EUCALYPTUS CAMALDULENSİS DEHN. YAPRAK UÇUCU YAĞININ BUHAR DİSTİLASYONU İLE ÜRETİMİ VE 1,8-SİNEOL ÜN SAFLAŞTIRILMASI Nezihe AZCAN, Mustafa KARA Anadolu Üniversitesi, Mühendislik Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 26470, Eskişehir ÖZET Tarsus/Karabucak ta yaygın olarak yetiştirilmekte olan Eucalyptus camaldulensis Dehn. yapraklarından laboratuar ölçekte Clevenger cihazı kullanılarak su distilasyonu ile, pilot ölçekte ise su buharı distilasyonuyla elde edilen uçucu yağların kuru madde bazındaki verimleri sırasıyla %1,54 ve %1,20 olarak tespit edilmiştir. Uçucu yağın ana bileşiklerini 1,8-sineol (%55,72), p-simen (%10,78), limonen (%4,67), α-pinen (%5,41) oluşturmaktadır. Uçucu yağa karakteristik özelliğini veren 1,8-sineol fraksiyonlu distilasyonu ile %88,18, kolon kromatografisi ile %98,83 oranında saflaştırılmıştır. Anahtar Kelimeler: Buhar distilasyonu; Uçucu yağ; Eucalyptus camaldulensis; Fraksiyonlu distilasyon; Myrtaceae; 1,8-sineol 1. GİRİŞ Anavatanı Avustralya olan Eucalyptus (Okaliptüs) un 600 farklı türü mevcut olup bunlardan 300 den fazlası uçucu yağ içermektedir. Tarsus taki Karabucak bataklığını kurutup sıtma hastalığından kurtulmak için ilk olarak 1939 yılında 885 hektarlık arazide ilk fidan dikimi gerçekleştirilmiş, bataklığın ağaçlandırmasına paralel olarak odun hammaddesine duyulan ihtiyacın da karşılanması amaçlanmıştır [1]. Karabucak ağaçlandırılmasında kullanılan tohumların Cezayir den sağlandığı tahmin edilmektedir [2]. Türkiye de 20.000 hektarlık alanın %90 ını E.camaldulensis oluşturmaktadır [3]. Dörtyol, Ceyhan, Karataş ve Antalya da ilk olarak yetiştirme denemeleri yapılmış olup, Adana, Mersin, Muğla ve İstanbul da (Yıldız Parkı) yetiştirilmektedir. Türkiye de Eucalyptus yaprak uçucu yağı üretilmemekte, Eucalyptus yağı ihtiyacı ithalat yoluyla sağlanmaktadır. Devlet İstatistik Enstitüsünden edinilen bilgilere göre Eucalyptus yağı ve 1,8-sineol ithalat değerleri her geçen gün artmaktadır. 1993 yılına kadar Eucalyptus yağı olarak, 1993 yılından günümüze kadar Okaliptol (sineol) adıyla ithalatı gerçekleştirilmiştir (Çizelge 1,2). Çizelge 1. Türkiye nin Eucalyptus yağı ithalat değerleri [4] Yıl Miktar (Kg) 1989 1.821 1990 3.600 1991 4.250 1992 5.320
Çizelge 2. Türkiye nin Okaliptol (sineol) ithalat değerleri [4] Yıl Miktar Tutar 1993 2.005 17.589 1994 1.605 13.049 1995 3.383 31.230 1996 1.384 15.914 1997 11.248 47.391 1998 9.153 42.712 1999 214 1.764 2000 2.295 19.087 2001 1.616 18.001 2002 1.780 23.497 2003 1.665 19.574 2004* 910 12.282 Toplam 37.258 262.092 *Altı aylık değeri kapsamaktadır Eucalyptus uçucu yağı; sineolik, parfümerik ve endüstriyel olmak üzere üç grupta sınıflandırılmaktadır. Sineolik uçucu yağlar tıbbi kullanıma uygun yağlardır. Parfümerik uçucu yağlar ise sitronellal bileşiğince zengindir. Endüstriyel olanı ise α-fellandren ce zengin yağlardır. Piperiton bileşiğince zengin olan yağlardan timol ve mentol sentezlenmektedir [5]. Ülkemizde kültürü yapılan E.camaldulensis ile yapılan çalışmada yaprak ve meyve uçucu yağlarının verimi sırayla %1,7 ve %2,0 olarak bulunmuş olup her iki yağın ana bileşiğini de 1,8 sineol oluşturmaktadır [6]. Bazı Eucalyptus türleri %30-70 oranlarında 1,8-sineol içeriğine sahiptir. Bu değer farksiyonlu distilasyon ile arttırılabilmektedir [7]. 