BOĞA DĐKENĐ (Eryngium campestre) BĐTKĐ EKSTRELERĐNĐN BĐYOLOJĐK AKTĐVĐTESĐNĐN ARAŞTIRILMASI VE BĐTKĐNĐN KĐMYASAL BĐLEŞENLERĐNĐN KARAKTERĐZASYONU

BOĞA DĐKENĐ (Eryngium campestre) BĐTKĐ EKSTRELERĐNĐN BĐYOLOJĐK AKTĐVĐTESĐNĐN ARAŞTIRILMASI VE BĐTKĐNĐN KĐMYASAL BĐLEŞENLERĐNĐN KARAKTERĐZASYONU Hüseyin AKŞĐT Y.Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ 2008 Her hakkı saklıdır

T.C. GAZĐOSMANPAŞA ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ KĐMYA ANABĐLĐM DALI Y. LĐSANS TEZĐ BOĞA DĐKENĐ (Eryngium campestre) BĐTKĐ EKSTRELERĐNĐN BĐYOLOJĐK AKTĐVĐTESĐNĐN ARAŞTIRILMASI VE BĐTKĐNĐN KĐMYASAL BĐLEŞENLERĐNĐN KARAKTERĐZASYONU Hüseyin AKŞĐT TOKAT 2008 Her hakkı saklıdır

Bu tez çalışması Devlet Planlama Teşkilatı (DPT) tarafından (Proje No: 2003K120510) desteklenmiştir.

Doç. Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ danışmanlığında, Hüseyin AKŞĐT tarafından hazırlanan bu çalışma 20/08/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalı nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan : Doç. Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ Đmza : Üye : Doç. Dr. Mustafa CEYLAN Đmza : Üye : Doç. Dr. Đsa TELCĐ Đmza : Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Metin Yıldırım Enstitü Müdürü

TEZ BEYANI Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim. Hüseyin AKŞĐT

ÖZET Y. Lisans Tezi BOĞA DĐKENĐ (Eryngium campestre) BĐTKĐ EKSTRELERĐNĐN BĐYOLOJĐK AKTĐVĐTESĐNĐN ARAŞTIRILMASI VE BĐTKĐNĐN KĐMYASAL BĐLEŞENLERĐNĐN KARAKTERĐZASYONU Hüseyin AKŞĐT Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ Bu çalışmada, ülkemiz florasında da yayılış gösteren Eryngium campestre (Boğa Dikeni) ekstrelerinin, insektisit aktivite ve anti kanserojen aktivite gibi bazı biyolojik aktiviteleri incelenmiştir. Bu bağlamda; bitkiden elde edilen ekstrelerin, önemli depo zararlılarından olan Buğday biti (Sitophilus granarius) üzerine insektisit aktivitesi ve Vero hücrelerine (Afrika Yeşil maymunu böbrek kanseri hücreleri) karşı anti kanserojen (Proliferasyon Deneyi) aktivitesi incelenmiştir. Bu amaçla, bitkiden elde edilen ham metanol:diklorometan (1:1) ekstraktının, buğday biti üzerine insektisit aktivite denemeleri ve Vero hücrelerine karşı anti kanserojen aktivite denemeleri yapılmış ve olumlu sonuçlar alınmıştır. Etkili fraksiyonları belirlemek için, ham ekstrakt vakum kromatografi ile değişik polariteli çözücü sistemleri kullanılarak yedi fraksiyona ayrıştırıldı. Bu fraksiyonlar, tekrar böcekler üzerine denendi, etki gösteren fraksiyonlar belirlendi. Bitkinin kimyasal bileşenlerinin aydınlatılması amacıyla yapılan çalışmalarda, bitkinin uçucu yağları ve sabit yağ asidi bileşenleri GC-MS ile analiz edilmiştir. Ayrıca bitkiden, mannitol ve sukroz izole edilip yapıları spektral yöntemlerle aydınlatılmıştır. Bitkinin polifenolik bileşenlerinden olan rutin ve kuersetin HPLC ile belirlenmiştir. Rutin bitkiden izole edilerek yapısı NMR teknikleri ile aydınlatılmıştır. 2008, 59 sayfa Anahtar kelimeler: Apiaceae, Eryngium campestre, rutin, kuersetin, HPLC, GC-MS, NMR, Mannitol, Sukroz, uçucu yağ, sabit yağ, Sitophilus granarius, Esterlerştirme, Asetilleme i

