kullanım kılavuzuna Bakınız

Transkript

1 HPV DNA-Chip Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Revizyon: BQ Mayis 2015 Maybachstr Frickenhausen almanya

2 SeMBoLLeR SÖZLÜĞÜ! tr Karanlık yerde saklayınız Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı okuyun Katalog numarası Üretici fi rma in vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması İçeriği <n> test için yeterlidir Tahriş HPV Parti DNA-Chip kodu Önemli edici Not en Store in the dark Use by Consult instructions For Use Catalog Number in Vitro Dianostic Medical Device Manufacturer Temperature limitation Contents suffi cient for <n> tests irritant Batch code important Note de im Dunkeln lagern Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch anweisung lesen Katalognummer Hersteller in-vitro- Diagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung inhalt ausreichend für <n> Tests Reizend Chargenbezeichnung Wichtiger Hinweis fr À stocker à l abri de la lumière Date limite de conservation jusqu au lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro limite de température Contenu suffi sant pour <n> tests irritant N o de lot Note importante es it pt nl Conservar en un lugar oscuro Nota importante Conservare al buio a utilizar preferiblemente antes de Da utilizzare entro e non oltre antes de usar, lea las instrucciones leggere le istruzioni prima dell uso Numero catalogo Nota importante Conservar a utilizar antes de PapilloCheck num local preferívelmente as inst- usar, leia escuro go antes de ruções Número de catálo- Número de catálogo Fabricante Produttore Fabricante Producto medicinal de diagnóstico in vitro Dispositivo medicodiagnostico in-vitro Producto medicinal de diagnóstica in vitro limitación de temperatura limitazione temperatura limitação de temperatura Contenido sufi ciente para <n> ensayos Contenuto suffi ciente per test <n> Conteúdo sufi ciente para <n> ensaios aviso importante Donker Tenminste Gebruik- Catalo- Fabrikant in vitro Tempera- bewaren houdbaar saanwij- gusnum- diagtuurbeper- tot zing lezen mer nostisch medisch product king Voldoende inhoud voor <n> tests irritante irritante irritante irriterend Código de lote Codice del lotto Código do lote lot nummer Belangrijke opmerking da Opbevares mørkt anvendes senest Læs brugsanvisningen Katalognummer Producent in vitro meskdicin doagnoseapparat Temperaturbegraensær indeholder nok til <n> test lokalirriterende lotnummer Vigtig henvisning sv pl no Förvaras mörkt. Sista förbrukningsdag Viktigt meddelande Przechowywa ć w Termin zydatności ReF ciemności läs bruksanvisningen före Przed użyciem przeczytać instrukcję Tillverkare Producent Servikal numunelerde använd-6ning 11, 16, 18, 31, 33, nostisk 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs apparatur tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Katalognummer in vitromedicinsk doag- Numer katalogowy Diagnostyka in vitro Produkt yw Temperatur-begränsning Ograniczenie temperatury Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından Oppbeva- holdbar til les katalog- produsent in-vitro tanılarda kullanılması içindir res mørkt bruksanvisning før bruk nummer in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr temperaturbegrensning innehållet räcker till <n> tester Zawartość wystarcza na <n> testów innhold tilstrekkelig for <n> tester irriterande lot nummer drażniący Kod partii Ważne Nisan 2011 irriterende batch nr. Viktig merknad el Αποθηκεύεται στα σκοτεινά το λιγότερο διατηρείται πριν την χρήση διαβάστε τις οδηγίες Αριθμός Καταλόγου Παραγωγός in vitro διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα περιoριoμός θερμοκραο ίας Maybachstr Frickenhausen almanya Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ ερεθιστικό κωδικός παρτίδας Σημαντική υπόδειξη 2

3 İÇİNDekİLeR 1. kitin İÇeRİĞİ GeRekLİ SARF MALZeMeLeRİ, ekipmanlar Ve DoNANIMLAR... HPV DNA-Chip6 3. NAkLİYe Ve SAkLAMA GÜVeNLİk TALİMATLARI ATIkLARIN Yok edilmesi GİRİŞ kullanım amacı ile saptanabilir hpv tipleri Miktar tayini prensibi DNA çipinin tasarımı çipi yerleşim planı Çip üstü kontroller PaPilloCheCk İŞ AkIŞI TALİMATLARI Genel talimatlar oda ayrımı Uyarılar ve önlemler Kontaminasyonun önlenmesi DNa çipleri ile işlem yapma talimatı Genel önlemler Güvenli çalışma PaPillOCheCk PRoSeDÜR Örnek toplama ve DNA izolasyonu Örnek toplama DNa izolasyonu Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Termal döngüleyici kurulumu...21 Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, , 68, Urasil-N-Glikosilaz 70, 73, 82 insan (UNG) papillomavirüs uygulaması tiplerinin...22 genotiplemesine yönelik tanı kiti PCR reaksiyon kurulumu ReF hibridizasyon ve yıkama Hazırlama ve kurulum...25 Yalnızca profesyonel Hibridizasyon...27 laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda Yıkama ve kullanılması kurutma...29 içindir Nisan çipinin taraması ve değerlendirmesi...31 Maybachstr Frickenhausen almanya 3

4 9. SoRUN GİDeRMe TekNİk YARDIM PaPilloCheCk PeRFoRMANS ÖZeLLİkLeRİ HPV DNA-Chip 11.1 analitik performans analitik hassasiyet analitik özgüllük HPV türleri analitik özgüllük HPV dışı organizmalar Tekrarlanabilirlik Yeniden Üretilebilirlik Dayanıklılık klinik performans PaPilloCheCk kisa PRoTokoL oda 2: PCR - Reaksiyon karışımının kurulumu oda 2: PCR - DNA şablonu ekleme / PCR reaksiyonu oda 3: hibridizasyon - hazırlama / hibridizasyon reaksiyonu oda 3: Yıkama ve kurutma / Tarama ve değerlendirme...44 Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Maybachstr Frickenhausen almanya 4

5 1. kitin İÇeRİĞİ test kiti 1 İçerik Miktar PCR MasterMix Slide kutusu, 5 x 12 Dizi 5 x PCR MasterMix 2 5 x 300 µl 1 x Slide Kutusu 5 çipi ile 3 5 x 12 Dizi HPV DNA-Chip Hibridizasyon Tamponu TaMPON a konsantrasyonu TaMPON B konsantrasyonu 2 x Hibridizasyon Tamponu 2 x Tampon a konsantratı 1 x Tampon B konsantratı 2 x µl 2 x 40 ml 1 x 15 ml 1 One test kiti, 60 numunenin analizi için yeterlidir. 2 DNa Taq Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz dışında PCR için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. 3 Bir çipi 12 mikrodizisi içerir. Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Maybachstr Frickenhausen almanya 5

