Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri

DERLEME REVIEW Hacettepe T p Dergisi 2010; 41:13-27 Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri Ayfle Dürdal Us 1 1 Prof. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Viroloji Ünitesi, Ankara ÖZET İnfluenza virüsleri, genetik değişime uğramaları ve pandemiler oluşturmaları nedeniyle tarih boyunca önemlerini korumuşlardır. Orthomyxoviridae ailesinde yer alan bu virüsler, zarflı, sferik/pleomorfik yapılı ve heliksel nükleokapsidli olup, parçalı RNA içerirler. Tek iplikli, negatif polariteli sekiz parçalı RNA, 10 adet yapısal ve bir adet yapısal olmayan protein kodlar. İnfluenza virüsleri, nükleoprotein (NP) ve matriks (M) proteinlerindeki farklılıklara göre üç tipe (tip A, B ve C); influenza tip A virüsleri ise zarf glikoproteinleri olan hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) antijenlerindeki farklılıklara göre alt tiplere (16 HA, 9 NA) ayrılır. İnfluenza tip A virüslerindeki antijenik değişimler, antijenik kayma (drift) (nokta mutasyonları ile) ve antijenik sapma (şift) (genetik karışım ile) sonucu ortaya çıkmaktadır. Antijenik sapma olayı ile ortaya çıkan yeni alt tipler, toplumların çoğu ya da hepsinin duyarlı olması nedeniyle pandemiler oluşturmaktadır. Tüm influenza A virüs alt tiplerinin doğal kaynağı yabani su kuşlarıdır; ancak bazı alt tipler insan, domuz, at, deniz ve diğer memelileri de infekte edebilir. Domuzların epitel hücre yüzey reseptörleri, hem insan hem de kuş orijinli virüslerin hücreyi infekte edebilmesine olanak verdiğinden, bu alt tiplerin yeniden karışıma uğraması açısından domuzlar en uygun konaktır. Nisan 2009 tarihinde ortaya çıkan 21. yüzyılın ilk pandemisi de domuz kaynaklı influenza A (H1N1) virüsleri (swine-origin influenza A virüs; S-OIV) tarafından oluşturulmuştur. Bu virüsler, dört farklı alt tipin gen parçalarını içermekte olup (dörtlü asortan), PB2 ve PA genlerini Kuzey Amerika kuş virüsünden; PB1 genini insan H3N2 virüsünden; HA (H1), NP ve NS genlerini klasik domuz virüsünden; NA (N1) ve M genlerini ise Avrasya kuş-benzeri domuz virüsünden almışlardır. S-OIV suşlarının patojenite ve virülansı, mevsimsel influenza A virüslerine benzemekle birlikte, adaptif gen mutasyonlarının artmasıyla birlikte virülansın değişebileceği de akıldan çıkarılmamalıdır. Pandemik influenza infeksiyonlarının laboratuvar tanısı, Centers for Disease Control and Prevention (CDC) tarafından önerildiği üzere, nazofarengeal aspirat/sürüntü, nazal aspirat/sürüntü ile birlikte orofarengeal sürüntü, endotrakeal aspirat veya bronkoalveoler lavaj örneklerinde gerçek zamanlı revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu ile yapılmaktadır. Bu derleme yazıda, influenza virüslerinin genel özellikleri, pandemik influenza A (H1N1) virüslerinin genetik orijini, patogenezi ve laboratuvar tanısı tartışılmaktadır. Anahtar Kelimeler: İnfluenza virüs, 2009 influenza A (H1N1), etyoloji, patogenez, laboratuvar tanı. 13

Us ABSTRACT Etiopathogenesis and diagnostic laboratory methods in pandemic influenza infections Association of influenza viruses (InfVs) with pandemics during the history due to the antigenic changes leads the maintaining of their importance until to date. InfVs belong to Orthomyxoviridae family, are enveloped and spheric/pleomorphic viruses with helical nucleocapsids. The 8-fragmented genome of single-stranded negative-sense RNA encodes 10 structural and one non-structural proteins. InfVs exhibit three types (type A, B, and C) according to the differences of nucleoprotein (NP) and matrix (M) proteins. Influenza A viruses also exhibit subtypes according to the differences of two major cell surface glycoproteins; hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Antigenic variations in influenza A viruses arise through antigenic drift (via point mutations) and antigenic shift (via genetic reassortment). Antigenic shift refers to the introduction of a novel influenza A virus subtype to which all or most of the population has no preexisting immunity. The natural reservoir for all influenza A subtypes is wild waterfowl, with certain subtypes transmissible among humans, pigs, horses, sea and other mammals. The epithelial cells of swine express suitable receptors in which both human and avian subtypes can bind and infect these cells, making swine a mixing vessel for coinfection and reassortment. The first pandemic of the 21 st century in April 2009 is caused by a newly emerged influenza A (H1N1) virus originated from swine (swine-origin influenza A virus; S- OIV). This virus contain a combination of gene segments from four different subtypes (quadruple assortant). Its PB2 and PA genes originate from North American avian virus; PB1 originates from the human H3N2 virus; HA (H1), NP, and NS genes come from classical swine virus (closely related to the 1918 human influenza A virus); NA and M genes are from the Eurasian avian-like swine virus. The pathogenicity and virulence of S-OIV appears to be similar to the other seasonal influenza A (H1N1) viruses, however it shoud be kept in mind that the virulence may change as the number of adaptive mutations increases. The laboratory diagnosis of 2009 pandemic influenza infections is mainly based on real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction performed in the nasopharyngeal aspirate/swab, nasal aspirate/swab together with oropharyngeal swab, endotracheal aspirate or bronchoalveolar lavage samples, as recommended by Centers for Disease Control and Prevention (CDC). In this review article, general properties of influenza viruses and genetic origin, pathogenesis and laboratory diagnosis of S-OIV have been discussed under the light of recent literature. Key Words: Influenza virus, 2009 influenza A (H1N1), etiology, pathogenesis, laboratory diagnosis. nfluenza virüsleri, ilk kez MÖ 412 yılında Hipokrat tarafından öksürüğü takiben gelişen pnömoni salgını şeklinde tanımlanan ve ilk dokümantasyonu 1580 yılında yapılan pandemiler oluşturmaları nedeniyle tarih boyunca güncelliklerini korumuşlardır. Günümüzde de giderek artan ve hala tüm tıp camiasını, kamuoyunu ve medyayı meşgul eden bir öneme sahiptirler. Bunun nedenleri arasında, virüsün genetik değişime uğrama özelliği; yaş, cinsiyet ve ırk gözetmeksizin her bireyi infekte etme yeteneği; her yıl büyük iş gücü ve ekonomik kayıplara yol açan epidemiler oluşturması ve elbette ki, kimi zaman yüksek mortalite ile seyreden ve ne zaman ortaya çıkacağı bilinmeyen pandemilere neden olmasıdır [1]. Parçalı genomlarına bağlı olarak gen segmentlerinin yeniden yapılanma özelliği ve yüksek antijenik değişim oranı nedeniyle yeni alt tiplerin ortaya çıkması sonucunda influenza tip A virüsleri, 20. yüzyılda üç pandemiye neden olmuşlardır. Bunlar; 1918-1919 yıllarında İspanyol gribi [A (H1N1); 50-100 milyon ölüm; mortalite oranı %5-10], 1957-1958 yıllarında Asya gribi [A (H2N2); 1-2 milyon ölüm; mortalite oranı < %3] ve 1968-1969 yıllarında Hong Kong gribi [A (H3N2); 700 bin ölüm; mortalite oranı < %0.5] pandemileridir [1,2]. Bu alt tipler halen dünyada dolaşımda olan tiplerdir. 1990 lı yılların ikinci yarısından itibaren ise yeni bir pandemi beklentisine girilmiş ve 1997 yılında Hong Kong da doğrudan kuş-insan geçişi ile ortaya çıkan kuş gribi [influenza A (H5N1)] epidemisinin, pandemiye dönüşme riski büyük korkulara yol açmıştır. Zira hipotetik bir hesaplamaya göre, 1918 pandemisindeki ölüm oranı, virülansı ve mortalite oranı çok yüksek olan olası bir influenza A (H5N1) pandemisine uyarlandığında, tüm dünyada ölüm sayısı 180-360 milyon olacaktır [3]. Bu nedenle influenza A (H5N1) pandemisi senaryoları dikkate alınarak ulusal ve uluslararası pandemi planları oluşturulmuştur [4]. Oysa korkulan olmamış ve influenza A (H5N1) virüsü, insandan insana doğrudan bulaş yeteneğini -henüz- kazanmamıştır. Buna karşın beklenen pandemi, 21. yüzyılın ilk pandemisi olarak, 2009 yılı şubat-mart aylarında Meksika da ortaya çıkan, nisan ayında Amerika Birleşik Devletleri (ABD) nde tanımlanan ve hızla dünyaya yayılan domuz kaynaklı influenza A (H1N1) [swine-origin influenza A virüs; S-OIV (H1N1)] virüsü tarafından gerçekleştirilmiştir [2]. NFLUENZA V RÜSLER N N YAPISI Orthomyxoviridae ailesinde yer alan influenza virüsleri, 80-120 nm büyüklüğünde, heliksel nükleokapsidli, zarflı, RNA virüsleridir [5]. Elektron mikroskobunda sferik veya pleomorfik bir görünüm sergilerler (Resim 1). Negatif polariteli tek iplikli sekiz parçadan (influenza tip C de yedi parça) oluşan RNA, dokuz ya- 14 H ACETTEPE T IP D ERG S

Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri zarfın lipid kısmına gömülü olarak bulunur. HA ve NA glikoproteinleri, gerek influenza virüslerinin genetik çeşitliliğini gerekse konak immün yanıtını belirleyen antijenlerdir [5,6]. Resim 1. İnfluenza A (H1N1) virüslerinin elektron mikroskobik görünümü (www.newscientist.com dan alınmıştır). pısal [polimeraz bazik (PB)2, PB1, polimeraz asidik (PA), nükleoprotein (NP), matriks proteini (M)1, M2, hemaglutinin (HA), nöraminidaz (NA), nüklear eksport protein (NEP)] ve bir yapısal olmayan protein (NS1) kodlar (Şekil 1) (Tablo 1) [5]. Virion içindeki her bir negatif tek iplikli RNA parçası, NP ve üç alt üniteden (PB2, PB1, PA) oluşan RNA polimeraz ile ilişkidedir. Bu yapı virüsün ribonükleoprotein (RNP) yapısını oluşturur (Şekil 1). PB1, PB2, PA ve NEP (NS2) proteinleri RNA transkripsiyonu ve replikasyondan sorumludur. Viral zarfın altında yer alan M1, virionun yaklaşık %40 ını oluşturur ve viral partikülün morfogenezinde rol alır. Virüsün iyon kanalı proteini olan M2, endozom membranıyla füzyonu ve viral nükleik asitlerin sitoplazmaya geçişini sağlamaktadır [5]. Zarf üzerinde yer alan iki önemli glikoproteinden birisi olan HA, konak hücre yüzeyindeki sialik asit reseptörlerine bağlanmadan, diğeri olan NA ise olgunlaşma sırasında sialik asidi parçalayarak virüsün infekte hücre yüzeyinden serbestleşmesinden sorumludur. HA, NA ve M2 transmembran proteinleridir ve NFLUENZA V RÜSLER N N REPL KASYONU İnfluenza virüslerinin replikasyonu, RNA virüsü olmalarına rağmen hücre çekirdeğinde gerçekleşmektedir. Tutunma, viral HA nın konak hücre yüzeyindeki sialik aside (N-acetyl neuraminic acid) bağlanmasıyla olur ve virüs, reseptöre bağlı endositozla hücre içine alınır. Endozom içindeki asidik ortamda (ph 5) HA monomerleri tripsin benzeri enzimler tarafından HA1 ve HA2 polipeptidlerine parçalanır [5]. Bu kesim HA nın konformasyonel değişikliğe uğramasına yol açar ve HA2 nin füzyon fonksiyonu aktive olur. Böylece viral zarf ile endozom membranının kaynaşması ve nükleokapsidin sitozole geçişi gerçekleşir (Şekil 2). Ayrıca asidik ph ile aktive olan M2 proteininin de, virion içine proton girişini sağlayarak M1 in parçalanmasında ve soyulma olayında önemli rolü vardır [5]. Viral RNP lerin hücre çekirdeğine taşınması, sahip oldukları özel nüklear translokasyon dizileri sayesinde olur. Nükleusa giren gen segmentlerinin transkripsiyonu, RNA polimeraz kompleksi (PB2, PB1, PA) tarafından yapılır [5,6]. Ancak öncelikle bu kompleksin, hücresel RNA polimeraz II enzimi tarafından metillenerek aktive edilmesi ve konak hücre mrna sının 5 ucundaki cap bölgesini primer olarak kullanması gereklidir. İşte bu nedenle influenza virüsleri, viral mrna transkripsiyonu yapabilmek için çekirdeğe bağımlılık göstermektedir. Negatif iplikli viral RNA lardan iki tip pozitif polariteli RNA transkripsiyonu yapılmaktadır. Bunlardan poliadenillenmiş transkriptler, mrna olarak işlev görürken, poliadenillenmemiş crna lar (complete RNA) progeni viral RNA (vrna) için kalıp görevi görür. Sitoplaz- Nöraminidaz (NA) PB2 5 PA 3 PB1 Polimeraz kompleksi İnfluenza virüs ribonükleoproteini (RNP) Nükleoprotein RNA RNA polimeraz (PB2, PB1, PA) RNA segmentleri NEP Hemaglutinin (HA) İyon kanalı (M2) Matriks proteini (M1) Lipid zarf Nükleokapsid proteini (NP) Şekil 1. İnfluenza virüsünün yapısı (www.virology.ws/influenza-virion.jpg den alınmıştır). 15

Us Tablo 1. İnfluenza tip A virüslerinin gen segmentleri ve kodladıkları proteinler RNA Boyut Protein segmenti (nükleotid) Simge Açık adı Fonksiyon 1 2341 PB2 Polimeraz RNA transkriptaz; cap bağlama bazik 2 2 2341 PB1 Polimeraz RNA transkriptaz; elongasyon bazik 1 3 2233 PA Polimeraz RNA transkriptaz; proteaz aktivitesi asidik 4 1778 HA Hemaglutinin Sialik aside tutunma; viral zarf-endozom membranı füzyonu 5 1565 NP Nükleoprotein Genomun yapısal komponenti, viral RNA nın nüklear/sitoplazmik transportu 6 1413 NA Nöraminidaz Sialik asidin parçalanması, virüsün (sialidaz) hücreden salınımı 7 1027 M1 Matriks proteini Virionun majör komponenti; viral morfogenez M2 İyon kanalı proteini; virüsün soyulması; paketlenme 8 890 NS1 Yapısal olmayan protein RNA transportu, splicing, translasyon; interferon sentezinin baskılanması NEP Nüklear eksport protein Progeni nükleokapsidlerin (NS2) sitoplazmaya taşınması Tomurcuklanma ve salınım Tutunma Paketlenme Posttranslasyonel işlemleme Translasyon Endositoz mrna (+) vrna (-) Füzyon, soyulma Nükleus crna (+) Sitoplazma Şekil 2. İnfluenza virüslerinin replikasyonu (http://www.microbiologybytes.com/virology/orthomyxoviruses.html den uyarlanmıştır). maya taşınan mrna lardan erken proteinlerin translasyonu gerçekleşir ve sentezlenen yüzey proteinleri (HA, NA, M2) hücrenin salgısal yolağına (golgi) girerek glikozillenir ve hücre membranına taşınır. Diğer taraftan 16 PA, PB1, PB2 ve NP proteinleri çekirdeğe geri dönerek crna lardan vrna ipliklerinin transkripsiyonunu yapar. Yeni sentezlenen negatif ipliklerin çoğu vrna yı oluştururken, bazıları da tekrar mrna sentezine katılır H ACETTEPE T IP D ERG S

Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri (Şekil 2). Çekirdeğe geri dönen M1 proteini yeni sentezlenen negatif ipliklere bağlanarak viral mrna sentezini durdururken, NS2 proteini (NEP) progeni (yeni sentezlenen) nükleokapsidlerin çekirdekten sitoplazmaya taşınmasında görev alır [5]. Sitoplazmaya geçen nükleokapsidler hücre yüzeyine doğru taşınır ve daha önceden hücre membranına entegre edilmiş olan HA ve NA ile birlikte paketlenerek tomurcuklanma yoluyla hücreden çıkar [4]. Bu safhada NA, hücre membranındaki sialik asit ünitelerini parçalayarak HA nın sialik aside yapışıp kalmasını önler ve virüsün salınmasını kolaylaştırır. Virüsün hücreden serbestleşmesinden sonra da NA nın fonksiyonu devam etmekte ve solunum yolu mukozasında bulunan sialik asit moleküllerinin parçalanmasına yol açarak virüsün epiteli kaplayan mukopolisakkaridlerin içinden geçişini sağlamaktadır [5]. Virüs hücrelerde lizise yol açmamakla beraber, normal hücresel makromolekül sentezinin bozulması sonucu hücre ölümüne neden olmaktadır. Paketlenme işlemi sırasında, virion içine girecek olan sekiz adet RNA segmentinin doğru olarak seçilmesinde, viral RNA nın kodlama yapmayan 3 ve 5 bölgelerindeki cis-acting sinyallerinin rol oynadığı, ancak yine de paketlemenin rastgele olduğu düşünülmektedir [6]. Bu hipoteze göre; virion içine ortalama 11-12 segment yerleşmekte, ancak sadece doğru sekiz parçanın olduğu virionlar infeksiyöz olmaktadır; ki bu da oluşan viral partiküllerin sadece %10 unun infeksiyöz olduğu bilgisini desteklemektedir. NFLUENZA V RÜS T PLER ve S MLEND RME İnfluenza virüsleri NP ve M proteinlerindeki antijenik farklılıklara göre tip A, tip B ve tip C olmak üzere üç tipe ayrılmıştır. Bu tipler arasında çapraz reaksiyon mevcut değildir. Yüzey glikoproteinlerindeki (HA ve NA) antijenik farklılıklara göre ise alt tiplendirme yapılır. Alt tipler sadece A tipi için geçerlidir. Bugüne kadar kuşlarda 16 HA ve dokuz NA alt tipi tanımlanmışken, insana adapte olmuş üç HA (H1, H2, H3) ve iki NA (N1, N2) alt tipi mevcuttur [5]. İnfluenza virüslerinin alt tip çeşitliliği nedeniyle, isimlendirilmeleri Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) tarafından önerilen formüle göre yapılmaktadır [7]. Bu formülde; virüs tipi/orijin aldığı konak/orijin aldığı coğrafi bölge/izolat numarası/izolasyon yılı (tip A için HA ve NA alt tipleri) belirtilmekte [örn. A/Avian/Hong Kong/1/97 (H5N1)], ancak insan izolatlarında orijin aldığı konak belirtilmemektedir [örn. A/California/7/2009 (H1N1)] (Şekil 3). NFLUENZA V RÜSLER NDE ANT JEN K DE fi M İnfluenza virüsleri negatif iplikli RNA içerdiklerinden, konak hücrede mrna larını sentezleyebilmek için virion içinde RNA ya bağımlı RNA polimeraz enzimi taşımaktadır. Viral RNA polimeraz enziminin ise hata oranı oldukça yüksektir. Bu nedenle transkripsiyon sırasında tüm fragmentlerde nokta mutasyonları meydana gelmektedir. Gen segmentlerinde oluşan nokta mutasyonlarının birikimi sonunda viral antijenlerin (özellikle de HA ve NA nın) değişikliğe uğraması antijenik kayma (antigenic drift) olarak adlandırılır (Şekil 4). Nokta mutasyonları ile yeni bir aminoasidin oluşması uzun zaman almaktadır (%0.5-1/yıl). Epidemiyolojik önemi olan antijenik kayma gösteren suşlarda, HA da bir veya daha fazla antijenik bölge mutasyonları mevcuttur. Antijenik kayma olayı, her üç tip influenza virüsü (tip A, B ve C) için de geçerlidir [5]. İnfluenza virüslerinin fragmentli genom içermesi ise, parçalar arasında rekombinasyon ve reasortman olaylarının gerçekleşmesini sağlamaktadır. Geno- Nükleoprotein farklılıklarına göre A/Fujian/411/2002 (H3N2) Virüsün tipi Coğrafik kaynak İzolat numarası Hemaglutinin tipi İzolasyon yılı HA ve NA farklılıklarına göre (sadece tip A için) Nöraminidaz tipi Virüsün alt tipi Bazı örnekler: A/New Caledonia/20/99 (H1N1) A/Leningrad/134/57 (H2N2) A/Moscow/10/99 (H3N2) B/Hong Kong/330/2001 B/Brisbane/32/2002 Domuz gribi virüsü: A/California/7/2009 (H1N1) Kuş gribi virüsü: A/Avian/Hong Kong/1/97 (H5N1) Şekil 3. İnfluenza virüslerinin isimlendirilmesi (www.bing.com/health ten uyarlanmıştır). 17

Us İnfluenza A (H1N1) HA da küçük değişim H1 N1 Nokta mutasyonu Antijenik drift İnfluenza A (H2N2) 2 farklı alt tipin aynı hücreyi aynı anda infekte etmesi HA nın tamamen değişmesi N2 H2 Genetik karışım Antijenik şift Şekil 4. İnfluenza A virüslerinde antijenik kayma (drift) ve antijenik sapma (şift). mun parçalı olması nedeniyle, bir hücreyi aynı anda infekte eden iki farklı influenza A virüs alt tipinin gen segmentlerinde karışımın olması ve progeni virionlar içine karışmış gen parçalarının paketlenmesi kaçınılmazdır (Şekil 4). Sekizer parça içeren iki farklı virüs tipinin aynı hücreyi infeksiyonu sonunda spontan olarak 256 gen kombinasyonu olasılığı vardır. Genetik karışım (genetic reassortment) olarak bilinen bu olay, viral antijenlerin tamamen değişimiyle sonuçlanır ve oluşan yeni tipler pandemilere yol açar. Genetik karışım ya da rekombinasyon ile HA ve NA yı kodlayan yeni gen segmentlerinin kazanılması ise antijenik sapma (antigenic shift) olarak tanımlanır ve sadece tip A virüslerinde gerçekleşir [5]. NFLUENZA V RÜSLER N N KONAK ÖZGÜLLÜ Ü İnfluenza tip A virüslerinin doğal kaynağı yabani kuşlardır, ancak bu virüsler çok geniş konak özgüllüğü (örn. domestik kuşlar, domuz, insan, at, sığır, deniz memelileri vb.) göstermektedir (Şekil 5). Domestik domuz, hem insan hem de kuş orijinli virüslerin üremesine olanak verdiğinden, bu tiplerin yeniden karışıma uğraması açısından en uygun konaktır. Kuş tiplerinin ise insana geçişi sınırlı olup insanda zayıf replikasyon gösterir. İnfluenza tip B nin doğal konağı insandır; influenza tip C ise insan ve nadiren domuzları infekte etmektedir [5]. İnfluenza virüslerinin konak özgüllüğünü, hücre yüzeyi reseptörleri olan sialik asit moleküllerinin galaktoz ile bağlanma bölgesi belirlemektedir. Örneğin; influenza A virüsünün insan alt tipleri (örn. mevsimsel H1N1), galaktoz ile α-2,6 bağları yapan sialik asit moleküllerinin (SAα2,6Gal) bulunduğu hücreleri tercih eder. Bu moleküller, insan solunum yolu epitel hücrelerinde bol miktarda bulunur. Buna karşın influenza A virüsünün kuş alt tipleri (örn. H5N1), galaktoz ile α-2,3 bağları yapan ve kanatlıların bağırsak hücrelerinde yaygın olarak bulunan sialik asit moleküllerinin (SAα2,3Gal) bulunduğu hücreleri infekte etmektedir. Ancak SAα2,3Gal molekülleri, insanlarda düşük oranda da olsa solunum yolu siliyalı epitel hücrelerinde bulunduğundan, influenza A (H5N1) alt tipinin sınırlı da olsa bu hücreleri infekte etmesi söz konusu olmuştur. Domuzların trakeal epitel hücrelerinde ise, hem SAα2,6Gal hem de SAα2,3Gal molekülleri bulunmaktadır [5,7]. Bu nedenle domuz hücre reseptörleri, hem insan hem de kuş orijinli virüslerin tutunmasına olanak verir ve aynı hücreyi infekte eden farklı alt tiplerin karışıma uğramasını kolaylaştırır (mixing vessel) (Şekil 6) [7]. 18 H ACETTEPE T IP D ERG S

Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri H5N1 Kedi H7N7, H4N5, H3N2 Fok Sığır At Domestik kuşlar (tavuk vb.) H4, 5, 7, 9, 10 N1, 2, 4, 7 H5N1 H7N7 Bıldırcın H9N2 H7N7, H4N8 Gelincik H10N4 İnsan H1N1, H2N2, H3N2 H5N1, H9N2, H7N7 Sınırlı konak geçişi DOĞAL KONAK Yabani kuşlar, su kuşları, ördek vb. Balina H1-16; N1-9 H3N2, H13N9 Domuz H1N1, H1N2, H3N2, H4N6 H5N1 İnsan Şekil 5. İnfluenza A virüs alt tiplerinin konak dağılımı (www.nanocid.com dan alınmıştır). α-2,3 Direkt kuş-insan geçişi nadir α-2,6 Kuş-domuz geçişi α-2,3 ve α-2,6 İnsan-domuz geçişi Domuz-kuş geçişi Domuz-insan geçişi Şekil 6. İnfluenza A virüslerinin konak özgüllüğü (http://www.nature.com/nrmicro/journal/v4/n11/images/nrmicro1530-f2.jpg). Diğer influenza A virüsleri gibi S-OIV suşları da, sialik asit reseptörlerine tutunarak hücreyi infekte etmektedir. Bu virüslerin sialik asit reseptör tiplerine (SAα2,6Gal veya SAα2,3Gal) bağlanma afiniteleri tam olarak bilinmemekle birlikte, insandan insana kolayca bulaşma özellikleri, insan hücre reseptörlerine (SAα2,6Gal) de bağlanabildiğini göstermektedir [7]. İnfluenza tip A virüsünün geniş konak spektrumu, iki önemli sorunu karşımıza çıkarmaktadır. Bunlardan birisi, insan ve hayvan tipleri arasındaki karışım oranının ve yeni pandemik suşların ortaya çıkma olasılığının yüksek olması; diğeri ise hayvan konaklardaki çeşitliliğin varlığı nedeniyle insanlarda aşılama ile eradikasyon olasılığının bulunmamasıdır. 19