ABSTRACT Ms. Thesis Investigation of Biological activity on Plant extracts of Boğa Dikeni (Eryngium campestre) and Characterization of its chemical compositions Hüseyin AKŞĐT Gaziosmanpaşa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Đbrahim DEMĐRTAŞ In this study, biological activity such as insecticide activity and anticancerogen activity of Eryngium campestre extracts (Boğa dikeni which is also grown in Turkish flora) were investigated. Therefore, extract obtained from the plant was investigated against important stored product insects Bugday Biti (Stophilus granarius) and anticancerogen activity against Vero cells (the kidney of a normal adult African Green monkey, Cercopithecus aethiops). For this aim, crude methanol:dichloromethane (1:1) extract obtained from the plant for Stophilus granarius and anticancerogen activity against Vero cells were used and obtained affirmative results. For determination of the effective fractions, crude extract was separated with vacuum chromatography for seven fractions using different solvents in different polarity. These fractions tested for Stophilus granarius again and determined the effective fractions. In the study for identification of the chemical composition of the plant, essential oil and fatty acids were analysed with GC-MS. In addition, two carbohydrates (mannitol and sucrose) were isolated from the plant and characterized with spectral methods. Rutin and Quercetin as plant s polyphenolic compounds were determined with HPLC. Rutin was isolated from the plant and identified using the NMR techniques. 2008, 59 pages Keywords: Apiaceae, Eryngium campestre, rutin, quercetin, HPLC, GC-MS, NMR, Mannitol, Sucrose, essantial oil, fatty acid, Sitophilus granarius, Esterification, Acetylation ii

TEŞEKKÜR Tez çalışmam boyunca, bilgi, fikir ve literatür temini konusunda her türlü desteğini gördüğüm, her zaman benim için bir yol gösterici olan ve tez yazımında yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Doç. Dr. Đbrahim DEMĐRTAŞ a; Đnsektisit aktivite çalışmalarındaki desteklerinden dolayı Doç. Dr. Ayhan GÖKÇE ve Arş. Gör. Ömer Cem KARAKOÇ a Botanik ve bitki sistematiği konularında her türlü bilgi birikimini benimle paylaşan ve bitki toplama aşamasında yardımcı olan Doç. Dr. Đsa TELCĐ ye Çalışmamım her aşamasında yardım ve moral desteğinden dolayı Arş. Gör. Ayşe ŞAHĐN e HPLC çalışmaları sırasında deneyimlerini paylaşan sayın hocam Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ a, Doç. Dr. Cemal KAYA ya ve uygulamada yardımcı olan arkadaşım Nusret GENÇ e Bölümümüzün her türlü imkânından faydalanmamı sağlayan Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü yöneticilerine ve manevi desteklerini esirgemeyen bütün öğretim elemanlarına; Bu çalışmada kullanılan kimyasalların ve spektral cihazların temini sağlayan DPT ye; (Proje No: 2003K120510) Hayatım boyunca maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme Teşekkürü borç bilirim Hüseyin AKŞĐT iii

Đçindekiler ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa ÖZET..i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii ĐÇĐNDEKĐLER... iv ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ... vi ÇĐZELGELER (TABLOLAR DĐZĐNĐ)... viii SĐMGELER VE KISALTMALAR DĐZĐNĐ... ix 1. GĐRĐŞ... 3 2. KAYNAK ÖZETLERĐ... 5 2.1. Eryngium Cinsi... 5 2.2. Eryngium campestre Türü... 6 2.3. Uçucu Yağlar... 8 2.4. Sabit Yağlar... 8 2.5. Terpenoid Bileşikler... 11 2.5.1. Terpenlerin Sınıflandırılması... 11 2.6. Kromatografi yöntemleri... 11 2.6.1. Vakum Kromatografisi... 11 2.6.2. Kolon Kromatografisi... 12 2.6.3. Đnce Tabaka Kromatografisi... 12 2.6.4. HPLC (High performance liquid chromatography)... 12 2.6.5. Gaz Kromatografi (GC)... 12 2.7. Đzolasyon Çalışmaları ile Đlgili Kaynaklar... 14 2.8. Biyolojik Aktivite Đle Đlgili Literatürler... 15 2.8.1. Đnsektisit Aktivite ile Đlgili Kaynaklar... 16 3. MATERYAL VE YÖNTEM... 18 3.1. Kullanılan Materyaller... 18 3.1.1. Araç ve Malzemeler... 18 3.1.2. Kimyasallar... 18 3.1.2.1. Reaktifler... 18 3.1.2.2. Çözücü ve Kurutucular... 18 3.1.2.3. Kolon Dolgu Maddeleri... 19 3.1.3. Cihazlar... 19 3.2. Biyolojik Materyaller... 19 3.2.1. Buğday Biti (S. granarius)... 19 3.2.2. Vero Hücreleri... 20 iv

