F. Ü. Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi, 16(4), 718-724, 2004 Doğu Anadolu Bölgesinde Bazı Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss) İşletmelerinde Görülen Flavobacterium psychrophilum Enfeksiyonunun Araştırılması Ünal İPİR Engin ŞEKER Naim AĞLAM Mustafa DÖRÜCÜ Fırat Üniversitesi u ürünleri Fakültesi, Hastalıklar Bilim Dalı. 23119, Elazığ Özet Doğu Anadolu Bölgesinde Elazığ, Malatya ve Erzincan illerinde bulunan beş farklı alabalık işletmesinde 2000 2002 yılları arasında 0.2 0.8 g ağırlığındaki gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss, W., 1792) yavrularında öldürücü bir enfeksiyona rastlandı. Hastalıklı balıklarda kısmen ekzoftalmus ve deride kararmaların olduğu, balıkların durgun, iştahsız ve yem almadıkları gözlendi. Bağırsakların boş ve yer yer hemorajik odakların oluştuğu görüldü. İç organlardan Anacker Ordal Agar (AOA) a ekimler yapılarak etkenin Flavobacterium psychrophilum olduğu belirlendi. Disk diffüzyon yöntemi ile antibiyogram testi uygulanarak suşların oksitetrasiklin, nitrofuran, amoksilin + klavunolik asit ve eritromisin antibiyotiklerine karşı duyarlı; kloramfenikol ve penisilin e ise dirençli olduğu tespit edildi. Anahtar kelimeler: Flavobacterium psychrophilum, Gökkuşağı alabalığı, antibiyotik A tudy of Flavobacterium psychrophilum Infection in ome Cultured Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Eastern Anatolia Abstract An outbreak has appeared affecting rainbow trout weighting 0.2 0.8 g from five different fish management units in East Anatolia Region between years 2000 2002. Infected fish had exophthalmus, and dark skin. They were calm, feed unwillingly and sometimes eat noting. Intestine of fish was empty and hemorrhagic. Flavobacterium psychrophilum was detected from incubation of samples from internal organs of fish on Anacker Ordal Agar (AOA). Antibiogram test by disc diffusion methods showed that strains have resistance to chloraphenycol and penicillin but sensitive to antibiotics; oxytetracyline, nitrofuran, amoxicillin + clavunolic acid and erytromycine. Key words: Flavobacterium psychrophilum, Rainbow trout, antibiotic 1. Giriş Kültür balıkçılığının gelişmesiyle birlikte bakteriyel kökenli balık hastalıklarıda, ekonomik kayıplara neden olan etkenlerin en önemlilerinden birini oluşturmaktadır. Hastalığın şiddeti, balığın yaşına ve türüne göre değişmekle birlikte balıklardaki bir çok enfeksiyonun tedavisi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmektedir. Ancak çevre şartlarının olumsuzluğu
Doğu Anadolu Bölgesinde Bazı Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss) İşletmelerinde Görülen balıkların hastalıktan korunmasını ve kontrol önlemlerinin alınmasını zorlaştırmakta, hatta imkansız hale getirebilmektedir. almonid lerin fry sendromu veya soğuk su hastalığı adıyla da bilinen enfeksiyonların etkeni Gram negatif, sporsuz, kapsülsüz, aerobik veya fakültatif anaerobik çomak şeklinde bir bakteri olan Flavobacterium psychrophilum dur. Flavobacterium psychrophilum A.B.D. de ilk kez 1948 de Coho salmonlardan (O. kisutch) izole edilmiştir. almo salar, Anguilla anguilla, Cyprinus carpio, Tinca