcus d fl nda), Penicillium, A.fumigatus, Cladosporium, Alternaria, A.niger, G.candidum, Fusarium, A.versicolor, A.flavus, Acremonium, Scopulariopsis, Beauveria, T.asahii, P.boydii, Bipolaris, Exserohilum, Aureobasidium dur (2,9,10,11,18,26,28). Çok çeflitli olan mantarlar n izolasyon ve idantifikasyonlar mikoloji laboratuvar nda, kültür temelli, kültüre dayal olmayan (serolojik, moleküler) yöntemler uygulanarak yap l r (6,7,10,13,15,19,23,27). Tam ve do ru bir laboratuvar tan s için, klinik tan ile uyumlu örneklerin uygun zamanda ve uygun yerden al narak uygun koflullarda laboratuvara hemen ulaflt r lmas gerekir. KL N K ÖRNEKLER N M KOLOJ LABORATUVARINA GÖNDER LMES NDE D KKAT ED LECEK ÖZELL KLER - Antifungal tedavi öncesi al nmal d r. - Aseptik koflullarda ve steril örnek toplama kaplar na al narak en geç iki saat içinde laboratuvara ulaflt r lmal d r. - Bu süre içinde laboratuvara gönderilemeyen örnekler Kan ve BOS d fl nda +4 o C de bekletilmelidir. - Anaerobik transport besiyerleri kullan lmamal d r. KL N K ÖRNEKLER VE UYGUN ALINIM KOfiULLARI (10,11,13,15,23) Alt solunum yolu örnekleri - Balgam, bronkoalveoler lavaj s v s (BAL), bronfliyal y kama s v s, trakeal aspirat ve doku biopsi örnekleri uygun örneklerdir. - En uygun örnek; BAL ve bronfliyal y kama s v s d r. - Balgam 5-10 ml, yeni ve sabah ç kar lm fl olmal d r. - Balgam, derin bir öksürükle ç kar lmal ; prodüktif öksürük yoksa izotonik tuzlu su inhalasyonu ile indüklenmelidir. - 24 saatlik balgam örne i; incelenmek için uygun de- ildir. - En az üç balgam örne i al nmal, tükürük gönderilmemelidir. Kan - Venden al nan örnek en uygunudur. (Küf infeksiyonu kuflkusunda mümkünse arter kan, tercih edilmelidir). - Kan, hasta bafl nda al nd nda derhal hemokültür fliflesine aktar lmal d r (önceden flifle a z ndaki lastik t pa alkolle silinmelidir). - Antikoagülan olarak sodyum polyanetol sulfat (SPS) kullan lmal d r. - Eriflkin bireylerden en az 10 ml (uygunu 20 ml), çocuklardan 1-5 ml kan al nmal d r. (Kan miktar n n çoklu u etkenin saptanma olas l n art r r). - Febril dönem bafl na iki-üç kan örne i al nmal d r. Kemik ili i - Steril bir kaba; 3-5 ml örnek aspire edilmelidir. - Antikoagülan olarak SPS tercih edilmelidir. - Örnekler, hasta bafl nda do rudan kan kültürü fliflesine al nabilir. Serum - En az 10 ml kandan elde edilmifl olmal d r. - Laboratuvara hemen ulaflt r lam yorsa +4 o C de k sa bir süre bekletilebilir. - Antikoagülan eklenmemelidir. - BOS, idrar veya di er vücut s v lar da serolojik yönden incelenmek üzere; steril bir cam tüpe al narak (miktar; 5-10 ml) gönderilebilir. - Örneklerin çift veya birkaç kez al narak gönderilmesi daha iyi sonuç verir. Plevra,sinoviyal ve peritoneal s v lar - Az miktarda heparin içeren (1/1000) steril kaplara al narak laboratuvara gönderilmelidir. drar - Sabah ç kar lan ilk idrar en uygun örnektir. - 24 saatlik (biriktirilmifl) idrar gönderilmemelidir. - Kateterize olmayan hastalarda uygun temizlik ifllemlerinden sonra orta ak m idrar al narak gönderilmelidir. - drar torbas ndan al nan örnek gönderilmemelidir. - Yenido anda en uygun idrar, suprapubik aspirasyon ile toplanand r. - Örnek laboratuvara hemen yollanam yorsa, +4 o C de 12-14 saat bekletilebilir. BOS - Membran filtreli (0,45 mm) steril injektörler ile örnek al nmas tercih edilmelidir. - Örnek miktar 3-5 ml olmal d r. - Örneklerin laboratuvara hemen ulaflt r lmas gerekir; e er bu mümkün de ilse, k sa bir