TANI KİTLERİ. Murat Topuzoğulları

Transkript

1 TANI KİTLERİ Murat Topuzoğulları C.-M. Cheng, C.-M. Kuan, C.-F. Chen, «In-Vitro Diagnostic Devices Introduction to Current Point-of-Care Diagnostic Devices», Springer International Publishing Switzerland 2016

2 Genel Bilgi Hastalık tanısı, Hastalıkların ilerleyişi, Tedavinin takibi, Hastalığın yayılmasının takibinin yapılması için tanı (teşhis) işleminin gerçekleştirilmesi elzemdir.

3 Genel Bilgi Klasik tanı teknolojileri; Karmaşık numune saflaştırma işlemleri, Çalıştırılması için iş gücü ve zaman gerektiren pahalı tanı ekipmanları, Kalifiye eleman, gerektirmektedir.

4 Genel Bilgi Daha hızlı, Yüksek doğruluğa sahip, Laboratuvar ekipmanı gerektirmeyen, Kullanımı için eğitim gerektirmeyen tanı sistemleri günümüzde istenmektedir. Ayrıca günümüzde, Hasta yatağındayken, Hastane dışındayken, Kaza yerindeyken, tanı işleminin gerçekleştirilmesi istenmektedir (POC, point of care).

5 Genel Bilgi POC konsepti, Kısa analiz süresi, Örnek hazırlama işleminin olmaması veya çok kısa olması, En az miktarda analiz reaktanı gerekliliği, Kullanıcı dostu analitik ekipman, Dijital veya görsel olarak kantitatif ya da yarı-kantitatif sonuç alımını içermektedir.

6 Genel Bilgi Bilinen ilk POC cihazı 1957 de geliştirilen idrardaki proteini saptayan bir kitti. Günümüzde en bilinen ve en çok kullanılan tanı kitleri ise glukozmetreler ve gebelik testleridir.

7 Genel Bilgi Gebelik testi «lateral» akışlı test stripleri için en iyi örnektir. Bu testte, idrardaki insan koriyonik gonatropin tayini gerçekleştirilmektedir. Bu striplerin geliştirilebilmesini; membranlar, antikor üretimi ve üretim proses teknolojilerinin gelişmesi sağlamıştır.

8 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay)

9 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Bu yöntemde; Test örneği stripin ucuna, absorbent pede, damlatılır. Örnek konjuge pede doğru ilerler. Konjuge pedde işaretli reaktanlar bulunur. Örneğin; kolloidal altın, renkli/fluresan/paramanyetik lateks partikülleri. Reaktanlar, örneğin yapısına göre antijen veya antikor esaslı olabilir. Örnek, reaktanla etkileşime girerek onu ve partikülü harekete geçirir. Bu karışım reaksiyon matriksine girer. Reaksiyon matriksinde, test çeşidine göre, antikor veya antijen immobilize haldedir. Bu moleküller membranın üzerinde belirgin bir çizgi halinde yerleştirilmiştir. Genelde; antijen yada antikordurlar.

10 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Bu yöntemde; Reaksiyon matriksinde, işaretleyici ile bağlı örnek buradaki molekül tarafından tutunurlar. Aşırı sıvı absorbent ped tarafından emilir. Sonuç olarak, gözle veya bir cihazla saptanabilen bir çizgi oluşumu takip edilir.

11 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) LFIA iki sınıfa ayrılabilir: Direkt yöntem Kompetitif (inhibisyon) yöntem

12 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Direkt yöntem Kompetitif (inhibisyon) yöntem Genelde büyük moleküller için kullanılır. Çizgi oluşumu pozitif yanıt verir. Genelde tek antijenik determinantı olan küçük moleküllerde kullanılır. Çizgi oluşumu negatif yanıt verir.

13 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Avantajları Bilinen bir teknolojidir. Üretim diğerlerine göre kolaydır. Ekipman ve prosesler zaten geliştirilmiştir ve piyasada bulunmaktadır. Yüksek miktarlarda üretilebilir. Oda sıcaklığında y saklanabilir. Kullanımı kolaydır. Küçük hacimlerde örnek yeterli olur. Elektronik devrelerle, okuyucu sistemlerle entegre edilebilir. Hassasiyeti ve spesifikliği yüksektir. Geliştirilmesi ve onaylanması gerekli maliyet ve zaman azdır. Piyasada zaten bilinen ürünler oldukları için kabul edilmeleri kolaydır. Kullanıcıya eğitim vermeye gerek yoktur.