Us PANDEM K NFLUENZA A (H1N1) V RÜSÜNÜN GENET K OR J N İnfluenza A (H1N1) virüslerinin bilinen tarihi kökeni 1918 yılına dayanmaktadır. Kuş orijinli olduğu bilinen bu virüs, türler arası geçiş için karmaşık engelleri aşarak insanları infekte etme yeteneği kazanmış ve 20. yüzyılın ilk ve en büyük pandemisine yol açmıştır. Yüksek mortaliteye yol açan 1918 pandemisinden sonra H1N1, insanlarda mevsimsel epidemiler oluşturmaya devam etmiş; 1957 yılında ise H2N2 olarak tanımlanan yeni bir alt tip ile yer değiştirmiştir. 1976 yılında yeniden ortaya çıkan A (H1N1), 1977 yılından beri, kimi zaman H3N2 alt tipinin dominant olduğu mevsimsel epidemiler yapmaya devam etmektedir [7,8]. Domuzlardan ilk kez 1930 yılında izole edilen influenza A (H1N1) virüsünün ise antijenik olarak 1918 insan influenza A virüsüne çok büyük benzerlik gösterdiği saptanmış ve aynı ortak atadan köken aldığı ifade edilmiştir. 1930 lu yıllardan 1990 lı yılların sonuna kadar domuz influenza A virüsleri klasik domuz influenza virüsü olarak anılmış ve bu virüsler uzun süre antijenik stabilitelerini korumuşlardır. Klasik domuz influenza virüsü, 1998 yılında insan influenza A (H3N2) ve Kuzey Amerika kuş influenza (alt tipi bilinmiyor) virüsleri ile genetik karışıma uğramış ve üçlü reasortan H3N2 domuz virüsü ortaya çıkmıştır. Kuzey Amerika da domuz popülasyonu arasında dolaşan üçlü reasortan H3N2 alt tipi, yine 1998 yılında klasik domuz influenza virüsü ile tekrar karışıma uğramış ve oluşan iki yeni domuz alt tipi (H1N1 ve H1N2) Asya da domuz popülasyonu arasında dolaşıma girmiştir. Her ne kadar insan ve domuz H1N1 virüslerinin hepsi kuş kaynaklı ise de bunların evrimi farklı konak türlerinde gerçekleşmiştir [7-9]. 2009 pandemik influenza virüsleri (S-OIV), daha önceden domuz veya insan influenza virüslerinde tanımlanmamış bir gen karışımı içermektedir. Yapılan çalışmalarda, S-OIV izolatlarının dört farklı alt tipin gen parçalarını içerdiği (dörtlü asortman) ortaya konmuştur [10,11]. Bu virüsler, PB2 ve PA genlerini Kuzey Amerika kuş virüsünden; PB1 genini insan H3N2 virüsünden; HA (H1), NP ve NS genlerini klasik domuz virüsünden; NA (N1) ve M genlerini ise Avrasya kuş-benzeri domuz virüsünden almıştır (Şekil 7). S-OIV suşları, diğer pandemik virüsler arasında antijenik olarak klasik domuz influenza A (H1N1) serotipine en fazla benzerlik gösteren virüslerdir. Ancak 2009 S-OIV suşlarının ortaya çıkışı, modern virolojide daha önce benzeri görülmemiş bir olay olarak kabul edilmektedir [7]. Zira bu virüs, yeni bir alt tipin klasik tanımı olan dünya popülasyonunun çoğunda ya da hiçbirisinde daha önce infeksiyon oluşturmamış olma özelliğine uymamaktadır. H1N1 virüsleri 1977 yılından beri sürekli dolaşımdadır ve 1956 yılından önce doğan birçok kişi H2N2 öncesi dönemde H1N1 serotipleri ile karşılaşmıştır. S-OIV ayrıca klasik drift tanımına da uymamaktadır; zira bu virüs, dolaşımdaki insan orijinli H1N1 virüsleri ile direkt bir evrimsel ilişki göstermemektedir. Benzer olarak şift tanımı da 2009 yılı H1N1 virüsüne tam olarak uygulanamamaktadır. Zira H1 ve N1 antijenlerinde bütünüyle gerçekleşen bir değişim söz konusu değildir. S-OIV HA antijeninin, mevsimsel insan influenza A (H1N1) serotipinin HA antijeni ile arasında sadece %20 oranında farklılık olduğu belirtilmektedir [7-12]. S-OIV suşlarının her bir gen segmenti arasında saptanan %99.9 luk dizi homolojisi, türler arasındaki geçişin yakın zamanda ve tek bir defada olduğunu düşündürmektedir. Ancak yine de S-OIV nin, günümüzde dolaşımda olan mevsimsel H1N1 virüsleri ile çok düşük oranda antijenik çapraz reaktivite gösterdiği bir gerçektir. Bu durumun, insan suşlarının, domuz suşlarına göre immün seleksiyon yönünden çok daha ağır bir baskı altında olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. İlginç olarak çocuk ve genç erişkinlerde S-OIV suşlarına karşı çapraz reaksiyon veren antikorlar mevcut değilken, 60 yaşın üzerindeki bireylerin %30-40 ında çapraz reaksiyon veren antikorlar tespit edilmiştir [8,13,14]. 1950 li yıllardan önce insanlar arasında dolaşımda olan H1N1 virüsleri, antijenik olarak klasik domuz H1N1 virüslerine dolayısıyla da S-OIV suşlarına bugünkü mevsimsel H1N1 serotiplerinden çok daha fazla benzerlik göstermektedir. Dolayısıyla o dönemde mevsimsel insan H1N1 virüsleri ile infekte olan kişiler S-OIV ye karşı çapraz koruma sağlayan antikorlara sahiptir. İnfluenza virüslerinin NA ve M proteinleri, klinikte kullanılan iki önemli antiviral ajan için (sırasıyla; amantadin/rimantadin ve oseltamivir/zanamivir) hedef teşkil etmektedir. Bu gen parçalarını Avrasya domuz virüsünden alan S-OIV suşları da, tıpkı ataları gibi oseltamivire duyarlı, amantadine dirençli olma özelliği göstermektedir (Şekil 7) [8]. Fereidouni ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, Genbank veri sisteminden temin edilen 305 S-OIV suşunun sekiz gen segmenti analiz edilmiş ve birçok ülkede dolaşan S-OIV suşlarının iki farklı küme oluşturduğu saptanmıştır [15]. Bu kümeler, sahip oldukları dokuz nükleotid farkı ile kolayca ayırt edilmişlerdir. Bu farklı nükleotidler, yüzey proteinlerini kodlayan iki gen segmenti (HA ve NA) ile dört internal gen segmenti (PB2, NP, M, NS1) üzerinde tespit edilmişlerdir. Yapılan incelemede, mutasyonların sekizinin transisyon, birinin ise transversiyon değişimi olduğu belirlenmiştir. PB1 ve PA 20 H ACETTEPE T IP D ERG S

Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri gen dizileri ise tüm suşlarda aynı bulunmuştur. Ancak saptanan bu mutasyonların, virüsün fenotipik özellikleri ya da biyolojik fonksiyonları üzerinde etkisi yok gibi görünmektedir. Meksika ve ABD de izole edilen suşların analizi, ilk ortaya çıkan S-OIV suşlarının birinci kümeye ait olduğunu, ikinci kümenin ise yaklaşık iki hafta sonra ortaya çıktığını düşündürmektedir [14]. Ancak influenza A virüslerinin genetik ve antijenik değişim oranının yüksek olduğu düşünülürse, bu durumun yadırganmaması gerektiği açıktır. NFLUENZA NFEKS YONLARINDA PATOGENEZ ve MMÜN TE İnfluenza virüsleri, solunum yollarından vücuda girdikten sonra kolonsu epitel hücrelerini infekte etmekte ve konak hücrenin protein sentezini bozarak ölümüne neden olmaktadır. Hücrenin ölümünden önce salınan progeni virionlar komşu hücreleri infekte ederek doku harabiyetine yol açar. Solunum yolu epitel hücreleri, influenza A virüsünün primer hedefidir. Bu hücrelerde yüksek titrelerde çoğalan virüs, daha sonra alveoler makrofajları infekte eder. Virüsle infekte makrofajlar apopitoz ile, epitel hücreleri ise nekrozla ölmektedir [16]. Hücre nekrozu ve/veya apopitozu, immün yanıtı ve sitokin/kemokinlerin üretimini tetikler. İnfekte akciğer epitel hücreleri ve alveoler makrofajlar tarafından öncül inflamatuvar mediyatörlerin salınması, infeksiyonun ilk üç günü içinde önce makrofaj ve nötrofillerin daha sonra da T-lenfositlerinin periferal kandan akciğer dokusuna göçünü sağlamaktadır. Chan ve arkadaşlarının çalışmasında, S-OIV ve mevsimsel influenza A (H1N1) virüslerinin hücre tropizmleri ve konakta oluşturdukları yanıtlar; eks vivo insan konjunktiva, nazofarenks ve bronş kültürleri ile in vitro insan nazofarengeal, bronşiyal ve alveoler epitel hücre kültürleri kullanılarak karşılaştırılmıştır [17]. Araştırıcılar, mevsimsel ve pandemik H1N1 virüslerinin replikasyon ve konak yanıtını benzer bulmuşlar; ancak bazı özelliklerin karşılaştırılabilir olduğunu saptamışlardır. Örneğin; S-OIV suşlarında, HA yapısının reseptöre bağlanma bölgesindeki küçük bir değişiklik nedeniyle, bu virüslerin insan konjunktiva hücrelerinde üreme yeteneği daha fazladır. Bu veri, pandemik influenzada, bilinen bulaş yollarının yanında konjunktiva yoluyla bulaşın da önemini vurgulamaktadır. S-OIV suşlarının bir diğer farkı ise, 33 C de bronşiyal epitelyumda replikasyon yeteneğinin daha yüksek olmasıdır ki, araştırıcılar bu özelliğin, S-OIV suşlarının virülansını az da olsa artırabileceğini ileri sürmüşlerdir [17]. İnfluenza virüslerine karşı oluşan immünite, tipe ve alt tiplere özgül olup, homotipik reinfeksiyonlara karşı koruma uzun sürelidir. İnfeksiyonun erken döneminde doğal immün yanıt mekanizmaları (interferon-alfa/beta, doğal öldürücü hücreler, kompleman sistemi, lektinler, nazal salgılardaki müsinler, pulmoner sürfaktan proteinler ve serum mannoz bağlayan proteinler) etkindir (Şekil 8). Brass ve arkadaşları, fonksiyonel genomik tarama analizi ile yaptıkları çalışmada influenza A (H1N1) virüslerine karşı etkili doğal hücresel antiviral mekanizmaların varlığını göstermişlerdir [18]. Bu araştırıcılar, endozomal asidifikasyon, veziküler taşınma, mitokondriyal metabolizma ve RNA splicing olaylarında rolü olan 120 nin üzerinde hücresel direnç faktörünü tanımlamışlar ve bunlardan birisi olan IFITM (interferoninducible transmembrane proteins) proteinlerinin, influenza A virüslerinin replikasyonunu erken safhada inhibe ettiğini bildirmişlerdir [18]. Virüse karşı kazanılmış immün yanıt ise beş-yedi gün içinde ortaya çıkar. Virüse özgül T lenfosit yanıtında, antijen sunan hücrelerin etkisiyle aktive olan CD4+ yardımcı T (Th1 ve Th2) hücreleri salgıladıkları sitokinlerle (interlökin-2, interferon-gama) CD8+ sitotoksik T hücrelerini ve B hücrelerini (IL-10, IL-4) aktive eder (Şekil 8). Sitotoksik T lenfositleri (CTL) virüsle infekte hücrelerin eliminasyonunu sağlayarak infeksiyonun şiddetini ve komplikasyon gelişme riskini azaltır [19]. Ayrıca, virüsün gerek yüzey glikoproteinlerine (HA, NA) gerekse kor proteinlerine (NP, M) karşı gelişen CTL yanıtı, farklı alt tiplere karşı da çapraz koruma sağlamaktadır. Hümoral immün yanıtta ise primer infeksiyonu takiben 10 gün içinde serumda tip/alt tipe özgül IgM ve IgG sınıfı nötralizan antikorlar oluşur ve uzun yıllar kalır. Korumada HA ve NA antijenlerine karşı oluşan antikorlar büyük önem taşırken, virüsün diğer proteinlerine karşı oluşan antikorların herhangi bir koruyuculuğu yoktur. Anti-HA antikorları reinfeksiyonun önlenmesi, anti-na antikorları ise hastalık şiddetinin ve virüs bulaştırıcılığının sınırlandırılması yönünden etkindir. Nazal salgılarda bulunan IgA antikorları da infeksiyonun eliminasyonunda büyük önem taşır, ancak daha kısa ömürlüdür [5]. HA glikoproteini, influenza infeksiyonlarına karşı koruyucu hümoral immün yanıtın en önemli hedefidir. Ancak oluşan antikor yanıtı, sadece belirli bir alt tipin sınırlı sayıdaki HA antijenik varyantlarına karşı koruma sağlar. Bu nedenle, farklı influenza A alt tiplerinin HA glikoproteinlerindeki korunmuş bölgelere karşı oluşan yüksek afiniteli nötralizan antikor varlığının saptanması, bugünkü ve gelecekteki pandemilerden korunmada büyük önem taşıyacaktır. Yapılan bir çalışmada, hem 1918 A (H1N1) pandemik virüsünün, hem de yüksek 21

Us Gen segmenti PB2, PA: Geçtiği konak ve yıl Yaklaşık 1998 Kuzey Amerika kuş tipi PB1: Yaklaşık 1968 Yaklaşık 1998 İnsan tipi (H3N2) Üçlü reasortan tip HA, NP, NS: Yaklaşık 1918 Klasik domuz tipi (H1N1) NA, MA: Yaklaşık 1979 Avrasya domuz tipi (H1N1) Dörtlü reasortan tip PB2 PB1 PA HA NP NA MA NS 2009 A (H1N1) Şekil 7. 2009 A (H1N1) virüsünün gen segmentlerinin orijini (http://www.allamericanpatriots.com dan uyarlanmıştır). patojen A (H5N1) virüsünün HA antijeni ile reaktivite gösteren geniş spektrumlu nötralizan bir insan antikor idiyotipi (CR6261 Fab) tanımlanmıştır [20]. Bu antikorlar, influenza alt tiplerine karşı oluşan diğer antikorların aksine, HA1 ve HA2 alt ünitelerinin membrana bağlı sap kısmında yüksek derecede korunmuş olan helikal bir bölgeye bağlanmakta ve membran füzyonunun blokajıyla virüsleri nötralize etmektedir. 2009 pandemik influenza virüs infeksiyonlarının daha ziyade çocuk ve genç erişkinleri etkilemesi, ileri yaştaki kişilerde daha önceden kazanılmış bir immün yanıtın varlığını akla getirmiştir. Nitekim yapılan çalışmalar 60 yaşın üzerindeki kişilerin yaklaşık 1/3 ünde önceki H1N1 suşlarıyla karşılaşma sonucu çapraz koruma sağlayan antikorların mevcudiyetini göstermiştir [13]. Hancock ve arkadaşları da, çeşitli nedenle serumları saklanmış 1880-2004 yılı doğumlu 417 kişide yaptıkları retrospektif çalışmada; 1910-1929 yılı doğumlu 11 kişinin hepsinde (%100); 1950 yılından önce doğanların %34 ünde; 1980 yılından sonra doğanların %4 ünde ve 1976 yılında uygulanan H1N1 aşısı ile aşılananların %54 ünde S-OIV ye karşı nötralizan antikor varlığı olduğunu bildirmişlerdir [14]. Meksika da yapılan bir çalışmada ise, 2008-2009 döneminde mevsimsel influenza aşısı ile aşılananların, pandemik influenza infeksiyonunu kontrollere göre çok daha hafif geçirdiği ve geçen influenza döneminde uygulanan aşının koruyuculuğunun %78 olduğu bildirilmiştir [21]. Dolayısıyla gerek doğal infeksiyon gerekse aşılama sonrası klasik/mevsimsel influenza A (H1N1) suşlarına karşı oluşan antikorlar, S-OIV ye karşı kısmen de olsa koruma sağlamaktadır. PANDEM K NFLUENZA A (H1N1) V RÜSÜNÜN V RÜLANS FAKTÖRLER Patojenitesi mevsimsel influenza A virüslerine benzeyen S-OIV, mortalite oranı yüksek olmayan infeksiyonlara yol açmaktadır. Buna karşın virüsün patogenezi ve virülansının, adaptif gen mutasyonlarının artmasıyla birlikte değişebileceği de akıldan çıkarılmamalıdır. Bugün için hangi tip adaptif mutasyonların virülansı artıracağı ya da azaltacağı konusunda bir öngörüde bulunmak mümkün değildir; ancak virüsün bazı gen parçaları bu açıdan özellikle önem taşımaktadır. Örneğin; virüsün replikasyonunda rol alan RNA polimeraz alt ünitesini kodlayan PB2 gen parçası, konak kısıtlılığı ile ilişkili olan önemli bir genetik faktördür. Hemen bütün insan influenza A virüslerinde, PB2 proteininin 627. pozisyonunda lizin (K) aminoasidi yer alırken, hemen 22 H ACETTEPE T IP D ERG S

Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri Konak İnfluenza virüsü Hümoral immün yanıt Hücresel immün yanıt B lenfositi Antijen/virüs Dendritik hücre CD4 TCR TCR CD8 Antikor sentezleyen plazma hücresi Aktive yardımcı T hücresi (Th) CD4 Aktive sitotoksik T hücresi (CTL) Virüsün eliminasyonu Th efektör hücre CTL efektör hücre İnfekte hücrenin ölümü Sitokinler İnfekte epitel hücresi Şekil 8. İnfluenza virüsüne karşı kazanılmış immün yanıt mekanizmaları. bütün kuş influenza A virüslerinde bu pozisyonda glutamik asit (E) bulunmaktadır [8]. S-OIV ise PB2 gen parçasını alt tipi bilinmeyen bir kuş influenza A virüsünden almıştır ve 627. pozisyonda E aminoasidini içermektedir. Yapılan deneysel çalışmalarda, kuş tiplerinde gerçekleşen E K mutasyonunun virüsün memeli hücrelerindeki virülansını artırdığı gösterilmiştir [8]. Nitekim, daha önceden fatal bir insan olgusundan izole edilen H7N7 kuş alt tipinde de bu mutasyon saptanmıştır. Dolayısıyla S-OIV de, PB2 proteini 627. aminoasit değişiminin izlenmesi virülansın belirlenmesinde yararlı olacaktır. İnfluenza virüslerinin patojenitesinde, PB1-F2 proteininin de büyük önemi vardır. Bu protein, PB1 geninin alternatif bir (açık okuma çerçevesi) bölgesinin kullanılması sonucu sentez edilir ve hücre içi membranların (özellikle mitokondriyal membranlar) parçalanmasına yol açarak apopitozu indükler. Bu proteinin, virülansı yüksek olan 1918 pandemik A (H1N1) ve A (H5N1) kuş gribi virüslerinin patojenitesinde etkisi olduğu bildirilmiştir [8]. S-OIV A (H1N1) suşlarının PB1 geni incelendiğinde, PB1-F2 nin eksik bir formunu içerdiği, zira 12. pozisyonda bir stop kodonuna sahip olduğu görülmektedir. Dolayısıyla, virüsün tam bir PB1- F2 proteini sentez etmesini sağlayacak olan 12. pozisyondaki olası bir mutasyon, insanlardaki patojenitesinin artmasına yol açabilir. Ancak bu mutasyonun insanlarda oluşma olasılığı zayıftır, zira insan virüslerinin evriminde PB-F2 ekspresyonu virüsün tercih ettiği bir durum değildir. İnfluenza virüsünün bir diğer iyi bilinen virülans faktörü NS1 proteinidir. Yapısal olmayan dimerik NS1 23

Us proteini, konağın mrna translasyonunu inhibe etmekte; viral pre-mrna ların splicing olayını, mrna ların translasyonunu ve viral polimeraz aktivitesini düzenlemekte ve hücrenin antiviral yanıtı olan interferon indüksiyonunu baskılamaktadır. Virülansı yüksek olan A (H5N1)/97 suşlarında, NS1 proteininin karboksi ucunda bulunan ESEV motifinin (Glu-Ser- Glu-Val), PDZ kangalı içeren hücresel modülatörlere bağlanarak hücre sinyalizasyon yolağını bozduğu belirlenmiştir [22]. S-OIV suşları, NS gen parçasını bir kuş alt tipinden almışlardır; ancak bu genin 220. pozisyonundaki stop kodonu nedeniyle S-OIV nin NS1 proteini PDZ kangalına bağlanma bölgesine sahip değildir [8]. Dolayısıyla bu durum da S-OIV nin virülansının yüksek olmamasını açıklamaktadır. Yine de NS 220. pozisyondaki bir mutasyon, virülansın artışı ile sonuçlanabilir. İnfluenza infeksiyonlarında morbidite ve mortalitenin yüksek olması, büyük ölçüde virüsün neden olduğu immünopatoloji ile ilişkilidir. Örneğin; yüksek patojen influenza A (H5N1) virüs infeksiyonu sırasında, inflamatuvar sitokin regülasyonunun bozulması ve olağandışı sitokin üretimi (hipersitokinemi; sitokin fırtınası) sonucu, yaygın pulmoner ödem, akut bronkopnömoni, alveoler hemoraji, nekroz ve doku harabiyeti sonucu akut solunum sıkıntısı sendromu ve ölüm meydana gelmektedir [22]. Buna karşın, 2009 pandemik virüsünün patojenitesi ile ilgili yapılan çalışmalarda, S- OIV nin böyle bir etkiye sahip olmadığı, infeksiyon sırasında oluşan sitokin tipleri ve düzeylerinin mevsimsel influenza alt tipleriyle benzer olduğu rapor edilmiştir [17,23]. 2009 NFLUENZA A (H1N1) NFEKS YONLARININ LABORATUVAR TANISI Pandeminin ilk dönemlerinde (2009 yılı nisan-temmuz ayları) grip benzeri hastalığı (influenza-like illness; ILI) olan riskli gruptaki (endemik bölgede yaşayanlar, bu bölgedeki kişilerle temas edenler ya da bu bölgelere seyahat edenler) tüm olgularda S-OIV tanısı için laboratuvar yöntemleri uygulanırken, 2009 yılı sonbahar aylarında virüsün kuzey yarım kürede hızla yayılması ve birçok ülkede mevsimsel influenza tiplerinin yerini alması sonucu, Kasım 2009 tarihinden itibaren infeksiyonun laboratuvar tanısı belirli durumlar için sınırlandırılmıştır. Bunlar arasında; a. Olası influenza tanısı ile hastaneye yatırılan olgular, b. İnfluenza benzeri hastalık nedeniyle ölen olgular, c. Tanı ile izlem, tedavi ve infeksiyon kontrolünün değişeceği olgular, d. Tanının yakın temaslıların (gebeler, immünsüpresif hastalar vb.) durumunu değerlendirmede gerekli olduğu durumlar yer almaktadır [24,25]. Örnekler S-OIV infeksiyonu şüpheli olguların laboratuvar tanısı için solunum yolu örnekleri alınmalıdır. En uygun örnekler, nazofarengeal veya nazal aspirat olup bu örneklerin alınamadığı durumlarda nazofarengeal sürüntü veya nazal sürüntü ile birlikte orofarengeal sürüntü örnekleri de alınabilir. Sürüntü örnekleri, ticari olarak temin edilebilen fırçamsı uçlu (dakron veya polyester) eküvyonlarla veya alüminyum ya da plastik tüpler içinde hazırlanan sentetik uçlu eküvyonlarla alınması önerilmektedir [26]. Pamuk uçlu veya kalsiyum aljinat içeren eküvyonlar kesinlikle kullanılmamalıdır. Alt solunum yolu infeksiyonu olan veya entübasyon yapılan hastalardan endotrakeal aspirat (TA) ve bronkoalveoler lavaj gibi örnekler de alınabilir. Sürüntü örneklerinin taşınması ve saklanmasında 1-3 ml viral taşıma vasatı kullanılmalıdır. Alınan örnekler en kısa sürede kuru buz veya buz paketleri içinde laboratuvara ulaştırılmalı; eğer bu mümkün değilse 72 saatten daha kısa süreler için buzdolabında (4 C de) saklanmalıdır [26]. Örnekler buzluk ya da -20 C lik dondurucuya kesinlikle konulmamalı, ancak uzun süre saklanması gerekiyorsa -70 C lik derin dondurucu kullanılmalıdır. Hasta örneklerinin alınma zamanı tanının başarısı için büyük önem taşır. Örnekler mümkün olduğunca akut infeksiyonun erken dönemlerinde (infeksiyonun ilk dört günü içinde) alınmalıdır. Daha geç dönemlerde alınan solunum yolu örneklerinde virüsün saptanma olasılığı çok düşüktür; ancak 7-10. günden sonra alınan serum örneklerinde özgül antikor varlığı gösterilebilir. Önerilen tanı testi [gerçek zamanlı revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu; (rrt-pcr)] Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2009 influenza A (H1N1) infeksiyonlarının laboratuvar tanısında özgüllük ve duyarlılığı yüksek olan rrt-pcr yöntemini önermektedir (Tablo 2) [25]. rrt- PCR testinde kullanılmak üzere tanımlanan prob ve primerler ile yöntemin protokolü CDC tarafından belirlenmiştir (2009 version) [27]. Buna göre yöntemde; influenza tip A nın M geni (üniversal), S-OIV ye özgül HA geni ve mevsimsel influenza A H1/H3 ve diğer alt tiplerin HA gen amplifikasyonları hedeflenmektedir. Sonuçların değerlendirilmesinde, M ve S-OIV HA için alınan pozitif; mevsimsel H1 veya H3 için alınan negatif so- 24 H ACETTEPE T IP D ERG S

Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri Tablo 2. İnfluenza A (H1N1) tanısında kullanılan yöntemler ve özellikleri 2009 H1N1 influenza 2009 H1N1 virüsünü diğer Uygulama Sonuç verme influenza için influenza A virüslerinden Tanı yöntemi Mekanizma olanağı süresi duyarlılık (%) ayırma yeteneği Hızlı testler Antijen tespiti Yaygın 0.5 saat 10-70 Yok Direkt ve indirekt Antijen tespiti Yaygın 2-4 saat 47-93 Yok immünfloresan yöntemleri (DFA ve IFA) Hücre kültüründen virüs Virüs izolasyonu Sınırlı 2-10 gün - Var izolasyonu Nükleik asit amplifikasyon RNA tespiti Sınırlı 48-96 saat 86-100 Var testleri (rrt-pcr) (test süresi 6-8 saat) rrt-pcr: Gerçek zamanlı revers transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu. nuçlar pandemik influenza H1N1 lehine yorumlanır. Klinik ve epidemiyolojik verilerle 2009 pandemik influenza infeksiyonundan kuvvetle şüphelenilen hastalarda, PCR ile negatif sonuç alınması halinde yöntem yeni bir örnekle tekrarlanmalı ve/veya diğer yöntemler (virüs kültürü, seroloji) uygulanmalıdır. RT-PCR testinin sonuç verme süresi ortalama altı saat olmakla birlikte, maliyet-etkinlik yönünden belirli sayıda hasta örneğinin biriktirilerek çalışılma gerekliliği, bu sürenin birkaç gün uzamasına neden olmaktadır. RT-PCR yöntemi, Food and Drug Administration (FDA) tarafından yetkili kılınan laboratuvarlar tarafından (Emergency Use Authorization; EUA) uygulanmaktadır [24,25]. Ükemizde de 2009 influenza A (H1N1) tanısı DSÖ tarafından kabul edilen iki referans laboratuvarda gerçekleştirilmektedir. Marmara ve Ege bölgelerine ait 23 ilden toplanan örnekler İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Viroloji Laboratuvarında; diğer bölgelere ait 58 ilden toplanan örnekler ise Ankara Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Viroloji Laboratuvarında çalışılmaktadır. Bu iki referans laboratuvar dışındaki diğer laboratuvarlarda da influenza A için konvansiyonel veya gerçek zamanlı PCR yöntemleri uygulanmaktadır. Ancak bu yöntemlerle elde edilen sonuçlar S-OIV için özgül olmayıp, şüpheli sonuç alındığında en az bir hedef ürünün (M ve/veya HA genleri) dizi analizi yapılmalıdır. Hızlı tanı testleri (rapid influenza diagnostic tests; RIDT) Bu yöntemler, solunum yolu örneklerinde influenza virüs NP antijeni tespitine dayalı olup, 15-30 dakika içinde sonuç vermektedir [28]. Bu amaçla, çıplak gözle değerlendirilen immünkromatografik yöntemler (kaset testleri) veya epifloresan mikroskopla değerlendirilen direkt immünfloresan (DFA) yöntemleri kullanılır. Özgüllükleri yüksek (> %95) olan hızlı testlerin mevsimsel influenza tanısındaki duyarlılığı %60-83 iken, S-OIV A (H1N1) tanısındaki duyarlılığı çok düşüktür (%10-70) (Tablo 2) [28,29]. Bir diğer deyişle, bu testlerin 2009 pandemik influenza için yalancı negatifllik oranı oldukça yüksektir. Dolayısıyla bu yöntemlerle alınan negatif sonuç infeksiyonu dışlamamaktadır. Ayrıca, bu testlerle sadece influenza tip A ile tip B nin ayırımı yapılabilmekte; influenza A alt tiplerinin ayırt edilmesi (H1 in H3 ten ayırımı ya da mevsimsel H1 in S-OIV H1 den ayırımı) mümkün olamamaktadır. RIDT ile influenza A için alınan pozitif sonuçlar, influenza A infeksiyonunu düşündürmekle birlikte S-OIV ile mevsimsel influenza A (H1N1 veya H3N2) veya hayvan kaynaklı diğer influenza A virüslerinin ayırımına olanak vermemektedir [29]. Özgüllüğün yüksek olması nedeniyle, RIDT veya DFA testleri ile alınan pozitif sonuçlar tanı için önem taşımaktadır. Her ne kadar bu testlerle influenza A alt tipi belirlenemezse de, bugün itibarıyla dolaşımda olan influenza A alt tipinin %99 oranında S-OIV olduğu göz önüne alındığında, saptanan pozitifliğin 2009 H1N1 influenza lehine yorumlanması mümkündür [24]. Ancak yine de S-OIV kesin tanısı sadece virüs kültürü veya rrt-pcr ile yapılabilir. Olası influenza infeksiyonu nedeniyle hastaneye yatırılan hastalara mutlaka tanı testleri uygulanmalı, eğer gerekiyorsa test sonucu beklenmeden ampirik olarak antiviral tedavi başlanmalıdır. RIDT ile alınan negatif sonuç infeksiyonu dışlamayacağı için, influenza şüpheli yatan hastalardan alınan örneklerde mutlaka rrt- PCR çalışılmalıdır. Virüs izolasyonu Klinik örneklerden virüs izolasyonu da CDC tarafından önerilen bir yöntemdir. Virüsün izolasyonu, biyo- 25

Us güvenlik düzeyi-3 (BSL-3) laboratuvarlarda yapılmalıdır. İnfluenza virüsleri MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) hücre kültürlerinde ürer ve genellikle beşinci günde sitopatik etki oluşumuna yol açar [28]. Hücre kültürlerinin duyarlılığı antijen saptama testlerine göre çok daha yüksektir. Bu yöntemin kullanılması, diğer testlerle saptanamayan yeni veya yüksek düzeyde değişime uğramış suşların saptanmasına, izole edilen suşların tanımlanması ve aşı suşu olma potansiyelinin belirlenmesine ve uygun hücre kültürü hibridleri kullanıldığında diğer solunum yolu virüslerinin de üretilebilmesine olanak sağlamaktadır. Ancak yine de virüs kültüründen elde edilen negatif bir sonuç, S-OIV infeksiyonunu dışlamamalıdır. İnfluenza virüsleri, 10-11 günlük tavuk embriyonlu yumurtasının amniyotik ve allantoik keselerinde de üretilebilir [28]. Bu yöntem zaman alıcı ve emek-yoğun olduğundan rutin ve hızlı tanı için uygun değildir; ancak virüsün büyük miktarlarda ve yüksek titrelerde elde edilmesi söz konusu olduğundan aşı hazırlanmasında halen kullanılmaktadır. Hücre kültürleri veya embriyonlu yumurtada virüsün üremesi, tipe özgül monoklonal antikorlar kullanılarak immünfloresan yöntemiyle gösterilebilir. Ancak influenza A virüslerinin alt tiplendirmesi için önerilen referans yöntem, özgül antiserumlarla uygulanan HA inhibisyon (HI) testidir [7,28]. HI testi ile, izole edilen virüsteki hem antijenik kaymalar hem de antijenik sapmalar belirlenebilir. S-OIV, hindi, tavuk, kobay ve insan O grubu eritrositlerini hemaglutine etmektedir. HI yöntemi, alt tipe özgül antikor varlığında virüsün bu eritrositleri aglutine etme yeteneğini bloke etmesi esasına dayanır. DSÖ tarafından hazırlanan ve mevsimsel influenza H1 alt tipine özgül poliklonal antikorları içeren kitler, HI testinde S-OIV suşları ile reaksiyon vermemektedir. Benzer olarak H1 monoklonal antikorlarını içeren DSÖ kitleri ile alınan sonuçlar da kesin sonuç şeklinde değerlendirilmemelidir [28]. İnfluenza A virüslerinin alt tiplendirmesinde ayrıca, çeşitli insan ve kuş suşlarına özgül primerler kullanılarak yapılan RT-PCR yöntemi de uygulanmaktadır. Bu yöntemle, gerek hücre kültürlerinden izole edilen virüsler gerekse doğrudan klinik örneklerdeki virüsler tanımlanabilir. Antikor saptama testleri Hasta serumunda antikor saptanması, genellikle virüs izolasyonu veya antijen testleri için örnek alınamadığı ya da yetersiz/zamansız alındığında veya negatif sonuç saptandığında başvurulan yöntemlerdir [28]. Pandemik influenza A (H1N1) virüsüne karşı oluşan antikorların tespitinde, orijinal suşun [influenza A/California/04/2009 (H1N1)] antijen olarak kullanıldığı HI ve mikronötralizasyon testleri uygulanır [25]. Toplumlarda influenza reinfeksiyonları sıklıkla görüldüğünden ve birçok kişide önceden oluşmuş antikorların mevcudiyetinden dolayı, tek bir serum örneğinde influenzaya özgül IgG veya total antikor pozitifliğinin hiçbir değeri yoktur [28]. Kesin serolojik tanı için, hastadan akut ve konvalesan dönemlerde (10-14 gün arayla) alınan serum örnekleri arasında dört kat ve daha fazla titre artışının (serokonversiyon) saptanması gerekmektedir. Dahası, serolojik testler, dolaşımdaki suşların antijenik kompozisyonu açısından bir bilgi vermemektedir. Dolayısıyla, serokonversiyonun gösterilmesi açısından uzun zamana (en az 10 gün) gereksinim duyan ve tanıda retrospektif özellik taşıyan serolojik testler daha ziyade seroepidemiyolojik amaçlı olarak tercih edilir. SONUÇ 1968 yılındaki son influenza pandemisinden 41 yıl sonra, 21. yüzyılın ilk pandemisi S-OIV A (H1N1) virüsü tarafından gerçekleştirilmiştir. Olumlu yönden değerlendirildiğinde, bu pandeminin ve pandemik virüsünün bazı avantajları olduğu görülecektir. Örneğin; Meksika da ortaya çıkan ve kısa sürede ABD ye sıçrayan pandemik suş hızla tanımlanmış, genetik yapısı ve orijini aydınlatılmış, kısa sürede tanı testleri ve etkin bir aşı geliştirilmiş ve organize bir bilgi akışı (bilgi kirliliğine rağmen) ve paylaşımı sağlanmıştır. Bu organizasyonun başarısında, beş yıl önce dünyayı tehdit eden kuş gribi deneyimi sonucu dünyanın birçok ülkesinde hazırlanmış olan pandemi planlarının rolü vardır [2,4]. 2009 pandemik virüsünün bazı özellikleri de bir bakıma avantaj olarak kabul edilebilir. Örneğin; 1. S-OIV suşlarının virülansı yüksek değildir. 2. Oluşturdukları infeksiyon genellikle hafif seyirli olup mevsimsel influenzaya benzemektedir. 3. Majör risk grubu olabilecek kişilerde (> 60 yaş) kısmi bağışıklık mevcuttur. 4. S-OIV, tedavide kullanılan NA inhibitörlerine (şimdilik) duyarlıdır. Sonuç olarak, günümüzde halen devam eden bu pandemi ile etkin mücadele için güncel ve doğru bilgilerin DSÖ ve CDC nin web sitelerinden izlenmesi gerektiği dikkate alınmalı ve influenza A virüslerinin yapıları gereği tarih boyunca olduğu gibi bundan sonraki yıllarda da pandemilere yol açacağı gerçeği yadırganmamalıdır. 26 H ACETTEPE T IP D ERG S

