1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ GELENEKSEL YOLLARLA ÜRETİLEN REÇEL ÖRNEKLERİNDEKİ HİDROKSİMETİLFURFURAL IN MİKTAR TAYİNİ Hazırlayan Mehmet Can KILIÇER Danışman Prof. Dr. İbrahim NARİN Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2011 KAYSERİ

2

3 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ GELENEKSEL YOLLARLA ÜRETİLEN REÇEL ÖRNEKLERİNDEKİ HİDROKSİMETİLFURFURAL IN MİKTAR TAYİNİ Hazırlayan Mehmet Can KILIÇER Danışman Prof. Dr. İbrahim NARİN Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2011 KAYSERİ

i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Mehmet Can KILIÇER

ii Geleneksel Yollarla Üretilen Reçel Örneklerindeki Hidroksimetilfurfuralin Miktar Tayini adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Analitik Kimya Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Mehmet Can KILIÇER Danışman Prof. Dr. İbrahim NARİN Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. İbrahim NARİN İmza ONAY : Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır.. /../ Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

iii TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım sırasında bana danışmanlık yapan, çalışma şartlarımı oluşturan ve çalışmalarımın her aşamasında bana yol gösterici ve destekleyici olan, her alanda emeğini hiçbir şekilde esirgemeyen Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı Sayın Hocam Prof. Dr. İbrahim NARİN e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmam sırasında teorik ve pratik her türlü yardımını esirgemeyen Sayın Ali Fuat TUNCAY a çok teşekkür ederim. Benim bu günlere gelmemi sağlayan, maddi ve manevi desteklerini hiçbir şekilde esirgemeyen aileme çok teşekkür ederim. 5 senelik üniversite eğitimim süresince her anlamda, her zaman, her türlü desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen başta Sayın Doğan CERAN, Sayın Mesut Kaan BAĞCI, Sayın Muhammed Emin GÜL, Sayın Taylan ATASOY, Sayın Melda KAYA ve Sayın Şefika Hilal ERSAVAŞ olmak üzere tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim. Mehmet Can KILIÇER

iv GELENEKSEL YOLLARLA ÜRETİLEN REÇEL ÖRNEKLERİNDEKİ HİDROKSİMETİLFURFURAL IN MİKTAR TAYİNİ Mehmet Can KILIÇER Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Mayıs 2011 Danışman: Prof. Dr. İbrahim NARİN ÖZET HPLC, gıda maddelerinin analizi için 1970 li yıllarda kullanılmaya başlanmış ve en güvenilir metotlardan birisi haline gelmiştir. Gıdalarda ilk olarak mikotoksin araştırmaları için kullanılmıştır. HMF, ısı etkisi ile şekerler ve aminoasitler arasından gerçekleşen bir reaksiyon sonucu oluşan ve kanserojen etkisinden dolayı birçok üründe miktarı sınırlanan bir bileşiktir. HMF nin oluşumu esas olarak maillard reaksiyonuna dayanmaktadır. Gıdalardaki HMF düzeyleri bir yerde gıdaların kalitesini belirlemek amacı ile kullanılan bir belirteçtir. HMF nin insan sağlığı üzerindeki etkisi göz ardı edilemeyeceği için gıda maddelerindeki miktarı saptanmalıdır. Bu amaçla HMF nin miktar tayini için kromatografik ve spektroskopik analiz teknikleri kullanılmaktadır. Çalışmada, Kayseride geleneksel yolla üretilen 32 adet reçel numunesinin HMF miktarı HPLC cihazı ile tayin edilmiştir. Analiz edilen örneklerden sadece bir tanesinde HMF derişimi aletin tayin sınırının altında bulunmuştur. Diğer örneklerdeki HMF miktarı 10,11-326,63 mg /kg aralığında bulunmuştur. Örneklerden 19 tanesinde ise HMF derişimi gıda kodeksinde müsaade edilebilen maksimum sınır olan 50 mg/kg dan daha yüksektir. Katı madde miktarının (briks) ise % 14-58 aralığında olduğu tespit edilmiştir. Anahtar kelimeler: HPLC, HMF, Geleneksel Yollarla Üretilen Reçel

v QUANTITY ANALYSIS OF HYDROXYMETHYLFURFURAL IN JAM SAMPLES WHICH ARE PRODUCED IN TRADITIONAL WAYS Mehmet Can KILICER Erciyes University, Pharmacy Fakulty Department of Analytical Chemistry Final Project, May 2011 Supervisor: Prof. Dr. Ibrahim NARIN ABSTRACT HPLC began to be used in 1970 s for food analysis and became to be one of the most important method. It firstly used for mycotoxin researches in foods. HMF is a compound which becomes as a result of reaction between amino acid and sugar with the effect of temperature and which is banned in many products due to its carcinogenic effect. Formation of HMF mainly is related to maillard reaction. HMF level in foods actually is indicator which is used in order to determine quality of foods. Effect of HMF on human health can not be ignored so quantity of HMF must be stabilized on foodstuffs. For this purpose, chromatographic and spectroscopic analysis techniques are used for quantity analysis of HMF. In this study, HMF quantities of 32 jaw samples which was produced in traditional ways in Kayseri was analyzed with HPLC device. It was discovered that HMF concentration of only one of the analyzed sample is low device s analysis limit. It was obtained that HMF quantity of other samples are 10,11 to 326,63 mg/kg range. In 18 of examples, HMF concentration is higher than 75 mg/kg which is maximum limit number allowed in food codex. It was determined that solid quantity is 14 to 58 %. Key words: HPLC, HMF, The Jams which are produced in traditional ways

vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK...i KABUL ONAY...ii TEŞEKKÜR...iii ÖZET...iv ABSTRACT...v İÇİNDEKİLER...vi KISALTMALAR...ix ŞEKİLLER LİSTESİ...x TABLOLAR LİSTESİ...xi 1. GİRİŞ VE AMAÇ...1 2. GENEL BİLGİLER...3 2.1. KROMATOGRAFİ...3 2.1.1. Kromatografinin Tanımı...3 2.1.2. Kromatografik Ayırma...3 2.1.3. Kromatografik Yöntemlerin Sabit Faz Üzerindeki Ayırım Mekanizmasına Göre Sınıflandırılması...4 2.2. HPLC Hakkında Genel Bilgiler...5 2.2.1. HPLC nin Temel Prensipleri ve Bazı Temel Tanımlar...5 2.2.2. HPLC Cihazları...8 2.2.2.1. Hareketli Faz Hazneleri ve Çözücü Muamele Sistemleri...9 2.2.2.2. Pompalama Sistemleri...9 2.2.2.3. Numune Enjeksiyon Sistemleri...10 2.2.2.4. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi Kolonları...11 2.2.2.5. Dedektörler...13 2.2.3. HPLC Cihazının Diğer Sıvı Kromatografi Türlerine Göre Üstünlükleri...16 2.3. HPLC de Ayırma Teknikleri...16 2.3.1. Yüksek Performanslı Dağılma Kromatografisi...17 2.3.1.1. Normal-faz Kromatografi...17 2.3.1.2. Ters-faz Kromatografi...17 2.3.1.2.1. İyon çifti kromatografi...18 2.3.1.2.2. Kiral Durgun Fazlı Kromatografi...18

vii 2.3.2. Adsorpsiyon Kromatografisi...19 2.3.3. İyon Değiştirme Kromatografisi...20 2.3.3.1. İyon Değiştirici Reçineler...21 2.3.3.1.1. Mikrogözenekli veya Jel Yapısındaki Reçineler...21 2.3.3.1.2. Makrogözenekli Reçineler...21 2.3.3.1.3. Pelikular Reçineler...21 2.3.3.1.4. Yüzeysel Gözenekli Reçineler...21 2.3.3.2. İyon-Eleme Kromatografi...23 2.3.4. Yüksek Performanslı Boyut Ayırıcı Kromatografi...23 2.4. HPLC Kullanırken Alınması Gereken Önlemler...25 2.4.1. Hareketli Faz Çözücüleri İçin Önlemler...25 2.4.2. Kolon Kullanımı İçin Önlemler...26 2.4.3. Örnek Hazırlanması...26 2.4.3.1. Katı Örnekler...26 2.4.3.2. Sıvı Örnekler...27 2.4.3.3. Örneklerin Süzülmesi...27 2.5 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografide Yöntem Geliştirme...27 2.6. HPLC nin Uygulama Alanları...28 2.4. HİDROKSİMETİLFURFURAL...29 2.4.1. HMF nin Tanımı ve Özellikleri...29 2.4.2. HMF OLUŞUMU...30 2.4.2.1. Maillard Reaksiyonu ile HMF Oluşumu...30 2.4.2.2. Asidik Ortamda Heksozların Isı Etkisi ile HMF Oluşumu...31 2.4.3. HMF Tanınma Reaksiyonu: Seliwanoff Testi...32 2.5.1. Reçelin Tanımı...34 2.5.2. Reçel Çeşitleri...34 2.5.2.1. Geleneksel Reçel...34 2.5.2.2. Ekstra Geleneksel Reçel...34 2.5.2.3. Diyabetlik Ürünler...34 2.5.3. Reçel Üretiminde Kullanılan Ham Maddeler...35 2.5.3.1. Meyveler...35 2.5.3.2. Sebzeler...35 2.5.3.3 Çiçek-Kabuk...35

viii 2.5.4. Ham Maddelerin Hazırlanması...36 3. GEREÇ VE YÖNTEM...38 3.1. GEREÇ...38 3.1.1. Kullanılan Cihazlar...38 3.1.2 Kullanılan Kimyasal Maddeler...39 3.2. YÖNTEM...39 3.2.1. Cam ve Plastik Malzemelerin Temizlenmesi...39 3.2.2 Standartların Hazırlanması...39 3.2.3. Numunelerin Hazırlanması...39 3.2.4. Hareketli Faz...39 3.2.5. HPLC Cihazının Çalışma Şartları...40 4. BULGULAR...41 5. TARTIŞMA VE SONUÇ...45 6. KAYNAKLAR...46 ÖZGEÇMİŞ...48

ix KISALTMALAR HMF HPLC TSE TLC UV-VIS PDA, DAD FLD ECD CDD RID ELSD TSA RT : Hidroksimetilfurfural : Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi : Türk Standartları Enstitüsü : İnce Tabaka Kromatografisi : Ultraviyole-Görünür Bölge Spektroskopisi : Foto Diyot Dizisi Dedektörü : Floresans Dedektör : Elektrokimyasal Dedektör : İletkenlik Dedektörü : Kırma İndisi Dedektörü : Buharlaştırmalı Işık Dedektörü : Tayin Sınırı Altında : Alıkonma Zamanı

x ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 2.1. Kromatografik yöntemlerin sınıflandırılması... 4 Şekil 2.2. (A) % 50 oranında ACN. (B) % 70 oranında ACN. (C) İlk 5 dk. % 50 5. dakikadan sonra % 70 ACN. (D) 7 dakika boyunca %30-85 aralığı oranında ACN kullanılmıştır.(gradient elüsyon).... 6 Şekil 2.3. Alıkonma zamanı kromatogramı... 7 Şekil 2.4. HPLC cihazının şematik gösterimi... 8 Şekil 2.5. Kolon dolgu maddelerinin tipleri... 12 Şekil 2.6. Adsorpsiyon kromatografinin tipik bir uygulaması cis-ve trans- pirazolinlerin ayrılması. Kolon: 100 0,3 cm zarlı kaplanmış silis. Hareketli Faz: % 50 metilen klorür/izooktan. Sıcaklık: Oda sıcaklığı. Akış hızı: 0,225 ml/dakika. Detektör: UV, 254 nm... 20 Şekil 2.7. Hidroksimetilfurfural ın kimyasal yapısı... 29 Şekil 2.8. Maillard reaksiyonu oluşumu... 31 Şekil 2.9. Heksozların dehidrasyonu sonucu HMF oluşumu... 32 Şekil 2.10.Heksoz ve pentozdan HMF ve furfural oluşması... 33 Şekil 2.11. HMF nin rezorsin ile reaksiyonu sonucu oluşan vişne kırmızısı bileşik... 33 Şekil 4.2. 9 nolu örneğin kromatogramı... 42 Şekil 4.3. HMF nin ölçümü için çizilen kalibrasyon doğrusu... 42

xi TABLOLAR LİSTESİ Tablo 2.1. HPLC dedektörlerinin başlıca özelliklerinin karşılaştırlması... 16 Tablo 2.2. Normal ve ters faz kromatografisi özellikleri... 18 Tablo 4.1. Örneklerdeki HMF nin geri kazanım değerleri... 43 Tablo 4.2. Örneklerdeki HMF ve % briks miktarları... 43