süre oda s s veya 30 o C lik etüvde bekletilebilir (4 o C de bekletilmemelidir). Cerahat - Ekuviyon ile al nan sürüntü uygun örnek de ildir (mutlaka gerekiyorsa antisepsi sonras en derin bölgeden al nmal d r). - Kapal lezyon ve abse örnekleri injektör ile aspire edilerek al nmal d r (en uygun yöntem). - Aç k lezyonlardan ak nt örne i almadan önce, bu bölge iyice temizlenmelidir. Doku - Lezyonun merkez ve kenar ndan al nmal, steril % 0,85 NaCl içeren steril kaplarda laboratuvara gönderilmelidir. - Örnek, formalin içine al nmamal d r. - 24 -

Invasive myocoses - Küçük lezyonlar tamamen ç kar l p yollanabilir. - Doku örnekleri laboratuvara hemen gönderilemiyorsa +4 o C de en fazla 8-10 saat bekletilebilir. Örnek dondurulmamal d r. Gözden al nacak örnekler - Kuflkulu korneal ülserlerin iç ve d fl kenarlar ndan steril bir spatula ile al nmal d r (örnek az ise, do rudan mikroskopik tan amac ile temiz bir lam üzerine al narak da gönderilebilir). - Endoftalmit kuflkusunda, >0,5 ml miktar ndaki s v, steril bir tüpe al narak gönderilmelidir. Örnek miktar az ise, içinde örnek olan injektör; laboratuvara gönderilebilir. Kulaktan al nacak örnekler - Kuflkulu lezyondan asepsi sonras kaz nt örne i al nmal d r. - Ak nt örnekleri asepsi sonras steril bir eküviyonla al n p gönderilebilir. Laboratuvara ulaflan, kültürü yap lacak klinik örneklerin; hastan n tedavisine bir an önce bafllanabilmesi aç s ndan; bekletilmeden, do rudan mikroskopik yöntemler ile incelenmesi ve hemen ilk sonucun bildirilmesi gerekir (6,9,15,18,23,26). KL N K ÖRNEKLERE LK OLARAK UYGULANMASI GEREKEN filemler Mikoloji laboratuvar nda: - Örnek üzerine % 10-15 KOH + % 1 kalkoflor beyaz konarak haz rlanan preparasyon fluoresans mikroskopta incelenir ve mantar elemanlar (hif ve/veya spor) aran r ( Do rudan mikroskopi) - Gram boyas - Çin mürekkebi boyas Patoloji laboratuvar nda: - Methanamine gümüfl boyas (GMS) - Papanicolau boyas - Periodic acid-schiff boyas (PAS) - Wright boyas Mikoloji laboratuvar nda preparasyonlar n mikroskopik incelenmesi sona erdi inde kültürel ifllemlere geçilir. Kültür besiyerleri Primer izolasyon amaçl lar Kullan m nedenleri - Sabouraud dekstroz agar (SDA) Saprofit ve patojen (Siklohekzimidli veya mantarlar n primer sikloheksimidsiz) izolasyonu - Beyin kalb inifüzyon agar (BHI) Saprofit ve patojen mantarlar n primer izolasyonu - nhibitör mold agar Patojen mantarlar n (dermatofit d fl ndaki) primer izolasyonu - Maya özütü fosfat agar Patojen mantarlar n (dermatofit d fl ndaki) primer izolasyonu Spesifik amaçl lar Tween 80 ve tripan mavili m s r unlu jeloz (MUJ) Pamuk tohumu dönüflüm agar -Czapek s agar -Kufl tohumu agar (Staib agar) -Maya fermentasyon buyyonu -Maya nitrojen agar C.albicans n klamidospor tan s B.dermatitidis in küf faz ndan maya faz na dönüflümü Aspergillus izolasyonu C.neoformans idantifikasyonu Mayalar n fermentasyon özellikleri Mayalar n karbonhidrat asimilasyon özellikleri Ekim yap lan besiyerleri 26 ve 37 o C de inkübe edilir. Bir-dört hafta içinde veya sonunda üreme görülmüflse koloniden preparasyon haz rlan r. zole edilen mantar bir maya ise; bu mayan n hif ve/veya yalanc hif oluflturup oluflturmad, klamidospor varl, karbonhidrat asimilasyonu, nitrat asimilasyonu, fleker fermentasyonu ve gerekti inde di er özellikleri araflt r larak tür düzeyinde tan ya gidilir. Son y llarda enzimatik reaksiyon oluflumu temeline dayanan; Chromagar, Albicans ID gibi testler baz