6 2. GeRekLİ SARF MALZeMeLeRİ, ekipmanlar Ve DoNANIMLAR 'in listelenen sarf malzemeleri, ekipmanlar ve donanımlar ile birlikte ve yalnızca profesyonel personel tarafından kullanılması önerilmektedir. HPV DNA-Chip Sarf Malzemeleri Greiner Bio-one kat. No. Miktar test kiti reaksiyon için test kiti ocheck DNa İzolasyon Kiti / Tek Kolon Hazırlama hazırlama için test kiti Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu 1 0,5-10 µl fi ltre uçları 0,5-20 µl fi ltre uçları µl fi ltre uçları µl fi ltre uçları µl fi ltre uçları /960 96/960 96/960 96/960 60/600 DNase-içermeyen reaksiyon tüpleri Reaksiyon tüpü 1.5 ml Reaksiyon tüpü 0,2 ml 2 8 x 0,2 ml PCR şeritleri 8 x 0,2 ml PCR şeritleri için kapak şeritleri / / / / ml polipropilen tüp /450 Pipetleyici için plastik pipetler Pipet 10 ml Pipet 25 ml Pipet 50 ml veya veya veya /200 1/200 1/200 1 Belirtilen uç boyutlarından bazıları kullanılabilir mikropipetlere bağlı olarak isteğe bağlıdır. 2 Prensip olarak 8'li tüp PCR şeridi kullanılması önerilmektedir. Şeritler mevcut değilse tekli reaksiyon tüpleri (0,2 ml) isteğe bağlıdır. 3 Yalnızca slide santrifüj mevcut değilse gerekir. Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Maybachstr Frickenhausen almanya 6

7 ekipman Greiner Bio-one kat. No. Miktar CheckScanner TM CheckReport TM Yazılımı Temel CheckReport TM Yazılımı eklentisi Slide tutuculu ocheck Hibridizasyon Odası HPV DNA-Chip 1 Slide tutucu kolu ocheck Yıkama Teknesi Gerekli enzimler Taq Polimeraz: HotStarTaq DNa Polimeraz 5 U/µl (Qiagen; , , , ) Urasil-N-Glikosilaz: Urasil-DNa Glikosilaz 1 U/µl (Fermentas; #EN0361, #EN0362) Gereken ek sarf malzemeleri PCR-kalitesinde su Distile veya deiyonize su Tek kullanımlık eldivenler Gereken ek ekipmanlar 1.5 ve 2 ml reaksiyon tüpleri için mikrosantrifüj 50 ml polipropilen tüpler için santrifüj (örn: BeckmanCoulter; allegra X-22 Santrifüj; C0650 Sabit açılı Rotor) veya slide santrifüj (örn: labnet: Slide Spinner; VWR international: Galaxy Miniarray Santrifüj) Tekli 0,2 ml reaksiyon tüpleri veya 8'li tüp PCR şeritleri için mikrosantrifüj (örn: labnet: Spectrafuge Mini Santrifüj) PCR termal döngüleyici: Geneamp PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) veya Veriti 96-Kuyucuklu Termal İşlemci (Uygulamalı Biyosistemler) peqstar 96X Universal (PEQlaB Biotechnology GmbH) Su banyosu (50 C) Mikropipetler ( µl arası farklı aralıklar) 8-Kanallı multipipet (aralık: 5-50 µl), örn. Brand Transferpette -8 (Marka) Cam ve plastik pipetler için pipetleyici Vortex çalkalayıcı Farklı reaksiyon tüpleri için rafl ar Gerekli ek donanımlar Bilgisayar (sistem gereksinimleri için CheckScanner TM ve CheckReport TM Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız) 4 yıkama prosedürü için üç adet ocheck Yıkama teknesi gerekmektedir. 5 Yalnızca Kat. No ile birlikte kullanıldığında gereklidir. Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Maybachstr Frickenhausen almanya 7

8 3. NAkLİYe Ve SAkLAMA test kitinin nakliyesi oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Bununla birlikte kit teslim alındıktan hemen sonra 4-8 C'de saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır. Doğru bir şekilde saklanan test kiti ve bileşenleri belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. ayrıca bu koşullar altında raf ömrü, kitin ve bileşenlerinin ilk kez açılmasından sonra son kullanma tarihinden HPV DNA-Chip sapmaz. 4. GÜVeNLİk TALİMATLARI test kiti yalnızca laboratuar kullanımına yöneliktir ve ilaç, evsel veya diğer amaçlar doğrultusunda kullanım için tasarlanmamıştır. Her zaman uygun bir laboratuar önlüğü giyin, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlük takın ve bu bölümde verilen güvenlik talimatlarını izleyin. test kitinin aşağıdaki bileşenleri zararlı veya tehlikeli bileşenler içerir. kit Bileşeni Tehlikeli içerik (Miktar) Tehlike ve tedbir ifadeleri 1272/2008 (ec) numaralı düzenleme için sınıflandırma GhS resimli çizelgesi ve sinyal kelimesi Hibritleştirme Tamponu Guanidin tiyosiyanat (%20 ila 60) CaS No akut toksisite, oral, (kategori 4) akut toksisite, soluma, (kategori 4) suda kronik toksisite, (kategori 3) TehLİke H302 H332 H314 H412 P273 Yutulması zararlıdır Solunması zararlıdır Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarlarına neden olur Uzun süreli etkiler ile birlikte su altı yaşam için tehlikelidir Çevreye salınmasından kaçının cilt korozyonu (kategori 1c) P280 giyin P305+P351+ P338 Koruyucu eldivenler/koruyucu kıyafet/göz koruyucu/yüz koruyucu takın/ GÖZE KaÇMaSi HalİNDE: Birkaç dakika boyunca suyla durulayın. Kontak lenslerinizi (varsa) çıkarın. Durulamaya devam edin. Derhal bir ZEHİRlENME MERKEZİNİ ya da doktoru arayın. İlave tehlike Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, bilgileri 40, (ab) 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, EUH032 asitlerle temasında çok toksik gaz 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine çıkarır yönelik tanı kiti PapilloCheck ReF 465 Sodyum dodesil sülfat (kategori 2), cilt irritasyonu H Hibritleştirme Tamponu (<%20) H318 Yalnızca profesyonel ciddi laboratuar göz hasarı personeli tarafından in-vitro tanılarda CaS No. kullanılması (kategori 1) TehLİke içindir P Cilt irritasyonlarına neden olur Ciddi göz hasarına neden olur Koruyucu eldiven/göz koruması/yüz Nisan 2011 koruması kullanın. P305+P351+ P338 GÖZE KaÇMaSi HalİNDE: Birkaç dakika boyunca suyla durulayın. Kontak lenslerinizi (varsa) çıkarın. Durulamaya devam edin Bu ürüne ait güncel Maybachstr. Güvenlik 2 Veri Formu, Frickenhausen Greiner almanya Bio-One internet sitesinden Tel: +49 (0) indirilebilir: Faks +49 (0)