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ HMF oldukça karışık bir ortamda, aminoasit ve şekerlerin reaksiyonuyla ortaya çıkan; maillard reaksiyonunun temel bir ürünüdür. HMF, bal gibi doğal gıdalarda eser miktarda bulunabilmektedir. Aynı zamanda ısıl işlem uygulanan meyve suyu, bal, reçel, marmelat, jele, domates salçası gibi birçok sebze ve meyve kaynaklı gıda maddeleri de HMF içerebilmektedir. Bu ürünlerde HMF miktarının belirli bir düzeyde bulunması; rengin esmerleşmesine, ürünün tat ve kokusunda önemli bozulmalara, besleyici değerlerinde azalmalara yol açabilmektedir. Ayrıca HMF nin kansorejen etkisi de bulunmaktadır. Bu nedenle gıda maddelerinde bulunmasına müsaade edilen HMF miktarları sınırlandırılmıştır. Genel olarak meyve suyu, reçel, marmelat, bal, pekmez, kuru meyveler ile şarap, bira gibi alkollü içeceklerde belirlenmiş ve ilgili bazı ürünler için gıda kodeksinde sınırlandırmalar getirilmiştir. Örneğin bal için TSE de 40 mg/kg, meyve suyu için 20 mg/kg, pekmez ürünleri için ise 75 mg/kg üst limit belirlenmiştir. Birçok gıdadaki HMF düzeyi, ısıl işlem şiddetinin ve kalitesinin belirlenmesi için bir belirteç olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda yaklaşık 500 ü askın gıda örneğinde yapılan çalışmalar, kurutulmuş meyvelerde, meyve marmeladı ve suyunda, değişik karamel ürünlerinde yüksek düzeyde (1-9.5 g/kg) HMF içeriği olduğunu göstermiştir. HMF oluşumu; üretim aşamasında ve depolama şartlarında özellikle sıcaklık ve ortam ph sına bağlı olarak değişmektedir. Bu değişim meyve suyu ve konsantrelerini içeren model gıdalarda da doğrulanmıştır. Ayrıca HMF nin tütün, sigara dumanı ve odun tütsülerinde de bulunduğu belirlenmiştir. HMF nin yüksek derişimlerinin, toksik etkisinin yanı sıra, üst solunuma, göz, deri ve mukoza membranlarına karsı tahriş edici özelliğinin bulunduğu bildirilmektedir. Denek fareler üzerinde yapılan diğer epidemiyolojk çalışmalardan elde edilen bulgular ışığında HMF nin tümörojenik etkisinin bulunduğu ve kolon kanserini başlatıcı faktör olduğu bildirilmektedir. Gıda güvenliğini ve insan sağlığını tehdit edebileceği anlaşılan HMF nin

2 değişik gıdalardaki düzeyinin belirlenmesi ve depolama sırasındaki artış değeri saptanmalıdır. İnsan sağlığı ve ürün kalitesi açısından HMF nin öneminin göz ardı edilemeyeceği konusunda yeterli seviyede literatür bilgisi bulunmaktadır. Dolayısıyla HMF nin, gıda maddelerindeki miktarları saptanmalıdır. Bu amaçla, spektroskopik ve kromatografik analiz yöntemlerinden yararlanılmaktadır. Bu çalışmada, geleneksel yöntemlerle üretilen 32 adet reçel numunelerindeki HMF düzeyinin, tayin edilmesi amaçlanmıştır.

3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. KROMATOGRAFİ 2.1.1. Kromatografinin Tanımı Kromatografi; bir karışımın bileşenlerinin, bunlara seçimsel ilgi gösteren iki ya da daha çok evreden oluşan sistemler arasındaki farklı göçlerine bakarak tanımak, gerektiğinde niceliklerini belirlemek amacıyla yapılan ve ayırma işlemine dayanan analitik yöntemdir (1). Kromatografik metotların tümünde bir durgun faz ve bir de hareketli faz vardır. Bir kolon veya düz bir yüzeyde tutturulmuş faza durgun faz; durgun faz üzerinden veya arasından geçen ve analiti içeren faza hareketli faz adı verilir. Karışımdaki bileşenler, akış halindeki gaz veya sıvı fazla durgun faz üzerinden geçirilir; kromatografik ayırma, bileşenlerin göç hızlarına bağlı olarak gerçekleşir (2). Kromatografi terimi başlangıçta, maddeleri renklerine göre ayırma işleminden kaynaklansa da zamanla uygulama alanı genişlemiştir (3). 2.1.2. Kromatografik Ayırma Kromatografi farklı yöntemlerle uygulanabilir. Bu yöntemler kolon, TLC, gaz, katı-sıvı, sıvı-sıvı, katı-gaz kromatografisi olarak sıralanabilir. Kromatografik ayırmada maddeler birbiriyle karışmayan iki faz arasında dağılırlar. Fazlardan birine hareketli (mobil) faz diğeri ise durgun faz denir. Karışımdaki her maddenin hareket hızı (Rt); maddenin haraketli veya mobil faza olan ilgisine göre belirlenir. Hareketli faza daha çok ilgisi olan maddeler daha hızlı hareket ederken, sabit faza daha çok ilgisi olan maddeler daha yavaş hareket ederler. Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili pik olarak adlandırılır, piklerin oluşturduğu tabloya da kromotogram adı verilir.

4 Bir kantitatif analiz tekniği olan kromatografide amaç, anlamlı bir süre içinde iyi bir ayırma yapmaktır. Ayırmayı etkileyen parametreler şu şekilde özetlenebilir: Kolon ile ilgili olanlar: Türü, boyutları Hareketli faz ile ilgili olanlar: Türü, bileşimi, akış hızı Ölçüm ile ilgili olanlar: Dedektör türü, dalga boyu vb Örnek ile ilgili olanlar: Örnek derişimi, örnek hacmi (3). 2.1.3. Kromatografik Yöntemlerin Sabit Faz Üzerindeki Ayırım Mekanizmasına Göre Sınıflandırılması Kromatografik yöntemlerin sabit faz üzerinden ayrılmasına göre sınıflandırılma şekli şekil 2.1 de görülmektedir. Buna göre kromatografi hareketli fazın türüne göre, sıvı kromatografisi, gaz kromatografisi ve süper kritik akışkanlı sıvı kromatografisi olmak üzere 3 e ayrılır. Sıvı kromatografisi dolgu maddelerinin yerleştirilme şekline göre düzlem kromatografisi ve kolon kromatografisi olarak 2 ye ayrılır. Düzlem kromatografisi ise kağıt ve ince tabaka olarak 2 ye ayrılmaktadır. Kolon kromatografisi ise açık ve HPLC olmak üzere 2 türdür. Kromatografi Süper kritik akışkanlı gsıvı kromatografisi Düzlem Sıvı Kolon Gaz Kapile Kağıt Açık Dolgu İnce Tabaka HPLC Şekil 2.1. Kromatografik yöntemlerin sınıflandırılması.

5 2.2. HPLC Hakkında Genel Bilgiler 2.2.1. HPLC nin Temel Prensipleri ve Bazı Temel Tanımlar HPLC, kimyasal, farmasötik ve biyoteknoloji endüstrilerinde büyük önem taşıyan bir ayırma tekniğidir. Poröz bir materyal içeren kolona örnek çözeltisi pompalanır ve bir mobil faz yardımıyla kolon boyunca yürür. Maddeler, kolondan geçerken farklı dağılma davranışlarına bağlı olarak farklı göç oranlarına sahip olduklarından farklı tutunma zamanlarına sahip olacaklardır ve bu süreye bağlı olarak kolondan yine farklı sürelerde çıkacaklardır. Bu şekilde de numunenin analizi yapılabilmektedir. Mobil faz (mobile phase): Örnek bileşenlerini, sabit faz (kolon) boyunca taşıyan, çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip çözelti veya çözücü karışımlarıdır (3). Hareketli fazın, tüm analiz boyunca bileşen oranına göre HPLC 2 ye ayrılır. 1. İzokritik elüsyon 2. Gradient elüsyon Gradient elüsyonun gelişmesinden önce izoktiritk elüsyon kullanılmıştır. İzokritik ayırmalar birçok uygulamada başarılı sonuçlar vermiştir fakat tek bir hareketli faz bileşimi olduğu için iyi bir ayırma sağlanamamıştır. Bu yüzden gradient elüsyon geliştirilmiştir. Şekil 2.2 de izokritik ve gradient sistemle ayrılmada ayırma sistemelerinin gücü görülmektedir. Şekilde de görüldüğü gibi izokritik sistemde (A ve B de) tam olarak ayrılma olmazken, gradient elüsyonda (C ve D de) ayrılma tamdır. Ayrıca D de hareketli fazın bileşimi belirli oranlarda artırıldığı zaman çok kısa sürede ayrılma görülmüştür (4). Sabit faz: Mobil faz içerisinde gelen örneğe ait bileşenlerin etkileşime girdikleri ve belirli ölçüde alıkonuldukları fazdır. Hareketli faz: Sabit faz üzerinde hareket ederek numune bileşenlerinin ayrılmasını sağlayan fazdır.

6 Alıkonma zamanı: Mobil faz içerisinde gelen, analizi yapılacak maddeye ait bileşenlerin sabit faz ile etkileşime girerek belirli oranda tutulması daha doğrusu yavaşlatılması ve böylece daha geç olarak sabit fazı terk etmesi olayıdır. Alıkonma zamanına göre tayin yapılır (2). Kromatografide karşılaştırmalarda alıkonma zamanı yerine kapasite faktöründen(k) yararlanılır. Burada t R, bileşene, to, kolonda tutunmayan türe ait alıkonma zamanlarıdır.(6) Pompa: Sıvı kromatografisinde, özellikle de HPLC donanımında temel bir bileşendir. HPLC uygulamalarında mobil fazı oluşturan çözücü karışımlarının, enjektör, kolon ve dedektör içerisinden belirli, sabit veya değişgen bir hızda, belirli basınç altında geçmesini sağlar. Şekil 2.2. (A) % 50 oranında ACN. (B) % 70 oranında ACN. (C) İlk 5 dk. % 50 5. dakikadan sonra % 70 ACN. (D) 7 dakika boyunca %30-85 aralığı oranında ACN kullanılmıştır.(gradient elüsyon).

7 Ölü zaman: Kolonda tutulamayan maddelerin pikidir (5). Dedektör: Kolonda ayırımı yapılan analizlenecek maddeye ait bileşenlerin alıkonma zamanlarına göre sırayla içerisinden geçerken miktar tayinlerinin yapıldığı HPLC donanımıdır. Kromatogram: Kromatografik analiz sonucunda elde edilen grafiktir. Y-ekseni, kullanılan dedektörün ölçtüğü fiziksel özelliği (absorbans, fluoresans, iletkenlik, akım, kırılma indisi vb.), X-ekseni ise zamanı göstermektedir (Şekil 2.3). Şekil 2.3. Alıkonma zamanı kromatogramı (5) Lineer akış hız: U ile sembolize edilir, kolon uzunluğunun (L) kolon ölü zamanına (t o ) bölünmesiyle hesaplanıp birimi cm/saniye dir. Çözünürlük: R ile sembolize edilir. Birbirini takip eden 2 adet bileşene ait piklerin birbirinden ayırımlarının başarısını (oranını) gösterir (2).

