T.C SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GÖLLER BÖLGESİNDEKİ ŞEKER PANCARI ÜRETİM ALANLARINDA RHİZOMANİA HASTALIĞININ BELİRLENMESİ ÜZERİNE ARAŞTIRMALAR Handan ÇULAL KILIÇ Danışman: Doç. Dr. Nejla YARDIMCI DOKTORA TEZİ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ISPARTA

2 TEZ ONAYI Handan ÇULAL KILIÇ tarafından hazırlanan Göller Bölgesindeki Şeker Pancarı Üretim Alanlarında Rhizomania Hastalığının Belirlenmesi Üzerine Araştırmalar adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Süleyman Demirel Üniversitesi Bitki Koruma Anabilim Dalı nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Doç. Dr. Nejla YARDIMCI (Süleyman Demirel Üniversitesi, Bitki Koruma Anabilim Dalı) (İmza) Jüri Üyeleri: Prof. Dr. Serap AÇIKGÖZ (Adnan Menderes Üniversitesi, Bitki Koruma Anabilim Dalı) Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU (Çukurova Üniversitesi, Bitki Koruma Anabilim Dalı) Doç Dr. Gürsel KARACA (Süleyman Demirel Üniversitesi, Bitki Koruma Anabilim Dalı) Doç. Dr. Bayram ÇEVİK (Süleyman Demirel Üniversitesi, Bitki Koruma Anabilim Dalı) (İmza) (İmza) (İmza) (İmza) Prof Dr. Mustafa KUŞÇU Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER.. i ÖZET iii ABSTRACT. iv TEŞEKKÜR. v ŞEKİLLER DİZİNİ. vi ÇİZELGELER DİZİNİ viii 1.GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ 9 3. MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Çalışma bölgesi hakkında bilgi Toprak örneklerinin alınması Şeker pancarı tohumlarının sağlanması Mekaniksel inokulasyon çalışmalarında kullanılan materyaller Polymyxa betae nın varlığının araştırılması sırasında kullanılan materyaller DAS-ELISA testinde kullanılan materyaller Total RNA ekstraksiyonu çalışmalarında kullanılan materyaller RT-PCR çalışmalarında kullanılan materyaller Agaroz jel elektroforez çalışmalarında kullanılan materyaller Yöntem Toprak örneklerinin alınması ve gözlemler Tuzak bitkilerinin yetiştirilmesi Test bitkilerinin yetiştirilmesi Test bitkilerine mekaniksel inokulasyon yöntemi Pancar köklerinde Polymyxa betae nın varlığının araştırılması DAS-ELISA testinin uygulanması ELISA testi sonuçlarının değerlendirilmesi Total RNA izolasyonu Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu i

4 Nested ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu Immunocapture ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu PCR çalışmalarında kullanılan kontroller Agaroz jelin hazırlanması ARAŞTIRMA BULGULARI Survey Çalışmaları Tuzak Bitki Test Yöntemi Mekaniksel İnokulasyon Çalışmaları Pancar Köklerinde Polymyxa betae nın Varlığının Araştırılması DAS-ELISA Testi Sonuçları Moleküler Çalışmaların Sonuçları Nükleik asit izolasyonu Uygun primer konsantrasyonlarının belirlenmesi Uygun MgCl 2 konsantrasyonunun belirlenmesi RT-PCR çalışmalarının sonuçları Nested RT-PCR çalışmalarının sonuçları Immunocapture RT-PCR çalışmalarının sonuçları TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR. 79 ÖZGEÇMİŞ.. 89 ii

5 ÖZET Doktora Tezi GÖLLER BÖLGESİNDEKİ ŞEKER PANCARI ÜRETİM ALANLARINDA RHİZOMANİA HASTALIĞININ BELİRLENMESİ ÜZERİNE ARAŞTIRMALAR Handan ÇULAL KILIÇ Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Nejla YARDIMCI Bu çalışma Isparta, Burdur, Afyon, Denizli illerinde bulunan şeker pancarı üretim alanlarında yılları arasında yürütülmüştür. Üretim alanlarına yapılan surveyler sırasında şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsünün (Beet necrotic yellow vein virus=bnyvv) simptomlarının gözlenmesi araştırmayı bu doğrultuda yönlendirmiştir. Bu amaçla survey alanlarında 203 adet toprak örneği toplanmıştır. Toplanan toprak örneklerinde Kasandra çeşiti şeker pancarı yetiştirilmiş ve 9 haftalık yetişme süresi sonunda hasat edilmiştir. Hasat edilen şeker pancarı bitkileri biyolojik, serolojik ve moleküler çalışmalarda kullanılmıştır. Virüsün tanılama çalışmalarında tuzak bitki yöntemi, mekaniksel inokulasyon çalışmaları, Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay (DAS-ELISA), Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu( RT-PCR), nested ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (nrt-pcr), immunocapture ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu yöntemleri kullanılmıştır. Ayrıca çalışmada üç PCR yönteminin bu virüs için kullanılabilirliği ve hassasiyeti araştırılmıştır. Hassas test bitkilerine mekaniksel inokulasyon sonucunda BNYVV için tipik belirtiler gözlenmiştir. DAS-ELISA testi sonucunda alınan toprak örneklerinde BNYVV nün hastalık oranı % olarak belirlenirken, uygulanan üç PCR yöntemi ile alınan örneklerdeki hastalık oranı % olarak belirlenmiştir. Yapılan çalışmalarla PCR yöntemlerinin BNYVV nün teşhisi için kullanılabileceği ancak Immunocapture RT-PCR yönteminin diğer iki yönteme göre daha hassas olduğu saptanmıştır. Vektör fungus olan Polymyxa betae (Keskin) nin oluşturduğu spor yapılarının tespiti için tuzak bitkilerin kökleri asit fuksin içeren laktofenol boya ile boyanmış ve sistosoriler gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Şeker pancarı, Beet necrotic yellow vein virus, Rhizomania DAS-ELISA, moleküler teşhis. 2010, 91 sayfa iii

6 ABSTRACT Ph.D. Thesis THE INVESTIGATION OF RHIZOMANIA DISEASES IN SUGAR BEET GROWING AREAS IN THE LAKE DISTRICT Handan ÇULAL KILIÇ Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Assoc.Prof.Dr. Nejla YARDIMCI This study was carry out in Isparta, Burdur, Afyon, Denizli provinces between years of 2006 and Due to high occurence of Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) symptoms in field surveys the study mainly focused on identification of this virus in sugar beet area. For this purpose, 203 soil samples were collected from the research area. Sugar beet cultivar Kasandra was sown in to soil samples as bait plant and harvested after nine weeks of growth period. Harvested sugar beet plants was used for biological, serological and molecular methods. Different identification methods including bait plant test, mechanical inoculation to indicator plants, Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay (DAS-ELISA), Reverse transcription polimerase chain reaction (RT-PCR), nested reverse transcription polimerase chain reaction, immunocapture reverse transcription polimerase chain reaction were used for virus detection. Furthermore, The applicability and sensitivity of three PCR methods for BNYVV detection were investigated. The virus was transmitted to sensitive test plants by mechanical inoculations. These plants produced typical BNYVV symptoms. The diseases incidence, as percentage of collected soil samples for BNYVV, was found % by DAS-ELISA and % by three PCR methods. It was found that the all three PCR methods evaluated in this study can be used for detection of BNYVV but immunocapture RT-PCR method was found to be more sensitive than other PCR methods. In order to determine the fungal structures of the vector fungus Polymyxa betae (Keskin) for bait plant roots were stained in acid fuccin lacto phenol and examined the fungal cystosori with a light microscope. Key Words: Sugar beet, Beet necrotic yellow vein virus, Rhizomania, DAS-ELISA, molecular detection 2010, 91 pages iv

7 TEŞEKKÜR Çalışmam da her türlü bilgi, deneyim ve yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Doç. Dr. Nejla YARDIMCI ya, tez izleme komitesinde yer alan sayın Prof. Dr. Serap AÇIKGÖZ ve Doç. Dr. Bayram ÇEVİK e tezimin her aşamasını değerlendirerek yapıcı eleştirilerde bulundukları için çok teşekkür ederim. Arazi çalışmalarım sırasında rehberlik eden Türkiye Şeker Fabrikaları A.Ş. personeli Dr. Rıza KAYA ya teşekkür ederim. ELISA çalışmalarımda örneklerin hazırlanmasında yardımını esirgemeyen ziraat yüksek mühendisi Medine KAYA ya, PCR çalışmalarımda her zaman yanımda olan arkadaşım ziraat yüksek mühendisi Meryem ATEŞ e teşekkürü bir borç bilirim. Ayrıca fungus teşhis çalışmalarımda ve arazi çalışmalarımda yardımcı olan arkadaşım Yrd. Doç. Dr. Hülya ÖZGÖNEN e teşekkür ederim. Doktora çalışmam sırasında maddi ve manevi hiçbir desteği esirgemeyen, bu süre zarfında sonsuz sabır ve anlayış gösteren annem, ablam ve eşim Hakan KILIÇ a, daha doğmadan PCR çalışmalarımda bana destek olan canım kızım Diloş uma sonsuz teşekkürlerimi sunarım D-07 nolu proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi, Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na teşekkür ederim. Handan ÇULAL KILIÇ ISPARTA, 2010 v

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. BNYVV nün genom organizasyonu 23 Şekil 3.1 Araştırmanın yürütüldüğü bölgeler.. 24 Şekil 3.2. Tuzak bitkilerin yetiştirilmesi Şekil 3.3. Bitki dokusundan total RNA izolasyonu 36 Şekil 3.4. Immunocapture RT-PCR ın şematik anlatımı. 41 Şekil 4.1. Rhizomania hastalığının tarladaki genel görünümü Şekil 4.2. Rhizomania ile infekteli şeker pancarı bitkisinin yapraklarının görüntüsü.. 45 Şekil 4.3. Rhizomania ile infekteli şeker pancarı yumrularının görüntüsü.. 45 Şekil 4.4. Rhizomania ile infekteli şeker pancarı bitkisinin yumru görünümü 46 Şekil 4.5. Rhizomania lı şeker pancarı köklerinde sakal görünümü.. 46 Şekil 4.6. Tuzak bitki test yöntemi uygulanan şeker pancarı bitkilerinin genel görünümü.. 47 Şekil 4.7. Tuzak bitki test yöntemi uygulanan şeker pancarı bitkisinde yumru görünümü 48 Şekil 4.8. BNYVV belirtisi gösteren şeker pancarı kökünden Chenopodium amaranticolor a yapılan mekanik inokulasyondan 5 gün sonra görülen belirtiler. 50 Şekil 4.9. Polymyxa betae nın tuzak bitkilerin köklerinde oluşturduğu sistosori Şekil ELISA Pleytinde pozitif ve negatif reaksiyon veren örneklerde meydana gelen renk değişimi Şekil Bazı BNYV izolatlarının RNA aktivite durumlarını gösteren jel fotoğrafı.. 62 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı. 63 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı. 64 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı. 64 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı. 65 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı. 65 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı. 66 vi

9 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı Şekil İzolatların Nested -PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı.. 68 Şekil İzolatların Nested -PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı. 69 Şekil İzolatların Nested -PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı.. 69 Şekil İzolatların Nested -PCR sonuçlarını gösteren jel fotoğrafı.. 71 vii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1. Mekanik inokulasyonda kullanılan test bitkileri Çizelge yılı Göller Bölgesindeki şeker pancarı ekim alanlarında örnek alınan bölgeler, toplam ekili alan, alınan örnek sayısı 28 Çizelge yılı Göller Bölgesindeki şeker pancarı ekim alanlarında örnek alınan bölgeler, toplam ekili alan, alınan örnek sayısı 29 Çizelge 3.4. RT-PCR çalışmalarında kullanılan primerler 37 Çizelge 3.5. RT-PCR reaksiyon karışımının içerikleri.. 38 Çizelge 3.6. Nested RT-PCR reaksiyon karışımının içerikleri.. 39 Çizelge 4.1. BNYVV nün test bitkilerinde oluşturduğu belirtiler. 49 Çizelge yılı tuzak bitkilerine uygulanan DAS-ELISA testi absorbans değerleri.. 51 Çizelge yılı tuzak bitkilerine uygulanan DAS-ELISA testi absorbans değerleri.. 55 Çizelge yılı Göller Bölgesi şeker pancar üretim alanlarından alınan örneklerde DAS-ELISA testi sonuçlarına göre BNYVV bulunma oranları 58 Çizelge yılı Göller Bölgesi şeker pancar üretim alanlarından alınan örneklerde DAS-ELISA testi sonuçlarına göre BNYVV bulunma oranı. 59 Çizelge 4.6. Göller Bölgesindeki şeker pancarı ekim alanlarında yıllara göre alınan örnek sayısı, BNYVV ile bulaşık örnek sayısı ve örneklerdeki hastalık oranı.. 60 Çizelge 4.7. RT-PCR uygulanan 2006 ve 2007 yılı izolatları. 63 Çizelge 4.8. Şeker pancarı izolatlarının RT-PCR sonuçları 67 Çizelge 4.9. Şeker pancarı izolatlarının nested RT-PCR sonuçları. 69 Çizelge Şeker pancarı izolatlarının immunocapture RT -PCR sonuçları. 71 viii

11 1. GİRİŞ İnsan yaşamının her döneminde önemli bir temel besin maddesi olan şeker, şeker pancarı ve şeker kamışından elde edilmektedir. Dünya şeker ihtiyacının yüzde 70'ini kamış şekeri ile karşılarken, bunu büyük oranda pancar ve diğer şeker türleri izlemektedir. (Keskin, 2003; Tan ve Ökten, 2008). Şeker pancarı kuzey yarım kürede ülkemizin de bulunduğu 30 güney- 60 kuzey enlemleri arasındaki farklı iklim kuşakları ve bölgelerde yetişmektedir (Morillo- Velarde, 1993). Chenopodiaceae (Kazayağıgiller) familyasının Beta cinsine ait olan şeker pancarı, Beta vulgaris var. saccharifera L. olarak adlandırılmaktadır (Kaya, 1999). Ekolojik olarak serin ya da soğuk iklim kuşağındaki ülkelerde üretilen şeker pancarında söz sahibi olan ülkeleri AB, ABD, Rusya ve Türkiye oluşturmaktadır. Söz konusu ülkeler dünya pancar şekeri üretiminin yaklaşık yüzde 70'ini karşılamaktadır. Ülkemizde yetiştirilen endüstri bitkileri içerisinde şeker pancarı önemli bir yere sahiptir. Türkiye de şeker pancarı tarımı, Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu Bölgeleri dışındaki beş bölgede yapılmaktadır. Ülkemizde şeker pancarı tarımın önemli bir parçası olup, 64 ilde, köyde yaklaşık 500 bin çiftçi ailesi tarafından şeker pancarı tarımı yapılmaktadır (Kıymaz, 2002). Ortadoğu ülkeleri toplam şeker pancarı üretiminde ise ülkemiz % 70 lik paya sahiptir. Ülkemizde toplam tarım alanı içerisinde yıllık şeker pancarı ekim alanı 2008 yılı verilerine göre hektar, üretim miktarı ise tondur. Ortalama pancar verimi kg/ha olarak belirlenmiştir (Anonim, 2010). Ülkemizde şeker pancarı tarımından, şeker üretiminin yanı sıra, melas, küspe ile yaprak ve baş artıkları gibi yan ürünlerinden de hayvan yemi elde edilmektedir. Aynı zamanda melas, alkol ve ispirto sanayisinde kullanılmaktadır (Şiray, 1990). 1

12 Şeker pancarı üretimi; bitkisel ve hayvansal üretimin gelişmesine, azami derecede endüstriyel girdiler kullanılmasına, toprakların fiziki yapıları ve ekolojik dengenin iyileşmesine katkı sağlamakta, kendinden sonra ekilecek ürünlerin verimlerini azami ölçüde arttırmaktadır (Kıymaz, 2002). Göller bölgesi bünyesinde barındırdığı uygun ekoloji ve mikroklima sayesinde şeker pancarı yetiştiriciliğinin yapıldığı önemli bir bölgemizdir yılı verilerine göre, Göller bölgesinde ha şeker pancarı ekimi yapılmış, ton pancar üretilmiştir. Bölgede, Burdur ili ha ve Afyon ha ile şeker pancarı üretiminde oldukça önemli bir yere sahiptir. Burdur ilinin hektara verim ortalaması kg iken Afyon ilinin kg dır. Bu değerler ile her iki ilinde hektara verim ortalaması Türkiye değerinin biraz üzerindedir. (Anonim, 2010). Şeker pancarı üretim alanlarında verimi, şeker miktarını ve kaliteyi sınırlayan faktörler arasında hastalıklar önemli bir yer tutmaktadır. Ekimden itibaren silolama dönemine kadar fungal, bakteriyel, viral toplam 82 hastalık şeker pancarına zarar vermektedir (Özgür, 2003). Fungal ve bakteriyel patojenlerden en önde gelenler; Cercospora yaprak lekesi (Cercospora beticola), Phoma yaprak leke hastalığı (Phoma betae ) Alternaria yaprak lekesi (Alternaria alternata, külleme (Erysiphe betae), kök çürüklükleri (Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium avenaceum, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Macrophomina phaseolina), beyaz çürüklük (Sclerotium rolfsii), Erwinia kök çürüklüğü (Erwinia carotovora subsp. betavasculorum) hastalıklarıdır (Karadimos et al., 2006; Özgönen ve Çulal- Kılıç, 2009; Anonymous, 2009a). Şeker pancarı üretim alanlarında görülen hastalıklardan virüs ve benzeri etmenlerin neden olduğu kayıplar zaman zaman ciddi boyutlara ulaşarak üretimi tehdit etmektedir. Şeker pancarı yaprak kıvırcıklık virüsü (Beet leaf curl virus= BLCV), şeker pancarı toprak kökenli mozayik virüsü (Beet soil-borne mosaic virus= BSBMV), şeker pancarı batı sarılık virüsü (Beet western yellow virus=bwyv), şeker pancarı tepe kıvırcıklık virüsü (Beet curly top virus= BCTV), şeker pancarı mozayik virüsü (Beet mosaic virus= BMV), şeker pancarı sarı cücelik virüsü (Beet 2