tinca gibi bir çok balık türünde bu patojen izole edilmiş ve önemli ekonomik kayıplara neden olduğu bildirilmiştir [1, 2]. Japonya da 1987 den beri doğal sularda ve Plecaglossus altivelis üretimi yapılan işletmelerde ciddi sorunlar oluşturmaktadır [3, 4]. Türkiye de; gökkuşağı alabalığı işletmelerinde fry ve fingerling balıklarda etkenin izole edildiği bildirilmiş [5-8] olup 0.5 1.0 g lık balıklarda yüksek mortaliteye (% 75) neden olduğu tespit edilmiştir [5]. Bu araştırmada da; Türkiye nin Doğu Anadolu Bölgesinde yer alan beş farklı alabalık işletmesinde yavru balıklarda toplu ölümlere neden olan etkenin ortaya çıkarılması ve gerekli tedavi şeklinin önerilmesi amaçlanmıştır. 2. Materyal ve Metot Keban (Elazığ), ürgü (Malatya) ve Kemaliye (Erzincan) yöresinde bulunan bazı gökkuşağı alabalığı işletmelerinde Nisan - Mayıs aylarında toplu ölümlerin olduğunun bildirilmesi üzerine, belirtilen tesislere gidilerek yerinde incelemeler yapıldı ve Fırat Üniversitesi u Ürünleri Fakültesi Balık Hastalıkları laboratuvarına canlı olarak getirilen 0.2 0.8 g ağırlığındaki yavruların iç organlarından ve derilerinden hazırlanan preparatlar mikroskopta native olarak incelendi. Hastalık semptomları gösteren balıklardan; Anacker Ordal Agar (AOA), Tryptone oy Agar (TA) ve Brain Hearth Infusion Agar (BHIA) a ekimler yapıldı. Agarlar 20 o C de 2 hafta boyunca inkübe edildi. İzole edilen 5 suşun fizyolojik, morfolojik ve biyokimyasal karakterleri Plump ve Bowser, [9] ile Austin ve Austin [10] a göre identifiye edildi. Bakteri suşlarının morfolojik karakterleri native muayene ve gram boyama ile yapıldı. Oksidasyon/Fermentasyon (O/F) testi, oksidaz, katalaz, Flexirubin pigment üretimi, Kongo red testi, Jelatin hidrolozi testi, İMVİC testleri ve Triple ugar Iron Agar (TIA) kullanılarak bazı biyokimyasal özellikleri belirlendi. Mikroorganizmanın tanımlanmasında [11] dan yararlanıldı. Elde edilen izolata AOA besiyeri kullanarak Antibiyogram testi uygulandı. İnhibisyon zonları milimetrik olarak ölçülüp, sonuçlar dirençli ve duyarlı olarak tanımlandı 3. Bulgular Her üç bölgedeki balıkçılık işletmelerinden alınan anamnezde; özellikle ortalama ağırlığı 0.65 ± 0.11 g ağırlığındaki yavrularda % 50 70 oranında ölümlerin olduğu, balıkların durgun, iştahsız veya yem almadığı belirlendi. Balıkların bulunduğu suyun 12 oc, 7.01 7.35 ph ve 7.65 8.11 mg L-1 O2 düzeyinde olduğu tespit edildi. Yavru balıkların dış bakısında, 719
Ü. İspir, E. Şeker, N. ağlam ve M. Dörücü renklerde kararma ile birlikte kısmen ekzoftalmus gözlendi. Otopside sindirim sisteminin boş, bağırsakların sarımtırak bir sıvı ile dolduğu ve yer yer hemorajilerin oluştuğu görüldü. olungaç ve karaciğerde solgunluk belirlendi. Native olarak yapılan bakteriyolojik incelemede, iç organlarda herhangi bir bakteriye rastlanmazken deride gilding hareketi yapan bakteriler tespit edildi. AOA da 7 10 gün inkübasyondan sonra açık sarı pigmentli koloniler izole edildi. TA da ise 3 4 gün sonra parlak sarı renkli kolonilerin ürediği görüldü. Her iki besiyerinde de kolonilerin kenarları düz, yuvarlak, sarı pigmentli ve agara yapışmadığı gözlendi. İzolatlara uygulanan Biyokimyasal