8 2.2.2. HPLC Cihazları HPLC, 1970 lerin ilk yıllarında gıda maddelerinin analizi için geliştirilmiş ve ilk olarak 1973 de mikotoksin araştırmaları için uygulamalar başlamıştır (7). Modern sıvı kromatografi sistemlerinde genel olarak kullanılan ve tanecik boyutu 2 ile 10 µm arasında olan dolgu maddeleri ile uygun sıvı akış hızları elde edebilmek için, yüzlerce atm lik pompa basınçlarına gerek vardır. Bu yüksek basınçların bir sonucu olarak HPLC için gerekli donanım, diğer tip kromatografi sistemleri dikkate alındığında, daha ince işçilik gerektirir ve sonuçta daha pahalıdır. Şekil 2.4 de tipik bir yüksek performanslı sıvı kromatografi cihazının çeşitli kısımları şematik olarak gösterilmiştir (3). Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi analitik ayırma teknikleri amacı ile en yaygın kullanılan cihazdır. Yaygın kullanılma sebepleri duyarlılığı, kantitatif tayinlere kolaylıkla uyarlanabilir olması, uçucu olmayan veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen bileşiklerin ayrılmasına uygunluğudur. Şekil 2.4. HPLC cihazının şematik gösterimi

9 En önemlisi ise sanayiinin birçok bilim dalının ve toplumun birinci derecede ilgilendiği maddelere geniş bir şekilde uygulanabilirliğidir. Bu tip bileşiklere örnek olarak amino asitler, proteinler, nükleik asitler, karbonhidratlar, ilaçlar ve pestisitler verilebilir (8). 2.2.2.1. Hareketli Faz Hazneleri ve Çözücü Muamele Sistemleri Modern bir HPLC cihazı, bir veya daha çok cam veya paslanmaz çelikten yapılmış hazne içermektedir. Bu hazneler çoğu zaman, çözücü haznelerde bulunabilecek tozları ve kolonda ve detektör sisteminde gaz oluşturarak bozucu etkilere sebep olan çözünmüş gazların (genellikle oksijen ve azot) giderilmesi için bir cihazla donatılmıştır.3 Sabit bileşimdeki tek bir çözücü kullanılarak yapılan bir ayırma izokratik elüsyon olarak adlandırılır. Analiz süresince hareketli fazın bileşiminin değiştirilebildiği ve polarlıkları birbirinden farklı iki (veya bazen daha fazla) çözücü sistemlerinin kullanıldığı tekniğe gradiyent elüsyon denir. Modern HPLC ekipmanları çoğu zaman, çözücülerin hacimsel oranı zamanla doğrusal olarak veya üstel olarak değiştirilebilecek şekilde, iki veya daha fazla hazneden aldığı çözücüleri bir karıştırma odasında sürekli olarak değişen hızlarda bir araya getiren sistemlerle donatılmıştır (3). 2.2.2.2. Pompalama Sistemleri HPLC cihazları, diğer sıvı kromatografisi cihazlarından, kolon giriş ve çıkışı arasında oluşturulması gereken yüksek basınç nedeni ile farklılık gösterir. Bu basınç farkı, kolon girişine bir pompa yoluyla uygulanan basınç ile sağlanır. Çözücü pompalama sistemi belki de HPLC sisteminin en önemli kısmıdır. Pompanın performansı, analitik sonuçlardaki tekrarlanabilirliği, nicel değeri, gözlenebilme sınırı vb. değerleri büyük ölçüde etkiler. HPLC pompalama sistemleri için gerekli şartlar oldukça sıkıdır. Bu sistemler 400 atm e kadar basınç üretimi, puls içermeyen basınç çıkışı, 0,1-10 ml/dakika aralığında akış hızları, % 0,5 veya daha iyi bir bağıl tekrarlanabilirlikle akış kontrolü, korozyona dayanıklı parçalar gibi özelliklere sahip olmalıdır.

10 HPLC cihazlarında kullanılan pompalama sistemleri: a) Pistonlu (sabit akış) pompalar: Pistonlu pompalar iki modeldir. Birinde piston, pompalanan hareketli sıvı faz ile doğrudan temas halindedir. Diyafram pompaları olarak adlandırılan diğerinde ise, piston hareketi hidrolik sistem yoluyla esnek paslanmaz çelik membrana iletilir. Ticari olarak satılan HPLC sistemlerinin yaklaşık % 90 ında kullanılan pistonlu pompalar, genellikle motor kontrollü bir pistonun ileri ve geri hareketiyle çözücünün pompalandığı küçük bir silindirden meydana gelmiştir. b) Sürgülü Pompalar: Sürgülü pompalar, bir kademeli motordan güç alan vidalı güdüm mekanizması ile kumanda edilen sızdırmaz bir sürgüsü olan, şırınga benzeri silindirik bir kaptan ibarettir. c) Pnömatik (havalı) Pompalar: Pnömatik (havalı) pompalar da gaz basıncıyla çalışır. Gaz basıncı küçük alanlı bir pistonu iten büyük alanlı bir pistona etki eder. Gaz basıncı böylece pistonların yüzey alanları oranında kuvvetlenir. Sabit basınçtaki sıvı sisteme dağıtılır (3). 2.2.2.3. Numune Enjeksiyon Sistemleri Çoğu zaman, HPLC ölçmelerin kesinliğini belirleyici en önemli faktörlerden biri, numunenin kolon dolgu maddesine sevkinin tekrarlanabilirliğidir. İdeal enjektör, örneği kolonun başına solvent akışına zarar vermeden verebilmelidir. Teorik olarak bunu gerçekleştirecek ideal metod, solvent akışını durdurmaksızın kromatografik materyal yatağının baş kısmına örneği verebilmelidir. Bu septum enjektörü kullanılarak başarılabilir, fakat yüksek basınç altında sızıntı problemi bu enjektörün kullanımını sınırlamaktadır. İlk ve en basit numune verme düzeneği, kendi kendine sızdırmazlık sağlayan elastomerik septumlardan şırınga ile enjeksiyon sistemidir. Bu amaçla 100 atm basınca kadar dayanıklı mikroşırıngalar kullanılır. Bu tekniğin avantajı basitliğidir. Şırınga ile enjeksiyonun tekrarlanabilirliği nadiren % 2-3 den daha iyidir ve çoğu zaman önemli ölçüde kötüdür. Valf enjektorler ve sırınga enjektorler olmak uzere iki tip enjeksiyon sistemi vardır. Yeni sistemler de, normal enjeksiyon ve oto enjeksiyon sistemleri vardır (3).

11 2.2.2.4. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi Kolonları Modern HPLC donanımının 4 temel yapı taşından birisi olan kolon, karmaşık örneklerde bileşenlerin birbirinden iyi çözünürlükle ayırımından sorumlu sabit fazdır. Kolonun ayırım gücü ve performansı, iç yüzeyine yapılan kaplamada kullanılan malzemenin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden etkilenmektedir. Kullanılan bu tür kaplama malzemeleri çok çeşitli olup, kullanılacak mobil fazın ve uygulanacak HPLC metodunun özelliklerine ve analizi yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre seçilmelidir. Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak basınca dayanıklı olmasına dikkat edilmelidir. Sıvı kromatografi kolonlarının büyük bir çoğunluğu 5-30 cm arasındadır. Sıvı kromatografi kolonlarının iç çapı genellikle 4-10 mm, yaygın olarak kullanılan birçok kolon dolgu maddesinin tanecik büyüklüğü: 5-10 µm arasındadır. Kolon iç çapı arttıkça akış hızı ve iç doldurma hacmi artmakta ama oluşacak piklerin çözünürlüğü dolayısıyla duyarlılık azalmaktadır. Kolonların boyları (uzunluğu) çok çeşitli olup genellikle 30-300 mm aralığında değişmektedir. Kolon uzunluğu arttıkça örnek bileşenlerinin ayırımı daha iyi olmakta fakat piklerde kuyruklanma olmakta ve analiz süresi uzadığı için daha fazla mobil faz harcanmaktadır. Kromatografik kolonda partikül büyüklüğü önemlidir. Pek çok dedektör konsantrasyona bağlı olduğundan, teşhis duyarlılığında bir artışa yol açacaktır. 3 µm dolgu partiküllü kolonların avantajı, sadece küçük hacimli enjeksiyona izin veren valfler kullanılması ve band genişlemesine yol açmayan dedektörlerle ortaya çıkar. Günümüzde en çok kullanılan kolon, 25 cm uzunluğunda, 4,6 mm iç çapında ve 5 µm tanecik büyüklüğüne sahip dolgu maddesi doldurulmuş kolondur. Bu tip kolonlar 40000-60000 tabaka/metre içerirler. Şekil 2.5 de çeşitli kolon dolgu maddelerinin tipleri görülmektedir (3). Koruyucu (guard) kolon, analit kolonun giriş kısmına takılarak çözücü gelebilecek toz ve kirlilikleri tutmak suretiyle kolonun ömrünü uzatırlar. Bunun yanında koruyucu kolonlar yardımıyla durgun faz, hareketli faz ile doyurularak sıvı-sıvı kromatografisinde durgun fazın sürüklenme ile kaybı minimuma indirilir.

12 Birçok uygulama için kolon sıcaklığının yakından kontrolü gerekli değildir ve kolonlar oda sıcaklığında kullanılırlar. Ancak, çoğu zaman, kolon sıcaklığı, derecenin onda birkaçı hata ile sabit tutulduğu zaman daha iyi kromatogramlar elde edilmektedir. Birçok modern ticari cihaz, kolon sıcaklığını oda sıcaklığından, 100-150 C a kadar her sıcaklıkta onda birkaç derece hata ile sabit tutabilen kolon ısıtıcıları ile donatılmıştır. İyi bir kolon dolgu maddesi kararlı olmalıdır ve hem hareketli faz çözücülerine hem de örnek çözeltilere karşı inert olmalıdır. Geniş yüzey alanına, düzgün olarak dağılmış ve hareketli faza kolay erişebilir açık yapısal yüzeye sahip olmalıdır. Yüksek basınç ve yüksek akış hızlarından etkilenmemelidir. Örneğin alıkonma hacmi ve tutulma kapasitesi dolgu maddesinin yüzey alanı ile orantılıdır. Gözenekli bir dolgu maddesinde örnek moleküllerinin tanecik merkezine ulaşması ve sonra geriye dönmesi için (25 µm + 25 µm = 50 µm) ideal diffüzyon uzaklığı olmalıdır. Kolon dolgu maddeleri genellikle silika ve alümina esaslıdır (2). Dolgu materyalleri, partikül yapılarına bağlı olarak; a) Büyük partiküllü ve tamamen gözenekli (poroz), b) Pelikuler, c) mikropartiküllü ve tamamen gözenekli dolgular, olmak üzere üç grup altında toplanabilir (9). Şekil 2.5. Kolon dolgu maddelerinin tipleri Başarılı bir kromotagrafinin amacı verimli bir ayırım ve dar bir kromatografik bant elde etmektir. Kromatografik kolon verimliliklerinin kantitatif ölçümünde birbiriyle bağıntılı olan iki terim sıkça kullanılır:

13 1. Tabaka yüksekliği, H, (Plate Height) 2. Teorik tabaka sayısı, N, (Number of Theoretical Plate) Bu iki terim arasındaki bağıntı aşağıdaki eşitlikle ifade edilebilir; N= L / H L: Kolon dolgusunun uzunluğu ( cm) Bir kolonda tabaka yüksekliğinin azalması ve teorik tabaka sayısının artmasıyla kolon verimliliği artar. Hareketli ve durgun fazların bileşimi, kolon dolgu maddesinin tanecik büyüklüğü ve kolon çapına bağlı olarak kolonun tipi kolon verimliliğine etki etmektedir. Kolon dolgu maddesinin tanecik çapı küçüldükçe kolon tabaka sayısı artmakta bu da kolon verimliliğini artırmaktadır. Martin ve Synge ayrı fakat bitişik dar tabakalardan meydana gelen kromatografik bir kolon düşündükleri teorik çalışmalarıyla tabaka yüksekliği ve teorik tabaka sayısı terimlerinin ortaya çıkışına öncülük etmişlerdir. Her tabakada maddenin hareketli ve durgun faz arasında kurduğu dengenin, yeniden meydana geldiği kabul edilmiştir. Analitin kolon içerisinde hareketi, dengedeki mobil fazın bir tabakadan diğerine geçişi olarak kabul edilmiştir. Teorik tabaka sayısı şu şekilde hesaplanır; N=16 (t R / W )2 veya N= 54,4 (t R / W1/2 )2 W : Pik taban genişliği Teorik tabaka sayısı N ve tabaka yüksekliği H, literatürlerde ve kromatografik cihaz üreticileri tarafından, kolon performansının bir ölçümü olarak kullanılır (10). 2.2.2.5. Dedektörler Detektör yüksek basınçlı sıvı kromatografisinde, aletin en önemli kısımlarından birini oluşturur. Kolondan çıkan maddelerin derişimi kolon çıkışına yerleştirilen uygun bir detektör ile ölçülür. Dedektör seçimi doğru ve hassas bir analiz yapabilmek için son derece önemlidir. Genellikle tek dedektör sistemi kullanılmakla beraber, birden fazla dedektör sisteminin yer aldığı cihazlar da mevcuttur. Duyarlılık, doğrusallık, üniversal ve seçici cevap, doğru cevap, koşulların değişiminden etkilenmeme, numuneyi tahrip etmeme,