laboratuvarlar taraf ndan izolasyon ve idantifikasyonda kullan lmaktad r. Küf üremesi saptand nda ise; koloniler önce makroskopik, daha sonra mikroskopik olarak incelenir. Mikroskopik tan da; laktofenol pamuk mavisi kullanarak sellofan band, koparma veya lam kültürü yöntemlerinden yararlan l r, tipik hif ve konidyum yap lar na göre isimlendirme yap l r. Kan, invaziv mikozda çok önemli bir klinik örnektir ve mantarlar n kandan izolasyonunda özel ifllemler uygulan r. zolasyon yöntemleri Bactec 9000 (özel flifleleri: MYCO/ FLYTIC medium= MFL) Bact/Alert ESP [(septi-chek-bifazik besiyeri) (kat ve s v )] Bu besiyerlerinde mayalar iki üç günde izole edilir. LS (isolatör): zolatör tüpündeki saponin, eritrosit ve lökositleri eriterek, hücre içindeki mikroorganizman n serbest kalmas n sa lar; tüp santrifüj edilerek, oluflan çökelti besiyerine ekilir. 3.8-10,5 günde üreme saptan r. Ço unlukla ilk dört günde üreme görülür. H.capsulatum ve filamentöz mantarlar bu besiyerinde bazen 10-14 günde ürer. (Optimal s : 30 o C, süre:21 gün) nvaziv mikozda en s k Candida cinsi, ikinci s kl kta Aspergillus cinsi etken olarak saptan r (5,9,10,18). Var olan kültürel yöntemlerin zaman al fl, etken mantar izolasyonundaki baflar oran n n çok yüksek olmay fl serolojik testlerin uygulanabilirli ini gündeme getirmifltir. Mantarlar, bakteriler ile karfl laflt r ld klar nda zay f antijenik yap ya sahip olsalar da, serumda sirküle olan antijen ve antikorlar n n saptanmas ve uygulanan deri testleri mikolojik tan ya yard mc olur. Çeflitli mikotik infeksiyonlarda tedaviye yan t n belirlenmesi için hastal k prognozunun izlenmesinde serolojik testlerden yararlan labilir (3,10,15,18). Günümüzde, serolojik test kitleri bulunan mikozlar: Kandidoz, kriptokokkoz, aspergilloz, blastomikoz, parakoksidiyo- - 25 -

nvaziv mantar hastal klar idomikoz, sporotrikoz, histoplazmoz, koksidiyoidomikoz dur. Serolojik test kitleri geliflme aflamas ndaki mikozlar: Pnömosistoz, zigomikoz, kromoblastomikoz dur. Patojenik mantarlar n çeflitli cins ve türlerinin ortak antijen yap s na sahip olmalar nedeniyle ço unlukla yüzeyel kolonizasyon ve derin mikoz ay r m nda karars z kal n r ve bu nedenle mantar infeksiyonlar nda antikor tan s n n yarar s n rl d r. Bu testlerden ancak subkutan ve derin mikoz ay r m nda yararlan l r. Histoplazmoz ve koksidiyoidomikozda antikor tan s de erlidir. Ardarda al nan serumlarda titrasyon art fl n n saptanmas anlaml d r. En gerçekçi mikoserolojik test; C.neoformans n antijen tan s d r. Aspergilloz, kandidoz, histoplazmoz için benzer serolojik testler gelifltirilmektedir. KAND DOZDA SEROLOJ K TANI nvaziv kandidozlu hastalar n % 50-70 i günümüzde kaybedilmektedir. Candida antijenleri Testler - Hücre duvar mannan EIA, RIA, LA - 1,3-b-D-glukan (çift antikor sandviç EIA ile kanserli hasta otopsilerinde % 65 duyarl l k, %100 özgüllük) - Enolaz (48 kda a rl ndaki EIA, RIA, LA stoplazmik protein) invaziv (Cand.tec: % 88 kandidozda seyrek olarak antikor duyarl yan t al n r. (48,52,45,47 kda (% 77 özgül) a rl kl antikorlar immunblot, IH,IF,IDF ile araflt r l r) -Hücre duvar termolabil glikoproteini -Polisakkaritçe zengin yüksek molekül a rl kl antijen (235 kda-250 kda) LA (1/8 titrasyon anlaml,1/4 titrasyon hem invaziv, hem kolonizan kiflilerde pozitif) CIE - Acotinase, pyruvate kinase, WB EIA, antijen phosphoglycerate, mutase, yakalamal EIA, methionine synthase,aspartil inhibisyon EIA proteinase (SAP) (invaziv