9 5. ATIkLARIN Yok edilmesi çipi yıkandıktan ve kurutulduktan sonra yıkama çözeltileri i, ii ve iii özel bir tedbir olmaksızın atılabilir. Kullanılmış çipi, kullanılmamış kit bileşenlerini ve kullanılmamış hibridizasyon karışımını laboratuar kimyasal atıklarıyla birlikte bertaraf edin. Bertaraf etme ile ilgili tüm ulusal düzenlemelere, devlet düzenlemelerine ve yerel düzenlemelere riayet edin. HPV DNA-Chip Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Maybachstr Frickenhausen almanya 9

10 6. GİRİŞ Hemen hemen tüm rahim boynu kanseri vakalarında karsinojenik insan papillomavirüs (HPV) ile kalıcı enfeksiyon tespit edilmiştir ikincisi tüm dünyada kadınlarda en yaygın görülen kanserdir. Bugüne kadar 100'den fazla HPV tipi saptanmıştır, bunların yaklaşık 40 tanesi cinsel yolla bulaşır ve genital mukozayı enfekte eder. Rahim boynu HPV tipleri hem yüksek risk (yüksek riskli HPV, hrhpv) HPV DNA-Chip hem de düşük risk grubunda (düşük riskli HPV, lrhpv) sınıflandırılır. Yüksek riskli HPV tipleri yüksek rahim boynu kanseri riski ile ilişkiliyken düşük riskli HPV tipleri çoğunlukla iyi huylu genital siğillere neden olur. Bununla birlikte, yüksek risk grubunda dahi kanser veya rahim boynu interepitelyal lezyonların (CiN) görülme riski tipe bağlıdır. Tüm rahim boynu kanser vakalarının yaklaşık % 70'i HPV 16 veya 18 ile bağlantılı kalıcı enfeksiyon ile ilişkilidir. En çok rastlanan düşük risk tipleri HPV 6 ve 11'dir. Karsinojenik HPV ile rahim boynu kanseri arasındaki hemen hemen kesin olan etyolojik ilişkiye göre hrhpv'nin test edilmesi birincil rahim boynu kanser taraması için düşünülmektedir. 6.1 kullanım amacı bir tanı kitidir ve insan rahim boynu smear'larından alınan DNa preparatlarında 24 türde insan papillomavirüsünün kalitatif tespiti ve genotiplemesinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kitin yalnızca uygun niteliklere sahip personel tarafından kullanılması amaçlanmıştır., İn Vitro Tıbbi Tanı Cihazları Direktifi nin (98/79/EC) koşullarına uyduğundan dolayı CE uyum işareti taşımaktadır. kullanılarak elde edilen her tanı sonucu diğer klinik bulgular veya laboratuar bulguları ile birlikte yorumlanmalıdır. 6.2 Papill ocheck ile saptanabilir HPV tipleri insan papillomavirüsünün (HPV) 18 yüksek risk ve 6 düşük risk tipinin saptanmasına olanak tanır (Tablo 1). Tablo 1: ile saptanabilir hpv tipleri hpv 16 hpv 45 hpv 59 hpv 6 hpv 18 hpv 51 hpv 66 hpv 11 hpv 31 hpv 52 hpv 68 hpv 40 hpv 33 hpv 53 hpv 70 hpv 42 hpv Servikal 35 numunelerde hpv 56 6, 11, 16, hpv 18, 73 31, 33, 35, 39, hpv 40, 43 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, hpv 59, 39 66, 68, 70, 73, hpv 8258insan papillomavirüs hpv 82 hpv tiplerinin 44 / hpv genotiplemesine 55* yönelik tanı kiti * PapilloCheck ReF 465 HPV ile HPV 55'in ayırt edilmesini sağlamaz. Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1): Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16: Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specificimplications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K Meijer, C.J. et al. (2009). Greiner Guidelines Bio-one for human papillomavirus Gmbh DNa test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. int J Cancer. Maybachstr. 124(3): Frickenhausen almanya 10

11 6.3 Miktar tayini prensibi, insan papillomavirüs (HPV) genomu E1 geninin bir parçacığının tespit edilmesine ve genotiplemesine yönelik mikrodizi tabanlı bir test kitidir. Miktar tayini prosedürü Şekil 1'de özetlenmiştir. HPV DNA-Chip analizinden önce bir rahim boynu smear'i numunesinden DNa izole edilmelidir. Numune toplama ve DNa izolasyonu test kitinin parçaları değildir. Greiner Bio-One numune toplama ( Toplama Kiti) ve DNa izolasyonuna (ocheck DNa İzolasyon Kiti) yönelik özel ürünler de sunmaktadır ve bu ürünler ayrı olarak satın alınmalıdır (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). Bir rahim boynu numunesinden viral ve insan genomik DNa'sının izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı HPV'ye özgü primerler grubunun bulunduğu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifi ye edilir. aynı reaksiyonda insan tek kopya geni adat1 (insan trna-özgül adenozin deaminaz1), rahim boynu numunesinde insan numunesi materyalinin varlığını (numune kontrolü) ve 'de bulunan dahili kontrol şablonunu izlemek için amplifi ye edilir. PCR MasterMix, PCR (PCR kontrolü) performansını izlemek için amplifi ye edilir. ayrıca PCR MasterMix, dutp içerir. Böylece, önceki PCR reaksiyonlarından kaynaklanan taşınma kontaminasyonu Urasil- N-Glikosilaz (UNG) uygulaması ile giderilebilir (bkz. bölüm 8.2.2). PCR ürünleri daha sonra spesifi k DNa problarına hibridize edilir ve çip yüzeyine çip üstü kontrolleri eklenir. Her çip 12 DNa-mikrodizisi içerir, 12 rahim boynu numunesinin eş zamanlı analizine olanak tanır. Hibridizasyon sırasında bağlı DNa fl oresanla etiketlenir ve bağı çözülmüş DNa sonraki yıkama adımlarında çıkarılır. Hibridizasyon etkinliği izlenir (hibridizasyon kontrolü). Son olarak çipi sırasıyla CheckScanner TM ve CheckReport TM Yazılımı kullanılarak otomatik olarak taranır, analiz edilir ve değerlendirilir (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). CheckScanner PapilloCheck TM, iki renkli lazer tarayıcısı olup (532 nm ve 635 nm eksitasyon dalgaboyları) HPV'ye özgü amplifi kasyon ürünlerinin yanı sıra kontrollerinin varlığı ile oluşturulan fl oresan sinyalinin tespit edilmesini sağlar (bkz. bölüm 6.4.2). CheckReport TM Yazılımı, sonuçların görüntülenmesine, analizine ve değerlendirilmesine olanak sağlar ve tespit edilen HPV türlerinin ve kontrollerin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda otomatik olarak gösterir. Rapor, tespit edilebilir bir veya daha fazla 24 HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça gösterir ve kapsamlı çip üstü kontrolleri analizi son derece güvenilir kılar. Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Maybachstr Frickenhausen almanya 11