14 ucuzluk ve kolay kullanım; bir detektörde bulunması gerekli önemli özelliklerdir. HPLC dedektörlerinin iki tipine rastlamak mümkündür. Genel dedektörler, hareketli faz ve örnek çözeltisinin özelliklerindeki değişimi ölçer. Seçici dedektörler ise yalnız örnek çözeltisi için duyarlık ve seçicilik gösterir. Genel özellikli dedektörlere örnek olarak kırılma indisi ölçen dedektörler ve kütle spektrofotometreleri verilebilir. Seçici dedektörlere örnek olarak da UV, FT-IR, floresans, elektrokimyasal, radyokimyasal, iletkenlik dedektörleri verilebilir. Seçici dedektörler, genel dedektörlerine göre yaklaşık 1000 kat daha duyarlıdır. Dedektörler, örnek bileşenlerini tayin ederken ölçtükleri fiziksel özelliklere göre farklılandırılabilir. 365 tane basılmış makalede yapılan inceleme, çalışmaların,% 71 UV absorpsiyonun belirlenmesiyle, % 15 floresansla, % 5,4 kırma indisiyle, % 4,3 elektrokimyasal ölçmelerle, % 4,3 diğer yöntemlerle yapıldığını ortaya koymaktadır. UV absorpsiyon detektörleri ile yapılan çalışmaların % 39 ışın kaynağı olarak cıvanın bir emisyon çizgisi, % 13 döteryum lambasından çıkan ışınların süzülmesi ile elde edilen ışın% 48 optik ağ monokromatörden yayılan ışın kullanılmıştır (3). HPLC de kullanılan dedektörler: a) Ultraviyole-görünür bölge dedektörü(ultraviolet / Visible dedector - UV/VIS): Absorbans ölçen dedektörler olup HPLC de kullanılan dedektörlerin yaklaşık % 80-90 ını oluşturmaktadırlar. Lambert-Beer yasası geçerlidir. Spektrum taraması yapmak, farklı dalga boyunda çalışmak veya dalga boyunu zamana karşı programlamak mümkündür. UV dedektörün karakteristikleri şunlardır: - Örneklerin UV- görünür bölgede absorpsiyon yapması gerekir. - Hareketli faz akış hızı ve sıcaklık değişimlerinden etkilenmez. - Band genişletme etkisi küçüktür. - Çok güvenilirdir, operasyonu kolaydır. - Örnek çözeltiyi bozmaz. b) Foto Diode Array Dedektör: Prensip olarak UV ve görünür bölgede çalışan dedektör sistemidir. Işın kaynağı olarak UV ve görünür bölge lambalar kullanılır. Ancak birçok dalga boyunda eşzamanlı analiz yapılabilir. c) Floresans Detektörler: HPLC için floresans detektörler, florimetre ve spektroflorimetrelere benzer şekilde tasarımlanmışlardır. Bunların çoğunda floresans,

15 uyarıcı ışına 90 derecede yerleştirilmiş bir fotoelektrik detektör yardımıyla gözlenmektedir. Floresans dedektörün en önemli avantajı hassasiyetidir. 1 ppb den daha düşük konsantrasyondaki maddelere cevap verebilmektedir d) Elektrokimyasal dedektör: Bu dedektörlerle elektroaktif maddeler analiz edilebilir. Belirli potansiyel değerlerinde yükseltgenebilir veya indirgenebilir maddelerin tayinleri mümkün olabilmektedir. e) İletkenlik Dedektörü: Bu tür dedektörlerle iletkenlik ölçülür. Daha çok anyon ve katyonların analizlerinde kullanılır. f) Kırma İndisi Dedektörü: Her bir bileşenin miktarını ölçebilen, yani seçimli olmayan bir dedektör türüdür. Bu sistemde herhangi şekilde ışığın absorpsiyonlanması olmadan sadece ışığın kırılması prensibine göre çalışan bir detektör sistemidir. g) Buharlaştırmalı Işık Dedektörleri (ELSD): Son yıllarda, HPLC için yeni bir genel detektör tipi, buharlaştırmalı ışık saçma detektörleri (ELSD), ticari olarak piyasaya çıkmıştır. ı) Kütle Spektrometrik Dedektörler: Sıvı kromatografi ile kütle spektrometriyi birbirine bağlamadaki temel problem, sıvı kromatografinin bağıl olarak çok çözücü hacimleri ile çalışması ve kütle spektrometrinin vakum gerektirmesidir. Bu problemi çözmek amacıyla çeşitli ara bağlantılar geliştirilmiştir. Kütle spektrometrisi detektörü sıvı kromatografi piklerinin on-line kalitatif analizi için en iyi araçtır (3). Tablo 2. 1 de HPLC de sık kullanılan dedektörlerin karşılaştırılması görülmektedir.

16 Tablo 2.1. HPLC dedektörlerinin başlıca özelliklerinin karşılaştırlması (6) 2.2.3. HPLC Cihazının Diğer Sıvı Kromatografi Türlerine Göre Üstünlükleri HPLC cihazının diğer kromatografik tekniklere göre bazı üstünlükleri vardır. Bu üstünlükler aşağıda sıralandırılmıştır. 1.HPLC kolonu, rejenerasyon olmaksızın pek çok kez kullanılabilir. 2. Kolonlarda gerçekleştirilen ayırma, öteki yöntemlerle elde edilenden çok daha çeşitlidir. 3. Bu teknik kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirliği daha yüksektir. 4. Nicel analiz için de kullanılabilir. 5. Analiz süresi çok kısadır. 6. Duyarlığı çok yüksektir, 10 µg lık bir örnek bile, floresans veya elektron yakalama dedektörleri kullanılarak tayin edilebilir (11-12). 2.3. HPLC de Ayırma Teknikleri HPLC normal sıcaklık da uçucu olamayan ve yüksek polariteye sahip maddelerin analizinde kullanılır. HPLC sistemi bir çözücüde çözülebilen bütün maddelere uygundur. Maddeler kolon içinden geçirilirken maddelerin kolon dolgu maddesi ile farklı etkileşimlerinden dolay kolon içersinde al konma zamanlar farklı olur ve detektöre farklı zamanlarda gelirler. Ayrılan maddeler dedektöre farklı zamanlarda geldiği için maddenin konsantrasyonuna bağlı olarak pik oluşur. Kaydedici sistemler bilgisayarlı bir software

17 yada Chromatopac denilen özel yazıcı sistemlerdir. Sistemde kullanılan kolonların çapı 20 µm den küçük dar kolonlardır. HPLC sisteminde kullanılan farklı ayırma teknikleri kullanılır, bunlar için uygun kolon sistemi seçilmesi gerekmektedir. 2.3.1. Yüksek Performanslı Dağılma Kromatografisi Dağılma kromatografi, dört ayrı tip sıvı kromatografi içinde, en yaygın kullanılanıdır. Dağılma kromatografisi sıvı - sıvı kromatografi ve sıvı bağlı faz kromatografi olmak üzere iki alt sınıfa ayrılabilir. İki teknik arasındaki fark katı parçacıklar yüzeyine durgun fazın tutturulmasındaki metod farkından kaynaklanır. Sıvı-sıvı tekniğinde durgun faz katı yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla; bağlı faz tekniğinde ise kovalent bağlarla tutturulur. Dağılma kromatografi, hareketli ve durgun fazlarının bağıl polarlığına bağlı olarak iki kısma ayrılabilir (3). Sabit fazın mobil fazdan daha polar olduğu kromatografi şekline normal faz kromatografisi, mobil fazın sabit fazdan daha polar olduğu kromatografi şekline ise ters faz kromatografisi denir (13). Tablo 2. 2 de normal faz ve ters faz HPLC nin özellikleri verilmiştir. 2.3.1.1. Normal-faz Kromatografi Normal-faz kromatografide en düşük polaritedeki bileşenler hareketli fazda nispeten çok çözündükleri için en önde elue edilirler, hareketli fazın polaritesindeki artış, elüsyon zamanının azalması ile sonuçlanır. Kolon olarak; Silika, Siyano, (CN) Amino, ( NH 2 ) Diol, ( OH) Nitro, ( NO 2 ) kolon sistemleri kullanılır. Bu kullanılan teknik de mobil faz olarak diklorametan yada hekzan gibi apolar çözücüler kullanılır. 2.3.1.2. Ters-faz Kromatografi İlk geliştirelen tekniğin yetersiz olduğu için daha sonra kolon ve çözücü sistemindeki polar ve apolar sistemi yer değiştirilerek ters faz sistemi geliştirilmiştir. Bu sistem en çok kullanılan kromotografi tekniğidir. Ters-faz kromatografide durgun faz apolardır ve çoğu zaman bir hidrokarbondur. Ters-faz kromatografide en polar bileşenler, en önde yürür ve hareketli fazın polaritesindeki artış, elüsyon zamanını artırır. Bu sistemde kolon apolar ve

18 çoğu zaman bir hidrokarbondur, mobil faz ise metanol, asetonitril ve su gibi polar çözücüler kullanılır. Bu sistem en çok kullanılan kromotografi tekniğidir. C18, ( ODS ), C8, C4, C2, Phenyl, CN, ( RP) NH 2 (RP ) kullanılan kolon çeşitleridir (5). HPLC ters- faz yöntemi ile A ve E vitaminleri, retinol asetat, α-, β- ve γ-tokoferol, α- tekoferol asetat gibi maddelerin tayini yapılabilir (9). Tablo 2.2. Normal ve ters faz kromatografisi özellikleri 2.3.1.2.1. İyon çifti kromatografi İyon-çifti (veya eşleşmiş iyon) kromatografi, iyonik türlerin ayrılması ve tayini için kullanılan bir tür ters-faz dağılma kromatografidir. İyonik bileşiklerin zıt-faz (RP) sistemde alıkonma derecesi molekülün yüküyle orantılıdır. 2.3.1.2.2. Kiral Durgun Fazlı Kromatografi 1960 lı yılların ortalarında, optikçe aktif izomerleri (enantiyometreleri) gaz ve sıvı kromatografisinin her ikisiyle de birbirinden ayırmak amacıyla, kimyacılar kiral durgun fazlar (CSP) kullanmaya başladılar. Bu teknik, gaz kromatografide kullanılsa da, kolon ve düzlemsel yüksek-performanslı kromatografiye daha uygun görülmektedir. Çünkü gaz kromatografik kolonlardaki yüksek sıcaklıklarda diastomerlerin dağılma katsayılarındaki fark gittikçe azalmaktadır. Ayrıca yüksek kolon sıcaklıkları çoğu zaman kiral durgun fazların rasemleşmesine sebep olmaktadır (3).

19 2.3.2. Adsorpsiyon Kromatografisi Bu yöntemde durgun faz, çok ince toz haline getirilmiş polar katı yüzeyidir. Bu tür dolgularda analit, dolgu maddesinin yüzeyinde hareketli faz ile adsorpsiyon yarışına girer. Kolondaki tutulma zamanı, analitin yüzeydeki adsorpsiyon kuvvetlerine bağlıdır.bileşenler birbirlerinden katı yüzeye olan farklı derecede ilgileri nedeniyle ayrılırlar. Adsorpsiyon denge sabiti büyük olan bileşen yüzeyde daha uzun kalırken, küçük olan daha kısa sürede kalmakta, hiç adsorplanmayan bileşen ise kolonda hiç geciktirilmeden hareketli faz ile taşınarak dışarı çıkmaktadır. Yüzeye adsorplanan bileşenler ise yüzeyle etkileşmelerine bağlı olarak farklı kalma sürelerinde kolonu terk etmektedir. Sıvı-katı HPLC için kullanılan durgun fazlar, sadece silis ve alüminadır. Adsorpsiyon kromatografide, çözücü sistemindeki farklılıklar, ayırma gücü ve alıkonma zamanlarında büyük farklılıkları beraberinde getirir ve uygun hareketli fazların bulunmadığı durumlarla nadir olarak karşılaşılır. Adsorpsiyon kromatografide, çözücü seçimi için uygun bir teknik, dağılma kromatografide tarif edilen tekniğe benzemektedir. Bu teknikte, bir tanesi çok kuvvetli ve diğeri çok zayıf olmak üzere birbiri ile uyumlu iki çözücü seçilir. Daha sonra iki çözücünün karışımındaki hacim oranları değiştirilerek istenen karışım elde edilir. Sıvıkatı kromatografi genellikle polar olmayan çözücülerde çözülebilen ve ters-faz dağılma kromatografide kullanılan sulu çözücülerde sınırlı çözünürlüğü olan numuneler için en uygun yöntemdir. Şekil 2.6 de adsorpsiyon kromatografisinin tipik bir uygulamasını ile bir ayrıma gösterilmektedir.