13 yellow stunt virus= BYSV) ve şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsü (Beet necrotic yellow vein virus=bnyvv), şeker pancarı Q virüsü (Beet Q virus= BQV), şeker pancarı toprak kökenli virüsü (Beet soil-borne virus= BSBV), pancar üretilen alanlarda görülen virüslerdir (Smith, 1972; Mouhanna et al., 2002; Lennefors, 2006). Bu virüsler arasında Şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsü (BNYVV), pancarda üretim ve kalite yönünden ciddi kayıplara yol açan ve dünyada şeker pancarı yetiştirilen tüm alanlarda bulunan bir virüstür (Suarez et al., 1999). Virüsün neden olduğu hastalığa pancar köklerinde aşırı kılcal kök oluşumuna yol açtığından kök azmanlığı-kök çılgınlığı anlamına gelen Rhizomania adı verilmiştir (Putz et al., 1990). Virüs, Polymyxa betae (Keskin) isimli toprak fungusunun zoosporları tarafından taşınmaktadır. Fungus, önceleri Myxomycota nın bir üyesi olarak gruplandırılırken, son yıllarda yapılan moleküler çalışmalar ile Protozoa aleminin Plasmodiophoromycetes sınıfına yerleştirilmiştir (Ward et al., 2003). Polymyxa betae (Keskin) ilk olarak Dr. Bahattin Keskin tarafından teşhis edilmiştir (Keskin, 1964). Blunt ve ark. (1991) dünyanın ılıman iklime sahip bölgelerindeki tarım arazilerinde yaygın olarak bulunan P. betae 'nin hastalığın ortaya çıkmasında, taşınmasında ve yayılmasında önemli rolü olduğunu bildirmişlerdir. Fungus toprakta çok uzun yıllar sporosori adı verilen kalın duvarlı spor kümeleri halinde kalabilmektedir. İnfekteli bitki köklerinde bulunan sistosori (kist) bitkinin çürümesiyle toprağa karışmaktadır. Bu dinlenme sporları çimlenerek primer zoosporları oluşturmaktadır. Primer zoosporlar bitki dokusuna temas etmeleri durumunda kamçılarını kaybederek enkist hale dönüşmekte ve yaklaşık 2 saat sonra zoosporların içeriği bitki dokusuna aktarılmaktadır. Eğer fungus virüs taşıyorsa içerikle birlikte virüste konukçu bitkiye aktarılmaktadır. Bitki dokusu içerisinde zoosporların çekirdekleri bölünmeye başlayarak plasmodiumu oluşturmaktadır. Bu plasmodiumdan ya sekonder zoosporların serbest kalacağı zoosporangium ya da 3

14 sporosorinin oluşacağı sporogenik plasmodium oluşmaktadır. Bir döngü yaklaşık 60 saat içerisinde tamamlanmaktadır (Rush, 2003). Rhizomania hastalığının en tipik belirtisi pancarda yan köklerin aşırı derecede çoğalması ve yumrunun sakallanmış gibi bir görüntü almasıdır. Hastalıklı bitkinin yapraklarında, damarlar boyunca sarı renk açılmaları ve yapraklarda dik gelişim görülmektedir. İleri dönemlerde yapraklardaki renk açılmaları koyulaşarak nekrotik alanları oluşturmaktadır (Whitney and Duffus, 1991). Hastalıklı bitkilerin şeker içeriğinde % 10, kök oluşumunda ise % 90 azalma meydana getirdiği bildirilmektedir (Lennefors, 2006). Kaya (2009), hastalığın kök veriminde % 90 oranında şeker veriminde ise % 70 azalmaya neden olduğunu ortaya koymuştur. İnfekteli alanlarda hastalık öbek öbek renk açılması şeklinde kendini göstermektedir. Toprak kuru veya sıcaklık yetersiz olduğunda kökler infeksiyon noktasında daralmakta ve kadeh şeklini almaktadırlar. Yumrulardan boyuna kesit alındığında iletim dokusunda kahverengi renk oluşumunun meydana geldiği ve bu yapıların odunsu bir hale dönüştüğü görülmektedir (Yılmaz ve Erkan, 2005). Rhizomania hastalığına genellikle drenajı yetersiz veya killi topraklar ile taban suyunun yüksek olduğu alanlarda rastlanılmaktadır. Hastalığın yayılmasında toprağın yanı sıra rüzgar, su, tarım alet ve makinaları etkili olmaktadır. Ayrıca patates, soğan, sarmısak gibi bitkilerin tarımı ve lahana, pırasa, domates, biber, marul ve kırmızı sofralık pancar gibi bitkilerin yetiştiriciliğinin yapılmasıda yayılmada etkili olmaktadır (Kaya, 1996). Asher ve Peck (1990), hastalığın yoğun olarak bulaşık olan çok az bir toprak parçası ile bile taşınabildiğini ve belirgin bir simptom oluşturmaksızın bitkilerde bulunabileceğini ifade etmektedir. Hastalığın yayılmasında sulama suyunun önemli rolünün olduğu, sulama kanallarının dibinde oluşan çamurda gerek virüsün gerekse vektörü olan fungusun en az bir yıl canlılığını sürdürebildiği bildirilmektedir (Yılmaz ve Erkan, 2005). 4

15 Campbell (1996), aşırı yağış ve salma sulama gibi yöntemler nedeni ile oluşan yüzey akıntılarının, vektör fungusun yayılmasını kolaylaştırdığını, ayrıca fungusun virüs ile bulaşık olması durumunda hastalığın bu şekilde hızla yayıldığını bildirmiştir. Şeker fabrikalarındaki yan ürünlerin özellikle buralardan sağlanan kuyruk uçları ile beslenen sığırların gübreleri temiz arazileri bulaştırmaktadır (Asher and Thompson, 1987). Bulaşık alanlarda rhizomania infeksiyonunu etkileyen ana faktörlerin, P. betae nın inokulum seviyesi, toprak sıcaklığı, toprak nemi (Asher and Blunt, 1987; Schlösser, 1988) ve ph (Abe, 1987) olduğu ifade edilmektedir. P. betae tarafından fide infeksiyonunun oluşması için optimal toprak sıcaklığın 25ºC olduğunu, 15ºC de infeksiyonun azaldığı ve 10ºC de ise enfeksiyon oluşumunun görülmediği bildirilmiştir (Blunt et al., 1991). Hastalığın bir kez temiz sahalara girdikten sonra mücadelesi çok zor olmaktadır. P. betae nın dinlenme sporlarında uzun süre yaşayabilen virüs çoğu Chenopodiaceae familyasına ait yabancı ot türlerinde canlılığını sürdürebildiği için üründe rotasyon uygulaması hastalığın kontrolü için etkili olmamaktadır (Barr, 1979; Hideo and Tamada,1986; Winner, 1984). Toprakta inokulum potansiyeli yavaş azaldığından rotasyon yetersiz kaldığı, çok uzun süreli bir rotasyon uygulamasının ise sadece bulaşıklık derecesindeki artışı azaltabildiği ifade edilmektedir (Tuitert, 1994; Schlösser, 1988). Günümüzde Rhizomania hastalığının en etkili kontrolü risk altında olan alanlarda dayanıklı çeşit ekimi ile yapılmaktadır. Bunun dışında, erken ekim, aşırı sulamadan kaçınma, ekim nöbeti gibi uygulamalar topraktaki virüs konsantrasyonunu düşürse de hastalığın kontrolünü tam olarak sağlayamamaktadır. Bu sebepten infekteli alanların belirlenmesi, etmenin tanılanması ve kültürel tedbirlerin alınması hastalığının kontrol açısından oldukça önem taşımaktadır (Mcgrann et al., 2009). Hastalık ilk kez 1950 lerde İtalya da rapor edilmiştir. Günümüzde ise Asya, Avrupa ve Amerika kıtalarında şeker pancarı yetiştiriciliği yapılan alanların büyük bir 5

16 kısmına yayılmış durumdadır (Putz et al., 1990; Suarez et al., 1999). Rhizomania hastalığı ülkemizde ilk kez 1987 yılında Dr. Koch tarafından Amasya Şeker fabrikasının Erbaa ve Taşova bölgeleri ile Alpullu Şeker fabrikasının Uzunköprü ve Keşan bölgelerinde saptanmıştır. Daha sonraları tarama çalışmalarına Alpullu, Turhal, Adapazarı, Ilgın, Kastamonu, Susurluk, Amasya, Eskişehir, Ankara ve Çarşamba şeker fabrikalarının ekim alanlarında devam edilmiştir (Özgür, 1995). Şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsü; önceleri Furovirus cinsi içerisinde yer alırken, 1997 yılında ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) tarafından yapılan bir düzenleme ile Benyvirus cinsine dahil edilmiştir (Pferdmenges, 2007). BNYVV, düz çubuk şeklinde ve tek iplikçikli RNA (+ ssrna) içermektedir. Virüsün genomu, genellikle RNA 1, RNA 2, RNA 3, RNA 4 olarak ifade edilen dört komponentten meydana gelmiştir. Ancak son yıllarda yapılan çalışmalarda bazı izolatların 5. RNA komponentini içerdiği tespit edilmiştir (Tamada et al., 1989; Koenig and Lennefors, 2000; Harju et al., 2005). Virüsün partikül büyüklükleri, 390, 265, 100, 85 nm uzunluğunda ve 20 nm enindedir. (Rush and Heidel, 1995). BNYVV genomunun tamamı nükleotidden oluşmuştur. RNA 1, 6746 nükleotid büyüklüğündedir. Etmenin en büyük RNA sıdır ve viral replikasyondan sorumludur. RNA 2, 4612 nükleotid büyüklüğündedir. Virüsün hücreden hücreye taşınmasından sorumludur. Ayrıca 75 kda büyüklüğündeki readthrough proteinini, kılıf proteinini ve 85 kda büyüklüğündeki polipeptidlerin şifresini içermektedir. RNA 3, 1175 nükleotidden oluşmuştur. Chenopodium quinoa gibi test bitkilerinin yapraklarında oluşan lokal lezyonlardan ve pancarın köklerinde oluşan simptomlardan sorumludur. RNA 4, 1431 nükleotidden oluşmuştur. Polymyxa betae (Keskin) vektörü ile taşınmadan sorumludur. RNA 5 ise simptomların şiddetlenmesinde rol oynamaktadır (Pferdmenges, 2007) (Şekil 2.1.). Şeker pancarı üretim alanlarında Rhizomania hastalığını belirlemek için en fazla kullanılan yöntem tuzak bitki yöntemidir. Tuzak bitki yöntemi, araziden alınan 6

17 şüpheli topraklarda hassas pancar çeşitlerinin yetiştirilerek bu bitkilere serolojik testler uygulanmasıyla yapılan bir tanılama yöntemidir. Her ne kadar bu yöntem oldukça zaman alıcı ve fazla iş gücü gerektiren bir yöntem olsa da arazideki BNYVV nün varlığı veya yokluğu hakkında kesin sonucu verebilmektedir (Rush and Heidel, 1995; Tamada and Baba, 1973; Beemster and De Heij, 1987). BNYVV nün teşhisinde yaygın olarak kullanılan en kesin ve etkili yöntemin ELISA testi olduğu bildirilse de virüs konsantrasyonunun düşük olması durumunda sonuçların doğruluğu etkilenmektedir (Hecht, 1989; Nolasco et al., 1993). Bazı araştırıcılar tarafından serolojik testlerde şeker pancarı bitkisinin yaprakları kullanılmakla birlikte virüsün yapraklara zor ulaşması nedeniyle, testlerde daha ziyade şüpheli bitkilerin yan köklerinden ve kuyruk ucundan alınan özsuyu tercih edilmiştir (Özgür, 1995; Jezewska and Piszczek, 2001). Son yıllarda moleküler biyoloji ve biyoteknoloji alanında görülen gelişmelere paralel olarak bitki virüs hastalıklarının tanılanmasında da moleküler yöntemler kullanılmaya başlanmıştır (Makkouk and Kumari, 2006). Rush vd. (1994) ve Wisler vd. (1994), Rhizomania hastalığının tanılanmasında nükleik asit hibridizasyon ve PCR tekniklerini geliştirmişlerdir. PCR yöntemi, DNA veya RNA üzerinde seçilen bölgenin, spesifik bir çift primer ve Taq polimeraz enzimi kullanılarak çoğaltılması işlemidir. ELISA dan daha hassas ve daha spesifiktir. Sağlıklı bitkilerden infekteli olanların ayrımı kesin ve doğru olarak yapılabilmektedir (Rush and Heidel, 1995). Günümüze kadar Göller Bölgesinde bulunan şeker pancarı üretim alanlarında Rhizomania hastalığının varlığına yönelik kapsamlı bir çalışma yapılmamıştır. Bu çalışmada şeker pancarı üretim alanlarında Rhizomania hastalığının varlığı araştırılmıştır. Toprak örneklerinde şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsünün vektörü olan Polymyxa betae nin bulunduğu belirlenmiştir. Virüsün tanılanması amacıyla farklı çalışmalar yürütülmüştür. Tuzak bitki yöntemi, mekaniksel inokulasyon çalışmaları ve serolojik testler ile bölgedeki şeker pancarı üretim 7

18 alanlarında bu virüsün varlığı belirlenmiştir. Çalışmada ayrıca Rhizomania hastalığının tanılanmasında kullanılan farklı PCR tekniklerinin kullanılabilirliği ve hassasiyeti ortaya konmuştur. 8

19 2. KAYNAK ÖZETLERİ Şeker pancarının en önemli viral hastalıklarından biri olan şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsü ile ilgili yapılan çalışmalar aşağıda özet halinde verilmiştir. BNYVV, ilk kez 1952 yılında Canova tarafından İtalya da rapor edilmiştir (Canova, 1959). Daha sonra hastalık Asya, Amerika, Güney ve Merkez Avrupa ve İskandinavya ülkelerinde hızla yayılmıştır (Asher, 1999) da Canova şeker pancarı köklerinden virüsü izole etmeyi başarmış ve bu virüse A virüsü adını vermiştir. Daha sonra Tamada ve Baba (1973) şeker pancarı bitkisinden çubuk şekilli virüs partiküllerini izole ederek virüsü Beet necrotic yellow vein virus olarak isimlendirmişlerdir. Virüsün neden olduğu kök simptomundan dolayı Rhizomania adı verilmiştir (Putz et al., 1990). BNYVV ü şeker pancarında önemli oranda verim düşmesine bu bitkinin tarımının ekonomik olmaktan çıkarak terk edilmesine neden olabilmektedir. BNYVV nin kök ağırlığında, şeker içeriğinde ve genel olarak ürün miktarında belli oranlarda azalmaya neden olduğu çeşitli araştırıcılar tarafından ortaya konmuştur. Richard- Molard (1985) ile Asher ve Peck (1990) de hastalığın % 50 oranında şeker kaybına neden olduğunu, Henry (1996) ise kök ağırlığının ve şeker içeriğinin sırayla % 50, % 8-48 oranında azaldığını saptamışlardır. Winner (1984), hastalığın yaygın olduğu alanlarda şeker pancarında % 30 dan fazla verim kaybına neden olduğunu belirtirken, Whitney ve Duffus (1991) bu zararın %100 e kadar ulaşabileceğini bildirmişlerdir. Özgür (2003) ise şeker pancarının kök veriminin, hastalığın şiddetine bağlı olarak % oranında azaldığını belirtmiştir. Holtschulte (1998), Macaristan da BNYVV nün şeker pancarı üretim alanlarında çok önemli ürün kaybına neden olduğunu ve köklerin şeker içeriğinde önemli oranda azalma meydana getirdiğini bildirilmiştir. 9

20 Şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsü Polymyxa betae (Keskin) fungusu ile taşınmaktadır. Fungus Plasmodiophoromycetes sınıfının bir üyesidir (Yılmaz ve Erkan, 2005). BNYVV Tubiviridae familyasının, Benyvirüs cinsine ait bir virüstür. Virüsün partikül büyüklükleri, 85 nm ila 390 nm arasında değişir. Eni ise 20 nm dir. Virüs, düz çubuk şeklindedir ve tek iplikçikli RNA (+ ssrna) içerir (Rush and Heidel, 1995). BNYVV nün bütün izolatları RNA1-RNA4 komponent içermektedir. Bazı Asya ve Avrupa izolatları ise 5. RNA komponentine sahiptirler. Virüs partiküllerinin % 5 i RNA, % 95 i proteinden oluşmaktadır (Mcgrann et al., 2009; Anonymous, 2006). BNYVV genomunda 6746 nükleotid büyüklüğünde olan RNA 1 tek bir ORF (Open reading frame: Açık okuma çerçevesi) den oluşmakta ve ve 237 kda büyüklüğünde polipeptidi kodlamaktadır. RNA 2, 4612 nükleotid büyüklüğünde ve 6 ORF ye sahiptir. İlk ikisi kılıf proteini readthrough bölgesini oluşturmaktadır. Bu bölge vektörle taşınma ile ilgili genleri içermektedir. RNA 2 nin merkezindeki üçlü gen bloğu virüsün hücreden hücreye taşınmasından sorumludur. RNA 3 deki P25 proteini, Chenopodium quinoa gibi test bitkilerinin yapraklarında oluşan lokal lezyonlardan ve pancarın köklerinde oluşan simptomlardan sorumlu iken RNA 4 deki P31 proteini Polymyxa betae (Keskin) vektörü ile taşınmadan sorumludur. RNA 5 deki P26 protein bölgesinin ise simptomların şiddetlenmesinde rol oynadığı bildirilmektedir (Pferdmenges, 2007) (Şekil 2.1.). Rhizomania hastalığının A, B, P ırkları bulunmaktadır. Dünya üzerinde en yaygın ırk A tipidir. Birçok Avrupa ülkesinde (İspanya, İtalya, Avusturya, Slovakya, Yunanistan, İsveç, Türkiye, İngiltere, Kazakistan, Belçika, Bulgaristan) Amerika, Japonya ve Çin de tespit edilmiştir (Meunier et al., 2005; Yılmaz vd., 2007). B tipi daha sınırlı alanda görülmektedir. Özellikle, Fransa, Almanya, İsveç de belirlenmiştir. Üçüncü tip olan P tipi daha saldırgan bir tip olup İngiltere, Fransa ve 10

21 Kazakistan da tespit edilmiştir (Koenig et al., 1997; Koenig and Lennefors, 2000; Harju et al., 2002). Schirmer vd. (2005), yaptıkları çalışmada RNA 5 içeren Japon ve Fransa izolatlarının sekans analizleri sonucunda kılıf proteininde bazı farklılıklar olduğunu belirlemişler ve bu yüzdende Japon izolatının J tipi olarak adlandırılmasını teklif etmişlerdir. BNYVV şeker pancarı dışında kırmızı pancar, hayvan pancarı, pazı, ıspanak gibi kültür bitkilerini de infekte etmektedir (Anonymous, 2006). Bu virüs Beta macrocarpa, Beta patellaris, Beta vulgaris, Chenopodium album, C. quinoa, C. amaranticolor, C. murale, Tetragonia tetragonioides, Gomphrena globosa, Spinacia oleraceae gibi bitkilere mekanik olarak inokule edilebilmektedir (Tamada and Baba 1973). Hugo vd. (1996) a göre, şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsü, doğal konukçuları olan Chenopodiaceae türleri dışında mekanik olarakta Tetragonia expansa, Gomphrena globosa, Nicotiana clevelandii gibi onyedi otsu bitkiye inokule edilebildiğini ifade etmektedirler. Tamada (1989), BNYVV nün mekaniksel inokulasyon çalışmalarında virüsün T. expansa bitkisinde lokal lezyona neden olduğunu bildirirken, Harju (2003), lokal lezyon konukçusu olarak C. quinoa bitkisini belirtmiştir. Abdel Salam ve El-Shazly (2002) ın yaptıkları çalışmada, şeker pancarında hastalık oluşturan BNYVV ve BSBMV (Beet soil borne mosaic virus) nün tespiti için mekaniksel inokulasyon ve ELISA yöntemini kullanmışlardır. Test bitkisi olarak, şeker pancarı, ıspanak (Spinacia oleracea L.) ve sirken (C. quinoa, C. amaranticolor) bitkilerini kullanmışlardır. Mahmoud ve Hashem (2004), Mısır ın bazı bölgelerinde yaptıkları çalışmada BNYVV nün varlığını test bitkilerine mekaniksel inokulasyon yöntemi, tuzak bitki yöntemi ve DAS-ELISA yöntemi ile belirlemişlerdir. Polymyxa betae nın varlığının araştırılmasında ise % 0.1 asit fuksin içeren laktofenol boyama çözeltisi kullanmışlardır. Test bitkisi olarak, Beta vulgaris, Beta macrocarpa, Beta maritema, 11