12 1. PCR reaksiyonu HPV DNA-Chip 2. hibridasyon 3. Yıkama ve kurutma veya 4. Tarama ve analiz Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından Şekil 1: in-vitro PapilloCheck tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 miktar tayini prosedürü 1. PCR reaksiyonu: DNa izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı ve iki kontrol hedefi nin parçacıkları PCR ile amplifi ye edilir. amplifi kasyon ürünleri daha sonra çip üzerinde tamamlayıcı DNa problarına hibridize edilir. 2. hibridasyon: Her bir HPV türü, beş kopya halinde bulunan spesifi k DNa probu ile tespit edilir. Hibridizasyon sırasında fl oresan etiketleme uygulanır. 3. Yıkama ve kurutma: Bağı çözülmüş DNa sonraki yıkama adımlarında çıkarılır. 4. Tarama ve analiz: Greiner PapilloCheck Bio-one çipi Gmbh CheckScanner TM ve CheckReport TM Yazılımı kullanılarak taranır, analiz edilir ve değerlendirilir. Tespit Maybachstr. edilebilir bir 2 veya daha Frickenhausen fazla 24 HPV türünün almanya varlığını veya yokluğunu açıkça gösteren bir rapor oluşturulur. 12

13 6.4 DNA çipinin tasarımı çipi yerleşim planı Her çipi, kuyucuk a1 - B6 olarak tayin edilmiş 12 mikrodizi içerir. Her mikrodizisi 28 farklı probdan oluşur ve yükseltilmiş bir alanla sınırlanır. Her prob beş kez damlatılır. HPV DNA-Chip mikrodizi yerleşim planı Şekil 2'de gösterilmekte ve -çip üstü kontrolleri Bölüm 6.4.2'de daha detaylı bir şekilde açıklanmaktadır. a) b) kırmızı kanalın (635 nm) yeşil kanalın (532 nm) oryantasyon kontrolü HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 hibridizasyon kontrolü oryantasyon kontrolü HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 c) HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 hibridizasyon kontrolü PCR kontrolü HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 numune kontrolü PCR kontrolü HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 numune kontrolü Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Şekil 2: çipinin tasarımı a) çipinin şematik çizimi. b) ve c) (b) kırmızı kanalın: 635 nm; c) yeşil kanalın: 532 nm taranmasında kullanılan ReF iki 465 farklı 060 eksitasyon dalgaboyu için CheckReport TM Yazılımı ve mikrodizi yerleşim planının şematik çizimleri. HPV türü spesifi k problar ve çip üstü kontroller belirtilir. Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Maybachstr Frickenhausen almanya 13

14 6.4.2 Çip üstü kontroller DNa-çipinin tasarımı kapsamlı çip üstü kontrolleri içerir. Çeşitli kontrol sistemleri, numune kalitesi ve DNa izolasyonu (numune kontrolü), PCR reaksiyonunun kalitesi (PCR kontrolü), hibridizasyon etkinliğinin (hibridizasyon kontrolü) yanı sıra nokta homojenliği ve baskı kalitesi (işletim kontrolü ve baskı kontrolü) de dahil olmak üzere miktar tayini ve çip işlemenin tüm kritik adımlarını izler. HPV türlerinin varlığına veya yokluğuna ek olarak CheckReport Yazılımı kontrollerin HPV DNA-Chip ve tespit edilen HPV türlerinin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda gösterir. Farklı kontrollerin okunması için CheckScanner 'in her iki eksitasyon dalgaboyu kullanılır. Miktar tayini performansının kontrolü için (numune ve PCR kontrolü) kırmızı kanal kullanılırken (635 nm eksitasyon dalgaboyu), hibridizasyonun ve çipin kalitesi (hibridizasyon, oryantasyon ve baskı kontrolü) yeşil kanalda değerlendirilir (532 nm eksitasyon dalgaboyu). Numune kontrolü, insan tek kopya geni adat1'in (insan trna-spesifi k adenozin deaminaz1) bir parçacığını amplifi ye ederek numunenin numunenin ve/veya DNa izolasyonunun kalitesini izler. İnsan DNa'sı rahim boynu numunesinden izole edilen DNa'da yeterli miktarda mevcut ise numune kontrol noktalarında bir fl oresan sinyali verilir. adat1 amplifi kasyonu gerçekleşmez veya yetersiz şekilde gerçekleşirse, CheckReport Yazılımı numune kontrolünün "başarısız" olduğunu gösterecektir ve rahim boynu numunesinde yetersiz miktarda hücre olmasının ve/veya yetersiz izolasyon performansının bir sonucu olarak analizi tekrarlanmalıdır (bkz. Bölüm 9). PCR kontrolü ayrıca PCR reaksiyonunun kalitesini de izler. PCR MasterMix'de bulunan dahili kontrol şablonunun amplifi kasyonu çipindeki PCR kontrol noktalarında bir sinyal oluşturur. amplifi kasyon reaksiyonunun kalitesi aynı zamanda CheckReport Yazılımı ile de otomatik olarak değerlendirilir. PCR performansı önceden tanımlanmış eşiğin altında ise CheckReport Yazılımı PCR kontrolünü "başarısız" olarak gösterir ve analiz tekrarlanmalıdır (bkz. Bölüm 9). Numunedeki HPV DNa çok yüksek ise, PCR kontrol noktalarının fl oresan sinyali, PCR reaksiyonu sırasındaki rekabete bağlı olarak düşük olabilir veya olmayabilir. Bu durumda testin geçerli olarak kabul edilebilmesi için en az bir HPV-spesifi k probunun fl oresan sinyali önceden tanımlanmış eşiği aşmalıdır. hibridizasyon kontrolü, çipinde spesifi k DNa dizilerine hibridize olan Hibridizasyon Tamponu içinde fl oresan ile etiketlenmiş prob kullanımı ile hibridizasyonun etkinliğini izler. Yeterli bir hibridizasyon etkinliği her bir dizi noktasında fl oresan sinyalleri ile sonuçlanır. Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, PapilloCheck 59, 66, 68, çipindeki beş hibridizasyon kontrol noktasının sonuçları ayrıca CheckReport 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı TM Yazılımı kiti ile de değerlendirilir. ReF oryantasyon ve baskı kontrolü PapilloCheck Yalnızca çipinin oryantasyon kontrol noktaları, hibridizasyon prosesinin etkinliğine bakılmaksızın profesyonel laboratuar personeli tarafından fl oresan sinyalleri verir. Bu noktalar, sinyallerin doğru analizi için bir ön koşul olan doğru nokta in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 tespitine yönelik kılavuz noktaları olarak CheckReport TM Yazılımı tarafından kullanılır. ayrıca baskı prosesinin kalitesi her bir çip noktasında (baskı kontrolü) yeşil bir fl oresan sinyali ile izlenir. Maybachstr Frickenhausen almanya 14