20 Şekil 2.6. Adsorpsiyon kromatografinin tipik bir uygulaması cis-ve trans- pirazolinlerin ayrılması. Kolon: 100 0,3 cm zarlı kaplanmış silis. Hareketli Faz: % 50 metilen klorür/izooktan. Sıcaklık: Oda sıcaklığı. Akış hızı: 0,225 ml/dakika. Detektör: UV, 254 nm (2) 2.3.3. İyon Değiştirme Kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi, net yükteki farklılıklara dayalı olarak iyonik bileşikleri ayırmak için kullanılır. İyon-değiştirme kromatografisi için ilk önce lazım olan, eğer bir ayırma söz konusu olacaksa, sabit fazın ilgilenilen bileşiklerinkine zıt bir yük taşımasıdır. İyon değiştirici reçinelerini kullanımına dayanan iyonların ayrılması ve tayini için modern ve etkili bir yöntemdir. Ayrılacak bileşiklerin yüküne bağlı olarak iki tip iyon değiştirici vardır. Bileşiklerin negatif yüklü oldukları anyon değiştiriciler ki, bunda iyon değiştirme materyali pozitif bir yük taşıyacaktır. Pozitif yüklü bileşiklerin analizi için ise, negatif yük taşıyan katyon değiştiriciler. İyon kromatografi, birbiriyle çok benzer olan nadir toprak katyonlarının katyon değiştirici reçinelerle ayrılması için geliştirilen Manhattan projesi sırasında ortaya çıkan iyon-değiştirme kromatografinin gelişmişidir. Modern HPLC nin gelişmesi 1960 lı yılların sonunda başladı, ancak bu yöntemlerin iyonik türlere uygulanmaları, alkali katyonlar, toprak alkali katyonlar, halojenürler, asetat, nitrat gibi iyonik türlerin eluatlarının belirlenmesi için genel bir yöntemin eksikliği sebebiyle gecikti. Bu duruma, 1975 yılında, Dow Kimya Sanayi çalışanları tarafından, iyonların kondüktometrik belirlenmesini mümkün kılan bir çözücü sinyali baskılama tekniği ile çözüm bulunmuştur.

21 2.3.3.1. İyon Değiştirici Reçineler İyon değiştirici reçinelerin kullanılması durumunda örnekte iyon halinde bulunan türlerin birbirinden ayrılması sağlanabilir. Kullanılan iyon değiştirici reçineler doğrudan kolona doldurulabilen katı reçineler olabileceği gibi, bir katı yüzeyine kaplanmış sıvı reçineler de olabilir. İyonların bu reçinelere olan ilgilerine etki eden birçok faktör vardır. Bunlar; iyonların yükü ve büyüklüğü, ph, iyon şiddeti, kullanılan reçinenin gözenekliliği, çözücü cinsi, çözücü derişimi ve sıcaklıktır. 2.3.3.1.1. Mikrogözenekli veya Jel Yapısındaki Reçineler Bu reçineler mikro gözenekler içeren, çapraz bağlı yapısal bir ağdan oluşmaktadır. Çok küçük gözeneklere sahip olduğundan polar olmayan çözücü sistemlerinde, şişme çok düşüktür. Büyük hacimlerdeki iyonların tuttunması yavaştır ve çoğu kez tersinmezdir. 2.3.3.1.2. Makrogözenekli Reçineler Bu reçineler mikrogözenekli reçinelere ek olarak, geniş büyüklükte gözenekler de içerir. Bunlar büyük iç yüzey alanlarına ve yüksek gözenekliliğe sahiptir. Büyük gözenekler, farklı büyüklükteki iyonların iyon değiştirici fonksiyonel gruplara kolayca ulaşmasını sağlayan kanallar içerir. 2.3.3.1.3. Pelikular Reçineler Bu reçineler, cam boncuklardan oluşmuş iç kısma, iyon değiştirici ince bir reçine filminin kaplanmasıyla hazırlanır. İç kısmın çapı çok küçüktür ve bu yüzden çözücülerin çok küçük miktarları için uygundur. 2.3.3.1.4. Yüzeysel Gözenekli Reçineler Cam boncuklardan oluşmuş katı iç kısım, üzerine iyon değiştiricinin bağlandığı silika mikroküreciklerinin ince tabakasıyla çevrilir. HPLC destek maddeleri hem silika temelindeki maddeleri hem de türevlendirilmiş hidrofilik veya hidrofobik polimerleri kapsar. Polimer temelindeki iyon değiştirici

22 reçinelerin polimerik iskeleti polistirene çapraz bağlanmış divinilbenzenden sentezlenir. Bu destek maddelerinin avantajı, ph 2 - ph 12 arasındaki ph aralığında kararlı olmalarıdır. Silika temelinde iyon değiştiren matriksler hidrofiliktir ve polimerik tabaka oluşması için kullanılan çapraz bağlayıcılar yüzünden düşük hidrofobik tutunma gösterirler. Küçük parçacık büyüklükleri ve sık dağılımları yüksek kaliteli bir ayırma sağlar. Gözenekli yüzeylerinden dolayı, hareketli faza önemli bir temas yüzeyi sağlarlar. Kimyasal ve mekanik olarak kararlı olan silika matriksleri, yüksek akış hızı gerektiren yüksek basınca karşı iyi direnç gösterirler. İyon-değiştirme olayları, çözeltideki iyonlar ve çözünmeyen, yüksek molekül ağırlıklı bir katının yüzeyindeki benzer yüklü iyonlar arasındaki değiştirme dengesi temeline dayanmaktadır. İyon kromatografisinde analit iyonları, uygunbir iyon değiştirici reçine ile doldurulmuş kolonun üstünden ilave edilir. Sonra, reçine yüzeyindeki yüklü gruplara bağlanmak için analit iyonları ile yarışan bir iyon içeren çözelti ile elüsyon yapılır. Bu ayırma işleminde kolonun üst kısmına önce numune konur. Kolonda anyonlar, reçine tarafından aşağıdaki reaksiyona göre tutulurlar. Daha sonra bir seyreltik baz çözeltisi ile elüsyon işlemi yapılarak yukarıdaki reaksiyonun ters yönde yürümesi sağlanır ve böylelikle anyonlar serbest hale getirilir. Her anyonun dağılma oranı bir diğerinden farklı olduğu için elüsyon esnasında iyonlar birbirinden ayrılır. İyon kromatografisinin çekici yönlerinden biri, iletkenlik ölçümlerinin, elüsyon ile ayrılan türlerin tanınma ve konsantrasyonlarının tayininde hemen hemen bütün iyonlara uygulanabilen genel bir metod olmasıdır. İyon değiştirme kromatografisi, Eluent Baskılayıcı Kolonlu İyon-Değiştirme Kromatografi ve Tek-Kolonlu İyon Kromatografi olarak uygulanabilmektedir. Eluent Baskılayıcı Kolonlu İyon-Değiştirme Kromatografisinde, baskılayıcı kolon, analit iyonlarını etkilemeyen, çözücü içindeki iyonları ise iyonlaşması sınırlı olan moleküler türlere etkin bir şekilde dönüştüren, ikinci bir iyon değiştirici reçine ile doldurulmuştur. Katyonlar ayrılacak ve tayin edilecekse, elue edici reaktif olarak çoğu zaman hidroklorik asit seçilir ve baskılayıcı kolon hidroksit formundaki bir anyon-değiştirici reçinedir. Anyon ayırmaları için baskılayıcı dolgusu, asit formundaki katyon-değiştirici reçinedir. Orijinal baskılayıcı kolonlarda karşılaşılan bir zorluk, dolgu maddelerini orijinal asit ve baz formlarına dönüştürmek için periyodik olarak (tipik olarak her 8-10 saatte bir) rejenere etme gereğidir. Yöntem çok hızlıdır. Tek- Kolonlu İyon Kromatografisi, elue edilmiş numune iyonları ve kullanılan elue edici iyonlar

23 arasındaki küçük iletkenlik farklarına dayanmaktadır. Bu farkları büyütmek amacıyla, düşük eşdeğer iletkenliği bulunan türlerle elüsyonu mümkün hale getiren, düşük kapasiteli iyon değiştiriciler kullanılır. Tek-kolonlu kromatografi, baskılayıcı kolonlu iyon kromatografiye göre daha az duyarlıdır ve kullanım aralığı daha dardır (3). 2.3.3.2. İyon-Eleme Kromatografi İyon-eleme kromatografi, iyonlardan çok nötral türlerin ayrılmasından dolayı iyon kromatografinin bir formu değildir. Buna rağmen, iyon-eleme kromatografide, ayırmalar için iyon kromatografi gibi iyon-değiştirici kolonlar kullanılır. Burada, durgun faz, asidik yapıdaki bir katyon değiştirici reçinedir ve elüsyon işlemi seyreltik hidroklorik asit çözeltisi ile gerçekleştirilir. Analitik kolonu baskılayıcı kolon takip etmektedir ve bu kolon içine gümüş formunda katyon değiştirici reçine doldurulmuştur. Eluent içindeki hidrojen iyonları, gümüş iyonları ile yer değiştirir ve bu, daha sonra klorür ile çöker. Böylece eluentten gelen bozucu iyonlar uzaklaşmış olur. İyonlaşmamış haldeki analit asitler kolondaki hareketli faz ve dolgu maddesinin gözeneklerinde tutulan hareketsiz sıvı arasında dağılmaya uğrar. Gerçi bu iki faz arasında farklı türlerin dağılımına diğer faktörler de etki eder, ama farklı asitler için dağılma katsayısı, öncelikle bunların iyonlaşma sabitleri ile ters orantılıdır. 2.3.4. Yüksek Performanslı Boyut Ayırıcı Kromatografi Bu metod kolon dolgu materyali üzerinde bir örneğin alıkonmasını içermemesiyle daha önce açıklananlardan farklılık gösterir. Ayırma mekanizması, değişik moleküllerin poröz bir ortam (matrix) içinden geçerken farklı diffüzyon veya permeasyon hızlarına dayanır. Jel-geçirgenlik veya jel-süzme kromatografi adı verilen boyut-eleme kromatografi, özellikle yüksek mol kütleli türlere uygulanabilen güçlü bir tekniktir. Boyut-eleme kromatografi için dolgu maddeleri, çözünen madde ve çözücü moleküllerinin içine difüzlenebileceği düzgün bir gözenek ağı içeren küçük boyutlu ( 10-µm) silis veya polimer partiküllerden meydana gelmiştir. Bu gözeneklerde moleküller, hareketli fazın akışı esnasında etkin bir şekilde tutulur ve sonra bırakılır. Ortalama gözenek büyüklüğünden önemli ölçüde daha büyük moleküller, dolgu maddesi tarafından tutulmazlar ve bu moleküller için tutulma süresinden bahsedilemez. Böylece bu moleküller kolondan hareketli fazla aynı hızda geçerler. Ortama gözenek büyüklüğünden önemli

24 ölçüde daha küçük moleküller ise, dolgu maddesinin gözeneklerine girerek en uzun bir süre için alıkonulur; bunlar en son elue edilirler (3). Piyasada çok sayıda boyut-ayırıcı dolgu maddesi bulunmaktadır. Bunların bazıları hidrofiliktir ve sulu hareketli fazlarla kullanılabilmektedir. Hidrofobik olanları ise apolar organik çözücülerle kullanılır. Hidrofilik dolgu maddelerinin kullanıldığı kromatografiye jel süzme kromatografisi, hidrofobiklerin kullanıldığı kromatografiye ise jel geçirgenlik kromatografisi olarak adlandırılmaktadır. Boyut-eleme kromatografi için iki tip kolon dolgusundan bahsedilir. Bu iki tür kolon dolgu maddesinin her ikisinde de gözenek çapı 5-10 µm olan dolgu maddeleri kullanılır. Bu dolgu maddeleri, polimer ve silis esaslı partiküllerden oluşur. Silis esaslı partiküllerin avantajları, kolay doldurma ve yüksek basınçlarda çalışmaya uygunluk sağlayan nispeten yüksek sağlamlık, su dahil, geniş bir çözücü aralığında kullanıma izin veren daha büyük kararlılık yeni çözücülerle çok daha hızlı dengeye erişme ve yüksek sıcaklıklardaki kararlılıktır. Silis esaslı partiküllerin sakıncası, çözünen maddeleri adsorpsiyonla alıkoyma meyli ve çözünen madde moleküllerinin bozunmalarını katalizleme özellikleridir. Boyut-eleme yöntemleri, jel süzme kromatografi ve jel geçirgenlik kromatografidir. Jel süzme kromatografide, sulu çözücüler ve hidrofilik dolgu maddeleri kullanılır, suda çözünen maddelere uygulanır. Jel geçirgenlik kromatografide polar olmayan organik çözücüler ve hidrofobik dolgu maddeleri kullanılır ve daha az polar olan organik çözücülerde çözünen numunelere uygulanır. Bunlar birbirini tamamlar. Boyut-eleme kromatografinin diğer bir uygulaması, yüksek mol kütleli doğal ürün moleküllerinin, düşük mol kütleli türlerden ve tuzlardan ayrılmasıdır. Kısa ve belirli ayırma zamanları, iyi bir duyarlık sağlayan dar pikler, çözünen maddelerin durgun fazla etkileşmemeleri sebebiyle numune kaybı olmaması, çözünen madde ve dolgu maddesinin etkileşmesine bağlı kolon deaktivasyonunun olmayışı bu kromatografik yöntemin avantajları ve kromatogramların zaman skalası kısa olduğundan dolayı, sadece sınırlı sayıda pik elde edilebilmesi ve izomerler gibi benzer büyüklükteki numunelere bu yöntem uygulanamaması, genellikle uygun ayırmalar için mol kütleleri arasında % 10 farka ihtiyaç olması dezavantajlarıdır (2).