1,8-sineol renksiz, kafur kokusunda ve yakıcı lezzettedir. Dahilen ve haricen uygulanan ilaçların terkibinde kullanılır. Dahilen, kronik bronşitte nefes açıcı etki gösterir. Haricen, enflamasyon tedavisinde kullanılır. Anestezik ve antiseptiktir. Bunların dışında sineol, oda spreylerinde, losyonlarda ve kozmetik preparatlarda kullanılır [8]. Avrupa farmakopesinin okaliptüs uçucu yağında aradığı özelliklerden en önemlisi yağın en az %70 oranında 1,8-sineol içermesidir [9]. Yapılan çalışmalarda Tarsus/Karabucak ta yetişmekte olan Eucalyptus camaldulensis yaprak uçucu yağının özelliklerinin Türk Standartlarının belirlediği değerlerle uyumlu olduğu fakat 1,8- sineol içeriğince istenen kalitede olmadığı belirlenmiştir [6,10]. Yapılan çalışmalarda Eucalyptus camaldulensis uçucu yağı ve 1,8-sineol ün fumigant, antimicrobial, antibakterial, analgesik ve anti enflamatuar, peroksit aktiviteyi azaltma etkilerine sahip olduğu belirlenmiştir [11-15]. Bu çalışmadaki amacımız Türk Standartları ve Avrupa Farmekopesinin aradığı özelliklere sahip Eucalyptus yağı üretim koşullarını belirlemek ve 1,8-sineol ü saflaştırmaktır. 2. DENEYSEL 2.1. Materyal Bu çalışmada Tarsus/Karabucak Okaliptüs ormanından Temmuz-Ağustos döneminde toplanan yapraklar kullanılmıştır.
2.2. Yöntem Nem Miktar Tayini: volumetrik nem miktar tayin cihazı kullanılarak bitkisel materyalin içermiş olduğu nem miktarı tespit edilmiş olup, bitkisel materyalin uçucu yağ verimi kuru materyal bazında hesaplanmıştır. Su Distilasyonu: Yaprak ve tüm bitkinin (yaprak+meyve+ince dal) içermiş olduğu uçucu yağın miktarı Clevenger apareyi kullanılarak laboratuar ölçekte belirlenmiştir. Üç saat süre ile distilasyon işlemine devam edilmiş olup bitki materyalinin içermiş olduğu yağın tamamı elde edilmiştir. Su Buharı Distilasyonu: Yarı endüstriyel ölçekte 500 L kapasiteli buhar distilasyonu ünitesi kullanılarak uçucu yağ elde edilmiştir. Optimum distilasyon süresini belirlemek amacıyla distilasyon sırasında belirli aralıklarda fraksiyonlar toplanıp her bir fraksiyondaki yağ verimleri belirlenmiştir. Farklı buhar akış hızlarında (0,5 ve 1,02; kg buhar/kg madde saat) distilasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Fraksiyonlu Distilasyon: Okaliptüs uçucu yağının ana bileşiği olan 1,8-sineol içeriğini arttırmak için yağın bileşiklerinin kaynama noktaları arasındaki farklılıklardan yararlanılarak Vakumlu Fraksiyonlu Distilasyon yöntemi kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan cihaz laboratuar ölçekli olup dış kısmında vakum ceketli ve 2,8 cm çapında cam kolon, Knit Mesh paslanmaz çelik tel örgülü dolgu maddesine sahiptir. Dolgunun boyu 1,35 m olup, sisteme bağlı vakum pompası ile yağdaki bileşenlerin kaynama noktaları arasındaki farklılıklardan yararlanılarak Vakumlu Fraksiyonlu Distilasyon yöntemi kullanılmıştır. Sisteme bağlı vakum pompası ile yağdaki bileşenlerin kaynama noktası düşürülmüş, böylece yağın zarara uğraması en aza indirilmiştir. Fraksiyonlama işlemi 9 mmhg ortam basıncında ve 1/20 riflaks (geri döngü) oranında yapılmıştır. Soğutma işlemi biri tepe kısmında diğeri ise ürünün ürün toplayıcıya ulaşmasını sağlayan borunun bulunduğu kısımda yerleşmiş olan iki soğutucu vasıtası ile yapılmıştır. Yoğunlaştırılamayan çok uçucu bileşikler karbon buzu ile soğutulan bir soğutucuda