14 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Antikorlar Çalışmaya uygun antikorların temin edilmesi gerekmektedir. LFIA da kullanılan antikor miktarı her bir strip için yaklaşık g/cm 2 iken bu değer ELISA testleride 0,3 g/cm 2 dir. Antijen-antikor afinitesi yüksek olmalıdır. Çünkü akış hızı 0,16-0,66 mm/sn dir. Antijenle immobilize antikorun etkileşmesi için yaklaşık 1-6 sn süre bulunmaktadır.

15 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) İşaretleyiciler Farklı metotlarla saptanabilmeli. Konjuge edildiğinde aktivitesi değişmemeli. Tampon, tuz veya deterjan içeren çözeltilerde spesifik olmayan bağlar yapmamalı Farklı sıcaklıklarda çalışabilmeli Düşük maliyetli olmalı. Konjugasyon prosedürü kolay olmalı. Farklı analitler için de kullanılabilmeli.

16 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) İşaretleyiciler Lipozomlar: Çok yüksek konsantrasyonlarda sinyal oluşturan molekül taşıyabilirler. Kolloidal Karbon: Konjugasyonu çok kolaydır. Ucuzdur. Kolloidal Altın: Günümüzde en çok kullanılan işaretleyicidir. Oluşan renk gözle görülebilir. Büyük moleküllü örnekler için idealdir. Kuantum Noktalar: En yüksek sinyal değerleri elde edilebilir. Hassasiyeti ve spesifikliği yüksektir. Vd.

17 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Membranlar LFIA testerinin en önemli kısmı membranlardır. Nitroselüloz membranlar kullanılmaktadır. Şu özelliklere sahip olmalıdır: Uygun miktarda proteinin bağlanmasına imkan vermelidir. Membran bloklanması yapılabilmelidir. Bu sayede spesifik olmayan bağlanmalar engellenebilmektedir. Membranın raf ömrü.

18 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Uygulamalar Tıbbi teşhis Hayvan sağlığı Gıda güvenliği Sanayi Çevre Tarım Adli bilimler Askeri/Biyosavunma

19 LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Uygulamalar

20 . LFIA (Lateral Akışlı Immunoassay) Uygulamalar Altın nanopartiküller gebelik, madde bağımlılığı gibi birçok testte kullanılmaktadır. LFIA lar ile tek bir kitte çoklu tayin yapılabilmektedir. LFIA lar, Δ9-tetrahydrocannabinol (THC), ametaminler, benzodiazepines, kokain, morfin, eroin, opiate, ve cannabis tanısında kullanılmaktadır. LC-MS/MS veya GC-MS/MS gibi karmaşık sistemlerle tayini yapılabilecek analitlerin tayini de günümüzde LFIA kitleriyle yapılabilmektedir. Nükleik asit tayini de bu yöntemle antikorlu veya antikorsuz olarak yapılabilmektedir.

21 Günümüzde birçok kompakt sistem tanı amacıyla kullanılmaktadır: DNA mikrodiziler, PCR çipleri, Peptid ve oligonükleotid kütüphaneleri, Hücre kültürü, vb. Tüm bu yöntemler minyatürize edilmiş ve çok çeşitli yapılarda üretilebilen Lab-on-a-Chip sistemlerini içeren in-vitro tanı kitlerindeki büyük ilerlemeyi göstermektedir.

22 Günümüzde birçok kompakt sistem tanı amacıyla kullanılmaktadır: DNA mikrodiziler, PCR çipleri, Peprid ve oligonükleotid kütüphaneleri, Hücre kültürü, vb. Tüm bu yöntemler minyatürize edilmiş ve çok çeşitli yapılarda üretilebilen Lab-on-a-Chip (LOC) sistemlerini içeren in-vitro tanı kitlerindeki büyük ilerlemeyi göstermektedir.

23 LOC lerin uygun bir malzeme kullanılarak üretilmeli ve üzerindeki akış kontrolü sağlanarak; örnek hazırlama, ayırma, reaktan saklama, metabolit ve moleküllerin saptanması, işlemlerinin tamamını veya bir kısmını yapabilmesi gerekmektedir.

24 LOC lerin Üretiminde Kullanılan Malzemeler

25 LOC lerin Üretiminde Kullanılan Malzemeler PDMS: En çok kullanılan malzemedir. Üretimi, şekillendirmesi ve bağlama işlemleri kolaydır. Hidrofobikliği yüksektir ama plazma işlemiyle hidrofilik hale getirilebilir. Kimyasal reaktivitesi düşüktür. Toksik değildir, biyouyumludur ve gaz geçirgenliği yüksektir. En önemli dezavantajı, diğer polimerik malzemeler kadar sertliğe sahip değildir.