25 2.4. HPLC Kullanırken Alınması Gereken Önlemler 2.4.1. Hareketli Faz Çözücüleri İçin Önlemler Farklı dolgulu kolonlar için çözücü sınırlaması: Silika dolgulu bir kolon kullanıldığında, kullanılan hareketli fazın ph ına dikkat edilmelidir. Uygun ph aralığı 2-7.5 arasındadır. Gözenekli polimere sahip bir kolonun çözücüsünü değiştirirken, kolon maddesinde şişme veya büzülme olup olmadığına dikkat edilmelidir. Dolgu maddesinin şişmesi, su yüzdesiyle artar. Asit, baz, tuz veya iyon çifti reeaktifi kullanıldıktan sonra kolon, metanol/su karışımı ile temizlenmelidir. Çözücünün saflığı: HPLC de kullanım için mümkün olan en yüksek saflıktaki çözücüler kullanılmaktadır. Çözücünün degaze edilmesi: HPLC de hareketli fazda yüksek basınç altında hava çözünürse, pompa başında veya dedektör hücresinde doğru analize imkân vermeyen hava kabarcıkları oluşur. Ayrıca bu hava dedektörde yanlış ölçüme neden olabilir. Bu yüzden mobil faz olarak kullanılan çözücü tamamen degaze edilmelidir. Degaze işlemi özellikle, gazların kolayca çözündüğü su, alkol ve asetonitril veya bunların karışımı için mutlaka gereklidir. Çözücünün süzülmesi: HPLC çözeltileri, kullanılmadan önce daima süzülmelidir. Eğer süzülmeden kullanılırlarsa, kolon filtresi ve kolon başı tıkanabilir. Bunun sonucunda duyarlığın azalması, basıncın artması ve kolon ömrünün azalması gibi değişik problemler ortaya çıkabilir. Sulu ortamda süzme genellikle selüloz ester karışımı 0.22 µm gözenek büyüklüğüne sahip filtrelerle, organik ortamda süzme ise 0.2 µm gözenek büyüklüğündeki politetrafloroetilen filtrelerle yapılır veya HPLC çözücüsü için özel süzme aleti kullanılabilir. Çözücülerin değişimi: Eğer çözücü değiştirilecek olursa, diğer çözelti ilkiyle iyi karışabilir olmalıdır. Bu durum yalnızca pompanın düzensiz çalışmasına yol açmaz, aynı zamanda kolon ve dedektörü de kararsız hale getirir. Bir tampon kullanıldıktan hemen sonra organik bir çözücü kullanılırsa, HPLC sistemi tuzların çökmesi yüzünden çalışamaz hale gelir. Bu kolonun ömrünü de etkileyebildiğinden, organik çözücü kullanılmadan önce sistem su veya ara polaritede bir çözücü ile temizlenmelidir (2).

26 2.4.2. Kolon Kullanımı İçin Önlemler Kolon seçimi: Örneğin molekül kütlesi, solvent sisteminin çözünürlüğü, ayırma modu gibi bilgiler performanslı bir ayırmadan önce kolon seçimine yardım eder. Üreticiler kolon dolgu maddelerini, ayırdıkları bileşikler, örnek kapasiteleri vb. şekilde sınıflandıran bir literatür vermektedir. Ön-kolon kullanımı: Hareketli faz, pompa çıkışından sonra, ayırmayı sağlayan kolon ile aynı sabit fazı içeren bir ön-kolondan geçirilir. Bu uygulamanın amacı, hareketli fazdaki safsızlıkları toplamak ve hareketli fazı sabit faz ile doygunluğa getirmektir. Önkolon kullanmanın bir diğer avantajı ise fiyatları bir hayli yüksek olan ayırıcı kolonların ömrünü uzatmasıdır. Ancak burada ayırma olmamasına dikkat edilmelidir. Kolon tabakasının bozulması: HPLC sistemi yeni çalıştırılınca akış hızı yavaş yavaş arttırılmalıdır. Aynı uygulama sistem kapatılırken de izlenmelidir. Böylece kolon tabakasının bozulmaksızın kolon basıncının artması sağlanır. Kolonun korunması: Kolonlar rutubetli ve çok yüksek veya çok düşük sıcaklıkların olduğu yerlerde saklanmamalıdır. Kolonların özel bir çözücü ile saklanması, kirlenmeyi azaltır ve kolon ömrünü artırır. Bazı tamponlar (özellikle halojen tuzlarını içeren tamponlar) kolonun paslanmaz çelik duvarını aşındırır. Bu nedenle kolon saklanmadan önce uygun bir çözücüyle temizlenmelidir. Kolonun rejenerasyonu (yenilenmesi): Kolon performansı azaldığında en iyisi kolonu rejenere etmektir. Normal faz kolonları kullanıldığında, kolon önce çok az polarlıkta bir çözücü geçirilerek yenilenebilir ve sonra tekrar hareketli fazla dengeye getirilir. Ters faz kolonları metanol, THF, CH 2 Cl 2 gibi çözücülerle yenilenebilir (2). 2.4.3. Örnek Hazırlanması 2.4.3.1. Katı Örnekler Bir örneği HPLC sistemine vermek için, bu örneğin, hareketli faz olarak kullanılan çözücüde çözünmesi gerekir. Örneğin, metanol/su karışımı bir hareketli fazla ile analiz yapılacaksa, örnek metanolde, suda veya metanol/su karışımında çözülmelidir. Eğer

27 örnek böyle bir çözücüde çözünmüyorsa, diğer bir çözücüde çözünmeli, fakat bu durumda kullanılan çözücü kesinlikle hareketli fazla karışabilir olmalıdır. Örnek bileşenlerinin, mobil faz çözücüsünde çökmemesine de dikkat edilmelidir 2.4.3.2. Sıvı Örnekler Sıvı örneklerde çözücü, sistem ile uyumluysa, doğrudan enjekte edilebilir. Eğer örnekler istenen çözücüde değillerse veya enjekte edilecek kadar derişik değillerse, kurutulmalıdır veya deriştirilmelidir. Daha sonra hareketli fazda tekrar çözünmelidir. 2.4.3.3. Örneklerin Süzülmesi Hareketli faz akışında azalmaya, geri basıncında artmaya, kolon veriminde azalmaya ve istenmeyen piklere neden olabilecek çözünmeyen maddelerin kolona girmesini önlemek için, örneğin enjeksiyondan önce süzülmesi tavsiye edilir (2). 2.5 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografide Yöntem Geliştirme Sıvı kromatografik bir yöntemin geliştirilmesinde üzerinde durulacak en önemli husus, yeterli ayırmaya ulaşıldığının belirlenmesidir. Bu yöntemler, genellikle mobil fazın bileşiminin (su-organik faz oranı) optimize edilmesinde kullanılır. Yüksek performanslı sıvı kromatografide ayırmanın optimizasyonu, seçiciliğin maksimum hale getirilmesini gerektirir. Kromatografik sistemin seçiciliği, kromatografik sistemde çözünen, mobil faz bileşenleri ve durgun faz arasındaki bütün etkileşimleri yansıtır. Bu etkileşimler, sıcaklık, mobil fazın yapısı gibi deneysel koşulların değiştirilmesiyle yönetilebilir. Seçicilik, çözünenlerin dağılma katsayıları ile ilgilidir ve çözünenlerin kapasite faktörlerinin bir fonksiyonudur. Bu nedenle çözünenlerin alıkonma davranışlarını ve onların deneysel koşullara bağımlılığını anlamak, seçiciliğin ve devamında ayırmanın optimizasyonu için gereklidir. Çözünenlerin alıkonma davranışını kontrol eden önemli deneysel parametreler, sıcaklık, mobil faz bileşimi ve mobil faz ph sıdır. Birçok durumda sıcaklık, mobil faz organik modifiyer derişimi ve ph değerlerinin kapasite faktörü üzerindeki etkileri incelenerek,

28 deneysel parametreler arasındaki bağıntılar anlaşılmaya çalışılır. Bu çalışmalarda, ph ve organik modifiyerin sabit olması sağlanarak sıcaklık değişiminin etkisi; ph ve sıcaklığın sabit olması sağlanarak organik modifiyerin etkisi ve organik modifiyer ve sıcaklığın sabit olması sağlanarak ph değişiminin etkisi incelenir (14). 2.6. HPLC nin Uygulama Alanları HPLC, yapıları benzer kimyasal türlerin ayrılması ve saflaştırılması işlemlerinde güçlü ve kullanışlı bir araçtır. Buna ek olarak ayrılan türlerin kalitatif ve kantitatif analizlerinde de kullanılan bir yöntemdir (9). HPLC günümüzde başlıca kullanım alanları; kimya, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, tıp kimyası, bitki kimyası, tarım ve kimya mühendisliğini içeren alanlarda ayırma ve analiz için vazgeçilmez bir araçtır. Bunlar yanında organik, inorganik ve biyolojik bileşenler, polimerler, kiral bileşenler, küçük iyonlar ve makromoleküllerin ayrılması, safsızlık tayini, buharlaşabilen ve buharlaşmayan yapıların tayini, nötral, iyonik ve çift iyonik türlerin tayini ve bileşen izolasyonu ve saflaştırılmasıdır. Kimyasal ayırma, ilaçların önemli kimyasalların saflaştırılmasında, kimyasal sentezlerde, kullanılan bir yöntemdir. Kromatografi karışımların ayrılması için mükemmel bir teknik olmasına karşın ayrılmış bileşiklerin kesin teşhisi için gerekli detayları sağlayamaz. HPLC nin yaygın uygulamaları; Fizyolojik örneklerdeki bazı aminoasit, nükleik asit ve protein miktarlarının tayini İlaç aktif maddelerinin, sentetik biyoürünlerin yada farmasötik ilaçlardaki bozunma ürünlerinin tayini Pestisit ve insektisit ve diğer çevresel örneklerin tayini Karışımlardaki bileşenlerin ayrılması Kalite kontrolü Bir karışımdaki polimerlerin moleküler ağırlık dağılımının belirlenmesidir. HPLC tekniği ne kadar gelişmiş ve yaygın bir teknik olsada bazı sınırlamaları vardır: Bileşenlerin tanımlanması, bazı durumlarda kütle spektrometresi ile kombine edilmemiş olan HPLC kullanıldığında yeterli olmayabilmektedir. Karmaşık örneklerde iyi çözünürlük sağlamak zor olabilmektedir