15 7. PaPilloCheCk İŞ AkIŞI TALİMATLARI 7.1 Genel talimatlar Moleküler biyolojide halihazırda kullanılan en gelişmiş teknikler bir laboratuvara uygulandığında, laboratuar personelinin azami güvenliğini ve yüksek kaliteli sonuçlar sağlamak amacıyla aşağıdaki HPV DNA-Chip talimatlar göz önünde bulundurulmalıdır. DNa izolasyonu, amplifi kasyon ve amplifi kasyon ürünlerinin tespiti uygun nitelikli personel gerektirir. ayrıca DNa bozunması veya amplifi kasyon ürünleri ile kontaminasyon nedeniyle ortaya çıkanlar gibi hatalı sonuçları engellemek için net ve iyi yapılandırılmış bir iş akışı gerekmektedir. Bunu sağlamak için Bölüm 7.2'de tanımlandığı gibi izolasyon, amplifi kasyon ve tespit alanlarının ayrılması gerekir. Her alanda ayrı ekipman, sarf malzemeleri, laboratuvar önlükleri ve eldivenler bulunmalıdır. laboratuvar önlüklerini, eldivenleri veya ekipmanları kesinlikle farklı bir alandan bir başka alana aktarmayın. 7.2 oda ayrımı Şekil 3bir laboratuvarın nasıl 3 farklı bölüme ayrılabileceğine yönelik bir örnek göstermektedir. Bu odalardan biri yalnızca DNa izolasyonu için, diğeri PCR reaksiyonlarının kurulması ve çalıştırılması için, sonuncusu ise hibridizasyon ve analiz için kullanılır. Her bir oda, numunelerin kontaminasyonunu önlemek amacıyla, yalnızca belirtilen uygulama veya teknik için kullanılır. Ekipmanların ve sarf malzemelerinin alanlar arasında yanlışlıkla yer değiştirmesini önlemek için renk kullanılması yararlı olabilir. oda 1 oda 2 oda 3 Şekil 3: oda ayrımı oda 1: Servikal DNa izolasyon numunelerde prosedürünün 6, tamamı 11, 16, bu 18, odada 31, gerçekleştirilmelidir. 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, oda 2: 59, Bu odada, 66, 68, PCR 70, reaksiyon 73, 82 insan karışımı papillomavirüs ayarlanır ve alikuotlara tiplerinin bölünür genotiplemesine (en uygunu bir PCR yönelik ocağı altında). tanı Oda kiti 1'de izole edilen DNa numunelerinin eklenmesi oda 2 içinde ayrı bir alanda gerçekleştirilmelidir. oda3: Hibridizasyon reaksiyonu, yıkama adımları ve çip kurutma üçüncü laboratuvar odasında yapılır. ayrıca CheckScanner ReF TM, CheckReport TM Yazılımı ile birlikte miktar tayininin nihai analizi için kullanılır.! Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro Ekipmanlar tanılarda ve sarf kullanılması malzemeleri, farklı içindir laboratuvar odaları ve alanları arasında yer değiştirmemelidir. Nisan 2011 Bu nedenle, laboratuvara ekipman temin edilirken ekipmanların ve sarf malzemelerinin çift olarak temin edilmesine dikkat edilmelidir. Maybachstr Frickenhausen almanya 15

16 7.3 Uyarılar ve önlemler kontaminasyonun önlenmesi Prosedürlerin uygulanması sırasında laboratuvar önlükleri giyilmelidir ve her bir laboratuvar odası için farklı laboratuvar önlük setleri bulunmalıdır. HPV DNA-Chip analizin her adımında eldivenler takılmalıdır ve özellikle DNa izolasyonu sırasında sık sık değiştirilmelidir. Çalışma yeri uygun temizlik solüsyonlarıyla dekontamine edilmelidir. Reaksiyon tüpü kapağının içine kesinlikle dokunulmamalıdır. Çapraz kontaminasyondan kaçınmak için, her seferde yalnızca bir tüp açılmalıdır. aerosol bariyerli uygun mikropipet fi ltre uçları kullanılmalıdır (DNase, Rnase ve insan DNa'sı içermeyen). Sıvı transferleri arasında pipet uçları daima değiştirilmelidir DNA çipleri ile işlem yapma talimatı DNa çipleri tozsuz bir ortamda kullanılmalıdır. Çip yüzeyinde toz ve diğer parçacıkların birikmesi önlenmelidir. Çip yüzeyindeki hibridizasyon bölgesine dokunulmamalıdır. Çipin yalnızca etiketli tarafı hibridizasyona yöneliktir. Çip üzerinde spesifi k olmayan fl oresana yol açtıklarından DNa çiplerinin tanımlanması için işaret kalemleri kullanılmamalıdır. DNa dizileri yalnızca tek kullanımlıktır. Hibridize edilen çipler yeni,den kullanılamaz. Kullanılmamış çipler, teslim edilen ve nem çekici fermuarlı torba içinde, orijinal kutusunda saklanır Genel önlemler Bu kit yalnızca in vitro tanılarda kullanıma yöneliktir ve yalnızca in vitro tanılarda laboratuvar uygulama deneyimine sahip eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır. Teslim alındığında kit bileşenlerinin hasarlı olup olmadığını kontrol edin. Bileşenlerden biri hasar görmüşse (örn. tampon şişeleri), yerel Greiner Bio-One distribütörünüze başvurun. Hasar görmüş kit bileşenleri kullanılmamalıdır. Bu komponentlerin kullanılması, kit performansını zayıfl atabilir. test kiti, son kullanma tarihinden sonra kullanılmamalıdır. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifl eri kullanmayın. Farklı serilere ait reaktifl eri karıştırmayın. Yalnızca Servikal kitle numunelerde birlikte sağlanan 6, 11, ve 16, üretici 18, 31, tarafından 33, 35, tavsiye 39, 40, edilen 42, 43, reaktifl 44/55, eri/ekipmanları 45, 51, 52, 53, kullanın. 56, 58, Mikropipetler, 59, 66, 68, su 70, banyosu 73, 82 insan ve termoblok papillomavirüs için düzenli tiplerinin kalibrasyon/bakım genotiplemesine gerçekleştirilmelidir. yönelik tanı kiti Mikrolitre aralığına küçük miktarlarda sıvı pipetlemek zordur. Bu nedenle olabildiğince doğru bir ReF şekilde pipetlemeye dikkat edin. Reaktifl Yalnızca erin profesyonel mikrobik kontaminasyonunu laboratuar personeli önlemek tarafından için alikuotlar reaktif tüplerinden Revizyon: alınırken BQ dikkatli in-vitro olunmalıdır. tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (18-25 C). Maybachstr Frickenhausen almanya 16