26 LOC lerin Üretiminde Kullanılan Malzemeler COP: Kimyasallara çok dayanıklı, biyouyumlu, UV-VIS ışığı geçiren ve rijit bir malzemedir. Su absorpsiyonu, gaz ve nem geçirgenliği ise düşüktür. Sadece non-polar organik çözücülerle etkileşime girdiğinden; çip üzerinde yapılcak ayırma, ekstraksiyon, yıkama gibi işlemlere oldukça dayanıklıdır. Ilık geçirgenliğinden ötürü lens olarak kullanım potansiyeli çok yüksektir.

27 LOC Üretim Prosesleri Soft Lithography

28 LOC Üretim Prosesleri Enjeksiyon Kalıplama

29 LOC Üretim Prosesleri Sıcakta Kabartma

30 LOC Üretim Prosesleri Nanoimprint (Nanobaskı) Litografi

31 LOC Üretim Prosesleri Direkt İşleme

32 LOC Üretim Prosesleri Lazer Baskılı Mikroakışkan Cihazlar Genelde kağıt ve toner esaslı mikroakışkan sistemlerin üretiminde kullanılmaktadır. Genelde polyester katman üzerine lazerle toner tabakası oluşturulur. PT çipleri olarak bilinirler. DNA çiplerinin üretiminde sıkça kullanılmaktadır.

33 LOC Cihazlarının Birleştirilmesi Yapıştırıcı ile Birleştirme Isıyla Birleştirme Solventle Birleştirme Kaynak Yapma

34 Akışkan Kontrolü - Valfler Çok işlevli (inkübasyon, ayırma, karıştırma, çoklu reaksiyon basamağı, vb.) LOC ler için akışkan davranuşını kontrol etmek için gerekmektedir. Pasif ve aktif valfler bulunmaktadır. Pasif valfler LOC nin geometrik tasarımı ve yüzeyin modifikasyonu ile çalışmaktadırlar. Aktif valfler ise manyetik, piezoelektrik, elektrostatik, faz değişimi, mekanik, şekil hafızalı malzemeler veya pnömatik esaslı olabilir.

35 Akışkan Kontrolü - Valfler Pnömatik valfler en çok kullanılan valflerdir. Bu sistemde bir gaz basıncı, ince elastomerik bir membrana uygulanarak akışkan akımı kontrol edilir. Ayrıca Braille sistemi veya vidalar kullanılarak da valfler geliştirilmektedir.

36 Akışkan Kontrolü - Pompalar Enjektör pompaları, diyafram pompaları, rotari pompalar ve peristaltik pompalar minyatürize edilerek LOC lere entegre edilebildiği gibi parmakla, kimyasa tetiklemeyle veya elektrokinetik yöntemlerle de çalışan pompalar da LOC lere eklenebilektedir. Sanrifüjde döndürme yöntemi de LOC ler de kullanılan diğer önemli bir pompa yöntemidir.

37 Akışkan Kontrolü - Karıştırıcılar Mikroakışkanlı LOC lerde karıştırma işlemi için özel karıştırıcı hatların eklenmesi gerekmektedir. Çünkü mikroakışkan sistemlerde Reynolds sayısı 1 den küçüktür ve laminer akım vardır. Bu sebeple eğer özel bi işlem yapılmazsa sadece dizüzyonla karışma olur, bu da işlemi oldukça geciktirir. LOC lerde çeşitli aktif ve pasif karıştırma işlemleri yapılabilmektedir.

38 Akışkan Kontrolü - Karıştırıcılar Aktif karıştırma işlemi manyetik taneciklerle ve hava kabarcıkları gibi dış etkenklerle yapılabilmektedir. Pasif karıştırmada ise uygun mikroyapılar hazırlanarak kaotik akış sağlanmaktadır. Ayrıca akışkan yoluna engeller ve kavisli yollar eklerek de karışma yapılabilmektedir.

39 Uygulamalar Örnek Hazırlama Birçok analiz işleminde, sinyal değerini arttırabilmek için, vücut sıvısındaki analit dışında kalan bileşenlerin uzaklaştırılması gerekmektedir. Bu sebeple LOC sistemlerine filtrasyon, saflaştırma, konsantre etme ve fraksiyonlama amaçlı parçalar eklenmekedir.

40 Uygulamalar Örnek Hazırlama Örneğin, liziz işlemi kimyasal veya mekanik yollarla yapılabilmektedir. Mekanik yolla liziz işlemi için LOC ye fonksiyonel bilyalar eklenmektedir.

41 Uygulamalar Ayırma İşlemleri Bugüne kaadr birçok ayırma işlemi LOC lere adapte edilmiştir. Sıvı-sıvı ve katı-sıvı ekstraksiyonu, Kapiler elektroforez, İzoelektrik fokuslama, Optik «tweezer»lar Manyetik parçacıklar Boyuta göre ayırma, Vb.