kandidoz tan ve tedavisinde önemli) Serum D-arabinitol, fungemi tan s nda önemli bir belirleyicidir, invaziv kandidozda idrarda saptan r (3,10,15,25). KR PTOKOKKOZDA SEROLOJ K TANI C.neoformans antijeni: Test Polisakkarit glukoroksilomannan LA(en gerçekçi (GXM) mikoserolojik test) Örnekteki Trichosporon asahii ve Capnocytophaga canimorsus (DF-2 basili) varl çapraz reaksiyona neden olabilir. Yalanc pozitifliklerde titrasyon 1/8 den azd r. LA ile; hem BOS, hem de serumda kriptokokkal meninjitli hastalar n % 90 dan fazlas nda pozitiflik saptan r (5,10,15,21,24). ASPERG LLOZDA SEROLOJ K TANI A.fumigatus, % 90; A.flavus % 10, A.niger % 2, A.terreus % 2, A.nidulans < % 1 civar nda invaziv aspergilloz etkenidir. Aspergillus antijenleri Testler - Galaktomannan polisakkarit antijeni CIE (serum, idrar, BAL, perikard s v s RIA ve BOS da) nvaziv infeksiyonda (IA) seruma LA k yasla idrarda daha yüksek pozitiflik oran saptan r. % 12 yalanc pozitiflik görülebilir. EIA (sandviç EIA, hematoloji hastalar nda daha duyarl olup % 50-90 duyarl l k, % 81-93 özgüllü e sahiptir. Çocuklarda alçak titrede yalanc pozitiflik saptan r. Kronik granulamatöz hastal olanlarda yalanc negatiflik görülebilir. A.fumigatus galaktomannan antijeni 1 ng/ml ye kadar saptanabilir. Riskli nötropenik hastalarda testin haftada 2-3 kez tekrar önerilir. - 1-3 b-d glukan (hücre duvar EIA (% 90 duyarl l k, komponenti olup serolojik tan da % 100 özgüllük) yeni bir yaklafl m olarak görülmektedir. EIA testlerinin asemptomatik IA riskli hastalarda tarama amac ile yetersiz; semptomatik hastalarda klinik tan y do rulamak için yeterli oldu u kabul edilmifltir. Antikor testlerinin, allerjik bronkopulmoner aspergilloz (ABA) ve aspergilloma tan s nda yararl, kronik invaziv aspergillozdaki yarar ise tart flmal d r. - 26 -

Invasive myocoses Antikor testleri IH, LA, IE, (yeni gelifltirilen Paragon yöntemi) RIA, EIA, BALISA, luminescent immunassay, indirekt IF (3,9,10,11,15,16,30). H STOPLAZMOZDA SEROLOJ K TANI Antikor testleri : CF, presipitasyon, LA, ID CF, en uygun testtir: 1/8 titrasyonda pozitiflik anlaml olup, 1/32 titrasyonda pozitiflik aktif infeksiyonu gösterir. Titrasyonda dört kat art fl anlaml d r.% 15 yalanc pozitiflik (blastomikoz,koksidiyoidomikozda) saptanabilir. H ve M antijenlerine karfl oluflan presipitasyonlar önemli kabul edilir. H antijeni; infeksiyon göstergesidir. M antijeni sadece aktif hastal k s ras nda de il, di er zamanlarda da pozitif olabilir (3,5,7,10,15,18,19,21,31). KOKS D YO DOM KOZDA SEROLOJ K TANI Primer serolojik testler önemlidir. Antikor yan t tan ve prognozda de erlidir. Erken primer infeksiyonda presipite edici antikorlar (IgM) oluflur. IgG s n f CF antikorlar infeksiyonun sonunda ortaya ç kar. Antikorlar IgM (iki hafta içinde belirlenip, alt hafta içinde kaybolur) lgg Testler Tüp presipitasyon veya ID (IDTP) Çift ID (IDCF) Antijen: Koksidioidin ve sferülin (her ikisi de eflit duyarl l a sahiptir, sferülin özgüllük aç s ndan üstünlük gösterir). IgG, IgM tan s nda LA (yalanc pozitiflik saptanabilir), EIA ve RIA testlerinden yararlan labilir(3,5,10,11,13,15,18,19,21). BLASTOM KOZDA SEROLOJ K TANI Bu konuda yap lm fl olan immunolojik araflt rmalar yeterli de- ildir. CF, ID, EIA, RIA testleri ile B.dermatitidis e karfl oluflan antikorlar aran r. CF, yeterli duyarl l k ve özgüllü e sahip, de ildir, ID ile, CF dan daha sa l kl sonuçlar al n r. RIA testinde 120 kda hücre duvar protein