29 Aynı anda sadece bir örnek analiz edilebilmektedir (2). 2.4. HİDROKSİMETİLFURFURAL 2.4.1. HMF nin Tanımı ve Özellikleri Hidroksimetilfurfural, ısı işlemi sonucu indirgen şekerler ve aminoasitler arasındaki reaksiyon ile oluşan ve birçok üründe aşırı ısı uygulamasını önlemek için miktarı sınırlanan bir bileşiktir (Şekil 2.7). Bir başka tanıma göre pişirim ya da sterilizasyon esnasında gıdalara uygulanan ısı işlemleri sonucu indirgen şekerlerin, aminoasitlerle oluşturduğu ve enzimatik olmayan maillard reaksiyonu neticesinde oluşan en temel ana üründür. Şekil 2.7. Hidroksimetilfurfural ın kimyasal yapısı (15) HMF, doğal ürünlerden balın yapısında eser miktarda bulunabilmektedir. Meyvelerin doğal bileşim unsurları içerisinde ve ısıl işlem uygulanmamış meyve sularında HMF bulunmamaktadır. Isıl işlem uygulanan meyve suyu, bal, reçel, marmelat, jele, domates salçası gibi birçok sebze ve meyve kaynaklı gıda maddelerinde HMF bulunabilmektedir. Bu ürünlerde HMF miktarının belirli bir düzeyde bulunması; rengin esmerleşmesine, ürünün tat ve kokusunda önemli bozulmalara, besleyici değerlerinde azalmalara yol açabilmektedir. Bu nedenle gıda maddelerinde bulunmasına müsaade edilen HMF miktarları sınırlandırılmıştır. HMF miktarı, ürünün üretiminde uygulanan işlemlerin yeterliliği hakkında bilgi vermektedir. HMF miktarı, uygulanan ısıl işlemin yeterli olup olmadığı veya aşırı ısı uygulamasının yapılıp yapılmadığı konusunda fikir vermektedir. Örneğin, baldaki HMF

30 miktarı balın saflık ve kalite analizinde göz önüne alınan parametrelerin en önemlilerindendir. Depolama ve saklama aşamalarında gıda maddelerinin kalitesinin azalmasına neden olan önemli değişmeler olmaktadır. Depolama ve saklama sırasında kalitenin bozulmasına neden olan en önemli kimyasal reaksiyon Maillard reaksiyonudur. Bu reaksiyon sırasında oluşan HMF miktarından yararlanılarak; ürünlerde meydana gelen değişiklikler gözlenebilmektedir (15). HMF in sitotoksik, genotoksik ve tumorejenik etkileri olduğu tespit edilmiştir. 2.4.2. HMF OLUŞUMU 2.4.2.1. Maillard Reaksiyonu ile HMF Oluşumu Gıdaların üretim, depolanma ve saklanma aşamalarında esmerleşme reaksiyonları meydana gelmektedir. Bu reaksiyonlar enzimatik olan veya enzimatik olmayan reaksiyonlar olarak incelenebilmektedir. Enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonlarından en önemlisi aminoasit ve proteinlerdeki amino grubu ile indirgen şekerler arasında gerçekleşen Maillard reaksiyonudur. Maillard reksiyonunun ilk aşamasında, indirgen şekerlerdeki karbonil grubu proteinlerdeki amino nitrojeni ile reaksiyona girmekte ve su kaybıyla birlikte kapalı halka formundaki glikozilamin oluşmaktadır (Şekil 2.8). Reaksiyonun ikinci aşamasındaysa, glikozikamin zayıf asidik koşulların katalizlediği Amadori dönüşümüyle 1-amino-1-deoksi-2-ketoz a dönüşmektedir. Bu aşamadan sonra üç ihtimal söz konusudur. Bu ihtimallerden en önemlisi 1-amino-1-deoksi-2-ketoz un enolizasyonu sonucunda furfural ve dehidrofurfural türevlerinin oluşmasıdır. İkinci ihtimal, moleküllerin parçalanarak nitrojen içermeyen asetol, diasetil, piruvaldehit gibi karbonil bileşiklere dönüşmesidir. Üçüncü ihtimalse, dehidrasyonla redüktanların oluşmasıdır.

31 2.4.2.2. Asidik Ortamda Heksozların Isı Etkisi ile HMF Oluşumu Meyve suyu, reçel, jele gibi gıda maddelerinde asidik ortamda heksozların ısı etkisi ile HMF oluşumu gözlenebilmektedir. Heksozların dehidrasyonu sonucu HMF oluşumu şekil 2.9 de gösterilmiştir (16). Şekil 2.8. Maillard reaksiyonu oluşumu (16)

32 Şekil 2.9. Heksozların dehidrasyonu sonucu HMF oluşumu (16) 2.4.3. HMF Tanınma Reaksiyonu: Seliwanoff Testi Şekil 2.10 da heksoz ve pentozdan HMF ve furfural oluşması görülmektedir. Bu test, kaynatma ve asit etkisiyle çeşitli reaksiyonlar verebilir. Bu reaksiyonlar aşağıda görüldüğü şekilde olabilmektedir. -Pentozlardan furfural, -Heksozlardan 5-hidroksimetilfurfural oluşması,

33 Şekil 2.10.Heksoz ve pentozdan HMF ve furfural oluşması (17) -Furfuralin, rezorsin ile mavi-yeşil renkli bir kompleks oluşturması (Şekil 2.11), -5-hidroksimetilfurfuralin ise rezorsin ile kırmızı renkli bir kompleks oluşturması prensibine dayanır. Pentoz ve heksozlar, kuvvetli mineral asitler içinde dehidre olur ve furfural oluşur, heksozlardan ise 5-hidroksimetilfurfural oluşur. Gıdalarda bulunabilen HMF oranı rengi vermeye uygundur (17). Şekil 2.11. HMF nin rezorsin ile reaksiyonu sonucu oluşan vişne kırmızısı bileşik (17)

34 2.5. REÇEL ÜRETİMİ 2.5.1. Reçelin Tanımı Reçel genel olarak meyvelerin bütün, yarım veya küçük parçalar hâlinde doğranması, rendelenmesi ve şeker ilave edilerek kaynatılması sonucu elde edilen lapamsı kıvamda ve sürülme kabiliyetindeki kıvamlı üründür. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği'ne göre ise reçel; şekerler ile bir veya birkaç çeşit meyvenin uygun jel kıvamına getirilmiş karışımı olarak tanımlanmaktadır. Türk Standartları tanımına göre ise reçel; reçel yapmaya elverişli olgunlukta, sağlam, yıkanmış, sapları ve varsa çanak yapraklan ayıklanmış, gerektiğinde çekirdekleri çıkarılmış bütün, yarım veya daha küçük parçalar hâlindeki taze veya çeşitli metotlarla muhafaza edilmiş meyve ve sebzelerin yardımcı maddelerle (sakaroz ve katkı maddeleri) ısıl işlem uygulanarak yeterli kıvama getirilmiş hâli olarak tanımlanmaktadır (18). 2.5.2. Reçel Çeşitleri 2.5.2.1. Geleneksel Reçel Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği'ne göre geleneksel reçel; şekerler ve meyvelerin belirli kıvama getirilmiş karışımıdır. 2.5.2.2. Ekstra Geleneksel Reçel Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği'ne göre ekstra geleneksel reçel; şekerler ve meyvelerin belirli kıvama getirilmiş karışımıdır. Geleneksel reçelden farkı içeriğindeki meyve yoğunluğunun daha fazla olmasıdır. 2.5.2.3. Diyabetlik Ürünler Normal şartlarda hazırlanan reçel vb. ürünlerde şeker oranı oldukça fazladır. Bu nedenle şeker tüketimi sakıncalı olan hastalar için diyabetlik ürünler üretilmektedir. Piyasada bulunan diyabetlik ürün çeşitleri şunlardır:

35 A-) Sorbitole dayalı reçel ve marmelat: Şeker oranı düşük olan sorbitol çoğu meyvede doğal hâlde az miktarda bulunan bir şeker alkoldür. Yaklaşık olarak sakkarozun yarısına yakın tatlılıkta olduğundan diyabetlik reçellerin yapımında kullanılmaktadır. B-) Düşük oranda şeker içeren normal ürünler: Bu ürünler diğer reçel vb. ürünlere benzemelerine rağmen yaklaşık % 20 25 ve daha düşük oranda şeker içerdiklerinden diyabetlik ürünler olarak piyasada satılmaktadır (19). 2.5.3. Reçel Üretiminde Kullanılan Ham Maddeler 2.5.3.1. Meyveler Reçel üretiminde kullanılan meyveleri şu şekilde gruplayabiliriz: -Yumuşak çekirdekli meyveler: elma, ayva, armut vb. - Sert çekirdekli meyveler: şeftali, kayısı, erik vb. - Vişne ve kiraz çeşitleri. - Üzümsü meyveler: taze yemiş, çilek, böğürtlen, ahududu vb. - Kuru meyveler: kuru kayısı, mürdüm eriği vb. (20). 2.5.3.2. Sebzeler Son yıllarda yöresel kullanımların da etkisi ile sebze ve çeşitlerinden reçel yapımı yaygınlaşmıştır. Genel olarak bilinen sebze reçelleri patlıcan, limon, havuç, domates vb.dir. 2.5.3.3 Çiçek-Kabuk Bilinen ve sevilerek tüketilen en yaygın çiçek reçellerine gül reçelini örnek verebiliriz. Kabuktan yapılan reçel çeşitleri ise turunç, karpuz, portakal kabuğu, bergamot, yeşil limon vb. dir (19).

36 2.5.4. Ham Maddelerin Hazırlanması Reçel ve benzeri ürünlerin ham maddesi meyve ve şekerdir. Reçel üretiminde genellikle taze sebze ve meyveler kullanılmasına karşın bazen farklı uygulamalar yapılabilmektedir. Örneğin üretimin sezon dışında devamlılığını sağlamak için taze sebze ve meyveler çeşitli yöntemlerle (dondurarak, ısı uygulayarak, koruyucu maddelerle) işlenip daha sonra da kullanılabilmektedir. Reçel üretiminde kullanılacak meyve ve sebzelerin amaca uygun nitelikte, taze, sağlıklı, kaliteli ve güvenilir olması işlenecek ürünün kalitesi açısından son derece önemlidir. Üretimde kullanılacak sebze ve meyvelerin kullanım amacına uygun dönemde hasat edilmesi önemli bir detaydır (20). Sezon dışında üretimi yapılacak meyveler ise bol olduğu dönemde bazı ön işlemlerden geçirildikten sonra çeşitli yöntemler ile muhafaza edilerek saklanır ve gerektiğinde kullanılırlar. Kullanılan muhafaza yöntemleri şunlardır: - Dondurarak muhafaza: Pahâlı bir yöntem olmasına rağmen bu yöntemle elde edilen reçeller taze meyveden elde edilen reçeller kadar üstün özellik taşır. Meyvelerin dondurulması ve daha sonra işlenmesi uygun ilke ve yöntemlere göre yapılmalıdır. - Isı uygulayarak muhafaza: Meyvelerin kendine özgü ön işlemlerden geçirildikten sonra konserve edilerek saklanması tekniğidir. - Koruyucu maddelerle muhafaza: Oldukça yaygın olan bu yöntemde muhafaza edilecek meyve kendine özgü ön işlemlerden geçirildikten sonra koruyucu maddelerin (benzoik asit, sorbik asit, kükürt dioksit vb.) ilavesi ile saklanırlar (18).

37 Koruyucu maddelerin çeşitleri ve kullanım miktarları, Gıda Kodeksi ne uygun yapılmalıdır.hasat edilen ham madde bekletilmeden ve özellikleri değişmeden işlenmelidir. Taze meyve ile yapılacak reçellerde önce meyveler özelliğine uygun olarak ön işlemlerden geçirilir ve daha sonra işlenerek reçel elde edilir. Reçel üretiminde kullanılacak meyve, sebze, çiçek-kabuk vb. öncelikle yıkamadan geçirilerek işlenmeye hazırlanmalıdır. Daha sonra ön işlemler konusunda detaylı olarak anlatılacak olan ayıklama ve sap ayırma, çekirdek çıkarma ve doğrama aşamalarından geçirilerek pişirmeye hazır hâle getirilirler (20).

38 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. GEREÇ 3.1.1. Kullanılan Cihazlar Tez çalışması sırasında kullanılan cihazlar aşağıda sıralanmıştır. HPLC: Geleneksel yolla üretilen reçel ürünlerinde HMF tayini Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Ana Bilim Dalında bulunan Agilent marka 1200 serisi 4 lü gradient sistem (Seri No: JP82010716) HPLC cihazı ile gerçekleştirilmiştir. Cihazın dedektör sistemi DAD dır. Enjeksiyon sistemi ise 20 µl örnek hacmine sahip manuel enjeksiyon sistemidir. Deiyonize Su Cihazı: Deneylerde kullanılan deiyonize su Millipore marka Elix5 model saf su cihazından temin edilmiştir. Cihazdan elde edilen saf su 14MΩcm -1 direncindedir. Analitik Terazi: Tartımlar 0,1 mg duyarlılıktaki 210 g maksimum kapasitede tartım yapabilen Ohasus marka EP214C model analitik terazi ile gerçekleştirilmiştir. Mikropipet: Çözelti hazırlama ve aktarma işlemlerinde Nichipet EX marka 100-1000 µl arasında ayarlanabilen mikropipet kullanılmıştır. Etüv: Cam ve plastik malzemelerin kurutulması için 200 C sıcaklığa kadar ıstılabilen, digital kontrollü, zaman ayarlı Nüve marka FN 120 model etüv kullanılmıştır. Ultrasonik Banyo: Analiz sırasında numunelerin çözünürleştirilmesi ve hareketli fazın degaze edilmesi amacı ile Bandelin Marka Sonorex Type RK52H model ultrasonik su banyosu kullanılmıştır.