22 C. quinoa, C. amaranticolor, C. murale, S. oleracea, Datura stramonium, Capsicum annum, Lycopersicon esculentum, Nicotiana glutinosa, Nicotiana tabacum var. White burley, Nicotiana tabacum var. Samsun, Cucumis sativus, Phaseolus vulgaris, Vicia faba, Cucurbita pepo bitkilerini kullanmışlar ve B. vulgaris, B. macrocarpa, B. maritema, C. quinoa, C. amaranticolor bitkilerinin virüsün lokal lezyon konukçusu olarak belirlemişlerdir. Koenig vd. (1984), şeker pancarı bitkisinden izole edilen BNYVV, C. quinoa da ve Nicotiana clevelandii de çoğaltmışlar ve daha sonra gümüş nitrat kloroform PEG yöntemi ile saflaştırmışlardır. Virüsün teşhisi için ELISA, Immunosorbent elektron mikroskobi (ISEM) ve Elektroblot Immunoassay (EBIA) yöntemlerini kullanmışlardır. Denemelerin sonucunda ISEM ve EBIA nın hassasiyetinin ELISA ya oranla daha az olduğunu belirlemişlerdir. Danielsen vd. (1992) Danimarka da altı şeker fabrikasının ekim alanlarından alınan 546 bitki örneğini BNYVV ve BSBV bakımından ELISA ile testlemişlerdir. Örneklerin hiçbirinde BNYVV bulunmazken, 148 örnekte BSBV (Beet soil borne virus) tespit etmişlerdir. Konukçu dizisi çalışmalarında ise, Chenopodiaceae ve Amaranthaceae familyasından 13 bitki türünü kullanmışlardır. Wauters vd. (1996), BNYVV nün Belçika da ilk kez 1984 de görüldüğünü belirterek, hastalığın başlarda yavaş ilerlemesine karşın 1992 den sonra önemli oranda artış gösterdiğini bildirmiştir. Virüsün teşhisinde ELISA ve Biyolojik indeksleme yöntemlerini kullanmışlardır. Wisler vd. (1999) California ve Güney Minnesota da ticari ve deneysel amaçlar için yetiştirilen sekiz şeker pancarı çeşitini BNYVV ve BSBMV bakımından TAS- ELISA yöntemi ile testlemiş ve bu çeşitlerin hepsinin BNYVV ile infekteli olduğunu bildirmişlerdir. Testlenen çeşitler USH11, KWS6770, Beta4776, SS-781R, Rival, HM7072, Beta4038R, 6921H50 dir. Rzrz genotipine sahip olan diploid hibritlerin benzer triploid (Rzrzrz) hibritlerden daha düşük absorbans değeri verdiği 12

23 bildirilmektedir. En yüksek absorbans değerine sahip şeker pancarı çeşiti ise KWS6770 olarak belirlenmiştir. Nemeth ve Kuroli (2002) Macaristan da 1982 de yaptıkları çalışmada Rhizomania ile infekteli olan ve olmayan koşullarda 5 tolerant ve 4 hassas hibrit çeşitle ürün parametrelerini karşılaştırmışlar ve infekteli koşullarda tolerant çeşitlerin hassas çeşitlere göre daha fazla kök ürünü oluşturduğunu saptamışlardır. Çalışmada BNYVV infeksiyonunu ELISA yöntemi ile tespit etmişlerdir. Mouhanna vd. (2002), Suriye de şeker pancarı üretiminin başta hastalıklar olmak üzere pek çok problemden etkilendiğini, buna rağmen viral hastalıklar ve toprakla taşınan funguslar hakkında surveyler yapılmadığını belirterek, 1998 yılında sararma, cüceleşme, nekroz ve mozayik gibi virüs simptomu gösteren bitkilerden yaprak ve kök örneği toplamışlardır. Araştırıcılar TAS-ELISA ve DAS-ELISA yöntemleri ile Suriye de ilk kez, BNYVV, Beet soil-borne virus, beet yellows virus ve beet mild yellowing virüslerinin varlığı ortaya koymuşlardır. Farzadfar vd. (2002) İran da yaptıkları çalışmada şeker pancarında zarar yapan BSBV ve BNYVV nün varlığını Tissue-Blot Immunoassay testi ile saptamışlardır. Araştırıcılar bitki örneklerinin % 17 sinin BSBV, % ünün ise BNYVV ile bulaşık olduğunu bildirmişlerdir. Hutchinson vd. (1992), poliakrilamid jel elektroforez yardımıyla BNYVV e özgü viral dsrna ları elde ederek molekül ağırlıklarını; 4.6, 3.4, 1.2 ve 1 X 10 6 olarak belirlemişlerdir. Wisler vd. (1994), USA dan alınan beş adet BNYVV izolatı ile sekiz adet BSBMV izolatının benzerlik derecesini serolojik, elektron mikroskobu, konukçu dizisi, fungal taşınma ve PCR testi kullanarak değerlendirlerdir. BSBMV izolatlarının çeşitli konukçularda BNYVV den farklı simptomlar sergilediğini ve BSBMV izolatının BNYVV den farklı furovirüsler olduğunu bildirmişlerdir. 13

24 Morris vd. (2001), Avrupa, Amerika ve Asya dan alınan toplam 21 şeker pancarı izolatında Rhizomania hastalığının tespiti için virüsü, Chenopodium quinoa da çoğaltmışlar ve bu örneklere RT-PCR, Immunocapture RT-PCR ve nested PCR yöntemlerini uygulayarak hassasiyetlerini araştırmışlardır. Nested PCR yönteminde, klasik RT-PCR la elde edilen PCR ürünlerini ikinci bir amplifikasyona tabi tutarak yaklaşık 326 bp lik virüse özgü bant elde etmişlerdir. Çalışmada nested PCR ın, klasik RT-PCR yönteminden 1000 kat daha hassas olduğunu vurgulamışlardır. Meunier vd. (2003), dünyanın farklı bölgelerinden alınan örneklere Multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (mrt-pcr) yöntemini başarı ile uygulamışlardır. Çalışma da BNYVV, BSBV, BVQ ve P. betae nın varlığını tespit etmişlerdir. Türkiye izolatlarında yalnızca BSBV ve Polymyxa betae nın varlığını belirlemişlerdir. Sohi ve Maleki (2004), İran ın Fars ilinden aldığı izolatlarda BNYVV nün varlığını belirlemek ve moleküler karakterizasyonunu gerçekleştirmek için öncelikle kök örneklerinden total RNA izolasyonunu gerçekleştirmişler ve kılıf protein genine spesifik primerler kullanarak nested-pcr yöntemiyle çoğaltmışlardır. PCR ürünlerini BamHI enzimiyle keserek plasmid DNA sına klonlamışlardır. Daha sonra bu plasmidi E.coli DH5 hücrelerine aktarmışlardır. Kılıf protein genini içeren koloniler alkaline lysis ve BamHI enzimiyle DNA ekstraksiyonuna tabi tutulmuşlardır. Iran- Fars izolatına özgü kılıf protein geninin nükleotid ve aminoasit dizilimini Japon S ve Yugoslavya YU2 izolatlarının kılıf protein genleriyle karşılaştırmışlardır. Bu karşılaştırmaya göre araştırcılar, Japonya nın S42 izolatı ile nükleotid düzeyinde % 99 benzerlik, S44 izolatı ile % 95 oranında benzerlik olduğunu belirtmişlerdir. Nagl vd. (2005), BNYVV nün mekaniksel inokulasyon çalışmalarında indikatör bitki olarak C. quinoa ve T. expansa bitkisini kullanmışlardır. Mekanik inokulasyondan 10 gün sonra bu bitkilerde klorotik lokal lezyon belirtisini gözlemlemişlerdir. Virüsün teşhisi için DAS-ELISA yöntemi, tek aşamalı RT-PCR ve Immunocapture RT-PCR yöntemlerini kullanmışlardır. Çalışmada kılıf protein geninin 587 bp ve 731 bp lik 14

25 kısmını çoğaltmışlardır. Örneklerin tamamında hem RT-PCR, hemde Immunocapture RT-PCR yöntemi ile istenen seviyede bant elde etmişlerdir. Harju vd. (2005), BNYVV nün teşhisi için Real-Time RT-PCR yöntemini kullanmışlardır. Real-Time RT-PCR ve klasik RT-PCR yöntemi ile RNA-5 inin yaklaşık 500 bp lik kısmını spesifik primerler kullanarak çoğaltmışlardır. Her iki yöntemde de istenen büyüklükte PCR ürünlerini elde etmişlerdir. Yapılan çalışmada araştırıcılar, Real-Time RT-PCR yönteminin kat daha hassas olduğunu vurgulamışlardır. Ayrıca araştırıcılar bu yöntemle hem işgücünden hem de zamandan tasarruf edildiğini belirtmişlerdir. Kardani vd. (2006), 2005 yılında İran nın Razavi Khorasan bölgesinde şeker pancarı üretim alanlarında BNYVV ve BSBV infeksiyonunu belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmalarında DAS-ELISA, TAS-ELISA ve RT-PCR yöntemlerini kullanmışlardır. Araştırıcılar, infekteli kök örneklerini RT-PCR ile testlemeleri sonucunda BNYVV için 324 bp büyüklüğünde, BSBV için 399 bp büyüklüğünde bant elde etmişlerdir. Zizyte vd. (2006), Litvanya da yaptıkları çalışmada şeker pancarı kök ve yapraklarından BNYVV virüsünü tespit etmek için DAS-ELISA, lateral flow test, elektron mikroskobi, indikatör bitkilere mekaniksel inokulasyon, Immunocapture RT-PCR, nested PCR yöntemlerini kullanmışlardır. Hassas indikatör bitki olarak, C. amaranticolor, C. quinoa, T. expansa bitkilerini kullanmışlardır. Immunocapture RT-PCR çalışmalarında BNYVV nün kılıf protein geninin read-through bölgesinde yaklaşık 500 bp lik bir kısmı amplifiye etmişlerdir. Shahnejat-Busnehri vd. (2006) İran da şeker pancarında görülen BNYVV nün teşhis yöntemlerini geliştirmek amacıyla RT-PCR dan sonra nested PCR yöntemini uygulamışlardır. Araştırıcılar bu yaklaşımla klasik RT-PCR la karşılaşılan istenmeyen bantların oluşumunun üstesinden gelindiğini ve çok daha hassas bir yöntem olduğunu belirtmişlerdir. Yapılan çalışmada ayrıca iki aşamalı RT-PCR yönteminin DAS-ELISA yöntemine göre 1250 kez daha hassas olduğu bildirilmişlerdir. 15

26 Rysanek vd. (2006), Çek Cumhuriyeti nde şeker pancarı üretim alanlarında Polymyxa betae ile taşınan virüsleri tespit etmek için RT-PCR yöntemini kullanmışlardır. Yapılan çalışma da BSBV hemen hemen bütün şeker pancarı yetiştirilen alanlarda tespit edilirken, BVQ virüs taranan alanın ancak % 50 sinde tespit edilebilmiştir. BNYVV ise çok daha sınırlı alanda belirlenmiştir. Konukçu dizisi çalışmalarında, BSBV ve BVQ nün, şeker pancarının tüm çeşitlerini (kırmızı pancar, pazı, hayvan pancarı) infekte ettiğini bildirmişlerdir. Litvanya da Zizyte vd. (2009) tarafından yapılan bir çalışmada C. quinoa, C. amaranticolor, T. expansa bitkilerinin BNYVV nün çoğalması ve purifikasyonu için iyi bir kaynak oluşturduğunu bildirmişlerdir. Virüsün indikatör bitkilere taşındığını, DAS-ELISA, immunoelektron mikroskobi, PCR ve Western Blot analizleri ile doğrulamışlardır. Koenig vd. (1997), Avrupa da, RNA 5 içeren izolatların sadece Fransa da bulunduğunu ve Japonya daki RNA 5 içeren izolatları ile karşılaştırıldıklarında aralarında büyük sekans farklılıkları bulunduğunu ortaya koymuşlardır. Suarez vd. (1999), İspanya da yaptıkları çalışmada şeker pancarında BNYVV nü tespit etmek için DAS-ELISA ve Immunocapture-RT PCR (IC-RT-PCR) yöntemlerini kullanmışlardır. Irkın belirlenmesi amacıyla öncelikle IC-RT-PCR PCR la cdna oluşturmuşlar, daha sonra bu ürünlerin RFLP (Restriction fragment length Polymorphism) profillerini ortaya koymuşlardır. RFLP çalışmalarında, RNA 1 de 459 bp lik kısmı çoğaltarak ScaI, EcoRI, RNA 2 de 343 bp lik kısmı çoğaltarak TaqI, BstUI, HincII, RNA 3 de 345 bp lik kısmı çoğaltarak EcoRI, MspI ve RNA 4 de 658 bp lik kısmı çoğaltarak ApaLI ve HincII ile kesmişler ve RFLP analizlerini yapmışlardır. İspanya da çalışılan bu izolatların Tip A ya daha yakın olduğu belirlenmiştir. Koenig ve Lennefors (2000), yaptıkları çalışma da BNYVV nün A tipinin Güney ve Kuzey batı Avrupa da, B tipinin Almanya ve Fransa da, agresif bir ırk olan P tipinin ise Fransa nın Pithiviers Kasabasında bulunduğunu bildirmişlerdir. BNYVV nün 16

27 nükleotid pozisyonlarını belirlemek için Avrupa ve Kazakistan dan alınan örnekleri öncelikle C. quinoa da çoğaltmışlar, daha sonra bu örneklere immunocapture RT- PCR yaparak, pgem-t vektörüne klonlayarak sekans analizini gerçekleştirmişlerdir. Kazakistan dan alınan örneklerin RNA 1, 2 ve 4 ünün P tipine, RNA 5 inin Pithivers deki RNA 5 e çok benzediğini bildirmişlerdir. Autonell vd. (2000), İtalya da 1997 ve 1998 yıllarında şeker pancarı üretim alanlarından aldıkları toprak örneklerine hassas şeker pancarı tohumlarını ekerek bu izolatların her birinin moleküler karakterizasyonu için RT-PCR çalışmalarını yürütmüşlerdir. Yapılan RFLP analizi sonucunda İtalya da A tipinin varlığını ortaya koymuşlardır. Rush (2003), benyvirüsler ve plasmodiophorid vektörlerinin ekolojisi ve epidemiyolojisi ile ilgili olarak hazırladığı derlemesinde, BNYVV nün A ve B tipleri arasında % 3-6 oranında nükleotid sekans farklılığı bulunduğunu ve aralarındaki aminoasit değişikliklerinin örtü proteininde yer aldığını bildirmiştir. Şeker pancarında önemli kayıplara neden olan Beet soil- borne virus, Beet Q virus, Beet soil-borne mosaic virus ve Beet necrotic yellow vein virus lerinin kılıf protein genlerinin karakterizasyonu Lennefors et al. (2005), tarafından gerçekleştirilmiştir. Araştırıcılar yaptıkları çalışma da, Fransa, Almanya ve ABD den alınan BNYVV izolatlarının baz dizilerini daha önce belirlenen baz dizileri ile karşılaştırmışlar ve Fransa izolatının P, Almanya izolatının B, Amerika izolatının A tipi ırk olduğunu bildirmişlerdir. Liu vd. (2005), California nın Imperial vadisinde yılları arasında yaptıkları çalışmada IV-BNYVV izolatlarının hangi tip ırka ait olduklarını belirlemek için RT-PCR ve SSCP çalışmaları yürütülmüştür. Araştırıcılar RNA 5 in yaklaşık 260 bp lik bir kısmını gen bankasında D63759 kayıt numarası ile yer alan spesifik bir çift primeri kullanarak PCR yöntemi ile çoğaltmışlardır. İzolatların hiç birinde RNA-5 bulamamışlardır. SSCP çalışmalarında ise, BNYVV nün RNA 1 ve RNA 2 genomik RNA sı oligonükleotid primerler kullanarak çoğaltmışlar ve bu 17

28 çoğaltılan PCR ürünlerini sıcaklık ve formamid uygulaması ile tek zincirli hale getirmişlerdir. Örnekler % 10 luk bisacrilamid jelde 200 Volt elektrik akımında 6 saat süreyle elektroforetik ayrıma tabi tutulmuşlardır. Çalışma sonucunda IV- BNYVV izolatlarının, pozitif kontrol olarak kullanılan A tipi ırk ile eşleştiği ortaya konulmuştur. Meunier vd. (2005), Belçika nın 10 farklı bölgesinden alınan BNYVV ile infekteli şeker pancarı izolatlarının moleküler karakterizasyonlarını yaparak, Fransa, Çin, Kazakistan ve Japonya izolatları ile karşılaştırmışlardır. Çalışmada RNA 2 nin P75 OFR bölgesi, RNA 3 ün P25 protein geni ve RNA 4 ün belirli bir kısmı RT-PCR ile çoğaltmışlar, çoğaltılan bu bölgede Sca I, EcoR I, Sma I, Taq I, Hind III, Acc I, BstU I, Sty I, BamH I, Msp I, ApaL I, BisHKA I, Bsp1286 enzimlerinin tanıdığı ve kestiği bölgelerin varolup olmadığını kontrol etmişlerdir. Ayrıca araştırıcılar çalışma da P75 ORF bölgesinin sekans analizlerini de yapmış ve buna göre, Belçika izolatlarının A ve B tipi ırk olduğunu belirlemişlerdir. Borodynko vd. (2009), Polonya da yaptıkları çalışma da şeker pancarı üretim alanlarında bulunan BNYVV, BSBV ve BVQ virüslerinin teşhisinde multiplex RT- PCR yöntemini kullanarak, virüslerin kılıf protein geninin moleküler karakterizasyonunu ortaya koymuşlardır. Araştırıcılar kılıf protein geninin nükleotid dizilerini, klonladıkları cdna dan belirleyerek 567 nükleotitden, 189 aminoasitten oluştuğunu bildirmişlerdir. BNYVV nün filogenetik analizleri sonucunda izolatların A ve B tipi ırk olduğunu belirlemişlerdir. Mehrvar vd. (2009), İran dan topladıkları 392 şeker pancarı örneğinin 288 inde Rhizomania hastalığını tespit etmişlerdir. RNA 3 üzerindeki P25 bölgesini spesifik primerler kullanarak RT-PCR yöntemiyle çoğaltmışlar ve sekans analizlerini gerçekleştirmişlerdir. P25 in pozisyonlarındaki aminoasit tetratlarında 9 farklı varyantın olduğunu belirlemişlerdir. Bunlar, ACHG, AHHG, AYHG, ALHG, AFHR, AFHG, AHYG, VLHG, VHHG dir. 288 pozitif örnekten 23 ünün P ırkı, diğerlerinin ise A ırkı olduğunu ifade etmişlerdir. BNYVV nün P25 bölgesinin pozisyondaki aminoasit tetratının SYHG olduğu belirlenmiştir. 18