antijeni (WI-1) kullanarak etkene karfl antikorlar araflt r lm flt r. % 52-80 hastada; A antijenine karfl antikorlar saptanm flt r. En uygun tan, yöntemi; organizman n mikroskopta gözlemlenmesidir. (2,10,15,21). PARAKOKS D YO DOM KOZDA SEROLOJ K TANI Agar jel ID testi ile olgular n % 95 inde dolaflan antikorlar saptan r, özgüllük oran yüksektir. CF (Albeit) IF, CIE, dotblot yöntemleri, di er antikor saptay - c testlerdir. Glikoprotein yap s ndaki gp43 e karfl oluflan IgG, IgM, IgA antikorlar n n belirlenmesinde EIA yöntemi ile iyi sonuçlar al nm flt r. % 60 dan fazla hastada antijen varl saptanm flt r (3,10,15,18). P.J ROVEC NFEKS YONLARINDA SEROLOJ K TANI Antipnömosistis antikor testlerinin tan da yarars z oldu u belirlenmifltir. En s k kullan lan, kist ve trofozoit saptay c ; mikroskopiden daha duyarl, ancak daha pahal olan IF yöntemidir. Çözünebilir P.jirovecii antijenlerinin saptanmas nda immunblot yöntemi kullan l r (10,12,14,22). MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLER Giderek popüler olmakla birlikte her klinik mikoloji laboratuvar nda rutin bir yöntem olarak uygulanmas gerek ekonomik nedenlerden, gerekse de tam bir standardizasyonunun sa lanamamas nedeni ile olas de ildir. Ancak invaziv mikozlarda mortalitenin yüksekli inden dolay erken tan çok önemli oldu u için ve bu yöntemlerle k sa zamanda sonuca ulafl ld ndan günümüzde birçok araflt rma laboratuar nda klinik örneklerde mantar DNA s n n saptanmas konusunda ümit verici çeflitli çal flmalar yap lmaktad r. Ayr ca, tür tayini, epidemiyolojik tiplendirme ve ilaç direnci konulu araflt rmalarda da epeyce yol al nm fl olup, çal flmalar sürdürülmektedir. nfeksiyon etkeni mantarlar n saptanmas ve tan mlanmas nda nükleik asit amplifikasyon ve hibridizasyon problar n n kullan ld sinyal amplifikasyon yöntemlerinden yararlan l r. Nükleik asit amplifikasyon teknolojilerinde polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya benzeri yöntemler kullan l r. yi donan ml klinik mikoloji laboratuvarlar nda Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis ve Coccidioides immitis tan mlanmas nda s kl kla nükleik asit hibridizasyon problar ye lenir.pcr çift iplikli bir DNA molekülünde, hedef dizilere iki oligonükleotid primerin ba lanmas ve uzamas esas na dayan r. Testin duyarl l (kan örneklerinde birden fazla kez çal fl ld nda) %100 dür.testin pozitifli i için gerekli süre iki gündür (Klinik tan için belirlenen ortalama süre: dokuz gün).yöntemi uygularken çevrede yayg n olarak bulunan küflerden dolay oluflabilecek kontaminasyon riski üzerinde titizlikle durulmas gerekir. Günümüzde sadece sistemik mikoz etkeni birkaç mantar türü için ticari kitler mevcuttur (Tablo1). Tablo 1. Sistemik mikoz etkeni olan mantarlar n moleküler tan lar n sa layan kitler ve uygulama süreleri Mantarlar Süre Test Hedef C.neoformans 2 saat Accuprobe rrna H.capsulatum 2 saat Accuprobe rrna C.immitis 2 saat Accuprobe rrna B.dermatitidis 2 saat Accuprobe rrna PCR temelli tan n n, geleneksel kan kültüründen daha duyarl oldu u (özellikle nötropenik hastalarda) gösterilmifltir. Bundan dolay mantar yükünün çok az olmas nedeniyle, kültür ve - 27 -