39 Refraktometre: Reçel örneklerinin kuru madde miktarı Grei Norm ATC marka % 0-30 aralığında ölçüm yapabilen refraktometre ile tayin edilmiştir. 3.1.2 Kullanılan Kimyasal Maddeler Asetik Asit Çözeltisi : % 10 luk yoğunluğu 1.266 g/ml olan Mark Sigma-Aldrich marka asetik asit çözeltisi kullanılmıştır. Metanol:% 90 lık yoğunluğu 0.79 g/ml olan Sigma-Aldrich marka metil alkol kullanılmıştır HMF: Standartların hazırlanmasında molekül ağırlığı 126.11 g/mol ve yoğunluğu 1.29 g/cm³ olan HMF kullanılmıştır. 3.2. YÖNTEM 3.2.1. Cam ve Plastik Malzemelerin Temizlenmesi Deneyde kullanılan cam ve plastik malzemeler, temizlenmesi için önce su ve deterjan ile yıkandı. Daha sonra saf sudan geçirilerek cam malzemeler 90 C de, plastik malzemeler ise 40 C kurutulmuştur. 3.2.2 Standartların Hazırlanması 250 mg HMF tartıldı ve su ile 25 ml ye seyreltildi. Hazırlanan bu çözeltiden 1000 µg ml -1 lik 100 ml HMF hazırlandı. Daha sonra sırasıyla 0.25, 0.50, 1, 2, 5 µg ml -1 lik standart HMF çözeltileri hazırlanmıştır. 3.2.3. Numunelerin Hazırlanması Yaklaşık 2 g 0.1 mg duyarlılıkta örnek tartılıp bir miktar deiyonize su ile çözülerek son hacim 25 ml ye tamamlanmıştır. 3.2.4. Hareketli Faz % 10 luk asetik asit çözeltisinden % 1 lik asetik asit çözeltisi hazırlandı ve 100 ml alındı. % 90 lık metanolden 900 ml alınarak hareketli faz hazırlandı.

40 3.2.5. HPLC Cihazının Çalışma Şartları Kullanılan kolon C18 dir. HPLC cihazının hareketli faz bileşimi % 1 CH 3 COOH: % 90 CH 3 OH (1:9) dur. Hareketli fazın akış hızı 0,7 ml/dk dır. Dedektör olarak DAD dedektörleri kullanılmıştır. Ölçümler 285 nm de yapılmıştır. Analiz süresi 7 dakika sürmüştür.

41 4. BULGULAR Öncelikle HPLC yönteminin çalışma şartları araştırılmıştır. Yapılan literatür çalışmasında, uygun hareketli fazın akış hızı 0,7 ml dk -1 olduğu belirlenmiştir. Bölüm 3.2.3 de anlatıldığı şekilde hazırlanan reçel örneğinin (9 nolu reçel) kromatogramı Şekil 4.1 de verilmiştir. Şekilde görüldüğü gibi HMF nin piki çok iyi şekilde ayrılmaktadır. Kuyruklanma problemleri ile de karşılanmamıştır. HMF nin alıkonma süresi 6.051 dk olarak belirlenmiştir. HMF nin tayini için öncelikle kalibrasyon doğrusu çizilmiştir. Bu amaçla 0.25, 0.50, 1, 2, 5 µg ml -1 lik standart HMF çözeltilerinden 20 şer µl sisteme enjekte edilmiştir. Elde edilen kalibrasyon doğrusu Şekil 4.2. de verilmiştir. Elde edilen doğrunun korelasyon katsayısı 0,9998 dir. Numunelerdeki HMF derişimi bu doğruya göre hesaplanmıştır. Yöntemin reçel örneklerine uygulanabilirliğini belirlemek için bir reçel örneğine farklı miktarlarda HMF ilave edilerek HMF miktarları tayin edilmiştir. Reçel örneğine ilave edilen HMF nin geri kazanım değerleri tablo 4.1 de verilmiştir. HMF nin geri kazanma değerleri 103.0-113.5 aralığında gerçekleşmiştir. Elde edilen sonuçlar yöntemin, reçel örneklerinin HMF miktarının tayini için uygun olduğunu göstermektedir

42 Norm. 100 80 60 40 20 0 DAD1 A, Sig=285,4 Ref=360,100 (MEHMET KILICER\MEHMET000022.D) 1 2 3 4 5 6 42 min 1.9 5 9 2.1 9 2 2.4 0 9 2.8 6 7 4.8 0 7 6.0 5 1 HMF Şekil 4.2. 9 nolu örneğin kromatogramı Area Rel. Res%(1): 14.101 800 700 5 600 500 400 300 4 200 3 100 1 2 0 Correlation: 0.99985 0 2 4 Amount[ng/ul] Şekil 4.3. HMF nin ölçümü için çizilen kalibrasyon doğrusu

43 Tablo 4.1. Örneklerdeki HMF nin geri kazanım değerleri Eklenen, µg ml -1 Ortalama µg ml -1 % Geri Kazanma - 2.12±0.03-2 4.39±0.17 113.5 3 5.45±0.13 111.0 4 6.54±0.02 110.5 6 8.30±0.17 103.0 Yöntemin doğruluğu belirlendikten sonra toplanan 32 reçel örneğinin HMF miktarları ve refraktomete ile katı madde miktarı (% briks) tayin edilmiştir. Elde edilen sonuçlar Tablo 4.2 de çeşitli verilmiştir. Tablo 4.2. Örneklerdeki HMF ve % briks miktarları Reçel Türleri HMF Miktarı, mg kg -1 Briks, % Çilek 28,69±3,44 42 Çilek 38,32±4,15 52 Çilek 14,13±0,63 40 Çilek 72,05±0,44 58 Çilek 34,74±0,31 58 Çilek 50,25±0,74 14 Çilek 34,86±0,19 50 Vişne 39,31±0,44 25 Vişne 227,02±3,91 44 Vişne 124,75±9,48 42 Kayısı 63,38±0,50 52 Kayısı 35,25±0,75 56 Kayısı 156,69±2,53 46 Kayısı 140,24±1,06 48 Kayısı 22,28±0,62 46 Kayısı 72,23±0,06 54 Kayısı 110,52±5,32 46 Kayısı 92,04±0,67 46 Kayısı 97,22±14,14 42

44 Kayısı 39,05±1,79 40 Kayısı 26,63±9,55 36 Kayısı TSA 50 Böğürtlen 77,81±1,06 42 Böğürtlen 26,57±0,31 38 Şeftali 10,11±0,31 46 Gül 84,95±2,49 54 Gül 59,22±0,43 48 Gül 117,10±1,35 44 Gül 103,33±1,48 54 Gül 218,63±4,13 54 Ayva 65,25±1,00 50 Ayva 326,63±0,50 34

45 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Yapılan son çalışmalarda, HMF nin yüksek konsantrasyonlarda toksik özelliğinin olduğu saptanmıştır. Bu toksik etkilerin sitotoksik, genotoksik ve tümörijenik etkiler olduğu görülmüştür. Yapılan bu çalışmada geleneksel yollarla üretilen 32 adet reçel numunelerindeki (kayısı, çilek, vişne, gül vs.) HMF miktarı HPLC cihazı ile katı madde miktarları ise refraktometre ile tayin edilmiştir. Reçel örneklerinden bir tanesinin HMF düzeyinin tayin sınırı altında olduğu saptanmıştır. Diğer reçellerin HMF içeriği ise 10.11-326.63 mg/kg aralığında değişmektedir. Türk Gıda Kodeksine göre gıda ürünlerinde HMF miktarı 50 mg/kg olarak sınırlandırılmıştır. Analizi yapılan reçel ürünlerinden 13 tanesinin Türk Gıda Kodeksinin HMF düzeyini sınırlayan maksimum değeri olan 50 mg/kg dan daha düşük olduğu belirlenmiştir. 19 Reçel örneğinde ise HMF düzeyinin üst sınır değer olan 50 mg/kg dan daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Analiz sonuçlarına göre HMF miktarı 50 mg/kg üzerinde olan reçellerin sayısının yüksek olması ve HMF nin insan sağlığı üzerindeki toksik etkileri göz önünde bulundurularak halkın bu konuda bilinçlendirilmesi ve reçel üretiminin daha dikkatli yapılması sağlanmalıdır.

46 6. KAYNAKLAR 1. (2011), Vikipedi, http://tr.wikipedia.org/wiki/kromatografi, (12.02.2011) 2. LoBrutto R, Kazakevich YV. HPLC for Pharmaceutical Scientists (1 st ed), John Wiley and Sons, New Jersey, 2007: 3-65 3. Hanai T. HPLC A Practical Guide, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1999: 11-90 4. Snyder LR, Dolan JW, Gant JR. Gradient elution in high-performance liquid chromatography : I. Theoretical basis for reversed-phase systems. J Chromatogr A 1979; 165: 3-30 5. Dong WM. Modern HPLC for Practicing Scientists, John Wiley and Sons, New Jersey, 2006 6. Poole CF, Poole SK. Chromatography Today (5 th ed), Elsevier Science, Amsterdam, 1997 7. Erkahveci A. Kırmızı Toz Biberlerde Aflatoksin Miktar Tayininde Kullanılabilecek Üç Farklı Analiz Metodunun Karşılaştırılması, Yüksek Lisans Tezi, İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü 1996 8. Atienza J, Jimenez JJ, Bernal JL, et al. Supercritical fluid extraction of fluvalinate residues in honey. Determination by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A 1993; 655: (1): 95-99 9. Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Enstrümental Analiz İlkeleri (5 th ed). Çev. Kılıç E, Köseoğlu F, Yılmaz H. Bilim Yayıncılık, Ankara, 2000 10. Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Enstrümental Analiz İlkeleri. Çev. Kılıç E, Köseoğlu F, Yılmaz H. Bilim Yayıncılık, Ankara, 1998: 299-347, 674-766

47 11. Şeker ME. Türkiyede bulunan bazı üzüm türlerinin çekirdeklerindeki e- vitamini miktarının HPLC ile tayini, Yüksek Lisans Tezi, Celal Bayar Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü 2006 12. (2011), http://www.kimyaevi.org, 19.04.2011 13. Hışıl Y. Enstrümental Gıda Analizleri-I, Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Ders Kitapları Yayın No: 31, İzmir, 1994: 119-126 14. Schoenmakers PJ, Molle SV, Hayes C, et al. Effects of ph in reversed-phase liquid chromatography. Anal Chim Acta 1991; 250: 1-19 15. T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı Trabzon İl Kontrol Müdürlüğü, Aylık Haber Bülteni 2008; 2 16. Alais C, Linden G. Non-enzymatic browning the Maillard reaction. In Food Biochemistry, Ellis Horwood Limited, England, 1991: 86-89 17. Ünal N. (2008) Katalizör, Popüler Kimya Dergisi, 1: 33-37 18. Cemeroğlu B, Acar j. Meyve ve Sebze İşletme Teknolojisi, Gıda Teknolojisi Derneği Yayınlar, Ankara: 1986 19. Türk Gıda Kodeksi, Gıda Maddelerinin Genel Etiketleme ve Beslenme Yönünden Etiketleme Kuralları Tebliği, Tebliğ No: 2002/58 20. Cemeroğlu B, Karadeniz F, Özkan M. Meyve ve Sebze İşleme Teknolojisi 3, Gıda Teknolojisi Derneği Yayınları, Ankara: 2003

48 ÖZGEÇMİŞ Mehmet Can KILIÇER, 1988, Kayseri doğumludur. İlk ve orta öğrenimini 2002 yılında Besime Özderici İlk Öğretim Okulunda, lise öğrenimini 2005 yılında Hakkı Altop Lisesinde tamamladı. 2011 yılında Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi beşinci sınıfında eğitimi devam etmektedir. Adres : İldem Yapı Koop. Cumhuriyet Mah. Yavuz Apt. No:8 Melikgazi/KAYSERİ Tel : 0554 585 96 23 Mail : mcanklcer@hotmail.com