yoğunlaştırılarak elde edilmiştir. Sistemin basınç ve sıcaklığı bilgisayar kontrollü olarak hassas bir şekilde kontrol edilmiştir. Kristallendirme: Fraksiyonlu distilasyon işlemi ile elde edilen 1,8-sineolce cengin fraksiyonu saflaştırmak için -22 derecede dondurulduktan sonra donmuş kısımdan alınan örneğin GC analizi yapılmıştır. Kolon Kromatografisi: Kolon dolgu maddesi olarak silikajel 60 (Merck 7734, 0.063;0,700 mm, 70-23 mesh ASTM) kullanılmıştır. Silikajel kolona hava boşlukları olmayacak şekilde kuru olarak doldurulduktan sonra saflaştırılacak olan 1,8-sineolce zengin olan yağ fraksiyonu (10 ml) n-pentan (10 ml) ile karıştırılarak kolona ilave edilmiştir. İlk olarak n-pentan kullanarak oksijensiz bileşikleri içeren fraksiyonlar, daha sonra eter ile oksijenli bileşikler içeren fraksiyonlar toplanmıştır. Pentanlı ve eterli fraksiyonların ayrı ayrı döner buharlaştırıcıda düşük basınç altında çözücüleri ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra kalan kısımın gaz kromatografisi ile analizi yapılmıştır. Gaz Kromatografisi (GC): Eucalyptus yağı ve bu yağın fraksiyonlu distilasyonu ile elde edilmiş olan fraksiyonları gaz kromatografisine uygulanarak uçucu yağ bileşikleri kolonda tutunma sürelerine göre ayrılmış ve relatif oranlara göre değerlendirilmiştir. GC değerlendirmeleri GC/MS tanımlamalarına göre relatif yüzdeler olarak yapılmıştır. Gaz kromatografisi analizinde Shimadzu GC-9A sistemi kullanılmıştır. Thermon 600-T (Fused Silica Kapiler Kolon, 50 m x 0.2 mm Ф) kolon ve taşıyıcı gaz olarak azot (1 ml/dak) kullanılmıştır. FID dedektör ile çalışılıp, enjeksiyon ve dedektör sıcaklığı 250 0 C ye
ayarlanmıştır. Split oranı 60:1 olup, Isı programı 70 0 C -10 //2 0 C /dak.//180 0 C -30 şeklinde uygulanmıştır. C-R4A entegratör yazıcı (Kağıt hızı 5 mm/dak) kullanılmıştır. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometrisi (GC/MS): Eucalyptus yağının fraksiyonlu distilasyonu sırasında toplanan fraksiyonlar gaz kromatografisi kolonunda ayrılıp iyonlaştırıldıktan sonra her birinin tek tek spektrumları alınmıştır. Değerlendirme işlemleri GC/MS cihazının 43.000 maddelik NBS/NIH/EPA kütüphanesi kullanılarak yapılmıştır. GC/MS analizi Shimadzu GC/MS QP 2000 A sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Thermon- 600 T (Fused Silica Kapiler Kolon, 50 m x 0.25 mm Ф ) kolon ve taşıyıcı gaz olarak Helyum (1 ml/dak) kullanılmıştır. Enjeksiyon sıcaklığı 250 0 C. Isı programı 70 0 C-10 //2 0 C /dak. //180 0 C 30 şeklinde uygulanmıştır. Split oranı: 60:1. İyon kaynağı sıcaklığı 250 0 C. Kütle spektrumları 70 ev ta, kütle aralığı 10-400, scan aralığı 2 sn olarak alınmıştır. 3. SONUÇLAR Materyalin içermiş olduğu nem miktarı %16 olup uçucu yağ verimleri kuru madde bazında hesaplanmıştr. Clevenger cihazında su distilasyonu ile yapraktan %1,54, tüm bitkiden ise %1,80 kuru madde bazında yağ elde edilmiştir. Tüm bitkinin buhar distilasyonunda ayrı ayrı iki çalışma yapılmıştır. Birinci çalışmada 0,5 kg buhar/kg madde saat buhar akış hızında toplam yağ verimi %0,84 olarak bulunmuştur. Distilasyon sırasında ilk üç saat 60 dakika aralıklarla daha sonra 30 dakika aralıklarda fraksiyonlar toplanmıştır. Toplam yağın %40,5 i ilk 60 dakikada alınırken %67,6 si ise 120 dakika sonunda alınmıştır (Şekil 1.). İkinci çalışmada ise 