29 Rhizomania hastalığının Türkiye deki varlığını ilk kez 1987 yılında Dr. Koch Erbaa, Taşova, Uzunköprü ve Keşan bölgelerinden aldığı örneklerde saptamıştır. Yine Vardar ve Erkan (1992), Türkiye nin farklı bölgelerinden aldıkları örnekleri DAS- ELISA yöntemine göre test etmişler ve bazı örneklerin BNYVV ile infekteli olduğunu belirlemişlerdir. Daha sonra Özgür (1995), Alpullu, Turhal, Adapazarı, Ilgın, Kastamonu, Susurluk, Amasya, Eskişehir, Ankara ve Çarşamba şeker fabrikalarının ekim alanlarında BNYVV nün varlığını ortaya koymuştur. Ertunç vd. (1998), Çorum, Kastamonu ve Turhal şeker fabrikalarının ekim alanlarında Rhizomania nın yaygınlığının belirlemek amacıyla bu alanlardan toprak örneklerini alarak incelemişlerdir. Hassas pancar çeşiti olan Fiona yı, bu toprak örneklerine tuzak bitki olarak ekmişlerdir. Tuzak bitkilerin yaprak ve köklerini I- ELISA testine tabi tutmuşlardır. Rhizomania nın yaygınlık oranını Çorum da % 77, Kastamonu da % 39, Turhal da ise % 66 olarak belirlemişlerdir. Polymyxa betae nın varlığını ise kılcal köklerin asit fuksin laktofenol çözeltisinde boyanması ile belirlemişlerdir. İlhan ve Ertunç (1999) Kastamonu şeker fabrikasına bağlı ekim alanlarından alınan ve I-ELISA testinde en yüksek absorbans değerini veren izolata karşı antiserum üretmişlerdir. Saflaştırılan virüsü 2 erkek Yeni Zelanda tavşanına 3 kas içi bir damar içi enjeksiyonla 10 ar gün ara ile ve her tavşana 2.5 mg şeklinde uygulamışlardır. Elde ettikleri antiserum titresini Ring Interferace Precipitasyon testi ile 1:1024 olarak tespit etmiş ve 10 ml 0.5 mg/ml konsantrasyonda IgG elde etmişlerdir. Özer ve Ertunç (2005), Amasya şeker fabrikası ekim alanlarında BNYVV hastalığının yaygınlık durumunun belirlemek amacıyla survey yapmış ve 284 bitki örneği, 279 toprak örneği toplamışlardır. I-ELISA testi sonucunda bitki örneklerinin % si, toprak örneklerinin % 26 sının BNYVV ile bulaşık olduğunu bildirmişlerdir. Polymyxa betae nin oluşturduğu yapıların tespiti için tesadüfi olarak seçilen 76 toprak örneğinde tuzak bitkileri yetiştirmişler ve kökleri asit-fuksin lakto fenol solüsyonu ile boyanmışlardır. Mikroskop incelemelerinde 47 örnekte fungusun oluşturduğu dinlenme sporlarını (sistosori) tespit etmişlerdir. 19

30 İlhan ve Ertunç (2001), Konya, Turhal ve Kastamonu şeker pancarı ekim alanlarından elde edilen BNYVV ile infekteli 6 izolat ile Çankırı dan elde edilen toprak kökenli buğday mozayik virüsü (Soil-borne wheat mosaic virus: SBWMV) ile infekteli 6 izolatın dsrna analizlerini yapmışlar ve bu yöntemin furovirüsler için etkinliğini araştırmışlardır. Yapılan çalışma sonucunda bir BNYVV izolatında kb büyüklüğünde RNA 1, başka bir izolatta kb büyüklüğünde RNA 3, bir izolatta kb büyüklüğünde RNA 1 ve kb büyüklüğünde RNA 3, bir izolatta da kb büyüklüğünde RNA 1 ve kb büyüklüğünde olan RNA 4 görmüşlerdir. Dört SBWMV izolatında ise 3.5 kb büyüklüğünde olan RNA 2 bantını gözlemlemişlerdir. Ertunç ve İlhan (2002), Kastamonu ve Turhal Şeker Fabrikaları ekim alanlarından BNYVV ile infekteli 73 toprak örneği alarak bu topraklara tuzak bitki olarak Fiona çeşiti şeker pancarı tohumlarını ekmişlerdir. Toplanan tüm örnekleri dsrna analizine tabi tutmuşlar ve izolatların yalnızca 34 ünde dsrna profili elde etmişlerdir. Kastamonu şeker fabrikasının şeker pancarı üretim alanlarında 1994, 1995, 1996 yıllarında Rhizomania hastalığının yayılma durumu incelenmiş ve sırasıyla infekteli alan oranı, % 69.21, % 33.12, % olarak bulunmuştur. Hastalıklı alan oranları tarladan alınan şeker pancarı kök örneklerine DAS-ELISA testi uygulanması ile belirlenmiştir (Yılmaz ve Erkan, 2001). Tokat ilinde şeker pancarı üretim alanlarında Rhizomania hastalığının belirlenmesi amacıyla Pazar ve Merkez ilçeleri başta olmak üzere Niksar, Başçiftlik ve Artova ilçelerinde surveyler yapılmıştır. Hastalık belirtisi gösteren bitkilerden kök örnekleri alınmış ve etmenin varlığı DAS-ELISA yöntemi ile belirlenmiştir. Merkez ilçede bulaşıklık oranı % bulunurken, Pazar da bu oran % olarak bulunmuştur. Diğer ilçelerde sonuçlar negatif çıkmıştır (Yılmaz ve Yanar, 2001). Yılmaz vd. (2004b), Tokat ili şeker pancarı üretim alanlarından aldıkları toprak örneklerinde BNYVV, BSBV ve BVQ nün ve Polymyxa betae nın varlığını tuzak 20

31 bitki ve multiplex RT-PCR yöntemi ile araştırmışlardır. 20 toprak örneğinde BNYVV, 24 örnekte BSBV ve 25 toprak örneğinin tümünde Polymyxa betae yı, belirlemişlerdir. Toprak örneklerinin hiçbirinde BVQ bulunamamıştır. Türkiye de Tokat ilinin farklı şeker pancarı üretim alanlarından alınan bitki örneklerinde Yılmaz vd., (2007) tarafından BNYVV nün moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Çalışmada hedef nükleik asit olarak RNA 3 genomik RNA sının belirli bir bölgesi spesifik primerler kullanılarak RT-PCR yöntemi ile çoğaltılmış ve çoğaltılan bu spesifik ürünler RFLP, sekans ve aminoasit analizlerine tabi tutulmuşlardır. Nükleotid sekans analizleri, Türk izolatlarının Fransa, Japonya, İtalya ve Kazakistan izolatlarına yakın olduğunu göstermiştir. Türk izolatlarının hepsinin A tipi ırk olduğu tespit edilmiştir. Yılmaz ve Sökmen (2007), Orta Karadeniz bölgesi şeker pancarı üretim alanlarında yaptıkları survey çalışmalarında 240 toprak örneği almış ve tuzak test bitkisi ve DAS-ELISA sonuçlarına göre bu örneklerin % 9.6 sının BNYVV ile infekteli olduğunu tespit etmişlerdir. BNYVV nün RNA 5 nin araştırılması için RT-PCR yöntemini kullanmışlardır. Bu amaçla RNA 5 üzerindeki P26 protein genine spesifik primerler kullanılarak amplifikasyonunu gerçekleştirmiş ve virüse özgü 518 bp büyüklüğünde bant elde etmişlerdir. Kutluk vd. (2000), BNYVV nün bilinen konukçularına ek olarak Tokat tan yıllarında şeker pancarı ekim alanlarından alınan yabancı otları toplayarak ELISA ya tabi tutmuşlardır. BNYVV ünü, biri parazit bitki olmak üzere toplam ondört yabancı otta tespit etmişlerdir. Araştırıcılar, Cirsium arvense (L.) Scop., Chamomilla recutita (L.) Rouschert, Xanthium strumarium L., Convolvulus arvensis L., Veronica hederifolia L., Datura stramonium L., ve Tribulus terrestris L. nin BNYVV nün konukçusu olduğunu ilk kez rapor etmişlerdir. Kaya (2009), 17 şeker fabrikasının 102 bölgesinde şeker pancarı ekim alanlarına surveyler yaparak şeker pancarı kök örneklerini toplamıştır. Toplanan bu örneklere DAS-ELISA test yöntemini uygulamıştır. Rhizomania nın yaygınlık oranını

32 1998 döneminde 4 fabrikada toplam %19.30, döneminde 9 fabrikada % 31.42, döneminde 15 fabrikada % olarak tespit etmiştir. 22

33 Şekil 2.1. BNYVV nün genom organizasyonu (Pferdmenges, 2007) 23

34 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Çalışma bölgesi hakkında bilgi Bu çalışma 2006 ve 2007 yıllarının Ağustos-Eylül dönemlerinde Isparta, Burdur, Afyon ve Denizli illerinde bulunan şeker pancarı üretim alanlarında yürütülmüştür. Türkiye de şeker pancarı üretiminin yoğun olarak yapıldığı alanlar arasında yer alan Göller Bölgesi Şekil 3.1.de görülmektedir. Şekil 3.1. Araştırmanın yürütüldüğü bölgeler Toprak örneklerinin alınması Isparta, Burdur, Afyon ve Denizli illerinde bulunan şeker pancarı üretim alanlarına 2006 ve 2007 yıllarında surveyler yapılmıştır. Araştırmada kullanılacak olan toprak örnekleri bu surveyler sırasında alınmıştır. 24

35 Şeker pancarı tohumlarının sağlanması Çalışmalarda, Rhizomania ya hassas olan Kasandra çeşiti pancar tohumu kullanılmıştır. Tohumlar Türkiye Şeker Fabrikaları Şeker Enstitüsü nden temin edilmiştir Mekaniksel inokulasyon çalışmalarında kullanılan materyaller Mekaniksel inokulasyon çalışmalarında, bitki büyütme kabinlerinde yetişen ve DAS- ELISA testleri ile pozitif olduğu saptanan şeker pancarı bitkilerinin kökleri ve yaprakları kullanılmıştır. Çalışmalarda kullanılan test bitkileri Çizelge 3.1. de verilmiştir. Test bitkilerinin tohumları Süleyman Demirel Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümünden sağlanmıştır. Mekaniksel inokulasyon çalışmalarında ayrıca havan, havaneli, karborandum tozu ve 0.01 M fosfat tampon çözeltisi (KH 2 PO 4 - Na 2 PO 4 : PH;7.2) ile merkaptoethanol kullanılmıştır. Çizelge 3.1. Mekanik inokulasyonda kullanılan test bitkileri Türkçe Adı Latince Adı Sağlandığı Yer Ak kazayağı Chenopodium amaranticolor S.D.Ü. Zir. Fak. Ak kazayağı Chenopodium quinoa S.D.Ü. Zir. Fak. Domates Lycopersicum esculentum S.D.Ü. Zir. Fak. Tütün Nicotiana tabacum L. S.D.Ü. Zir. Fak. Y. Zelanda Ispanağı Tetragonia expansa S.D.Ü. Zir. Fak. Şeker pancarı Beta vulgaris cv. Kasandra Türk. Şeker Enst. 25

36 Polymyxa betae nın varlığının araştırılması sırasında kullanılan materyaller Fungusun oluşturduğu dinlenme sporlarının (sistosori) varlığını belirlemek için tuzak bitki olarak yetiştirilen hassas Kasandra çeşitlerinin kökleri kullanılmıştır. Bu çalışmada % 10 luk KOH, laktofenol boyama çözeltisi, saf su, lam, lamel ve Carl Zeiss Axiostar marka ışık mikroskobu ile çalışılmıştır DAS-ELISA testinde kullanılan materyaller Tuzak bitkilerden elde edilen kök örnekleri ELISA çalışmalarında materyal olarak kullanılmıştır. BNYVV kiti Agdia Company (Elkhart, USA) adlı firmadan temin edilmiştir. ELISA çalışmalarında mikropipetler, pipet uçları, VersaMax marka ELISA okuyucusundan yararlanılmıştır Total RNA ekstraksiyonu çalışmalarında kullanılan materyaller Total RNA ların elde edilmesi çalışmalarında, DAS-ELISA testinde negatif sonuç veren ancak absorbans değeri negatif kontrolün 2 katından daha fazlasına yakın olan tuzak test bitkilerinin kök örnekleri kullanılmıştır. Ekstraksiyon işlemi sırasında Qiagen firmasından temin edilen RNeasy RNA Ekstraksiyon kiti, steril havan, havaneli, mikro pipetler, pipet uçları, Hettich Mikro 220R marka soğutmalı santrifüjden yararlanılmıştır RT-PCR çalışmalarında kullanılan materyaller Total RNA ekstraksiyonu çalışmalarında elde edilen nükleik asitler, çoğaltılması istenen hedef nükleik asitlerin materyalini oluşturmuştur. RT-PCR çalışmaları, 200 μl lik ependorf tüp, Reverse Transcriptase (M-MuLV 200U/ μl, 2680Q, Takara) enzimi ve reverse transcriptase reaksiyon tampon çözeltisi (M-MuLV 10X), Termostabil DNA Polymeraz enzimi (Taq DNA Polimerase, 5U/ μl, Bio Basic, D0081), RNAse inhibitör (40U/ µl, 2310S, Takara), dntp mix (datp, 26

37 dctp, dgtp, dttp 10mM, Bio Basic), MgCl 2 (20 mm, Takara) ve RNA nın hedef bölgesine spesifik primerler (Bio Basic), steril pipet ucu, pipet, steril saf su ve PCR tüpleri kullanılarak yapılmıştır. Nükleik asitlerin çoğaltım işlemi, Bio-Rad MJ Mini Thermocycler cihazı kullanılarak bölüm moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilmiştir Agaroz jel elektroforez çalışmalarında kullanılan materyaller Agaroz jel elektroforez çalışmalarında, total RNA ekstraksiyon işlemi sonucunda elde edilen BNYVV ne ait total RNA lar ile RT-PCR çalışmalarında elde edilen PCR ürünleri materyal olarak kullanılmıştır. Elektroforez çalışmalarında, agaroz, tampon çözeltiler, Biorad marka elektroforez cihazı ve güç kaynağı, UVP marka Doc-It görüntüleme sisteminden yararlanılmıştır. RT-PCR ürünlerinin molekül ağırlıklarının kontrolü için kullanılan 100 bp DNA marker (Bio Basic) BioGen firmasından temin edilmiştir Yöntem Toprak örneklerinin alınması ve gözlemler Çalışmanın ilk yılı olan 2006 yılı Ağustos-Eylül döneminde yaklaşık da lık üretim alanında surveyler yapılarak 121 toprak örneği alınmıştır. İkinci yılı olan 2007 yılının Ağustos-Eylül aylarında ise da lık alanda yapılan surveyler sırasında 82 adet toprak örneği alınmıştır. Isparta, Burdur, Afyon ve Denizli de 2006 ve 2007 yıllarında örnekleme yapılan yöreler, toplam şeker pancarı ekili alanları ve alınan örnek sayısı Çizelge 3.2 ve Çizelge 3.3. de verilmiştir. Örneklemede, şeker pancarı ekili alanların büyüklüğü gözönüne alınmamıştır. Örnekler gözlemsel olarak hastalıklı olduğundan şüphe duyulan alanlardan alınmıştır. Toprak örneklerinin alındığı tarlalarda, bitkilerin öbekler halinde sararmış bir görüntü sergilemesi oldukça dikkat çekmiştir. Ayrıca yapılan incelemelerde 27

38 yapraklarında sarı renk açılmaları gözlenen bitkilerin aşırı derecede yan köklere ve sakallı yumrulara sahip olduğu görülmüştür. Rhizomania hastalığının tipik belirtilerini sergileyen bu bitkilerin fotoğrafları çekilmiştir. Survey alanlarında bulunan şeker pancarı tarlaları Barnet (1986) nın önerdiği şekilde W tarzında gezilerek bir örneği oluşturacak 5 alt örnek alınmıştır. Tarlanın 5 farklı yerinden cm kök derinliğinden alınan toprak alt örnekleri karıştırılarak kg olacak şekilde bir toprak örneği hazırlanmıştır. Örnekler ayrı ayrı etiketlenmiş olan polietilen torbalarda laboratuvara getirilmiştir. Çizelge yılı Göller Bölgesindeki şeker pancarı ekim alanlarında örnek alınan bölgeler, toplam ekili alan, alınan örnek sayısı Örnek Alınan Bölge Toplam Ekili Alan (da) Toplanan Örnek Sayısı ISPARTA Şarkikaraağaç Yalvaç Atabey Senirkent Gönen Keçiborlu BURDUR Yeşilova Tefenni Gölhisar Ağlasun Bucak AFYON Sandıklı Dinar Şuhut Dazkırı Sinanpaşa Bolvadin Çay Başmakçı

39 Çizelge 3.2. (devam) DENİZLİ Acıpayam Çivril 21 3 Çal Toplam Çizelge yılı Göller Bölgesindeki şeker pancarı ekim alanlarında örnek alınan bölgeler, toplam ekili alan, alınan örnek sayısı Örnek Alınan Bölge Toplam Ekili Alan (da) Toplanan Örnek Sayısı ISPARTA Şarkikaraağaç Yalvaç Atabey Senirkent Gönen Keçiborlu BURDUR Yeşilova Tefenni Gölhisar Çeltikçi Karamanlı Bucak AFYON Sandıklı Dinar Şuhut Dazkırı Bolvadin Çay Başmakçı DENİZLİ Çivril 20 7 Çal Toplam