17 7.3.4 Güvenli çalışma İnsanlara bulaşma potansiyeli taşıyan maddeler içeren biyolojik numunelerle işlem yaparken dikkatli olun. Bulaşma potansiyeline sahip maddelerden enfeksiyon alma riskini azaltmak için, numune lizisi tamamlanana kadar, laminar hava akımı şartları altında çalışmanız tavsiye edilir. Tüm biyolojik numuneleri, enfekte edici ajanlar taşıma kapasiteleri bulunuyormuş gibi kabul ederek kullanın ve bertaraf edin. HPV DNA-Chip Solüsyonları kesinlikle ağzınızla pipetlemeyin. Çalışma alanlarında yiyecek ve içecek bulundurmayın, sigara içmeyin veya kozmetik ürünler kullanmayın. Biyolojik numunelere doğrudan temas etmekten, bu numuneleri sıçratmaktan veya püskürtmekten kaçının. İnsan numuneleriyle çalışırken daima laboratuvar önlüğü giyin, eldiven takın ve koruyucu gözlük kullanın. Numuneleri ve reaktifl eri kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Servikal numunelerde 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti ReF Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir Nisan 2011 Maybachstr Frickenhausen almanya 17

18 8. PROSEDÜR Aşağıdaki bölümde, her bir analiz edilen rahim boynu numunesinde tespit edilebilir bir veya daha fazla 24 HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça belirten ayrıntılı bir raporun hazırlanması ile sonuçlanan farklı çalışma adımları ayrıntılı bir şekilde açıklanmaktadır. Şekil 4, gerekli olan farklı çalışma adımlarına bir genel bakış sunar. Ayrıca spesifik miktar tayini adımının tanımlandığı ilgili alt bölümü de gösterir. Çalışma adımları bu bölümde belirtilen sırada gerçekleştirilmelidir. Her adım mavi ok ile gösterilmiştir.! CheckReport TM Yazılımı ile örnek toplama, DNA izolasyonu ve analiz test kitinin parçaları değildir. Bu nedenle bu çalışma adımlarının tanımı bu bölümde kısaltılmıştır. Daha ayrıntılı bilgi için lütfen Kullanım Kılavuzuna bakın, örn: Toplama Kitinden, ocheck DNA İzolasyon Kiti ve CheckReport TM Yazılımından. 8.1 Örnek toplama ve DNA izolasyonu Örnek toplama Örnek toplama, test kitinin bir parçası değildir. Greiner Bio-One tarafından rahim boynu örneklerine yönelik özel bir toplama kiti ( Toplama Kiti) de sunulmaktadır (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız)., aşağıdaki toplama sistemleri veya araçlarından biri ile toplanan insan rahim boynu smear'larından ocheck DNA İzolasyon Kiti ile hazırlanan DNA kullanılarak valide edilmiştir: Toplama Kiti (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, ABD) Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) STM TM (Qiagen, Hilden, Almanya) Easyfix (Labonord, Templemars, France) Cyt-All (Alphapath, Mauguio, France). Uygun taşıma araçları veya DNA izolasyon sistemleri ile ilgili daha fazla bilgi için yerel Greiner Bio- One distribütörünüz ile iletişime geçin veya Greiner Bio-One internet sitesine başvurun: 18

19 Bölüm DNA izolasyonu Bölüm 8.2 PCR Bölüm Hibridizasyon Bölüm Yıkama ve kurutma or Bölüm 8.4. Tarama ve değerlendirme Şekil 4: Farklı çalışma adımlarına genel bakış 19

20 8.1.2 DNA izolasyonu DNA izolasyonu, test kitinin bir parçası değildir. analizinden önce Greiner Bio-One tarafından sağlanan ocheck DNA İzolasyon Kiti (Bölüm 2^de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız) kullanılarak DNA izolasyonu gerçekleştirilmelidir. ocheck DNA İzolasyon Kitini kullanırken lütfen Kullanım Kılavuzunu izleyin. ocheck DNA İzolasyon Kiti ile DNA izolasyonu için 250 µl numune çözeltisi kullanılmalıdır. Papill ocheck Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No ) PreservCyt toplama ortamında kullanılarak toplanan insan rahim boynu semar numuneleri (Hologic, Bedford, MA, ABD) doğrudan işlenebilir. STM TM toplama ortamında (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) toplanan rahim boynu numuneleri kullanım öncesi yıkanmalıdır: 250 µl numuneyi g'de 5 dakika süreyle santrifüj edin ve pelleti 250 µl distile suda resüspanse edin. Daha sonra 250 µl ocheck DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir. STM STM TM toplama ortamında (Qiagen, Hilden, Almanya) toplanan rahim boynu numuneleri seyreltilmelidir: 100 µl numune kullanın ve 150 µl distile su ekleyin. 250 µl seyreltilmiş numune ocheck DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir. Genel olarak rahim boynu smear numunesi çok konsantre görünüyorsa ve zaten agrege olmuşsa, DNA izolasyonuna başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir! Çok seyreltilmiş ve gözle görünür hücreleri göstermeyen rahim boynu smear numuneleri, DNA izolasyonu için daha fazla hücre verimi elde etmek amacıyla konsantre edilmelidir: 1000 µl numuneyi g'de 5 dakika süreyle santrifüj edin ve pelleti 250 µl distile suda resüspanse edin. Daha sonra 250 µl ocheck DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir.! Bu konsantrasyon adımı yalnızca Toplama Kiti ile, PreservCyt toplama ortamında veya Surepath TM toplama ortamında toplanan rahim boynu smear numuneleri için uygundur. STM TM toplama ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir. 20

21 8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) PCR, son derece küçük DNA miktarlarını tespit edebilen çok hassas bir yöntemdir. Reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için özel önlemlere uyulmalıdır (bkz. Bölüm 7). HotStarTaq Polimeraz ve Ursail-N-Glikosilaz gerekir ancak test kiti ile birlikte verilmez ve ayrı olarak satın alınmalıdır (bkz. Bölüm 2).! test kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq Polimeraz ve Fermentas tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak (Bölüm 2 de yer alan sipariş verme bilgilerine bakınız) valide edilmiştir. Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimlerin kullanılması zorunludur Termal döngüleyici kurulumu test kiti aşağıdaki termal döngüleyicilerle valide edilmiştir: GeneAmp PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) Veriti 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler) peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH)..! Belirlenen performansın elde edilmesi için yukarıda belirtilen termal döngüleyicilerden birinin kullanılması kesinlikle şarttır. PCR'nin termal döngüleyici programı Tablo 2'de özetlenmektedir. Tablo 2: PCR'nin termal döngüleyici programı Süre Sıcaklık C Döngü sayısı 20 dk. 37 ºC 1 15 dk 95 ºC 1 30 sn. 25 sn. 45 sn. 30 sn. 45 sn. 95 ºC 55 ºC 72 ºC 95 ºC 72 ºC Tutun 10 C Ayrıca her termal döngüleyici için aşağıdaki işlem parametreleri ayarlanmalıdır. Bu parametrelerin nasıl ayarlanması gerektiğinin açıklaması için ilgili termal döngüleyicinin Kullanım Kılavuzuna bakınız. GeneAmp PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) Reaksiyon hacmini 26 µl'ye, rampa hızını 9600 e ayarlayın ve 103 C kapak sıcaklığını kullanın. Veriti 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler) PCR programına girmek için Veriti 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyicinin Dönüştürme Yöntemi aracını kullanın ve 9600 Emülasyon Modu nu seçin. Reaksiyon hacmini 26 µl'ye ve kapak sıcaklığını 103 C'ye ayarlayın. peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH) Isıl döngüleyici ile birlikte sağlanan ön programlı PCR programı PapilloCheck.js yazılımını kullanın. Genellikle program şu yoldan açılabilir. local/scripts/greinerbioone/papillocheck.js. 21