testler sonucunda (Tablo 1) üç bölgeden izole edilen 5 suşun da aynı ve Flavobacterium psychrophilum olduğu belirlendi. Tablo 1. Doğal olarak infekte gökkuşağı alabalığı yavrularından izole edilen bakterinin (Flavobacterium psychrophilum) fenotipik ve biyokimyasal karakterleri Biyokimyasal testler I. izolat II. izolat III. izolat IV. izolat V. izolat Gram boyama - - - - - Hareket (Oda sıcaklığında) + * + * + * + * + * Koloni rengi sarı sarı sarı sarı sarı Flexirubin tipi pigment + + + + + Kongo red testi - - - - - Jelatin hidrolozi + + + + + Oxidaz - + (z) + (z) + + Katalaz + + + + (z) + Metil Red testi - - - - - Voges Proskauer reaksiyonu - - - - - itrat (immons) kullanımı - - - - - Üre hidrolizi (Üreaz) - - - - - H 2 üretimi (TIA da) - - - - - İndol üretimi - - - - - Nitrat üretimi - - - - - 5 o C üreme + + + + + 25 o C üreme - - - - - 37 o C üreme - - - - - Glukoz (TIA da) - - - - - Laktoz (TIA da) - - - - - Galaktoz - - - - - ucroz - - - - - Arabinoz - - - - - orbitol - - - - - Oxidasyon/Fermentasyon (O/F) F F F F F * Kayma hareketi (z): Zayıf aktivasyon 720
Doğu Anadolu Bölgesinde Bazı Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss) İşletmelerinde Görülen Yapılan antibiyogram testi sonucunda izole bakterilerin gentamisin, oksitetrasiklin, nitrofuran, amoksilin + klavunolik asit ve eritromisin antibiyotiklerine karşı duyarlı, Chloramphenicol ve penicilin antibiyotiklerine ise dirençli oldukları tespit edildi (Tablo 2). Tablo 2. İzole bakterinin (Flavobacterium psychrophilum) bazı kemoterapötik maddelere karşı duyarlılığı Kemoterapötik madde Duyarlılık Gentamisin Oksitetrasiklin Nitrofuran Amoksilin + klavunolik asit Eritromisin Kloramfenikol Penisilin : ensitive (Duyarlı) R: Resistant (Dirençli) R R 4. Tartışma ve onuç on yıllarda balık yetiştiriciliği ve endüstrisi hızla gelişmekte ve buna bağlı olarak da balık hastalıkları da büyük sorunlar oluşturmaya başlamaktadır. Yakın geçmişe kadar balıklar için 15 20 bakteri türünün patojenik etki gösterdiğinin [12] sanılmasına rağmen günümüzde doğal olarak infekte balıklardan 70 e yakın bakteri türü izole edilmiştir [10]. Bu çalışmadaki; bakteriyel izolatlarının identifikasyon test sonuçları (Tablo 1), Flavobactirum psychrophilum un önceki bilgileriyle uyum sağlamıştır [5, 8, 11]. Bu bakteri suyun normal mikrobiyal florasında bulunmakta olup balıklar için potansiyel bir hastalık etkenidir [13]. Çalışma sırasında, bu bakterinin epizootik olarak yavru gökkuşağı alabalıklarında seyrettiği gözlenmiştir. Cytophage/Flexibakter benzeri bakterilerin tatlısu ve deniz balıkları yetiştiriciliğinin her ikisinde de kayıplara neden olduğu önceki araştırmalarda ortaya konulmuştur [14, 15]. Özellikle Avrupanın değişik bölgelerinde Flexibakter türü izolatlara sıkça rastlanılmıştır [2, 16 18]. Enfeksiyon mikroorganizmanın 3-6 günlük inkübasyonundan ve fiziksel su kirliliğinden sonra mikrobiyal aktivitedeki artış ve balığın direncindeki azalış nedeniyle ortaya çıkmakta ve önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır [14]. Flavobacterium psychrophilum un neden olduğu hastalıktan özellikle genç balıklar çok kötü bir şekilde etkilenmektedir. Oncorhynchus