40 Tuzak bitkilerin yetiştirilmesi Surveyler sırasında alınan toprak örnekleri tuzak bitki test yönteminde kullanılmıştır. Toprak örnekleri oda sıcaklığında kurutulduktan sonra 1:1 oranında steril kum ile karıştırılmıştır. Bu karışım saksılara aktarılmış ve her saksıya 8-10 adet Kasandra çeşiti pancar tohumu ekilmiştir. Her toprak örneği için 5 tekerrür uygulanmıştır. Bitki büyütme kabinlerinde 23 C sıcaklıkta yetiştirilen tuzak bitkiler, 9 hafta sonunda hasat edilmiştir. Kontrol bitkisi olarak steril toprak ve kum karışımında yetişen sağlıklı tuzak bitkiler kullanılmıştır. Tuzak bitkilerin kökleri musluk suyu altında yıkandıktan sonra kurutularak polietilen torbalar içerisinde daha sonra yapılacak çalışmalara kadar -20 C deki derin dondurucuda muhafaza edilmiştir (Şekil 3.2.) Test bitkilerinin yetiştirilmesi Yetiştirme ortamı olarak 2 kısım toprak, bir kısım kum, bir kısım gübre karışımı kullanılmıştır. Kullanılan toprak ve saksılar önceden sterilize edilmiştir. Küçük tohumlu olan bitkiler, içlerinde steril toprak bulunan kaplara ekilerek çimlendirilmiş ve 2-4 yapraklı döneme ulaşınca yine steril toprak bulunan 10 cm ağız çaplı saksılara şaşırtılmıştır. Hassas test bitkileri C sıcaklık ile aydınlanma periyodu 16 saat/gün olarak ayarlanan kabinlerde yetiştirilmiştir. 30

41 Şekil 3.2. Tuzak bitkilerin yetiştirilmesi (Anonymous, 2009c) Test bitkilerine mekaniksel inokulasyon yöntemi Mekaniksel inokulasyon çalışmalarında inokulum DAS-ELISA testi sonucunda pozitif reaksiyon veren tuzak bitkilerin kök ve yaprakları kullanılarak hazırlanmıştır. Steril porselen havanda bitkinin kök ve yaprakları 1:1 (W/V) oranında %0.01 lik 2- Merkaptoethanol içeren 0.01 M fosfat tampon çözeltisi (ph; 7.2) içerisinde homojenize edilmiştir. Elde edilen homojenat iki katlı tülbent bezinden süzülmüştür. İnokulum karborandum tozu serpilmiş olan test bitkilerinin yapraklarına tülbent bezi yardımı ile aşılanmıştır (Smith, 1972). Mekaniksel inokulasyon yapılan hassas test bitkilerinin yaprakları hemen musluk suyu ile yıkanarak, gelişecek simptomları izlemek üzere C deki büyütme 31

42 kabinlerine konulmuştur. Kontrol olarak kullanılan bitkilere ise sadece musluk suyu uygulanmıştır. Büyütme kabinlerindeki test bitkileri periyodik olarak izlenmiş ve gelişen simptomlar değerlendirilmiştir Pancar köklerinde Polymyxa betae nın varlığının araştırılması Tuzak bitki olarak yetiştirilen Kasandra pancar çeşitlerinin köklerinde Polymyxa betae fungusunun oluşturduğu dinlenme sporlarının varlığı Yılmaz vd. (2004a) nin belirttiği kök boyama yöntemi ile belirlenmiştir. Kök boyama yöntemi aşağıdaki şekilde yürütülmüştür. Kökler, saf su ile yıkanıp 15 gün % 10 luk KOH içerisinde bekletilmiştir. Mikroskop altında incelemeden önce örnekler saf sudan geçirilmiştir. Köklerden ince kesitler alınmıştır. Kesitler lamın üzerine yerleştirilerek üzerine % 0.1 asit fuksin içeren laktofenol boyama çözeltisi damlatılmıştır. Boyanan örneklerin üzerine lamel kapatılarak ışık mikroskobu altında fungal etmene özgü dinlenme sporlarının varlığı araştırılmıştır DAS-ELISA testinin uygulanması Tuzak bitkilerden elde edilen 203 adet kök örneğine DAS-ELISA testi uygulanmıştır. Örneklerde şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsü (BNYVV) nün varlığı BNYVV antiserumu kullanılarak araştırılmıştır. Serolojik testler Clark and Adams (1977) ın önerdiği şekilde yürütülmüştür. Negatif kontrol olarak sağlıklı pancar kökleri kullanılmıştır. Kök örneklerine DAS-ELISA testleri aşağıdaki şekilde uygulanmıştır. 1. BNYVV e özgü poliklonal antikor, kaplama tamponu ile 1:200 oranında sulandırılarak hazırlanmış ve ELISA pleytinin her bir kuyucuğuna 100 er µl ilave edilerek + 4 C de tüm gece inkubasyona bırakılmıştır. 32

43 2. İnkubasyondan sonra yıkama tamponu (PBS-Tween Buffer) ile tüm çukurlar 3 kez yıkanmıştır. Yıkama tamponu 3 dakika süreyle çukurlarda bekletilmiştir. Pleytler hızlı bir şekilde ters çevrilerek boşaltılmış ve 8-10 katlı kurutma kağıdı üzerine vurularak kuruması sağlanmıştır. 3. Derin dondurucuda muhafaza edilen tuzak bitki kök örneklerinden 5 gram alınarak 5 ml genel ekstraksiyon tampon solüsyonu ile ezilmiş ve örnekler altalta gelecek şekilde her iki çukura 100 er µl olarak konulmuştur. Pleytler + 4 C de tüm gece inkubasyona bırakılmıştır. 4. İnkubasyondan sonra yıkama tamponu ile tüm çukurlar tekrar 3 kez yıkanmıştır. Yıkama tamponu 3 dakika süreyle çukurlarda bekletilmiştir. Örneklerin birbirine karışmaması için pleyt hızlı bir şekilde ters çevrilerek boşaltılmış ve 8-10 katlı kurutma kağıdı üzerine vurularak kuruması sağlanmıştır. 5. Bu kez konjugat tamponu (ECI Buffer) 1:5 ve konjugatlar (Alkaline fosfataz enzim konjugatı) ise 1:200 oranında sulandırılarak hazırlandıktan sonra her bir çukura 100 µl ilave edilerek 37 C de inkubasyona bırakılmıştır. 6. İnkubasyondan sonra yıkama tamponu ile tüm çukurlar 3 kez yıkanmıştır. Yıkama tamponu 3 dakika süreyle çukurlarda bekletilmiş ve pleyt hızla ters çevrilerek boşaltılmış ve 8-10 kurutma kağıdı üzerine vurularak kuruması sağlanmıştır. 7. Her bir çukura substrat tamponu ile taze olarak hazırlanan substrattan (Pnitrophenly phosphate) 100 µl ilave edildikten sonra oda sıcaklığında karanlıkta inkubasyona bırakılmıştır. 8. İnkübasyon süresi sonunda reaksiyonu durdurmak için her bir çukura 50 µl 3 M NaOH ilave edilmiştir. 33

44 9. İlk okuma 30 dakikalık sürenin sonunda İkinci okuma ise 60 dakika sonra gerçekleştirilmiştir. Ölçümler VersaMax marka ELISA okuyucusunda 405 nm dalga boyunda yapılmıştır ELISA testi sonuçlarının değerlendirilmesi Absorbans değerlerine göre sağlıklı kontrol değerinin en az iki katı ve daha yukarı okuma değeri veren örnekler pozitif olarak kabul edilmiştir (Mouhanna et al., 2002) Total RNA izolasyonu Total RNA ların elde edilmesi çalışmalarında, DAS-ELISA testinde negatif sonuç veren ancak absorbans değeri negatif kontrolün 2 katından daha fazlasına yakın olan 50 izolatın kök örnekleri kullanılmıştır. Total RNA lar RNeasy RNA Ekstraksiyon kiti (Qiagen, Almanya) protokolüne göre aşağıdaki şekilde izole edilmiştir: mg kök materyali, havan ve havaneli yardımıyla sıvı azot içerisinde toz haline gelinceye kadar ezilmiş ve ependorf tüplerine aktarılmıştır. 2. Örneklere 450µl RLT tampon (Guanidine thiocyanate) eklenmiştir (Tampona kullanmadan önce 4.5 µl β-mercaptoethanol eklenmiştir.) 3. Karışım vortekstle karıştırıldıktan sonra ilk olarak bitki artıklarının uzaklaşmasını sağlayan leylak renkli filtrasyon kolona yerleştirilerek ependorf tüplerine transfer edilmiştir. 4. Karışım rpm de 2 dakika santrifüj edilmiştir. 5. Santrifüjden sonra üstte kalan süpernatant kısmı alınarak temiz bir tüpe aktarılmıştır. 6. Üzerine 0.5 hacim etil alkol (%96- %100) ilave edilmiştir. 7. Son homojenat, RNA ların bağlanmasını ve saflaştrılmasını sağlayan pembe renkli kolona aktarılmış, tüpler ve kolon rpm de 15 saniye santrifüj edilmiştir. 8. Tüpe geçen süpernatant atılmıştır. 34

45 9. Aynı kolona 700 µl etil alkol içeren RWI tampon ilave edildikten sonra rpm de 15 saniye santrifüj edilerek tekrar tüpe geçen kısım atılmıştır. 10. Pembe kolon yeni tüpe oturtularak kolona 500 µl RPE tampon (20 mm NaCl, 2 mm Tris-HCL içeren konsantre tampon) ilave edilmiştir. RPE tamponuna kullanılmadan önce 4 volüm etil alkol eklenmiştir. 11. Daha sonra kolon rpm de 15 saniye santrifüj edilerek süpernatant uzaklaştırılmıştır. 12. Aynı kolona aynı tüp tekrar yerleştirilerek üzerine 500 µl RPE tamponu ilave edildikten sonra rpm de 2 dakika santrifüj edilmiştir. 13. Son olarak bu kolonlar 1.5 ml lik ependorf tüplerine yerleştirilmiştir. 14. Kolon üzerine µl RNase içermeyen saf su ilave edildikten sonra homojenat rpm de 1 dakika santrifüj edilmiştir. 15. Tüpler -20 C deki derin dondurucuda PCR çalışmalarına kadar saklanmıştır. 35

46 Şekil 3.3. Bitki dokusundan total RNA izolasyonu (Qiagen, 2008) 36

47 Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) Çalışmanın bundan sonraki aşamalarında DAS-ELISA testleri sonucunda BNYVV ile infekteli olmadığı belirlenen örneklerle çalışılmıştır. RT-PCR yöntemi, 1985 yılında Kary Mullis ve arkadaşları tarafından geliştirilen, DAS-ELISA dan daha hassas ve spesifik, hedef DNA nın tüp içerisinde sentetik olarak çoğaltılmasını sağlayan bir metoddur. RT-PCR çalışmalarında ELISA testleri sonucunda negatif çıkan ancak pozitife yakın absorbans değeri veren 50 örneğin BNYVV ile infekteli olup olmadığı araştırılmıştır. RT-PCR çalışmalarında RNA 2 üzerinde bulunan BNYVV nün kılıf protein geninin read-through bölgesinde yaklaşık 500 bp lik bir kısmı amplifiye eden 016 ve 017 primer çifti ile 326 bp lik bir kısmı amplifiye eden spesifik primer çiftleri (Morris et al., 2001) Biogen firması tarafından sentezlenmiştir. (Çizelge 3.4.). Çizelge 3.4. RT-PCR çalışmalarında kullanılan primerler Primer Baz Dizisi Nükleotid Pozisyonu 017 Reverse (Geri) 5 ACTCGGCATACTATTCACTT nt 016 Forward (İleri) 5 CGATTGGTATGAGTGATTTA nt Rhzn 17 Reverse 5 GACGAAAGAGCAGCCATAGC nt Rhzn 15 Forward 5 ATAGAGCTGTTAGAGTCACC nt RT ve PCR reaksiyonları tek aşamalı olarak Harju (2003) ya göre yürütülmüştür. Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir reaksiyonunda reaksiyon karışımı 50 μl den oluşmuştur (Çizelge 3.5.). Tek bir reaksiyon karışımı 1μl RNA, 2.5 μl virüse spesifik primer çifti, 1 μl 10 mm dntp ler, 3.75 μl 20 mm MgCl 2, 5 μl 10X reaksiyon tamponu, 0.5 μl Taq DNA polimeraz, 0.05 μl MMuLV ters transkriptaz, 0.5 μl RNasin ve 33.2 μl steril saf su ile hazırlanarak PCR cihazına yerleştirilmiştir. Amplifikasyon için uygulanan program şu şekilde yürütülmüştür: 37

48 RT 37 C 30 dakika 94 C..2 dakika PCR 94 C. 1 dakika 55 C.1 dakika ] 72 C..1 dakika ] 30 Döngü 72 C. 3 dakika ] +4 C. programlanmıştır. Çizelge 3.5. RT-PCR reaksiyon karışımının içerikleri İçerikler Ambalaj Konsantrasyonu 1x 50 µl için RNA 1 µl TersTranskriptaz 200U/ µl 10 U (M-MuLV) Taq DNA Polimeraz 5U/ µl 2.5 U RNase inhibitörü 40U/ µl 20 U dntp karışımı 10 mm 1 µl MgCl 2 20 mm 3.75 µl PCR Tamponu 10X 1X Primerler 100 µm 2.5 µl Steril Su 33.2 µl Nested ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (Nested RT- PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) Çalışmanın bu bölümünde RT-PCR reaksiyonu sonucunda BNYVV yönünden negatif olarak belirlenen örneklerin nested RT-PCR ile testlenmesi çalışmaları yürütülmüştür. Nested RT-PCR yöntemi çok düşük virüs konsantrasyonlarında bile oldukça hassas olduğu bildirilen bir yöntemdir (Webster et al., 2004). 38

49 Nested RT-PCR çalışmalarında, RT-PCR çalışmasında BNYVV yönünden negatif olarak elde PCR ürünleri kullanılmıştır. Bu yöntem için yaklaşık 326 bp lik (Rhzn 15 ve Rhzn 17) bir kısmı amplifiye eden spesifik farklı bir çift primer dizayn edilmiştir (Çizelge 3.4.). Nested RT-PCR yöntemi tek aşamalı olarak Harju (2003) ya göre gerçekleştirilmiştir. Nested RT-PCR çalışmalarında reaksiyon karışımı 50 μl den oluşmuştur (Çizelge 3.6.). Tek bir reaksiyon karışımı; 0.5 μl RT-PCR ile çoğaltılmış PCR ürünü, 2.5 μl virüse spesifik primer çifti, 1 μl 10 mm dntp ler, 3.75 μl 20 mm MgCl 2, 5 μl 10X reaksiyon tamponu, 0.5 μl Taq DNA polimeraz, 0.5 μl RNasin ve μl steril saf su ile hazırlanmış ve PCR cihazına yerleştirilmiştir. Amplifikasyon için; RT 94 C... 2 dakika PCR 94 C..1 dakika 58 C dakika] 72 C..1 dakika] 72 C...3 dakika] 30 döngü +4 C. programlanmıştır. Çizelge 3.6. Nested RT-PCR reaksiyon karışımının içerikleri İçerikler Ambalaj Konsantrasyonu 1x 50 µl için RT-PCR ile çoğaltılmış 0.5 µl PCR ürünü Taq DNA Polimeraz 5U/ µl 2.5 U RNase inhibitörü 40U/ µl 20 U dntp karışımı 10 mm 1 µl MgCl 2 20 mm 3.75 µl PCR Tampon 10X 1X Primerler 100 µm 2.5 µl Steril Su µl 39

50 Immunocapture ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (Immunocapture Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) Immunocapture RT-PCR: Immune olarak yakalanmış virüs partiküllerinin RT-PCR ı Çalışmanın bu aşamasında Nested RT-PCR yöntemi sonucunda negatif olarak belirlenen örneklerde bu kez immunocapture RT-PCR metodu ile BNYVV nin varlığı araştırılmıştır. Immunocapture RT-PCR yönteminde virüse özgü spesifik antibody ler kullanılarak, ezilen bitki dokusundaki viral formlar immunolojik olarak yakalanır ve viral RNA amplifikasyonda kullanılır. Immunocapture RT-PCR yöntemi temelde ELISA yöntemi ile RT-PCR yönteminin bir bileşkesi olarak ifade edilmektedir (Webster, 2004). Bu yöntemde nükleik asit izolasyonuna gerek kalmadan doğrudan bitki ekstraktları sulandırılarak kullanılır (Şekil 3.4.). Immunocapture RT-PCR çalışmaları Morris vd. (2001) yöntemine göre aşağıdaki şekilde yürütülmüştür. 1- PCR tüpleri BNYVV ne özgü poliklonal antiserum ile kaplanmış ve 3 saat 33 C de inkübasyona bırakılmıştır. 2- İnkubasyondan sonra yıkama tamponu (PBS-Tween Buffer) ile tüpler 3 kez yıkanmıştır. 3-1 gr örnek 10 ml genel ekstraksiyon tampon solüsyonunda ezildikten sonra BNYVV ne özgü poliklonal antiserum ile kaplanmış PCR tüplerine 100 er µl olarak ilave edilmiştir. Örnekler + 4 C de tüm gece inkubasyona bırakılmıştır. 4- İnkubasyondan sonra yıkama tamponu (PBS-Tween Buffer) ile tüpler 3 kez yıkanmış, bir kez de steril saf su ile yıkanmıştır. 5- Daha sonra bu PCR tüplerinin üzerine RT-PCR karışımı eklenmiştir. 40

51 RT-PCR reaksiyonu tek aşamalı olarak gerçekleştirilmiştir. Primer olarak Morris et. al. (2001) e göre sentezlenmiş olan 016 ve 017 primer çifti kullanılmıştır (Çizelge 3.4.). Şekil 3.4. Immunocapture RT-PCR ın şematik anlatımı (Anonymous, 2009b) 41

52 Tek bir reaksiyon karışımı, 2.5 μl virüse spesifik primer çifti, 1 μl 10 mm dntp ler, 3.75 μl 20 mm MgCl 2, 5 μl 10X reaksiyon tamponu, 0.5 μl Taq DNA polimeraz, 0.05 μl MMuLV ters transkriptaz, 0.5 μl RNasin ve 34.2 μl steril saf su ile hazırlanmış ve PCR cihazına yerleştirilmiştir. Amplifikasyon için uygulanan program şu şekildedir: RT 37 C 30 dakika 94 C..2 dakika PCR 94 C. 1 dakika 55 C.1 dakika ] 72 C..1 dakika ] 72 C. 3 dakika ] 30 Döngü +4 C. programlanmıştır PCR çalışmalarında kullanılan kontroller PCR çalışmalarında pozitif kontrol olarak BNYVV ile bulaşık şeker pancarı köklerinden izole edilen RNA ekstraktı kullanılmıştır. Bu RNA ekstraktları Dr. Claudio RATTI (Universita di Bologna, DISTA, Area Patologia Vegetale) den temin edilmiştir. Negatif kontrol olarak, steril saf H 2 O ile hazırlanmış su kontrol kullanılmıştır Agaroz jelin hazırlanması BNYVV ile infekteli şeker pancarı örneklerinden RT-PCR, Nested RT-PCR ve Immunocapture RT-PCR yöntemleri ile elde edilen PCR ürünlerinin görüntülenmesi amacıyla elektroforez çalışmaları yürütülmüştür. Bu amaçla % 1 lik agaroz jel ve 1X TBE (0.089 M Tris-Borate, M Boric acid, M EDTA) tampon solüsyonu kullanılmıştır. Jeldeki kuyucuklara 2 µl yükleme boyası ile birlikte 12 µl 42