22 8.2.2 Urasil-N-Glikosilaz (UNG) uygulaması PCR MasterMix, PCR sırasında amplifikasyon ürünlerine dahil edilen dutp içerir ve PCR ürünlerini UNG ile bozunmaya duyarlı hale getirir. UNG, PCR ürününü deoksiuridilat kalıntısının dahil edildiği bölgelerde ayırır. Ayrık PCR ürünleri sonraki bir reaksiyonda amplifiye edilmez. Bu nedenle UNG uygulaması, önceki PCR kontaminasyonlarından taşınma kontaminasyonunu gidermek için kullanılabilir. PCR kalitesinde suda Urasil-N-Glikosilazı 1:200 seyreltin. Her PCR reaksiyon kurulumu için yeni bir UNG seyreltmesi kullanın (bkz. Bölüm 8.2.3). Seyreltilmiş UNG'yi yeniden kullanmayın. 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek UNG seyreltmeyi karıştırın. Urasil-N-Glikosilaz orijinal konsantrasyonu 1 U/µl'dir. Sonuç olarak, seyreltmenin konsantrasyonu 0,005 U/µl'dir.! test kiti Fermentas tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak valide edilmiştir (bkz. Bölüm 2). Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur. Bu seyreltmeden 1 µl her bir PCR reaksiyonuna ekleyin (bkz. Bölüm 8.2.3, Tablo 3). Bu miktar, PCR taşınma kontaminasyonunu gidermek için yeterlidir. PCR performansı üzerinde olumsuz bir etkisi olabileceğinden ve hassasiyetinin azalması ile sonuçlanabileceğinden daha yüksek konsantre edilmiş UNG solüsyonu kullanmayın. Genel olarak UNG uygulaması için PCR reaksiyon karışımı 37 C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra, UNG 95 C'de 15 dakika süreyle ek inkübasyon adımı ile etkisizleştirilir. Bu iki adım PCR'ye zaten dahil edilmiştir ve termal döngüleyici programının ilk iki adımına karşılık gelir (bkz. Tablo 2). İkinci adımda (95 C'de 15 dakika) Urasil-N-Glikosilaz'ın etkisizleştirilmesi ve HotStarTaq Polimeraz etkinleştirmesi gerçekleşir. 12! PCR nin dahil edilen UNG sistemi yalnızca önceki PCR reaksiyonlarından PCR ürünleri ile taşınma kontaminasyonlarını giderir. Numune hazırlama, DNA izolasyonu veya PCR şablon ekleme sırasında meydana gelenler gibi diğer kontaminasyonlar giderilemez. Bu nedenle Bölüm 7 de tanımlanan kontaminasyonunun önlenmesi için talimatların ve özel önlemlerin izlenmesi hala gereklidir. 5 PapilloCheck ürününü satın aldığınızda ürünle birlikte ABD Patent Numaraları 5,035,996; 5,683,896; 5,945,313; 6,287,823 ve 6,518,026 altında sınırlı bir lisans ve ilgili yabancı patentler gelir. 6 longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, ,

23 8.2.3 PCR reaksiyon kurulumu HotStarTaq Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz hariç olmak üzere PCR MasterMix, PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için gerekli olan tüm bileşenleri zaten içermektedir (PCR tamponu, MgCl 2, dntp'ler, primerler, PCR kontrol şablonu).! test kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq Polimeraz kullanılarak valide edilmiştir (bkz. Bölüm 2). Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur. Reaksiyon karışımının kurulumu, reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için en uygun bir biçimde PCR ocağı gibi korunan bir ortamda gerçekleştirilir. Reaksiyon karışımını ( PCR MasterMix, HotStarTaq Polimeraz ve Urasil-N- Glikosilaz'dan oluşur) Tablo 3'te belirtildiği gibi gerekli PCR miktarı için hazırlayın. Çoklu numuneleri analizi etmek için reaksiyon karışımı bir seri halinde hazırlanmalıdır (tüm analizler için gerekli olan miktarda). Pipetleme sırasında hacim varyasyonlarını düzenlemek için reaksiyonların sayısının her çip için (n) 1 arttırılması (=n+1) önerilir, örn: 12 numunenin test edilmesi gerekiyorsa 13 amplifikasyon reaksiyonu için bir reaksiyon karşımı hazırlayın (bkz. Tablo 3). Bir çipin reaksiyonları için her zaman bir MasterMix flakonu kullanın. PapilloCheck! PCR MasterMix in her serisi için bir negatif kontrolün dahil edilmesi önerilir. Negatif kontrol olarak uygun DNA izolasyon kitinin DNA elüsyon tamponu veya PCR kalitesinde su kullanılabilir. 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek reaksiyon karışımını iyice karıştırın. Her bir PCR reaksiyonu için reaksiyon karışımının 21 µl'sini pipetleyerek 0,2 ml'lik, ince duvarlı PCR reaksiyon tüpüne alikuotlara bölün. Şablon DNA'yı reaksiyon karışımının kurulumundan ayrı bir çalışma alanına ekleyin (bkz. Bölüm 7.2). Her bir PCR reaksiyonuna 5 µl DNA ekstraktı ekleyin ve 2 saniye süreyle vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya birçok kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek karıştırın. Bir PCR reaksiyonunun toplam hacmi 26 µl'dir. Reaksiyon tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve Bölüm 8.2.1'de tanımlanan termal döngüleyiciyi kullanarak PCR reaksiyonunu başlatın (Tablo 2).! PCR tamamlandıktan sonra amplifikasyon ürünleri hibridizasyon için hemen kullanılmalı veya bir hafta süreyle -20 C de saklanmalıdır. 23

24 Tablo 3: PCR reaksiyonunun kurulumu 1 reaksiyon 13 reaksiyon (1 çip) 26 reaksiyon (2 çip) 39 reaksiyon (3 çip) 52 reaksiyon (4 çip) PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl HotStarTaq Polimeraz (5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Urasil-N-Glikosilaz (1:200 seyreltme, 0,005 U/µl) Numune DNA eklenmeden önce toplam hacim Rahim boynu numunesinden DNA ekstraktı (DNA şablonu) 1 µl 13µl 26 µl 39 µl 52 µl 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl 5 µl Reaksiyon başına toplam hacim 26 µl 24