1,2 kg buhar/kg madde saat akış %1,20 verimde yağ elde edilmiştir. Bu çalışmada da aynı aralıklarda fraksiyonlar toplanmıştır. Toplam yağın %50,6 sı ilk 60 dakikada, %87,6 si ise 120 dakikada alınmıştır. Distilasyon işlemine devam edildiğinde 210 dakikanın sonunda yağ veriminde değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 2.). Düşük buhar akış hızında distilasyon süresinin uzun olduğu tespit edilmiştir. Yağ (ml) 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 40 80 120 160 200 240 280 320 Zaman (dakika) Şekil 1. (0,5 kg buhar) / (kg madde saat) buhar akış hızında zamana karşı alınan yağ miktarları
Yağ (ml) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 40 80 120 160 200 240 Zaman (dakika) Şekil 2. (1,2 kg buhar) / (kg madde saat) buhar akış hızında zamana karşı alınan yağ miktarları Çizelge 3. de görüldüğü gibi su ve buhar distilasyonu ile ayrı ayrı elde edilen yağların ana bileşiğini 1,8-sineol oluşturmakta (%50,42 ve %55,72) ve oranları açısından çok az bir farklılık olduğu görülmektedir. Bunun nedeni buhar distilasyonunda kullanılan materyalin bir miktar meyve içermesidir. Meyve uçucu yağının 1,8-sineolce zengin olduğu daha önce yapılan çalışmada gösterilmiştir [10]. Buhar distilasyonu ile elde edilen uçucu yağın ana bileşiklerini 1,8-sineol (%55,72), p-simen (%10,78), limonen (%4,67), α-pinen (%5,41) oluşturmaktadır Çizelge 3. Su distilasyonu ve su buharı distilasyonu ile elde edilen Eucalyptus camaldulensis yaprak uçucu yağlarının ana bileşikleri Uçucu Yağ Ana Bileşikleri SuDistilasyonu (%) Su Buharı distilasyonu (%) α-pinen 3,60 5,41 limonen 2,92 4,67 1,8-sineol 50,42 55,72 γ-terpinen 3,82 5,37 p-simen 10,18 10,78 Kamfolen aldehit 0,02 3,03 Uçucu yağın kalitesini 1,8-sineol içeriği belirlediğinden elde edilen yağda bu bileşiğin oranının düşük olduğu ve Türk Standartlarına göre en az %70 değerine ulaşmak için buhar distilasyonu ile elde edilen 450 ml uçucu yağ fraksiyonlu distilasyon işlemine tabi tutulmuştur. Toplanan her bir fraksiyonun kompozisyonu GC analizi ile belirlenmiştir (Çizelge 4). Çizelge 4. Uçucu yağın fraksiyonlu distilasyonunda toplanan fraksiyonların bileşimleri Fraksiyon No Miktarı Uçucu yağ ana bileşikleri (ml) 1,8-sineol p-simen limonen α -pinen 1 16 52,52 3,40 2,46 33,01 2 16 70,08 3,01 2,08 14,99 3 30 83,64 2,77 3,00 -- 4 46 88,18 2,72 3,23 -- 5 66 87,18 4,64 4,40 -- 6 52 78,20 12,86 7,43 -- 7 36 64,41 24,43 10,04 -- Dip ürün 125 6,25 13,72 2,67 -- Çizelge 4 de görüldüğü gibi %55,72 oranında 1,8-sineol içeren uçucu yağı sineolce zenginleştirmek için fraksiyonlu distilasyon işlemine tabi tutulduğunda 125 ml dip ürün
uzaklaştırıldıktan sonra standartlara uygun Eucalyptus yağı üretilmiş olur. En yüksek 1,8-sineol değerine (%88,18) dördüncü fraksiyonda ulaşılmıştır.farmasötik endüstrisinde yaygın olarak kullanılan saf 1,8-sineol elde etmek için fraksiyonlu distilasyon işleminde ayrılan dördüncü fraksiyona iki farklı işlem uygulanmıştır. İlk olarak -25 o C ta dondurulduktan sonra oluşan kristalin %91,57 1,8-sineol, %3,31 p-simen, %2,73 limonenden oluştuğu tespit edilmiştir. İkinci olarak yine aynı fraksiyondan 10 ml kolon kromatografi ayırma işlemine tabi tutulmuştur. n- pentan ile toplanan eluatların çözücüsü uzaklaştırıldıktan sonra 1 ml limonence zengin fraksiyon elde edilirken, eter