53 yüklenen RT-PCR ürünleri, 100 V da 45 dakika süreyle elektroforetik ayrıma tabi tutulmuştur. Daha sonra jel ethidium bromide ile boyandıktan sonra jel görüntüleme sisteminde incelenerek profillerin fotoğrafları çekilmiştir (Rush et al., 1994). 43

54 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. Survey Çalışmaları Araştırmanın yürütüldüğü Isparta, Burdur, Afyon ve Denizli yöresinde yapılan surveyler sırasında şeker pancarı üretim alanlarındaki bitkilerin yer yer düzensiz sarı renk açılımları sergilediği dikkat çekmiştir. Şiddetli infeksiyon gösteren alanlarda şeker pancarı yapraklarının fıstık yeşili renk aldığı ve normalden daha dik geliştiği görülmüştür (Şekil 4.1. ve Şekil 4.2.). Bu belirtileri sergileyen pancar bitkisinin kökü sökülerek incelendiğinde ise aşırı derecede yan köklere sahip sakallı ve küçük yumruların oluştuğu gözlenmiştir (Şekil 4.3., Şekil 4.4.ve Şekil 4.5.). Şekil 4.1. Rhizomania hastalığının tarladaki genel görünümü 44

55 Şekil 4.2. Rhizomania ile infekteli şeker pancarı bitkisinin yapraklarının görüntüsü Şekil 4.3. Rhizomania ile infekteli şeker pancarı yumrularının görüntüsü Sağlıklı yumru (En sağdaki) 45

56 Şekil 4.4. Rhizomania ile infekteli şeker pancarı bitkisinin yumru görünümü Şekil 4.5. Rhizomania lı şeker pancarı köklerinde sakal görünümü 46

57 4.2. Tuzak Bitki Test Yöntemi Isparta, Burdur, Afyon ve Denizli bölgesindeki şeker pancarı ekim alanlarının incelenmesi sırasında BNYVV nin tipik simptomlarını sergileyen tarlalardan toplam 203 adet toprak örneği alınmıştır. Bu örnekler daha sonra tuzak bitki test çalışmalarında kullanılmıştır. Bitki yetiştirme kabinlerinde 23 C sıcaklıkta, 9 haftalık süre sonunda gelişen tuzak bitkiler Şekil 4.6. ve Şekil 4.7. da görülmektedir. Şekil 4.6. Tuzak bitki test yöntemi uygulanan şeker pancarı bitkilerinin genel görünümü 47

58 Şekil 4.7. Tuzak bitki test yöntemi uygulanan şeker pancarı bitkisinde yumru görünümü 4.3. Mekaniksel İnokulasyon Çalışmaları Tuzak bitki test yöntemiyle elde edilen şeker pancarı köklerinin virüse duyarlı test bitkilerine inokulasyonu sonucunda elde edilen belirtiler Çizelge de verilmiştir. Yapılan mekaniksel inokulasyon çalışmalarında sadece C. amaranticolor bitkisinde belirtiler gözlenmiştir. C. amaranticolor bitkisine şeker pancarı kök örnekleri ile yapılan inokulasyondan 5 gün sonra yapraklarda klorotik lokal lezyonlar görülmüştür (Şekil 4.8.). 48

59 Çizelge 4.1. BNYVV nün test bitkilerinde oluşturduğu belirtiler Test Bitkileri Oluşan Belirtiler Chenopodium amaranticolor KLL Chenopodium quinoa - Lycopersicum esculentum - Nicotiana tabacum L. - Tetragonia expansa - Beta vulgaris cv. Kasandra - KLL: Klorotik Lokal Lezyon - Belirti yok Pancar Köklerinde Polymyxa betae nın Varlığının Araştırılması BNYVV nün vektörü olan Polymyxa betae toprakta çok uzun yıllar sistosori adı verilen kalın duvarlı spor kümeleri halinde kalabilmektedir. Bu kümelerden oluşan zoosporlar bitki dokularına temas ettiği zaman kamçılarını kaybederek enkist hale dönüşürler. BNYVV nün vektörü olan fungusun pancar kök dokusunda oluşturduğu sistosori araştırılarak Polymyxa betae nın varlığı araştırılmıştır. Bu amaçla tuzak bitki olarak yetiştirilen Kasandra hasssas pancar çeşitlerinin kılcal köklerinde Polymyxa betae fungusunun oluşturduğu dinlenme sporlarının varlığı görülerek fotoğraflanmıştır (Şekil 4.9.). 49

60 Şekil 4.8. BNYVV belirtisi gösteren şeker pancarı kökünden Chenopodium amaranticolor a yapılan mekanik inokulasyondan 5 gün sonra görülen belirtiler A- İnokule edilen bitki yaprağı B- Kontrol bitkisinin yaprağı Şekil 4.9. Polymyxa betae nın tuzak bitki köklerinde oluşturduğu sistosori (400X) 50

61 4.5. DAS-ELISA Testi Sonuçları Isparta, Burdur, Afyon ve Denizli illerindeki şeker pancarı üretim alanlarından araştırmanın yürütüldüğü 2006 ve 2007 yıllarında toplam 203 BNYVV şüpheli toprak örneği alınmıştır. Toprak örneklerinin hepsi tuzak bitki yetiştirilmek amacıyla kullanılmıştır. Bu topraklarda yetiştirilen tuzak bitkilerin tamamının köklerine DAS- ELISA testi uygulanmıştır. Testler sonucunda 203 adet örneğin 85 adedi pozitif sonuç vermiştir. Şüpheli toprak örneklerinde BNYVV ile bulaşıklık oranı % olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.6.). Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.3. de tuzak bitki kök örneklerine uygulanan DAS-ELISA testleri sonucunda okunan absorbans değerleri verilmiştir. I. değerler reaksiyon durduktan 30 dakika sonra, II. değerler ise 60 dakika sonra okunan absorbans değerleridir. Çizelge yılı tuzak bitkilerine uygulanan DAS-ELISA testi absorbans değerleri Örnek AlınanYer ISPARTA-Ş.Karaağaç Yalvaç Absorbans I (30 dakika) Absorbans II (60 dakika) Sonuç

62 Çizelge 4.2. (devam) Atabey Gönen Keçiborlu Senirkent BURDUR- Yeşilova Tefenni

63 Çizelge 4.2. (devam) Gölhisar Ağlasun Bucak AFYON-Sandıklı Dinar Şuhut Dazkırı Sinanpaşa

64 Çizelge 4.2. (devam) Bolvadin Çay Başmakçı DENİZLİ-Acıpayam Çivril Çal Negatif Kontrol-1: Negatif Kontrol-1: Negatif Kontrol-2: Negatif Kontrol-2: Negatif Kontrol -3: Negatif Kontrol-3: Pozitif Kontrol-1: Pozitif Kontrol-1: Pozitif Kontrol-2: Pozitif Kontrol-2: Pozitif Kontrol-3: Pozitif Kontrol-3:

65 Çizelge yılı tuzak bitkilerine uygulanan DAS-ELISA testi absorbans değerleri Örnek AlınanYer Absorbans I Absorbans II Sonuç ISPARTA-Ş.Karaağaç Yalvaç Atabey Gönen Keçiborlu Senirkent BURDUR- Yeşilova Tefenni

66 Çizelge 4.3. (devam) Gölhisar Çeltikçi Bucak Karamanlı AFYON-Sandıklı Dinar Şuhut Dazkırı Bolvadin Çay Başmakçı

67 Çizelge 4.3. (devam) DENİZLİ-Çivril Çal Negatif Kontrol-1: Negatif Kontrol-1: Negatif Kontrol-2: Negatif Kontrol-2: Pozitif Kontrol-1: Pozitif Kontrol-1: Pozitif Kontrol-2: Pozitif Kontrol-2: ve 2007 yıllarında örnek alınan yerler, şüpheli örnek sayısı, BNYVV ile bulaşık örnek sayısı ve ilçe hastalık oranları Çizelge 4.4. ve Çizelge 4.5. de verilmiştir. 57

68 Çizelge yılı Göller Bölgesi şeker pancar üretim alanlarından alınan örneklerde DAS-ELISA testi sonuçlarına göre BNYVV bulunma oranları Örnek Alınan Bölge BNYVV şüpheli örnek sayısı BNYVV ile bulaşık örnek sayısı Örneklerdeki Hastalık Oranları (%) ISPARTA Şarkikaraağaç Yalvaç Atabey Senirkent Gönen Keçiborlu BURDUR Yeşilova Tefenni Gölhisar Ağlasun Bucak AFYON Sandıklı Dinar Şuhut Dazkırı Sinanpaşa Bolvadin Çay Başmakçı DENİZLİ Acıpayam Çivril Çal Toplam

69 Çizelge yılı Göller Bölgesi şeker pancar üretim alanlarından alınan örneklerde DAS-ELISA testi sonuçlarına göre BNYVV bulunma oranı Örnek Alınan Bölge BNYVV şüpheli örnek sayısı BNYVV ile bulaşık örnek sayısı Örneklerdeki Hastalık Oranları (%) ISPARTA Şarkikaraağaç Yalvaç Atabey Senirkent Gönen Keçiborlu BURDUR Yeşilova Tefenni Gölhisar Çeltikçi Karamanlı Bucak AFYON Sandıklı Dinar Şuhut Dazkırı Bolvadin Çay Başmakçı DENİZLİ Çivril Çal Toplam yılında şeker pancarı üretim alanlarından toplanan BNYVV şüpheli toprak örneklerindeki hastalık oranı % olarak belirlenirken, 2007 yılında alınan örneklerdeki hastalık oranı ise % olarak tespit edilmiştir. 59

70 Çizelge 4.6. Göller Bölgesindeki şeker pancarı ekim alanlarında yıllara göre alınan örnek sayısı, BNYVV ile bulaşık örnek sayısı ve örneklerdeki hastalık oranı Yıllar Alınan Örnek Sayısı BNYVV ile Bulaşık Örnek Sayısı Örneklerdeki Hastalık Oranı (%) Genel Toplam nm dalga boyunda okunan absorbans değerlerine göre sağlıklı kontrol değerinin en az iki katı ve daha yukarı okuma değeri veren örnekler pozitif olarak kabul edilmiştir. Ayrıca gözlemsel olarak değerlendirildiğinde bu örneklerin bulunduğu çukurlarda sarı renk oluşumunun meydana geldiği görülmüştür (Şekil 4.10.). Şekil ELISA Pleytinde pozitif ve negatif reaksiyon veren örneklerde meydana gelen renk değişimi. Sarı renkli çukurlar pozitif, şeffaf renkli çukurlar negatif sonucu göstermektedir. 60

71 4.6. Moleküler Çalışmaların Sonuçları Nükleik asit İzolasyonu Tuzak test bitkilerinin köklerinden elde edilen toplam RNA lar RNeasy RNA Ekstraksiyon kiti (Qiagen, Almanya) protokolüne göre izole edilmiştir. RNA ların aktivite durumlarını belirlemek için agaroz jelde elektroforez yapılmıştır (Şekil ) Uygun primer konsantrasyonlarının belirlenmesi PCR çalışmalarında hedef bölgelerin çoğaltılması amacıyla sentezlettirilen primerler 100 µm olacak şekilde purifiye edilmişlerdir. Çalışmalarda kullanılacak primerlerin uygun konsantrasyonun belirlenmesi amacıyla 100 µm stok konsantrasyonu olan primerler sulandırılmadan 5 µl, 2.5 µl ve 1 µlt konsantrasyonlarda hazırlanmıştır. Ön çalışmalar sonucunda primer sulandırılmadan 2.5 µl uygulandığında bant elde edilebilmiş ve optimum primer konsantrasyonu olarak bu değer kullanılmıştır Uygun MgCl 2 konsantrasyonunun belirlenmesi PCR çalışmalarında en uygun MgCl 2 konsantrasyonun belirlenmesi için 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 ve 3.75 µl MgCl 2 toplam 50 µl lik karışıma katılmış ve en iyi bant 3.75 µl MgCl 2 de elde edildiği için bu konsantrasyon seçilmiştir. 61

72 Şekil Bazı BNYV izolatlarının RNA aktivite durumlarını gösteren jel fotoğrafı RT-PCR çalışmalarının sonuçları Şeker pancarı üretim alanlarından alınan 203 toprak örneğinde yetiştirilen tuzak bitkilere ELISA testi uygulanmış ve örneklerin 85 adedinin BNYVV ile infekteli olduğu saptanmıştır. 118 örnek ise negatif reaksiyon vermiştir. Negatif örneklerden absorbans değeri pozitif değere yakın olan ve BNYVV ile infekteli olduğundan şüphelenilen 50 izolat RT-PCR çalışmalarında kullanılmak üzere seçilmiştir (Çizelge 4.7.). RT-PCR çalışmalarında BNYVV nün kılıf protein geninin read-through bölgesinden yaklaşık 500 bp lik bir kısmı amplifiye eden 016 ve 017 primer çiftleri kullanılmıştır. RT-PCR çalışmaları sonucunda DAS-ELISA testleri sonucunda negatif reaksiyon veren 50 izolatın 25 adedinin beklenen seviyede bant verdiği ve BNYVV ile infekteli olduğu tespit edilmiştir (Çizelge 4.8.). Su kontrolünde ise herhangi bir bant oluşumu gözlenmemiştir. 62

73 Çizelge 4.7. RT-PCR uygulanan 2006 ve 2007 yılı izolatları 2006 Yılı İzolatları 2007 Yılı İzolatları ISPARTA BURDUR AFYON DENİZLİ Ş.Karaağaç-1 Tefenni-1 Sandıklı-5 Çal-1 Ş.Karaağaç-4 Tefenni-2 Dinar-4 Ş.Karaağaç-5 Gölhisar-9 Şuhut-1 Yalvaç-1 Ağlasun-1 Dazkırı-2 Yalvaç-6 Ağlasun-2 Çay-1 Atabey-6 Ağlasun-3 Çay-2 Keçiborlu-8 Bucak-1 Senirkent-2 Bucak-3 Bucak-5 Yalvaç-3 Gölhisar-1 Dinar-1 Çal-1 Atabey-3 Gölhisar-2 Şuhut-1 Çal-2 Gönen-1 Gölhisar-4 Başmakçı-2 Çal-3 Senirkent-3 Karamanlı-2 Başmakçı-3 Çivril-1 Karamanlı-3 Çivril-2 Yeşilova-1 Çivril-3 Yeşilova-2 Çivril-4 Yeşilova-4 Çivril-5 Çeltikçi-1 Çeltikçi-2 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçları M.Marker (100 bp DNA Ladder); 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Yalvaç-1; 4.Senirkent-2; 5.Gölhisar-9; 6.Bucak-5; 7.Karamanlı-2) 63

74 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçları M.Marker (100 bp DNA Ladder); 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Atabey-6; 4.Keçiborlu-8; 5.Ağlasun-3; 6.Karamanlı-3; 7.Çal-1) Şekil İzolatların RT-PCR sonuçları M.Marker (100 bp DNA Ladder); 1.Pozitif Kontrol; 2.Çay-2; 3.Şuhut-1; 4.Çivril-3; 5.Başmakçı-3; 6.Çivril-1; 7.Dinar-4 64

75 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçları M. Marker (100 bp DNA Ladder,); 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Ağlasun-1; 4.Çal-1; 5.Ş.Karaağaç-5; 6.Atabey-3; 7.Gölhisar-1) Şekil İzolatların RT-PCR sonuçları M. Marker (100 bp DNA Ladder); 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Tefenni-1; 4.Tefenni-2; 5.Çeltikçi-1; 6.Şuhut-1; 7.Dazkırı-2; 8.Çivril-4; 9.Çay-1; 10.Dinar-1; 11.Yeşilova-1) 65

76 Şekil İzolatların RT-PCR sonuçları M. Marker (100 bp DNA Ladder); 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Ş. Karaağaç-1; 4.Yalvaç-6 ; 5.Sandıklı-5; 6.Gönen-1; 7.Çivril-5; 8.Bucak-1; 9.Yeşilova-4; 10.Başmakçı-2; 11.Senirkent-3; 12.Çal-3) Şekil İzolatların RT-PCR sonuçları M. Marker (100 bp DNA Ladder); 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Ş.Karaağaç- 4; 4.Yalvaç-3 ; 5.Gölhisar-2; 6.Gölhisar-4 ; 7.Yeşilova-2; 8.Ağlasun-2; 9.Bucak-3; 10.Çivril-2.; 11.Çeltikçi-2; 12.Çal-2; 13.Su Kontrol; 14.Pozitif Kontrol 66

77 Çizelge 4.8. Şeker pancarı izolatlarının RT-PCR sonuçları Örnek AlınanYer RT-PCR Sonuçları Ş.Karaağaç- 1 - Ş.Karaağaç- 4 - Ş.Karaağaç- 5 - Yalvaç-1 + Yalvaç-3 - Yalvaç-6 - Senirkent-2 + Senirkent-3 - Atabey-6 + Atabey-3 - Keçiborlu-8 + Gönen-1 - Gölhisar-1 - Gölhisar-2 + Gölhisar-4 + Gölhisar-9 + Yeşilova-1 + Yeşilova-2 - Yeşilova-4 - Bucak-1 - Bucak-3 - Bucak-5 + Tefenni-1 - Tefenni-2 + Karamanlı-3 + Karamanlı-2 - Ağlasun-1 - Ağlasun-2 + Ağlasun-3 - Çeltikçi-1 + Çeltikçi-2 + Çay-1 - Çay-2 + Sandıklı-5 - Şuhut-1 (2006) + Şuhut-1 + Çivril-1 + Çivril-2 - Çivril-3 + Çivril-4 + Çivril-5 - Dinar-1 + Dinar

78 Çizelge 4.8. (devam) Dazkırı-2 + Başmakçı-2 - Başmakçı-3 + Çal-1 (2006) + Çal-1 - Çal-2 - Çal Nested RT-PCR çalışmalarının sonuçları Nested RT-PCR çalışmalarında ise bu kez DAS-ELISA ve RT-PCR çalışmalarında negatif sonuç veren 25 izolat kullanılmıştır. Nested RT-PCR çalışmalarında virüsün kılıf protein geninin read-through bölgesinden yaklaşık 326 bp lik bir kısmı çoğaltan farklı bir çift primer (Rhzn 15 ve Rhzn 17) kullanılarak reaksiyon gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan 25 izolattan 19 tanesinin BNYVV ile infekteli olduğu tespit edilmiştir (Çizelge 4.9.). Su kontrolünde ise herhangi bir bant oluşumu gözlenmemiştir. Şekil İzolatların Nested -PCR sonuçları M. Marker (100 bp DNA Ladder,); 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Ağlasun-1; 4.Ağlasun-3; 5.Ş.Karaağaç-5; 6.Atabey-3; 7.Gölhisar-1 68