3.2.2.1. Vero Hücrelerinin Hücre Kültüre Edilmesi... 20 3.2.2.2. Hücrelerin hazırlanması... 20 3.2.2.3. Hücrelerin Dondurulması ve Saklanması... 21 3.3. Bitkisel Materyal... 21 3.4. Đnsektisit Aktivite Testleri... 21 3.4.1. Kontakt-toksisite Testleri... 21 3.5. Anti Kanserojen Aktivite Testleri... 22 3.5.1. Gerekli Çözeltilerin Hazırlanması... 22 3.5.2. Anti Kanserojen Aktivite Denemeleri Deney Dizaynı... 23 3.5.3. ELĐZA Ölçümlerinin Yapılışı... 24 3.6. Uçucu Yağların Eldesi... 24 3.6.1. Uçucu Yağların Belirlenmesi... 24 3.7. Kovats Đndeks in Hesaplanması... 24 3.8. Sabit Yağ Asitlerinin Eldesi... 26 3.8.1. Sabit Yağ Asitlerinin Metil Esterlerinin Elde Edilmesi... 26 3.8.2. Eryngium campestre Bitkisinin Sabit yağ Asitlerinin GC-MS Analizi... 26 3.9. Karbonhidratların GC-MS Analizi... 27 3.9.1. Asetilleme... 27 3.10. Fenolik Maddelerin (Rutin ve Kuersetin) HPLC Analizi... 27 3.10.1. Standart Stok Çözeltilerin Hazırlanması... 28 3.10.2. Fraksiyonların Stok Çözeltilerinin Hazırlanması... 28 3.10.3. HPLC Analizi... 28 4. BULGULAR ve TARTIŞMA... 30 4.1. Ekstraksiyon... 30 4.2. Fraksiyonlandırma... 30 4.3. Eryngium campestre Bitkisinin Uçucu Yağlarının Belirlenmesi... 31 4.4. Eryngium campestre Bitkisinin Sabit Yağ Asidi Bileşenlerinin Belirlenmesi... 35 4.5. Mannitol ve Sukroz un NMR ile Aydınlatılması... 37 4.5.1. Mannitol ve Sukroz karışımının GC-MS Analizi... 40 4.6. Rutin in Đzolasyonu ve Karakterizasyonu... 40 4.7. Rutin ve Kuersetin in HPLC Analizi... 50 4.8. Kontakt-Toksisite Testleri... 53 4.8.1. Kontakt Toksisite Denemeleri Sonuçları... 53 4.9. Anti Kanserojen Aktivite Testleri Sonuçları... 55 5. SONUÇ ve TARTIŞMA... 55 KAYNAKLAR... 59 v

Şekil ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ Sayfa Şekil 1.1. Hali Hazırda Dünyada Kullanılmakta Olan Sentetik Đnsektisitler... 2 Şekil 2.1. Boğa Dikeni (Eryngium campestre)... 7 Şekil 2.2. Boğa Dikeni Çiçek... 7 Şekil 2.3. Boğa Dikeni Kök... 7 Şekil 2.4. Uçucu Yağ Molekülleri... 8 Şekil 2.5. Gliserit ve sterollere örnek moleküller... 9 Şekil 2.6. E. campestre Bitkisinden Đzole Edilen Siklohekzanon Tipi Monoterpenler... 14 Şekil 2.7. E. campestre Bitkisinden Đzole Edilen Triterpen Saponin Molekülü... 14 Şekil 2.8. E. campestre bitkisinden izole edilen 7-alkoksi kumarin türevleri... 15 Şekil 2.9. E. campestre Bitkisinden Đzole Edilen Flavanon Glikoziti... 15 Şekil 3.1. Sitophilus granarius (Buğday Biti) ve buğdaya verdiği zarar... 19 Şekil 3.2. Eryngium campestre Bitkisinin GOPÜ Taşlıçiftlik Kampüsü nden toplandığı alanı gösteren kroki... 21 Şekil 3.3. n-alkanların ( C8-C20) GC kromatogramı... 25 Şekil 3.4. 37 Bileşenli Yağ Asiti Metil Esterleri Karışımının GC- MS Kromatogramı. 27 Şekil 3.5. Kuersetin... 28 Şekil 3.6. Rutin... 28 Şekil 4.1. Eryngium campestre çiçekleme döneminde uçucu yağ bileşenlerinin GC-MS kromatogramı... 32 Şekil 4.2. Eryngium campestre Bitkisinin Sabit Yağ Asitleri GC-MS Kromatogramı.. 35 Şekil 4.3. Mannitol+Sukroz karışımı 100 MHz 13 C NMR spektrumu... 37 Şekil 4.4. Sukroz... 38 Şekil 4.5. Mannitol... 38 Şekil 4.6. Mannitol+Sukroz karışımı 13 C-APT Spektrumu... 39 Şekil 4.7. Mannitol ve Sukroz karışımının GC-MS kromatogramı... 40 Şekil 4.8. E. campestre den izole edilen Rutin molekülü... 40 Şekil 4.9. Rutin 400 MHz 1 H NMR spektrumu... 41 Şekil 4.10. Rutin in D 2 O damlatılarak alınan proton NMR Spektrumu... 42 Şekil 4.11. Rutin 100 MHz 13 C spektrumu... 43 Şekil 4.12. Rutin 100 MHz 13 C-APT spektrumu... 44 Şekil 4.13. Rutin 100 MHz 13 C-DEPT135 Spektrumu... 45 Şekil 4.14. Rutin 100 MHz 13 C-DEPT45 Spektrumu... 46 Şekil 4.15. Rutin 100 MHz 13 C-DEPT90 Spektrumu... 47 Şekil 4.16. Rutin bileşiğine ait aromatik 100 MHz 13 C NMR spektrumu... 48 vi