42 Uygulamalar Ayırma İşlemleri Şekilde görüldüğü üzere PMMA esaslı bir ters faz kromatografi sistemi LOC ye adapte edilebilmektedir. Yada, boyut esasına göre kandaki hücreler ayrılabilmektedir. Antikor kaplı altın nanopartiküller veya manyetik partiküller de ayırma amacıyla, özellikle hücrelerin ayrılmasında, kullanılabilmektedir.

43 Uygulamalar Reaktan Saklama Reaktanlar genelde kurutulmuş şekilde LOC lere yüklenmektedir. Raf ömürlerini uzatmak için kurutulmuş biyomoleküller dextran, PEG gibi polimerlerle kaplanmaktadır. Ancak polimerler kaplama işlemi sonrasında aktivite kaybı olmamalıdır. Ancak DNA ekstraksiyonu gibi işlemler için sıvı reaktanların saklanması gerekebilmektedir. Bu sıvılar cam ampullerde veya valflerle kapatılmış haznelerde uzun süreli olarak tutulabilmektedirler.

44 Metabolit ve Küçük Molekül Tayini En çok bilinen ve kullanılanı kan glukozu ölçen LOC lerdir. Günümüzde bu testin hassasiyetini arttırmak için grafen, karbon nanotüpler ve metalik nanopartiküller kullanılmaktadır. Ayrıca; kolesterol ve trigliseridlerin ölçümü kardiyovasküler sistemler için önemlidir. Diğer önemli bir uygulama da kreatinin ölçümüdür. Böbrek fonksiyonlarının takibini sağlamaktadır. Nefesteki amonyak miktarı üremi ve böbrek rahatsızlığını göstermektedir ve önemli bir hedef moleküldür.

45 DNA ve RNA Esaslı Tayinler DNA ve RNA esaslı testler için genelde PCR ve ve benzeri yöntemlerle nükleotidlerin çoğaltılması gerekmektedir. Lab koşullarında PCR, pahalı ve zaman gerektiren yöntemlerdir. LOC kullanarak çok daha kısa süre ve çok daha az miktarlarda sarfiyat yapılır.

46 DNA ve RNA Esaslı Tayinler

47 Protein Esaslı Tayinler Bu tayinler daha çok ELISA yöntemi (LFIA) esasına göer çalışmaktadır. En çok kolorimetrik ve floresans görüntüleme yapılmaktadır. Hassasiyetin arttırılması için altın nanopartiküller (ANP) kullanılmaktadır. Plazmon etkisi sebebiyle daha yüksek sinyal vermektedir. Ayrıca ANP ve yeşil floresan proteinler beraber kullanılarak hassasiyet daha da arttırılabilmektedir.

48 Hücresel Tayinler Spesifik hücrelerin tanımlanması hastalık teşhisi için büyük öneme sahiptir. Genelde işaretli antikor, protein veya aptamerlerin hücrelere bağlanması esasına dayanmaktadır.

49 Hücresel Tayinler

50 Düşük Maliyetli Tanı Teknolojileri Tanı kitleri ücra noktalarda bile kullanılabilmesi ve herkesi sağlık uygulamalarına ulaşailmesi için bu teknolojiler büyük önem taşımaktadır. Ancak ucuz olmasının yanında bu teknolojide biyouyumlu malzemelerin kullanılması gerekmektedir. Bu sebeplerle aşağıdaki yöntemler geliştirilmektedir: Kağıt Esaslı Mikroakışkan Sistemler Pamuk Esaslı Mikroakışkan Sistemler

51 Düşük Maliyetli Tanı Teknolojileri Kağıt Esaslı Mikroakışkan Sistemler (μpad) Kağıt ucuz, hafif ve kolayca saklanabilirdir. Ucuzdur. Çevreye zararsızdır. Kolorimetrik analiz için çok uygundur. İnce olduğu için çok az miktarda örnekle çalışılabilir. Kimyasal modifikasyonu kolaydır. Mum benzeri malzemelerle kaplanarak hidrofobik yapılabilir. Mikroakışkan kanalları üzerinde açılabilir.

52 Düşük Maliyetli Tanı Teknolojileri Kağıt Esaslı Mikroakışkan Sistemler

53 Düşük Maliyetli Tanı Teknolojileri Kağıt Esaslı Mikroakışkan Sistemler Bu sistemlerde öncelikle hidrofob duvarların oluşturulması gerekmektedir. Bu amaçla aşağıdaki yöntemler kullanılmaktadır. Mum (wax) baskılama Plazma yöntemi UV ışık Lazer basklı toner fimleriyle, Lazer

54 Düşük Maliyetli Tanı Teknolojileri Kağıt Esaslı Mikroakışkan Sistemler Görüntüleme yöntemleri Kolorimetrik, Floresans Elektrokimyasal Elektrokemiluminesans Raman spektroskopisi