79 Şekil İzolatların Nested-PCR sonuçları M. Marker (100 bp DNA Ladder); 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Tefenni-1; 4.Ş.Karaağaç-1; 5.Ş. Karaağaç-4; 6.Yalvaç- 3; 7.Yalvaç-6; 8.Gönen-1; 9.Yeşilova-2; 10.Bucak-1; 11.Çivril-5 Şekil İzolatların Nested-PCR sonuçları M. Marker (100 bp DNA Ladder) 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Senirkent-3; 4.Yeşilova-4; 5.Bucak-3; 6.Sandıklı-5; 7.Çay-1; 8.Başmakçı-2; 9.Çal-1; 10.Çal-2; 11.Karamanlı-2; 12.Çivril-2; 13.Çal-3 Çizelge 4.9. Şeker pancarı izolatlarının Nested RT-PCR sonuçları Örnek AlınanYer Nested-PCR Ş.Karaağaç- 1 + Ş.Karaağaç- 4 + Ş.Karaağaç- 5 + Yalvaç-3 + Yalvaç-6 + Atabey-3 + Gönen-1 + Senirkent

80 Çizelge 4.9. (devam) Tefenni-1 + Gölhisar-1 + Yeşilova-2 + Yeşilova-4 - Ağlasun-1 + Ağlasun-3 + Bucak-1 + Bucak-3 - Sandıklı-5 + Çay-1 + Başmakçı-2 - Karamanlı-2 + Çal-1 + Çal-2 - Çal-3 - Çivril-2 - Çivril Immunocapture RT-PCR çalışmalarının sonuçları Immunocapture RT-PCR çalışmaları Morris vd. (2001) yöntemine göre gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın bu kısmında nested RT-PCR da negatif çıkan 6 izolat kullanılmıştır (Çizelge 4.10.). Immunocapture RT-PCR çalışmalarında kullanılan 6 örneğin 2 sinde 500 bp büyüklüğünde beklenen seviyede bant elde edilmiştir (Şekil ). 70

81 Şekil İzolatların Immunocapture RT-PCR sonuçları (M. Marker (100 bp DNA Ladder) 1.Su Kontrol; 2.Pozitif Kontrol; 3.Başmakçı-2; 4.Yeşilova-4; 5.Bucak-3; 6.Çal-2; 7.Çivril-2; 8.Çal-3 Çizelge Şeker pancarı izolatlarının Immunocapture RT -PCR sonuçları Örnek AlınanYer Immunocapture-RT-PCR Yeşilova-4 - Bucak-3 + Başmakçı-2 - Çal-2 - Çal-3 - Çivril-2 + Moleküler düzeyde yapılan ve BNYVV nin varlığının araştırıldığı RT-PCR, Nested RT-PCR ve Immunocapture RT-PCR çalışmalarının sonucunda, DAS-ELISA çalışmalarının neticesinde negatif reaksiyon veren 50 izolatın 46 sında virüse özgü RNA profili elde edilmiştir. 71

82 5. TARTIŞMA VE SONUÇ Bu tez çalışması ülkemizin şeker pancarı üretim alanları arasında önemli bir yeri olan Isparta, Burdur, Afyon ve Denizli illerindeki üretim alanlarında Rhizomania hastalığının varlığının araştırılması amacıyla yürütülmüştür. Rhizomania hastalığına yol açan virüsün tanılanması amacıyla biyolojik, serolojik ve farklı moleküler yöntemler uygulanmıştır. Tuzak bitki çalışmaları, mekaniksel inokulasyon çalışmaları, DAS-ELISA, RT-PCR, Nested RT-PCR ve Immunocapture RT-PCR çalışmaları sonucunda araştırma alanlarında BNYVV nün varlığı ortaya konmuştur. Uygulanan tüm bu yöntemler birbirini desteklemiştir. Ayrıca farklı PCR yöntemlerinin şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsünün tanılanması açısından kullanılabilirliği ve hassasiyeti ortaya konulmuştur. Araştırma kapsamına giren alanlarda iki yıl süreyle survey çalışmaları yürütülmüştür. Surveyler sırasında bazı tarlalarda bitkilerin öbekler halinde sararmış bir görüntü sergilemesi oldukça dikkat çekmiştir. Şeker pancarı yapraklarının fıstık yeşili renk aldığı ve normalden daha dik geliştiği görülmüştür. Bu belirtileri sergileyen pancar bitkilerinin kökleri sökülerek incelendiğinde ise aşırı derecede yan köklere sahip, sakallı ve küçük yumruların oluştuğu gözlenmiştir. Bu belirtiler, BNYVV için karakteristik olup çok sayıda araştırmacı tarafından da Rhizomania hastalığının tipik belirtileri olarak ifade edilmiştir (Ertunç vd., 1998; Yılmaz ve Yanar, 2001; Mouhanna et al., 2002; Dermic et al., 2005; Kaya, 2009). Surveyler sırasında hastalık belirtisinin görüldüğü alanlarda üreticilerin genellikle salma sulama ve yağmurlama sulamayı tercih ettikleri bilgisine ulaşılmıştır. Laboratuvar aşamasında ilk olarak Rhizomania hastalığının belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan tuzak bitki yöntemi çalışmaları yürütülmüştür. Tuzak bitkilerin bir kısmında Rhizomania hastalığının tipik kök ve yaprak belirtileri gözlemlenmiştir. Tanılama çalışmalarında bu yöntemi kullanan farklı araştırıcılar da tuzak bitki çalışmalarında aynı belirtileri elde etmişlerdir (Goffart et al., 1989; Heidel and Rush, 1994; Ertunç vd., 1998; Morris et al., 2001; Mouhanna et al., 2002; Harju, 2003; Meunier et al., 2003; Autonell et al., 2005; Liu et al., 2005). Putz vd. (1990); Özer ve Ertunç (2005), hastalığa dayanıklı çeşitlerin ekili olduğu bölgelerde BNYVV nün 72

83 varlığını belirlemek için, araziden alınan toprak örnekleri üzerinde hassas şeker pancarı çeşitlerinin yetiştirilmesinin daha kesin ve güvenilir sonuçlar vereceğini bildirmişlerdir. Ancak BNYVV nün varlığını araştırmak ve virüsten ari alanları belirlemek için tuzak bitki yönteminin tek başına yeterli olmadığı, farklı tanılama yöntemleri ile teyit edilmesi gerektiği vurgulanmaktadır ( Büttner and Bürcky 1990). Mekaniksel inokulasyon çalışmalarında, Chenopodium amaranticolor bitkisinde inokulasyondan 5 gün sonra yapraklarda lokal lezyonlar gözlenmiştir. Diğer test bitkilerinde herhangi bir belirti elde edilememiştir. Chenopodium amaranticolor bitkisindeki lokal lezyon belirtileri Tamada ve Baba (1973), Putz (1977), Wisler vd. (1994), Kutluk (1999), Abdel-Salam ve El-Shazly (2002), Harju (2003), Wintermantel vd. (2003), Mahmoud ve Hashem (2004), Jackeviciene vd. (2005), Zizyte vd. (2006) nin bulguları ile paralellik göstermektedir. Lycopersicum esculentum ve Nicotiana tabacum L. bitkilerinin BNYVV ne ait belirti sergilemedikleri Harju (2003) ve Mahmoud ve Hashem (2004) tarafından da rapor edilmiştir. Virüsün ırkı, sera ve toprak koşulları, bitki tür ve çeşiti gibi nedenlere bağlı olarak mekanik inokulasyon testleri ile test bitkilerinde zaman zaman belirti ortaya çıkmaması nedeniyle bu yöntemin tek başına kullanımının yanılgıya neden olabileceği göz önüne alınmalı ve tanılama çalışmaları daha duyarlı test teknikleri ile desteklenmelidir. Şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsünün en etkili vektörü olan Polymyxa betae nın pancar bitkilerinin kök dokusunda oluşturduğu sistosori yapılarının varlığı araştırılmıştır. Bu amaçla tuzak bitki olarak yetiştirilen Kasandra çeşiti pancarın kılcal kökleri Yılmaz vd. (2004a) nin belirttiği kök boyama yöntemine göre boyanarak ışık mikroskobunda incelenmiş ve dinlenme sporu görülerek fungusun varlığı ortaya konmuştur. Şeker pancarı köklerinde Polymyxa betae nın varlığını ortaya koyan kök boyama yöntemi pek çok araştırıcının tercih ettiği bir yöntemdir. Benzer dinlenme sporları Ertunç vd. (1998) ve Blunt vd., (1991), Abe ve Tamada 73

84 (1986), Mahmoud ve Hashem (2004), Özer ve Ertunç (2005) tarafından da etmenle bulaşık şekerpancarı kılcal köklerinde tesbit edilmiştir. DAS-ELISA yöntemi ile test edilen 203 adet tuzak bitki kök örneğinin 85 adedinin BNYVV ile infekteli olduğu belirlenmiştir. Testlenen örneklerdeki hastalık oranı % olarak belirlenmiştir. DAS-ELISA yönteminin, örnek sayısının yüksek olduğu çalışmalarda en uygun ve ekonomik yöntem olması nedeniyle tercih edildiği bildirilmektedir (Wisler et al., 1994; Ertunç vd., 1998; Suarez et al., 1999; Yılmaz ve Erkan, 2001; Yılmaz ve Yanar 2001; Abdel Salam and El-Shazly, 2002; Mouhanna et al., 2002; Zizyte et al., 2006; Kaya, 2009). Bu yöntemin güvenilir olduğu, rutin testlemelerde kullanılabilirliği ifade edilmektedir (Clark and Adams, 1977; Clark, 1981; Wisler et al., 1994; Rush and Heidel, 1995) yılında virüs şüpheli üretim alanlarından alınan 121 toprak örneğinde yetiştirilen tuzak bitkilerin kökleri ile yapılan DAS-ELISA testi sonuçlarına göre örneklerdeki infeksiyon oranları sırasıyla, Gönen % 100, Sinanpaşa % 100, Çivril % 100, Acıpayam % 100, Sandıklı % 80, Yeşilova % 75 ve Çay % 71 olarak saptanmıştır yılında virüs şüpheli üretim alanlarından alınan 82 toprak örneğinde yetiştirilen tuzak bitkilerin kökleri ile yapılan DAS-ELISA testi sonuçlarına göre örneklerdeki BNYVV infeksiyon oranları ise sırasıyla Tefenni % 100, Dazkırı % 100, Bolvadin % 100, Çay % 100 ve Gönen de % olarak tespit edilmiştir. Bunu Şuhut, Sandıklı, Karamanlı, Yeşilova ilçeleri takip etmektedir. Çalışmanın bu kısmında ELISA tekniği ile saptanan limitlerin altında olan virüs konsantrasyonlarında bile sonuç alındığı ifade edilen (Ertunç, 2003) RT-PCR, Immunocapture RT-PCR ve nested RT-PCR yöntemleri ile örneklerde BNYVV infeksiyonu olup olmadığı araştırılmıştır. Şeker pancarı köklerinden total RNA nın elde edilmesi Qiagen in RNA ekstraksiyon kiti ile gerçekleştirilmiştir. Bu ekstraksiyon kitinin tercih edilme nedeni, insan 74

85 sağlığı açısından zararlı olan fenol, kloroform gibi kimyasalların, işlemler sırasında direkt uygulanmasına gerek kalmadan basit ve kısa sürede total RNA nın elde edilmesini sağlamasıdır. BNYVV nün PCR çalışmalarında kullanılacak primerin uygun konsantrasyonun belirlenmesi amacıyla farklı primer konsantrasyonları denenmiş ve en keskin bantlar primer sulandırılmadan 100 µm stok solüsyonundan 2,5 µl olarak uygulandığında bant elde edilebilmiştir. PCR çalışmalarında kullanılan MgCl 2, Taq polimerazın aktivitesini artırmaktadır. Bu nedenle yapılan ön çalışmalarda en uygun konsantrasyonun belirlenmesine çalışılmıştır. En uygun MgCl 2 konsantrasyonun belirlenmesi için 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 ve 3.75 µl MgCl 2 toplam 50 µl lik karışıma katılmış ve en iyi bant 3.75 µl MgCl 2 de elde edilmiştir. İlk PCR yöntemi olarak RT-PCR çalışması yürütülmüştür. DAS-ELISA da negatif reaksiyon veren 118 örnekten, absorbans değeri pozitif değere yakın olan 50 izolat RT-PCR için seçilmiştir. RT-PCR reaksiyonunda BNYVV nün kılıf protein geninin read-through bölgesinden yaklaşık 500 bp lik bir kısmı amplifiye eden 016 ve 017 primer çiftleri kullanılmıştır. Sonuç olarak DAS-ELISA da negatif çıkan 50 izolatın 25 adedinin BNYVV ne özgü beklenen seviyede bant verdiği ve BNYVV ile infekteli olduğu ortaya konmuştur. Benzer şekilde çeşitli araştırmacılar (Wisler et al., 1994; Mahmood and Rush, 1999; Nagl et al., 2005; Zizyte et al., 2006) tarafından da BNYVV nün RNA 2 kılıf protein geninin bir kısmı amplifiye edilmiş ve bu çalışma ile paralel sonuçlar elde edilmiştir. BNYVV nün teşhisi için uygulanan RT-PCR çalışmalarında beklenen seviyede bantlar dışında spesifik olmayan bantlarda ortaya çıkmıştır. Bu bantların yok edilmesi için farklı annealing sıcaklıkları denenmiş fakat olumlu bir sonuç elde edilememiştir. Ancak bu nonspesifik bantların yok edilmesi nested RT-PCR çalışmaları ile gerçekleştirilebilmiştir. 75

86 Rhizomania hastalığı ile ilgili çalışma yapan pek çok araştırıcı BNYVV nün teşhisi için RT-PCR yönteminin, ELISA yönteminden daha hassas ve güvenilir bir yöntem olduğunu bildirmiştir (Rush and Heidel, 1995; Henry et al., 1995; Yılmaz ve Erkan, 2005). Nitekim, Shahnejat-Busnehri vd. (2006) RT-PCR yönteminin DAS-ELISA yöntemine göre 1250 kez daha hassas olduğunu bildirirken, Harju (2003) serolojik yöntemlere göre RT-PCR yönteminin 800 kez daha hassas olduğunu vurgulamıştır. Bu çalışmada elde edilen RT-PCR sonuçları da bu yöntemin DAS-ELISA dan daha hassas bir yöntem olduğunu açık bir şekilde ortaya koymuştur. Moleküler çalışmaların ikinci kısmını oluşturan Nested RT-PCR çalışmalarında bu kez RT-PCR çalışmalarında negatif sonuç veren 25 izolat kullanılmıştır. Nested RT- PCR çalışmalarında virüsün kılıf protein geninin read-through bölgesinden yaklaşık 326 bp lik bir kısmı farklı bir çift primer kullanılarak amplifiye edilmiştir. Kullanılan 25 izolattan 19 tanesinin BNYVV ile infekteli olduğu tespit edilmiştir. Moleküler tanılama çalışmalarının son kısmında nested RT-PCR da negatif çıkan 6 izolata Immunocapture RT-PCR yöntemi uygulanmıştır. Bu örneklerin 2 sinde 500 bp büyüklüğünde beklenen seviyede bant elde edilmiştir. DAS-ELISA testleri sonucunda testlenen 203 adet örneğin 85 adedinin BNYVV ile infekteli olduğu belirlenmiş iken, PCR çalışmaları sonucunda 203 örnekten 131 adetinin BNYVV ile infekteli olduğunun ortaya konması PCR yöntemlerinin DAS- ELISA yöntemine göre çok daha duyarlı olduğunu ve doğru sonuçlar verdiğini göstermiştir. Bu durumda DAS-ELISA yöntemine göre testlenen örneklerdeki hastalık oranı % iken daha duyarlı bir teknik olan PCR sonuçlarına göre % olarak ifade edilebilir. Son yıllarda virüs infeksiyonlarını belirlemede farklı PCR yöntemleri kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsünün tanılanmasında RT-PCR, nested RT-PCR ve Immunocapture RT-PCR yöntemlerinin kullanılabilirliğini ve hassasiyeti araştırılmıştır. Uygulanan üç PCR yönteminde de virüse özgü bantlar elde edilmiştir. Çalışma sonuçları BNYVV nin tanılanmasında 76

87 her üç yöntemin başarıyla kullanılabileceğini ortaya koymuştur. Diğer PCR yöntemleri ile negatif çıkan örneklerin Immunocapture RT-PCR yöntemi ile pozitif çıkması bu yöntemin daha hassas olduğunu göstermiştir. Ayrıca bu yöntemde, virüsün nükleik asit izolasyonuna gerek olmadığından diğer yöntemlere göre tercih edilebileceği söylenebilir. BNYVV nün tanılanmasında kullanılan nested ve Immunocapture RT-PCR yönteminin klasik RT-PCR yöntemine göre bazı avantajlara sahip olduğu çeşitli araştırıcılar tarafından da ifade edilmiştir (Morris et al., 2001; Harju, 2003; Webster et al., 2004; Nagl et al., 2005; Zizyte et al., 2006). Benzer şekilde Nagl vd. (2005), Immunocapture RT-PCR da nükleik asit izolasyonuna gerek kalmadan doğrudan bitki ekstraktlarının kullanılması ile izolasyon sırasında karşılaşılan bazı sorunların ortadan kalktığını vurgulamış ve çalışmasında bu yöntemi kullanmıştır. Yine Webster vd. (2004) nested RT-PCR yönteminin, çok düşük virüs konsantrasyonlarında dahi oldukça hassas olduğunu, ayrıca bu yöntemin kullanılması ile PCR çalışmalarında oluşan nonspesifik bant oluşumunun engellendiğini de ifade etmiştir. Buna karşılık BNYVV nün teşhisi için RT-PCR, nested RT-PCR, Immunocapture RT-PCR yöntemlerini kullanan Morris vd. (2001), Zizyte vd. (2006), RT-PCR ile Immunocapture RT-PCR yöntemi arasındaki hassasiyetin çok az olduğunu ancak nested RT-PCR yönteminin diğer iki yönteme göre daha hassas olduğunu vurgulamışlardır. İlhan (2004) ise çalışmasında RT-PCR ile Immunocapture RT-PCR yöntemini uygulamış ancak Immunocapture RT-PCR yönteminden herhangi bir sonuç alamamıştır. Bu tez çalışması Isparta, Burdur, Denizli ve Afyon illerinde bulunan şeker pancarı üretim alanlarında BNYVV nün varlığını ortaya koymuştur. BNYVV nün vektörü olan fungusun pancar kök dokusunda oluşturduğu dinlenme sporları araştırılarak Polymyxa betae nın varlığı ortaya konmuştur. Virüsün tanılama çalışmalarında ise tuzak bitki yöntemi, mekaniksel inokulasyon çalışmaları, DAS-ELISA yöntemi ve üç 77