kisuch un genç bireylerinde bu etkenden dolayı % 50 oranında mortalite görülmüştür [19]. Gökkuşağı alabalıklarında fry sendromunun genellikle beslemenin ilk iki ayında meydana geldiği [20] ve mortalitenin % 75 civarında olduğu bildirilmiştir [20, 21]. Bu araştırmada da Flavobacterium psychrophilum özellikle beslemenin ilk aylarında 0,2 0,8 g ağırlığındaki fry lerde görülmesi ve işletmelerdeki mortalite oranlarının % 50 70 lerde olması önceki bilgileri doğrulamaktadır. 721
Ü. İspir, E. Şeker, N. ağlam ve M. Dörücü Enfekte juvenil balıklarda renklerde kararma, kısmen ekzoftalmus, durgunluk ve iştahsızlık görüldüğü halde etkenin oluşturduğu lezyon ve yüzgeç dejenerasyonu gibi klinik semptomlara rastlanılamadı. Bu bakterinin neden olduğu enfeksiyonlarda lezyonların büyük balıklarda olduğu görülmüştür [19]. Enfekte balıkların vücut boşluğunda ve özellikle sindirim sisteminin sarımtırak bir sıvı ile dolu olması önceki araştırmalardaki [5, 21] sonuçları desteklemektedir. Bu araştırmada balıkların nekroskopisinde karaciğer ve solungaçlardaki solgunluk, iç organlardaki hemorajiler önceki araştırmalarda [22 25] da görüldüğü halde bu çalışmalarda bildirilen dalakta büyüme, böbrekte solgunluk ve anüsün hemorajik olarak dışarı çıkması gibi bulgulara rastlanılmamıştır. Aquatik çevrede mikrobiyal genetik transferin oluşumu ile direncin meydana gelmesinin potansiyel bir risk oluşturması [26] nedeniyle dirençli izolatların oluşumu ve yetiştiricilikte anti mikrobiyal maddelerin kullanımı arasındaki ilişkiyi tam olarak açıklamak mümkün değildir. Bulaşıcı ve öldürücü bir bakteri olan Cytophaga/Flexibacter benzeri bakterilerin neden olduğu enfeksiyonların sağıtımında çeşitli antimikrobiyal bileşiklerin etkili olarak kullanıldığı bildirilmektedir [27]. Bununla birlikte Flavobacterium psychrophilum un antibiyotiklere karşı geniş duyarlılık gösterdiğide bilinmektedir [13]. Özellikle yavru balıklarda % 20-90 oranında mortaliteye neden olan bu bakterinin [28] izolasyonunu takiben suşun mutlaka antibiyotik duyarlılık testinin yapılması gerekmektedir. Zira Flavobacterium psychrophilum da fonksiyonu tam olarak açıklanmasa da plazmidlerin varlığının olması, bakterinin bazı antibiyotiklere karşı hassasiyetinin zamanla azalabileceğini ortaya koymaktadır. Flavobacterium psychrophilum un neden olduğu enfeksiyonları balıklardan uzaklaştırmak oldukca zor olmaktadır. Oxytetrasiklin, oxolonik asit ve sulfanamit gibi antimikrobiyal bileşikler Cytophage/Flexibakter benzeri bakterileri ile provoke infeksiyonlarda tedavi amaçlı olarak kullanılmaktadır [21, 29]. Bu bakterinin Oxytetrasiklin ve amoksilin e karşı direnç kazanabileceği bildirilmiştir [30 32]. Bu çalışmada da; Oxytetrasiklin, nitrofuran, amoksilin + klavunolik asit ve eritromisin gibi antibiyotiklere karşı duyarlı olduğunun bulunması önceki araştırma [28, 29] bulgularını destekler niteliktedir. Araştırma sonucu olarak elde edilen bulgulara göre Flavobacterium psychrophilum işletmelerden kolayca uzaklaştırılamayan bir hastalık ve önemli mortalitelere neden olduğu anlaşılmaktadır. Bu nedenle; çözüm olarak su sıcaklığının düştüğü aylarda işletmenin genel hijyenik durumuna özen gösterilmesi ve yoğun stoklamadan kaçınarak optimum su kalitesi değerlerinin sağlanması, hastalık ile ilgili mücadele çalışmalarının sürekli yapılması önerilebilir. Kaynaklar 1. J. F. Bernardet, Immunization with bacterial antigens Flavobacterium and Flexibacter infection. Developments in Biological tandardization 90: 179 188, 1997. 