Şekil 4.17. 500 ppm Kuersetin Standart HPLC Kromatogramı... 50 Şekil 4.18. 500 ppm Rutin Standart HPLC Kromatogramı... 50 Şekil 4.19. Rutin+Kuersetin 500 ppm Standart Karışımının HPLC kromatogramı (1:Rutin, 2:Kuersetin )... 51 Şekil 4.20. 500 ppm Fr-4 fraksiyonu HPLC kromatogramı (2: Kuersetin)... 51 Şekil 4.21. 500 ppm Fr-5 fraksiyonu HPLC kromatogramı (1:Rutin, 2: Kuersetin)... 51 Şekil 4.22. 500 ppm Fr-6 Fraksiyonu HPLC kromatogramı (1: rutin, 2: Kuersetin)... 52 Şekil 4.23. 500 ppm Fr-7 Fraksiyonu HPLC kromatogramı (1: Rutin)... 52 vii

ÇĐZELGELER (TABLOLAR) DĐZĐNĐ Tablo Sayfa Tablo 2.1. Doymuş Yağ Asitleri (saturated fatty acids: MUFA)... 9 Tablo 2.2. Tekli Doymamış Yağ Asitleri (Monounsaturated fatty acids: MUFA)... 10 Tablo 2.3. Çoklu Doymamış Yağ asitleri (Polyunsaturated fatty acids: PUFA)... 10 Tablo 2.4. Terpenlerin Sınıflandırılması... 11 Tablo 3.1. Poliferasyon Denemeleri Deney Dizaynı... 23 Tablo 4.1. Eryngium campestre bitkisinin Vakum kromatografisi ile elde edilen fraksiyonlar... 31 Tablo 4.2. Eryngium campestre Bitkisinin Çiçekleme Dönemi Uçucu Yağ Bileşenleri 33 Tablo 4.3. Eryngium campestre Uçucu Yağlarının Sınıflandırılması... 34 Tablo 4.4. Eryngium campestre Bitkisinin Sabit Yağ Asidi Bileşenleri... 36 Tablo 4.5. Sukroz 13 C-NMR verileri... 38 Tablo 4.6. Mannitol 13 C verileri... 38 Tablo 4.7. Rutin Bileşiğine Ait Karbon Ve Hidrojen NMR ına Ait Kimyasal Kayma Değerleri... 49 Tablo 4.8. Fraksiyonların Rutin Ve Kuersetin Đçerikleri... 52 Tablo 4.9. Kontakt Toksisite Deneme Sonuçları... 53 Tablo 4.10. 500 µg/30.000 Hücre Đle Yapılan Denemelerin Eliza Sonuçları... 54 Tablo 4.11. Anti Kanserojen Aktivite Đstatiksel Analiz Sonuçları... 54 viii

SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐNĐ δ APT CCNSC d dd DEPT DMEM DMSO DPBS DPT GC-MS HPLC IR J KOH m MS NMR PHA ppm s t TCA UV-VIS Kimyasal Kayma Attached Proton Test Cancer Chemotherapy National Service Center Dublet Dubletin dubleti Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dulbecco s Modified Eagle s Medium-High Glucose Dimetilsülfoksit Dulbecco s Phosphate Saline Devlet Planlama Teşkilatı Gaz Kromatografisi- Kütle Spektrometresi High Performence Liquid Chromatography Infrared Etkileşme Sabiti Potasyum Hidroksit Multiplet Kütle Spektrometresi Nükleer Manyetik Rezonans Phytohemagglutinin Milyonda bir kısım Singlet Triplet Trikloroasetik asit Ultra viyole-görünür Bölge ix