nvaziv mantar hastal klar serolojik tan n n henüz yetersiz oldu u evrede PCR temelli tan yöntemlerinin çok daha etkin olaca söylenebilir. Reverstranskriptaz (RT) PCR da hedef RNA n n ço alt lmas amaçlanm flt r. Pneumocystis jirovecii yi de içeren çeflitli mantarlar n saptanmas n amaçlayan PCR-parmak izi (PCR fingerprinting), mitokondriyal sitokrom b gen dizi analizi, multipleks PCR, gerçek zamanl PCR(real-time PCR), yuvalanm fl PCR (nested PCR), kesilmifl parçalar n uzunluk polimorfizmi (RFLP), rastgele ço alt lm fl polimorfik DNA (RAPD) ve PCR ELIZA (PCR-EIA) yöntemleri PCR temeline dayanmaktad r. Çeflitli hibridizasyon yöntemlerinden baz lar çizgi prob {line prob assay (PCR-LPA)}, referans sarmal arac l kl uyum tekni i {reference strand mediated conformational analysis (RSCA)} ve insitu hibridizasyon (ISH) dur. Yeni moleküler yöntemlerin yak n bir gelecekte tan sürecini k salt p, do ru tan olas l n art rmas, en k sa zamanda etkene özgü tedavi olana sa lay p, klinik baflar oran n art rmas hedeflenmektedir (1,4,19,20,21). Sonuç olarak, ba fl kl k yetmezli i olan hastalarda (özellikle nötropenikler) Candida, Aspergillus, Cryptococcus ve Pneumocystis vb. gibi ön plandaki mantar infeksiyonunun tan mlanmas nda, geleneksel yöntemlerin yan s ra koflullar uygunsa h zl tan yöntemlerinin de gözard edilmemesi ve geliflmifl teknolojik yöntemlerin devreye sokulmas hastan n k sa zamanda tedavisi aç s ndan büyük yarar sa layacakt r. KAYNAKLAR 1. Bialek R, Konrad F, Kern J, Aepinus C, Cecenas L, Gonzales GM Just-Nubling G, Willinger B,Presterl E, Lass-Florl C,Rickerts V. PCR based identification and discrimination of agents of mucormycosis and aspergillosis in paraffin wax embedded tissue. J Clin Pathol 2005; 58:1180-1184. 2. Bradsher RW. Blastomycoses. In: Dismukes WE, Pappas PG, Sobel JD (eds). Clinical mycology. Oxford University Press. New- York, USA, 2003; pp 299-310. 3. de Repentigny L, Serological techniques for diagnosis of fungal infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1989; 8:361-375. 4. de Valk HA, Meis JF, Curfs IM, Muehlethaler K, Mouton JW, Klassen CH. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. J Clin Microbiol 2005; 43:4112-4120. 5. Dupont P, Pappas PG, Dismukes WE. Fungal infections among patients with AIDS. In: Dismukes WE, Pappas PG, Sobel JD (eds). Clinical mycology. Oxford University Press. NewYork, 2003; pp 188-205. 6. Frank U, Malkotis D, Mlangeni D, Daschner FD. Controlled clinical comparison of three commercial blood culture systems. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999; 18:248-255. 7. Gomez BL, Figuero JL, Hamilton AJ, Ortiz BL, Robledo MA, Restrepo AHay RJ. Development of a novel antigen test for histoplasmosis J Clin Microbiol 1997; 35:2618-2622. 8. Guinvarc h A, Guilbert L,Marmorat-Khuong A, Lavarde V, Chevalier P, Guillemain R, Berrebi A. Disseminated Fusarium solani infection with endocarditis in a lung transplant recipient. Mycoses 1998; 41: 59-61. 9. Kern ME. Medical mycology a self-instructional text, FA Davis Co. Philadelphia, USA, 3nd ed; 1988. 10. Kwon-Chung KJ, Bennett JE. Medical mycology, Lea&Febiger. Philadelphia, USA, 1992. 11. Larone DM. Medical important fungi,a quide to identification, ASM Press. Washington D.C, USA, 4nd ed; 2002. 12. Linke MJ, Rebholz S, Collins M, Tanaka R, Cushion MT. Noninvasive method for monitoring Pneumocystis carinii pneumonia. Emerg Infect Dis 2003; 9:1613-1616. 13. Merz WF, Roberts GD. Algorithms for detection and identification of fungi. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JM, Pfaller MA (eds). Manual of Clinical Microbiology. ASM Press. Washington, USA, 8nd., 2003; pp 299-310. 