2. J. Lehmann, D. Mock, F. tuenberg and J. F. Bernardet, First isolation of Cytophaga psycrophila from a systemic disease in ell and cyprinids. Dis. Aquat. Org., 10: 217 220, 1991. 3. Y. Iido, and A. Mizokami, Outbreaks of coldwater disease in wild ayu and pale chub. Fish Pathol., 31, 157 164, 1996. 4. H. Wakabayashi, T. Toyama, T. Iida,, A study on serotyping of Cytophaga psycrophila isolated from fishes in Japan. Fish Pathol., 29, 101 104, 1994. 722
Doğu Anadolu Bölgesinde Bazı Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss) İşletmelerinde Görülen 5. F. Balta, Kültürü yapılan alabalıklarda (Oncorhynchus mykiss) görülen Flexibacter psychrophila enfeksiyonu. IX. Ulusal u Ürünleri empozyumu. 17 19 Eylül 1997. Eğirdir/Isparta. 641 648., 1997. 6. H. Çağırgan, T. Tanrıkul, F. Balta, Characteristic yellow pigmented bacteria isolated from diseased Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Eighth International Conference Diseases of Fish and hellfish 14 19 ep. 1997, Edinburg, cotland European Association of Fish Pathologists. 7. Ö. Diler,. Altun ve B. I. Işıklı, Kültürü yapılan gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) ndan izole edilen Flavobacterium psychrophilum un fenotipik karakterleri.. D. Ü. Fen Bil. Enst. Derg., 7, 1 8, 2003. 8. J. Korun, ve G. Timur, Gökkuşağı alabalıklarında (O. mykiss) fry mortalite sendromu (FM) üzerinde bir çalışma. İst. Üniv. u Ürün. Derg. 12, 15 30, 2001. 9. J. A. Plump and P. R. Bowser, Microbial fish disease laboratory manual. Brown Printing Company Montgomery, Alabama, UA, p. 95, 1983. 10. B. Austin, and D. A. Austin, Bacterial fish pathogens disease in farmed and wild fish. 2 th edition, Ellis Horwood, London, 376 pp., 1993. 11. J. G. Holt, N. R. Krieg, P. H. A. ueath, J. T. atley, and. T. Williams, Bargey s Manual of Determinative Bacteriology. Williams and Witkins, Baltimore. 1993. 12. A. L.. Munro, The pathogenesis of bacterial diseases of fish. In Microbial disease of fish (ed. By R. J. Roberts). Academic Press, London pp. 131 149, 1982. 13. M. Arda,. eçer ve M. arıeyyüpoğlu, Balık Hastalıkları. Medisan, Ankara, 51 57 s., 2002. 14. J. F. Bernardet and B. Kerovault, Phenotypic and genomic studies of Cytophaga psychrophila isolated from diseased rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in France. Appl. Environ. Microbiol. 55: 1796 1800, 1989. 15. M. L. Kent, C. F. Dungam, R. A. Elstom, and R. A. Holt, Cytophaga sp. (Cytophagales) infection in sea water pen reared Atlantic salmon almo salar. Dis. Aquat. Org., 4: 173 179, 1988. 16. A. C. Campbell, and B. A. Buswell, An investigation into the bacterial aetiology of black patch necrosis in dover sole (olea solea,l.). J. Fish Dis. 5: 495 508, 1982. 