ile elde edilen 8 ml fraksiyonun %98,8 oranında 1,8-sineol içerdiği GC analizi sonucunda tespit edilmiştir. Optimum distilasyon süresinin 2 saat, buhar akış hızının (1,2 kg buhar) / (kg madde saat), materyalin içermiş olduğu meyve ve ince dalın gerek yağ verimini gerekse yağ kompozisyonunu çok fazla etkilemediğini, yaprakların toplandıktan hemen sonra işlenebileceği tespit edilmiştir. Ayrıca yağın 1,8-sineol açışından zenginleştirmek için fraksiyonlu distilasyon işleminin uygulanabilir olduğu ve kristallendirme ile saf 1,8-sineol üretilebileceği sonucuna varılmıştır. KAYNAKLAR 1- Adalı, F., Sağlık Ağacı Okaliptus, Ziraat Vekaleti Neşriyat Müdürlüğü, Genel Sayı: 609,Pratik Kitaplar Sayı: 3, İstanbul, 1944. 2- Saatçıoğlu, F. And Pamay, B., Tarsus-Karabucak Mıntıkasında Okaliptus Tesis Çalışmalarının 20 Yıllık Neticeleri Üzerine Silvikültürel Araştırmalar, İ.Ü. Orman Fakültesi Yayınları, 782, İstanbul, 1958. 3- Gürses, M.K., Ökaliptusun Türkiye Ormancılığı Açısından Önemi ve Bazı Öneriler, Orman Bakanlığı, 1. Ormancılık Şurası Tebliğler ve Ön Çalışma Grubu Raporları. Cilt 1, Seri No: 13,:006, Ankara, 1993. 4- Devlet İstatistik Enstitüsü Bilgileri, 2004. 5- Zrira, S.S., Benjilali, B., The Essential Oil of the Leaves and the Fruits of E.camaldulensis, J. Essent. Oil Res., 3, 117-118, 1991. 6- Azcan, N., Kara, M., Başer, K.H.C., Kırımer, N., Kürkçüoğlu, M., Özek, T., Gülbaba, G., Aslan, S., Günses, K., A Systematic Study of Essential Oils of Eucalyptus Species Grown in Turkey, Proceedings of the 13 th International Cogress of Flavours, Fragrances and Essential Oils, 181-199, İstanbul, 1995. 7- Tyler, V.E., Brady, L.R. and Robbers, J.E., Pharmacognosy, 8th Ed., Lea and Febiger, Philadelphia., pp. 139-139, 1981. 8- Gunther, E., The Essential Oils, Vol. 1, Robert E. Krieger Publishing Company, Florida, pp. 241-242, 1972. 9- Zrira, S.s., Benjilali, B.B., Fechtel., M.M. and Richard, H.H., Essential Oils of Twentyseven Eucalyptus Species Grown in Morocco, J. Essent. Oil Res., 4, 259-264, 1992. 10- Azcan, N., Kürkçüoğlu, M., Kara M., Başer, K.H.C., 1997, Eucalyptus camaldulensis Dehn. ve Eucalyptus grandis W.Hill ex Maiden Yaprak ve Meyva Uçucu Yağlarının Bileşimleri, XI. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiri Kitabı, 431-437, Ankara, 1996. 11- Tunç, İ., Berger, B.M., Erler, F., and Dağlı, F., Ovicidal Activity of Essential Oils From Five Plants Against Two Stored-Product Insects, Journal of Stored Products Research, 36, 161-168, 2000. 12- Ponce, A.G., Fritz, R., del Valle, C., and Roura, S.I., Antimicrobial Activity of Essential Oils on the Native Microflora of Organic Swiss Chard, 36, 679-684, 2003. 13- Ponce, A.G., Valle, C.E. and Roura, S.I., Natural Essential Oils as Reducing Agent of Peroxidase Activity in Leafy Vegetables, Lebensmittel-Wissenschaft und-technologie, 37, 199-204, 2004. 14- Byung, H.L., Peter, C.A., Fa ale, T., and Won-Sik, C., Fumigant Toxicity of Essential Oils From the Myrtaceae Family and 1,8-cineole Against 3 Major Stored-Grain Insects, Journal of Stored Products Research, 40, 553-564, 2004. 15- Jeane, S., Worku, A., Sousa, S.M., Duarte, V.G., Machado, M.I.L., and Matos, F.J.A., Analgesic and Anti-İnflammatory Effects of Essential Oils of Eucalyptus, Journal of Ethnopharmacology, 89, 277-283, 2003.