25 8.3 Hibridizasyon ve yıkama Hazırlama ve kurulum Hibridizasyon oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (20-25 C). Hibridizasyon ve yıkama adımlarının gerekli hazırlıklarına hibridizasyon prosedürünü başlatmadan en az 30 dakika önce başlayın. Hibridizasyon ve yıkama tamponlarında potansiyel çökeltileri çözmek için bunları 30 dakika süreyle oda sıcaklığına (20-25 C) maruz bırakın ve kullanım öncesinde iyice karıştırın. test kitinin 4-8 C'de saklanması Hibridizasyon Tamponunda ve Tampon B'de SDS çökeltisi ile sonuçlanabilir. Solüsyonların oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin ve daha sonra tüpe vorteks uygulayın veya çökeltiler çözülene kadar şişeyi karıştırın. ocheck Hibridizasyon Odasını Hazırlayın: Hibridizasyon Odasına yeni bir nemli kağıt havlu yerleştirin ve neme doygun bir ortam oluşturmak için kapağı kapatın. Çip üzerindeki kullanılmış hibridizasyon karışımının küçük hacminin buharlaşmasını önlemek için hibridizasyonun neme doygun bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekir. Greiner Bio-One tarafından analizi için özel bir Hibridizasyon Odası sunulmaktadır (bkz. Bölüm 2). Gereken miktarda çiplerini hazırlanan Hibridizasyon Odasında en az 10 dakika süreyle oda sıcaklığında (20-25 C) inkübe edin.! Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu iki ucun yalnızca birinde bir mıknatıs içerir. Dörtten az çipinin paralel olarak hibridize edilmesinin gerekmesi durumunda slide tutucuyu mıknatısın karşı tarafından çipleri ile doldurmaya dikkat edin. Aksi takdirde çipleri yıkama prosedürü sırasında sıvı ile kaplanmaz. Yıkama solüsyonları I, II ve III'ü aşağıdaki talimatlara uygun olarak hazırlayın. Yıkama solüsyonları I, II ve III'ün hazırlanması: Yıkama solüsyonu karışımını Tablo 4'te gösterildiği gibi analiz edilmekte olan çipleri sayısı için uygun olan yıkama solüsyonları I, II ve III için hazırlayın. Yıkama solüsyonu karışımının üç eşit hacmini üç ayrı ocheck Yıkama Teknelerine alikuotlar halinde bölün ve yıkama solüsyonu I, II ve III olarak etiketleyin. Her bir ocheck Yıkama Teknesi, 4 çipe kadar gerekli olan yıkama solüsyonunun doğru miktarını gösteren yerleşik bir terazi içermektedir. Tampon miktarını kontrol etmek için lütfen bu teraziyi kullanın. Yıkama solüsyonu II'yi kullanmadan önce sıcaklık kontrollü bir su banyosunda en az 20 dakika süreyle 50 C'ye önceden ısıtın. Su banyosunun dolum seviyesinin yıkama solüsyonu II'nin dolum seviyesine eşit olmasını sağlayın. 25

26 Tablo 4: Yıkama solüsyonu karışımının hazırlanması Bu tabloda özetlenen hacimler belirtilen sayıdaki çipleri için üç yıkama adımı (yıkama çözücüleri I, II ve III) için de yeterlidir. çiplerinin sayısı Bileşenler Distile veya deiyonize su 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml Tampon A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml Tampon B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml Toplam hacim 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml! Muhtemelen sonuçlarına engel olacak yıkanmış PCR ürünlerinin birikmesine yol açacağından yıkama solüsyonlarını kesinlikle yeniden kullanmayın. Her miktar tayini için yeni yıkama solüsyonu kullanın. Hazırlanan yıkama solüsyonu karışımı oda sıcaklığında bir hafta süreyle saklanabilir. SDS çökeltisi meydana gelip gelmediğini kontrol edin. Çökelti meydana gelmişse, çökelti çözülene kadar yıkama solüsyonu karışımını ısıtın ve tekrar oda sıcaklığına dengeleyin. Daha sonra bir sonraki hibridizasyon deneyi için hazırlanın. 26

27 8.3.2 Hibridizasyon Hibridizasyon oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (20-25 C). PCR reaksiyonunun PCR ürünlerini çipine hibridize etmeye yönelik başlıca çalışma adımları Şekil 5'te gösterilmektedir. PCR ürünlerini kullanmadan önce karıştırın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. PCR ürünleri hibridizasyona kadar -20 C'de saklanmışsa PCR ürünlerini karıştırmadan önce çözün ve daha sonra belirtilen şekilde ilerleyin. Hibridizasyon Tamponuna kullanmadan önce vorteks uygulayın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. 30 µl Hibridizasyon Tamponunu 8x PCR şeridin yeni reaksiyon tüpünde 5 µl PCR ürünü ile vorteks uygulayarak veya birkaç kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek karıştırın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. 25 µl hibridizasyon karışımını, çok kanallı bir pipetin altı kanalını kullanarak her bir çip kuyucuğuna aktarın. Hava kabarcığı oluşmasını önleyin! 8 kanallı multipipet ve 8x PCR şeridi kullanılarak altı numunenin paralel bir şekilde işlenmesi önerilir (bkz. Şekil 5). Bu kullanım etkinliğini, hızını arttırır ve böylece buharlaşma riskini azaltır. Bir seferde birden fazla slaytın işlenmesi gerekiyorsa multipipet kullanımı, doğru hibridizasyon süresinin elde edilmesi için zorunludur. Mümkün olursa bir çipin 12 kuyucuğunu hibridize edin. 12'den daha az numunenin işlenmesi durumunda kullanılmamış kuyucukları boş bırakın. İşlenmiş bir çipte kullanılmamış kuyucuklar gelecek numuneler için kullanılamaz.! Hibridizasyon karışımının dökülmesini önlemek için çipi dikkatli bir şekilde kullanın. Dökülme numunelerin çapraz kontaminasyonuna ve hatalı pozitif sonuçlara neden olabilir. Çipi, karanlık, neme doygun bir ortamda, hazırlanmış bir Hibridizasyon Odası içinde oda sıcaklığında (20-25 C) tam olarak 15 dakika süreyle inkübe edin. Hibridizasyon sırasında Hibridizasyon Odasını hareket ettirmemeye dikkat edin.! İnkübasyon zamanını veya hibridizasyon reaksiyonunun sıcaklığını kesinlikle değiştirmeyin, bu floresan sinyal yoğunluğunun kaybolmasına veya spesifik olmayan floresanda artışa neden olabilir. Hibridize edilen çipleri doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın. 27