17. M. F. Chen, D. Henry Ford and J. M. Groff, Isolation and characterization of Flexibacter maritimus from marine fishes of Chalifornia. J. Aquat. Anim. Health 7: 318 326, 1995. 18. H.Wakayabashi, M. Hikida, K. Masumura, Flexibacter maritimus sp. nov., a pathogen of marine fishes. Int. J. yst. Bacteriol. 36: 396 398, 1986. 19. R. A. Holt, Cytophaga psychrophila the causative agent of bacterial cold water disease in salmonid fish. PhD thesis, Oregon tate University, Corvallis. 1987. 20. E. Lorenzen, I. Dalsgaard, J. From, E. M. Hansen, V. Horlyck, H. Korshom,. Mellergaard, N. J. Olesen, Preliminary investigations of fry mortalitysendrome in raşnbow trout. Bull. Europ. Assoc. Fish Pathol., 11: 77 79, 1991. 21. D. W. Bruno, Cytophaga psychrophila (=Flexibacter psychrophilus) (Borg), histopathology associated with mortalites among farmed rainbow trout, Oncorhynchus mykiss in UK. Bull. Europ. Assoc. Fish Pathol., 12: 215-216, 1992. 22. M. L. Kent, J. M. Groff, J. K. Morrison, W. T. Yasutake, R. A. Holt, piral swimming behaviour due to cranial and vertebral lesions associated with Cytophaga psychrophila infections in salmonid fishes. Dis. Aquat. Org., 6: 11 16, 1989. 23. V. E. Ostland, D. G. McGrogan, H. W. Ferguson, Cephalic osteochhondritis and necroticscleritis in intensively reared salmonids associated with Flexibacter psychrophilus. J. Fish Dis., 20. 443 451, 1997. 723
Ü. İspir, E. Şeker, N. ağlam ve M. Dörücü 24. L. Madseen and I. Dalsgaard, Vertebral column deformities in farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 171: 41 48. 1999. 25. L. Madseen and I. Dalsgaard, Comparative studies of Danish Flavobacterium psychrophilum isolates: ribotypes, plasmid profiles, srotypes and virulence. J. Fish Dis., 23: 211 218, 2000. 26. C. L. Gyles,. Palchaudhuri, W. F. Maas, Naturally occuring plasmid carrying genes for enterotoxin production and drug resistance. cience 198: 198 199, 1978. 27. M. oltani,. hanker, and B. L. Munday, Chemotherapy of Cytophaga / Flexibacter like bacteria (CFLB) infections in fish: studies validating clinical efficacies of selected antimicrobials. J. Fish Dis.18: 555 565, 1995. 28. O. Evensen and E. Lorenzen, imultaneous demonstration of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) and Flavobacterium psychorophilum in paraffin embedded specimens of rainbow trout Oncorhynchus mykiss fry by use of paired immnohistochemistry. Dis. Aquat. Org., 29: 227 232, 1997. 29. R. A. Holt, J.. Rohove, J. L. Fryer, Bacterial cold water disease. In: V. Inglis, R. J. Roberts, N. R. Bromage (Eds). Bacterial diseases of fish. Blackwell cientific Publications. UK. 3 23, 1993. 30. R. E. Rangdale, R. H. Richards, D. J. Alderman, Minimum inhibitory concentrations of selected antimicrobial compounds against Flavobacterium psychrophilum the causal agent of rainbow trout fry sendrome. Aquaculture 158: 193 201, 1997. 31. M.. Bruun, A.. chmidt, L. Madsen, I. Dalsgaard, Antimicrobial resistance patterns Danish isolated Flavobacterium psychrophilum. Aquaculture 189: 201 212, 2000. 32. I. Dalsgaard and Madsen, L., Bacterial pathogens in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, reared at Danish freshwater farms. J. Fish Dis., 23: 199 209, 2000. 724