14. Ng L, Virani NA, Chaisson RE, Yajko DM, Sphar HT, Cabrian K, Rollins N, Charache P, Krieger M, Hadley WK. Rapid detection of Pneumocystis carinii using a direct fluorescent monoclonal antibody stain. J Clin Microbiol 1990;28:2228-2233. 15. O Shaughnessy EM, Shea YM, Witebsky FG. Laboratory diagnosis of invasive mycoses. Infect Dis Clin N Am 2003; 17:135-158. 16. Peterson DL. New clinical presentations of invasive aspergillosis in non-conventional hosts. Clin Microbiol Infect 2004; 10:24-30. 17. Pfaller MA, Diekema DJ. Twelve years of fluconazole in clinical practice: global trends in species distribution and fluconazole susceptibility of bloodstream isolates of Candida. Clin Microbiol Infect 2004; 10:11-23. 18. Richardson MD, Warnock DW. Fungal infection, diagnosis and management, Blackwell Pub Ltd. Massachusetts, USA, 3nd ed; 2003. 19. Sandhu GS, Kline BC, Stockman L, Roberts GD.Molecular probes for diagnosis of fungal infections. J Clin Microbiol 1995; 33:2913-2919. 20. Sar bafl Z, Ar kan S(çevirenler).Patojen mantarlar n moleküler yöntemlerle saptanmas. çinde: Tekeli A, Ustaçelebi fi(çeviri editörleri).moleküler mikrobiyoloji, tan prensipleri ve uygulamalar. Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang YW, Unger ER, Relman DA, White TJ (eds): Molecular microbiology, diagnostic principles and practice kitab ndan. Palme yay nc l k. Ankara, 2006; 551-559. 21. Stockman L, Clark KA, Hunt JM, Roberts GD. Evaluation of commercially available acridinium ester-labeled chemiluminescent DNA probes for culture identification of Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans and Histoplasma capsulatum. J Clin Microbiol 1993; 31:845-850. 22 Stringer JR, Beard CB, Miller RF, Wakefield E. A new name (Pneumocystis Jiroveci) for Pneumocystis from humans. Emerg Infect Dis 2002; 8:891-896. 23. Sutton DA. Specimen collection, transport and proccessing: Mycology In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA (eds). Manual of clinical microbiology. ASM Press Washington, USA, 8nd ed., 2003; pp 1659-1667. 24. Tanner DC, Weinstein MP, Fedorciw B, Joho KL, Thorpe JJ, Reller L. Comparison of commercial kits for detection of cryptococcal antigen. J Clin Microbiol 1994; 32:1680-1684. 25. Tavanti A, Davidson AD,Johnson EM, Maiden MC, Shaw DJ, Gow NA, Odds FC. Multilocus sequencetyping for differentiation of strains of Candida tropicalis. J Clin Microbiol 2005; 43:5593-5600. 26. Vanbreuseghem R, Vroey CH De, Takashio M. Practical quide to medical and veterinery mycology, Masson Pub. NewYork, USA, 2nd ed., 1978. 27. Walsh TJ, Fancesconi A, Kasai M, Chanock SJ. PCR and singlestrand conformational polymorphism for recognition of medically important opportunistic fungi. J Clin Microbiol 1995; 33:3216-3220. 28. Walsh TJ, Groll A, Hiemenz J, Fleming R, Roilides E, Anaissie E. Infections due to emerging and uncommon medically important fungal pathogens. Clin Microbiol Infect 2004; 10: 48-66. 29. Welty FK, McLeod GX, Ezratty C, Healy RW, Karchmer E. Pseudallescheria boydii endocarditis of the pulmonic valve in a liver transplant recipient. Clin Infect Dis 1992; 15:858-860. 30. Wheat LJ. Rapid diagnosis of invasive aspergillosis by antigen detection. Transpl Infect Dis 2003; 5:158-166. 31. Wheat LJ. Current diagnosis of histoplasmosis. Trends Microbiol 2003; 11:488-494. 32. Yeo SF, Wong B. Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive fungal infections. Clin Microbiol Rev 2002; 15:465-484. - 28 -