Pandemik influenza infeksiyonunda etyopatogenez ve laboratuvar tan yöntemleri Kaynaklar 1. Hsieh YC, Wu TZ, Liu DP, Shao PL, Chang LY, Lu CY, et al. Influenza pandemics: past, present and future. J Formos Med Assoc 2006; 105:1-6. 2. Taubenberger JK, Harvey HA, Memoli MJ. The 1918 influenza pandemic: lessons for 2009 and the future. Crit Care Med 2009 Dec 31 [Epub ahead of print]. 3. Petrosino AL. Cytokine storm and the influenza pandemic. Available from: http://www.cytokinestorm.com/ 4. Osterholm MT. Preparing for the next pandemic. N Engl J Med 2005; 352:1839-42. 5. Orthomyxoviruses (Inflenza viruses). In: Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA (eds). Jawetz, Melnick, Adelberg s Medical Microbiology. 24 th ed. USA: Mc Graw Hill, 2007: 533-45. 6. Influenza. Available from: http://pathmicro.med.sc.edu/ mhunt/flu.htm 7. Sullivan SJ, Jacobson RM, Dowdle WR, Poland GA. 2009 H1N1 Influenza. Mayo Clin Proc 2010; 85:64-76. 8. Chang LY, Shih SR, Shao PL, Huang DT, Huang LM. Novel swine-origin influenza virus A (H1N1): the first pandemic of the 21 st century. J Formos Med Assoc 2009; 108:526-32. 9. Sinha NK, Roy A, Das B, Das S, Basak S. Evolutionary complexities of swine flu H1N1 gene sequences of 2009. Biochem Biophys Res Commun 2009; 390:349-51. 10. Itoh Y, Shinya K, Kiso M, Watanabe T, Sakoda Y, Hatta M, Muramoto Y, Tamura D, Sakai-Tagawa Y, Noda T, et al. In vitro and in vivo characterization of new swine-origin H1N1 influenza viruses. Nature 2009; 460:1021-5. 11. Garten RJ, Davis CT, Russell CA, Shu B, Lindstrom S, Balish A, et al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science 2009; 325:197-201. Epub 2009 May 22. 12. Igarashi M, Ito K, Yoshida R, Tomabechi D, Kida H, Takada A. Predicting the antigenic structure of the pandemic (H1N1) 2009 influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 2010 Jan 1;5(1):e8553. PLoS One 2010 ;5:e8553. 13. Katz J, Hancock K, Veguilla V, Zhong W, Lu XH, Sun H, et al. Serum Cross-Reactive Antibody Response to a Novel Influenza A (H1N1) Virus After Vaccination with Seasonal Influenza Vaccine. MMWR 2009; 58:521-4. 14. Hancock K, Veguilla V, Lu X, Zhong W, Butler EN, Sun H, et al. Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus. N Engl J Med 2009; 361:1945-52. Epub 2009 Sep 10. 15. Fereidouni SR, Beer M, Vahlenkamp T, Starick E. Differentiation of two distinct clusters among currently circulating influenza A(H1N1)v viruses, March-September 2009. Euro Surveill 2009; 14:19409. 16. La Gruta NL, Kedzierska K, Stambas J, Doherty PC. A question of self-preservation: immunopathology in influenza virus infection. Immunol Cell Biol 2007; 85:85-92. 17. Chan MC, Chan RW, Yu WC, Ho CC, Yuen KM, Fong JH, et al. Tropism and Innate Host Responses of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus in ex Vivo and in Vitro Cultures of Human Conjunctiva and Respiratory Tract. Am J Pathol 2010 Jan 28. [Epub ahead of print] 18. Brass AL, Huang IC, Benita Y, John SP, Krishnan MN, Feeley EM, et al. The IFITM proteins mediate cellular resistance to influenza A H1N1 virus, West Nile virus, and dengue virus. Cell. 2009; 139:1243-54. 19. Stambas J, Guillonneau C, Kedzierska K, Mintern JD, Doherty PC, La Gruta NL. Killer T cells in influenza. Pharmacol Ther 2008; 120:186-96. 20. Ekiert DC, Bhabha G, Elsliger MA. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science 2009; 324:246-51. 21. Garcia-Garcia L, Valdespino-Gómez JL, Lazcano-Ponce E, Jimenez-Corona A, Higuera-Iglesias A, Cruz-Hervert P, et al. Partial protection of seasonal trivalent inactivated vaccine against novel pandemic influenza A/H1N1 2009: case-control study in Mexico City. BMJ 2009; 339:b3928. doi: 10.1136/bmj.b3928. 22. Us D. Cytokine storm in avian influenza. Mikrobiyol Bul 2008; 42:365-80. 23. Woo PC, Tung ET, Chan KH, Lau CC, Lau SK, Yuen KY. Cytokine profiles induced by the novel swine-origin influenza A/H1N1 virus: implications for treatment strategies. J Infect Dis 2010; 201:346-53. 24. WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans. Available from: http://www. who.int/csr/resources/publications/swineflu/who_diagnostic_recommendationsh1n1_20090521.pdf 25. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). H1N1 flu: diagnosis and laboratory testing. Available from: http://www.cdc.gov/ h1n1flu/diagnosis 26. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). H1N1 flu: Interim guidance on specimen collection, processing, and testing for patients with suspected novel influenza A (H1N1) virus infection. Available from: www.cdc.gov/ h1n1flu/specimencollection.htm 27. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Realtime RTPCR (rrtpcr) protocol for detection and characterization of swine influenza (version 2009). Available from: http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/ realtimeptpcr 28. Kaore NM, Kaore SN, Sharma P, Yadav VK, Sharma R. Laboratory diagnosis of novel H1N1 virus. JK Science 2009; 11:172-4. 29. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Evaluation of rapid influenza diagnostic tests for detection of novel influenza A (H1N1) virus-united States, 2009. MMWR 2009; 58:826-9. 27