88 farklı PCR yöntemlerinden yararlanılmıştır. Bu çalışma sonuçları, ileride yapılacak olan BNYVV izolatlarının RFLP, nükleotid dizi analizi gibi yöntemlerle karakterizasyonu, izolatlar arasında nükleotid ve aminoasit farklılıklarının ortaya konması çalışmalarına ışık tutacaktır. 78

89 6. KAYNAKLAR Abdel-Salam A.M., El-Shazly M.A., Occurrence of Rhizomania of sugarbeet in Egypt associated with Beet Necrotic Yellow Vein Benyvirus infection. Arab Journal of Biotechnology, 5(1): Abe H., Studies of ecology and control of Polymyxa betae Keskin as a fungal vector of the causal virus (Beet Necrotic Yellow Vein Virus) of Rhizomania disease of sugar beet. Bull. Hokkaido Prefectural Agric. Exp. St., 60, 81. Abe H., Tamada, T., Association of Beet Necrotic Yellow Vein Virus with isolates of Polymyxa betae Keskin. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 52, Anonim, İnternet Sitesi. http// Erişim Tarihi: Anonymous, Beet Necrotic Yellow Vein Virus. İnternet Sitesi. Erişim Tarihi: Anonymous, 2009a. Crop Profile for Sugar Beets in Washington. İnternet Sitesi. http// Erişim Tarihi: Anonymous, 2009b. İnternet Sitesi. Erişim Tarihi: Anonymous, 2009c. Rhizomania in Sugar Beet. İnternet Sitesi. Erişim Tarihi: Asher, M., Sugar-beet Rhizomania : the spread of a soilborne disease. Microbiology, Vol. 26, Asher, M.J.C., Blunt, S.J., The Ecological requirement of Polymyxa betae. In: Proc 50 th IIRB Cong., Brussels, Asher, M.J.C, Peck, A., Rhizomania. Recent Research and Its Implication. British Sugar Beet Review, 58(3), Asher, M.J.C., Thompson, K., Rhizomania in Europe. British. Sugar Beet Review, 55, Autonell, C.R., Resca, R., Ratti, C., Turina, M., Canova, A., Molecular characterisation of Italian isolates of BNYVV. Atti Gionate Fitopatologische, Perugia, Aprile, volume primo, Autonell, C.R., Ratti, C., Resca, R., Bianchi, L., Pisi, A., A multiplex RT-PCR assay for sugar beet soil-borne virus diseases survey in Italy. Sixth International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors Symposium, Bologna, Italy, September, 5-7,

90 Barnet, O.W., Surveying for Plant Viruses: Design and Consideration in Plant Virus Epidemics: Monitoring, Modeling and Predicting out Breaks. By Meleon, G.R., Garnett, G., Ruesink, G., Academic Pres, Sydney, Orlando Barr, D.J.S., Morphology and host ranges of Polymyxa graminis, Polymyxa betae and Ligniera pilorum from Ontario and some other areas. Canadian Journal of Plant Pathology, 1, Beemster, A.B.R., A., De Heij, A method for detecting Polymyxa betae and Beet Necrotic Yellow Vein Virus in soil using sugar beet as a bait plant. Netherlands Journal Journal of Plant Pathology, 93, Blunt, S.J., Asher, M.J.C., Gilligan, C.A., Infection of sugar beet by Polymyxa betae in relation to soil temperature. Plant Pathology, 40, Borodynko, N., Rymelska, N., Hasiów-Jaroszewska, B., Pospieszny, H., Molecular characterization of three soil-borne sugar beet-infecting viruses based on the coat protein gene. Journal of Plant Pathology, 91 (1), Büttner, G., Bürcky, K., Experiments and considerations on the detection of BNYVV in soil by means of bait plants. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, 97, Campbell, R.N., Fungal transmission of plant viruses. Annual Review of Phytopathology, 34, Canova, A., On the pathology of sugar beet. Inf Fitopatol., 9, Canova, A., Ricerche Virologiche Della Bietola. Annali Academia Nazionale de Agricaltora (Bologna), 72, Clark, M.F., Adams, A.N., Characteristic of the microplate method of enzyme linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34, Clark, M.F., Immunosorbent assays in plant pathology. Annual Review of Phytopathology, 19, Danielsen, S., Mugrabi, M., Albrechsten, M., Thomson, A., Rhizomania in sugar beet. Survey for BNYVV and BSBV in Denmark and host range of P. Betae, BNYVV and BSBV. Tidsskrift for Planteavl, 96(3), Dermic, E., Cvjetkovic, B., Autonell, C.R., The occurence and distribution of sugarbeet Rhizomania in Croatia. Sixth International Working Group on 80

91 Plant Viruses with Fungal Vectors Symposium, Bologna, Italy, September, 5-7, Ertunç, F., Şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsünün genomik konformasyonunun RT-PCR yöntemi ile belirlenmesi. TÜBİTAK Tarımsal Araştırma Projeleri Raporu, TARP-2388, Ankara. Ertunç, F., Erzurum, K., Karakaya, A., İlhan, D., Maden, S., Incidence of Rhizomania disease on sugar beet in Çorum, Kastamonu and Turhal Sugar Refinery Regions. The Journal of Turkish Phytopathology, Vol. 27, No:1, Ertunç, F., İlhan, D., dsrna analysis of Turkish Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) isolates. The Journal of Turkish Phytopathology, Vol. 31, No:3, Farzadfar, Sh., Pourrahim, R., Golnaraghi, A.R., Shahraeen, N., First report of Beet Soil-Borne Virus on sugar beet in Iran. Plant Disease, 86, 187. Goffart, J.P., Horta, V., Maraite, H., Inoculum potential and host range of Polymyxa betae and Beet Necrotic Yelllow Vein Furovirus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 19, Harju, V.A., Mumford R.A., Blockley, A., Boonham, N., Clovert, G.R.G., Weekes, R., Henry, C.M., Occurence in the United Kingdom of Beet Necrotic Yellow Vein Virus isolates which contain RNA-5. Plant Pathology, 51, 811. Harju, V., Protocol For The Diagnosis of Quarantine Organism. Beet Necrotic Yellow Vein Virus. Central Science Laboratory, Sand Hutton York. UK. Harju, V.A., Skelton, A., Clover, G.R.G., Ratti, C., Boonham, N., Henry, C.M., Mumford, R.A., The Use of real-time RT-PCR (TaqMan) and Post- ELISA virus release for the detection of Beet Necrotic Yellow Vein Virus types containing RNA 5 and its comparison with conventional RT-PCR. Journal of Virological Methods, 123, Hecht, H Rhizomania control by advances in breeding of tolerant sugarbeet cultivar and their performance under conditions of zero, weak and strong Infection with Sugarbeet Necrotic Yellow Vein Virus. Bayerisches Landwirtschaftliches Jahrbuch, 66: Heidel, G.B., Rush, C.M., Distribution of Beet Necrotic Yellow Vein, Beet Distortion Mosaic Virus, and an Unnamed Soilborne Sugar Beet Virus in Texas and New Mexico. Plant Disease, 78, Henry, C., Rhizomania-Its effect on sugar beet yield in the UK. British Sugar Beet Review. Vol. 64,

92 Henry, C. M., Barker, I., Morris, J., Hugo, S.A., Detection of beet necrotic yellow vein virus using reverse transcription and polymerase chain reaction. The Journal of Virological Methods, 54, Hideo, A., Tamada, U., Host range of Polymyxa betae Keskin strains in Rhizomania infested Soils of sugar beet fields in Japan. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 52, Holtschulte, B., Rhizomania of sugar beet, methods of detection and measures for decreasing crop losses. Cukoripar, 51, 3, Hugo, S.A., Henry, C.M., Harju, V., The role of alternative hosts of Polymyxa betae in transmission of Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) in England. Plant Pathology, 45, Hutchinson, P.J., Henry, C.M., Coutts, R.H.A., A comparison, using dsrna analysis, between beet soil-borne virus and some other tubular viruses isolated from sugar beet. Journal of General Virology, 73, İlhan, D., Ertunç, F., Production of antiserum against Beet Necrotic Yellow Vein Virus. The Journal of Turkish Phytopathology, Vol. 28, No. 1-2, İlhan, D., Ertunç, F., Investigation of Some Furoviruses by dsrna Analysis Method. The Journal of Turkish Phytopathology, Vol. 30, No. 1, İlhan, D., Şeker Pancarı Nekrotik Sarı Damar Virüsü (Beet Necrotic Yellow Vein Benyvirus:BNYVV) nün Moleküler Olarak Tanılanması.Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Ensititüsü, Doktora Tezi, 75s, Ankara Jackeviciene, E., Staniulis, J., Zitikaite, I., Taluntyte, L., Jankuviene, L., Vascilo, I Detection of Beet Necrotic Yellow Vein Virus in Lithuania. Sixth International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors Symposium, Bologna, Italy, September, 5-7, Jezewska, M., Piszczek, J., Surprisingly high frequency of detection of Beet Necrotic Yellow Vein Virus in Sugarbeet leaves by ELISA. Phytopathologic Polonica, No: 21, Karadimos, D., Tsialtas, J.T., Maslaris, N., Papakosta, D., Root rot disease of sugar beet (Beta vulgaris L.) as affected by defoliation Intensity. Proc. Nat. Sci., Matica Srpska Novi Sad. No. 110, Kardani, S. G., Tabasinezhad, F., Jafarpour, B., Rastegar, M. F., Detection of Beet Soil Borne Virus and Type A of Beet Necrotic Yellow Vein Virus in Razavi Khorasan Province of Iran using the RT-PCR Method with specific primers. Ninth Arab Congress of Plant Protection, November, Damascus, Syria. 82

93 Kaya, R., 1996.Rhizomania Irkları ve Dünyadaki Yayılışı. Doktora Semineri. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 30s. Ankara. Kaya, R., Alpullu Şeker Fabrikasının Ekim Alanlarında Rhizomania Hastalığının Yayılma Durumu ve Toprak Özellikleri ile İlişkisi. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 132 s. Ankara. Kaya, R., Türkiye de şeker pancarı ekim alanlarında Rhizomania hastalığının yayılma durumu. Tarım Bilimleri Dergisi, 15 (4), Keskin, G., Şeker ve Tatlandırıcılar. Tarımsal Ekonomi Araştırma Enstitüsü Bakış Dergisi, Sayı: 2, Nüsha:7. Keskin, B., Polymyxa betae n.sp., ein Parasit in den Wurzeln von Beta vulgaris Tournefort, besonders während der Jugendent wicklung der Zuckerrübe. Archiv für Mikrobiologie, 49, Kıymaz, T., Şeker Politikalarında Yeni Yönelimler ve Türkiye nin Konumu. İktisadi Sektörler ve Koordinasyon Genel Müdürlüğü Tarım Dairesi, DPT Yayın No: 2652, Ankara. ( Koenig, R., Leseman, D. I., Burgermeister, W., Beet Necrotic Yellow Vein virus: purification, Preparation of antisera and detection by Means of ELISA, immunosorbent electron microscopy and electroblot immunoassay. Phytopathologische Zeitschriftt, 111, Koenig, R., Haeberle, A.M., Commandeur, U., Detection and characterization of a distinct type of Beet Necrotic Yellow Vein Virus RNA 5 in a sugar Beet growing Area in Europe. Archives of Virology, 142, Koenig, R., Lennefors, B.L., Molecular analyses of European A, B and P type sources of Beet Necrotic Yellow Vein Virus and detection of the rare P type in Kazakhstan. Archives of Virology, 145, Kutluk, N.D., Kastamonu İlinde Şeker Pancarı Üretim Alanlarında Görülen Kök Sakallanması Hastalığının Yaygınlık Oranı, Etmen Tanısı, Bioekolojisi ve Çeşit Reaksiyonları Üzerinde Araştırmalar. Gaziosmanpaşa Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 97s, Samsun. Kutluk, N.D., Erkan, S., Biçken, S., Haas, H.U., Hurle, K., Weeds as hosts for Rhizomania agent. Proceedings 20th German Conference on Weed Biology and Weed Control Stuttgart-Hohenheim, Germany, March, 2000,17, Lennefors, B.L., Savenkov, E.I., Mukasa, S.B., Valkonen, J.P.T., Sequence divergence of four soilborne sugarbeet-infecting viruses. Virus Genes, 31, 1,

94 Lennefors, B.L., Molecular Breeding for Resistance to Rhizomania in Sugar Beets. Swedish University of Agricultural Sciences, Doctoral Thesis, 41pp. Uppsala. Liu, H.Y., Sears, J.L., Lewellen, R.T., Occurence of resistance-breaking Beet Necrotic Yellow Vein Virus of sugar beet. Plant Disease, 89, Mahmood, T., Rush, C.M., Evidence of cross-protection between beet soilborne mosaic virus and beet necrotic yellow vein virus in sugar beet. Plant Disease, 83, Mahmoud, S.Y.M., Hashem, M., Occurence and spread of sugar beet Rhizomania Disease Caused by Beet Necrotic Yellow Vein Benyvirus in some Governorates of Egypt. Egyptian Journal Virology, 1, Makkouk, K., Kumari, S., Molecular diagnosis of plant viruses. Arab Journal of Plant Protection, Vol. 24, No.2. Mcgrann, G.R.D., Grimmer, M.K., Mutasa-Göttgens, E.S., Stevens, M., Progress towards the understanding and control of sugar beet Rhizomania disease. Molecular Plant Pathology, 10(1), Mehrvar, M., Valizadeh, J., Koenig, R., Bragard, C.G., Irain beet necrotic yellow vein virus (BNYVV): pronounced diversity of the p25 coding region in A-type BNYVV and identification of P-type BNYVV lacking a fifth RNA species. Archives of Virology, 154, Meunier, A., Schmit, J-F., Stas, A., Kutluk, N., Bragard, C., Multiplex reverse transcription-pcr for simultaneous detection of Beet necrotic yellow vein virus, Beet soilborne virus, and Beet virus Q and their vector Polymyxa betae Keskin on sugar beet. Applied Environment Microbiology, 69, Meunier, A., Schmit, J.F., Bragard, C., Comparison of the Beet Necrotic Yellow Vein Virus P75 nukleotide sequences of Belgian Type A and Type B sources. Virus Research, 108, Morillo-Velarde, R., International Institute for Beet Research. 56. Winter Congres, Belgium. Morris, J., Clover, G.R.G., Harju, V.A., Hugo, S.A., Henry, C.M., Development of a highly sensitive nested RT-PCR method for Beet Necrotic Yellow Vein Virus detection. Journal of Virological Methods, Volume 95, Issue 1-2, Mouhanna, A.M., Nasrallah, A., Langen, G., Schlösser, E., Surveys for Beet Necrotic Yellow Vein Virus (the Cause of Rhizomania) other viruses, and soil borne fungi infecting sugar beet in Syria. Journal of Phytopathology. 150,

95 Nagl, N., Atanassov, I., Roussanov, K., Paunovic, S., Atanassov, A., Kovachev, L., Construction of plant transformation vectors carrying beet necrotic yellow vein virus coat protein gene (I)-transformation vectors. Biotechnology & Biotechnological Equipment, Vol. 19, Number 2, Nemeth, L., Kuroli, G., Effect of subsoiling on the yield of sugar beet under conditions of Rhizomania infection. Meded Rijksuniv Gent Fakulteit Landbouwkd Toegep Biologische Wetenschappen, 67(2), Nolasco, G., Blas de, C., Torres, V., Ponz, F., A method combining immunocapture and PCR amplification in a microtiter plate for detection of plant viruses and subviral pathogens. Journal of Virological Methods, 45, Özer, G., Ertunç, F., Amasya şeker fabrikası şeker pancarı ekim alanlarında Rhizomania hastalığının belirlenmesi. Tarım Bilimleri Dergisi, 11(3), Özgönen, H., Çulal-Kılıç, H., Isparta ili şeker pancarı ekim alanlarında fungal hastalıkların ve yaygınlık oranlarının belirlenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Dergisi, 4(1), Özgür, O.E., Türkiye Şeker Pancarı Hastalıkları. Türkiye Şeker Fabrikaları A.Ş. Genel Müdürlüğü, Yayın No: 218, Özgür, O.E., Türkiye Şeker Pancarı Hastalıkları (Sugar Beet Diseases In Turkey). Türkiye Şeker Fabrikaları A.Ş. Genel Müdürlüğü, Yayın No: 219, Pferdmenges, F Occurrence, Spread and Pathogenicity of Different Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) Isolates. Der Georg-August- Universität, Doctoral Thesis, 110pp, Göttingen. Putz, C., Composition and structure of Beet Necrotic Yellow Vein Virus. Journal of General Virology, 35, Putz, C., Merdinoğlu, D., Lemaire, O., Stocky, B., Valentin, P., Wiedemann, S., Beet Necrotic Yellow Vein Benyvirus causel agent of Rhizomania. Rewiev of Plant Pathology. 69(5), Qiagen, İnternet Sitesi. Erişim tarihi: Richard Molard, M., Beet Rhizomania disease the problem in Europe. Rep.1984, British Crop Protection Conference, Pests and Diseases, Rush, C.M., Frech, R.C., Heidel, G.B., Differentiation of two closely related Furoviruses using the polymerase chain reaction. Phytopathology, 84:

96 Rush, C. M., Heidel G., Furovirus diseases of sugar beets in the United States. Plant Disease, 79, Rush, C.M., Ecology and epidemiology of benyviruses and plasmodiophorid vectors. Annual Review of Phytopathology, 41, Rysanek, P., Homa, I., Zouhar, M., Study of sugar beet viruses transmitted by Polymyxa betae in the Czech Republic. Proc. Nat. Sci., Matica Srpska Novi Sad, No.110, Schirmer, A., Didier, L., Cognat,V., Moury, B., Beuve, M., Meunier, A., Bragard, C., Gilmer, D., Phylogenetic analysis of isolates of Beet Necrotic Yellow Vein Virus collected worldwide. Journal of General Virology, 86, Schlösser, E., Epidemiology and Management of Polymyxa betae and Beet Necrotic Yellow Vein Virus. In: Cooper, J.I., Ashe, M.J.C., Develops in Applied Biology II. Viruses with Fungal Vectors, A.A.B., Wellesborne, Shahnejat-Busnehri, A.A., Jamaledin, A., Dehkordi, M.K.H., Detection of Beet Necrotic Yellow Vein Virus with reverse transcription-polimerase chain reaction. International Journal of Agriculture Biology, Vol.8, No.2. Smith, K.M., A Textbook of Plant Virus Diseases. Academic Pres, Inc. III. Fifth Avenue, New York, 684p. Sohi, H.H., Maleki, M., Evidence of presence of types A and B of Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) in Iran. Virus Genes, 29(3), Suarez, M.B., Grondona, I., Garcia Benavides, P., Monte, E., Garcia-Acha, I., Characterization of Beet Necrotic Yellow Vein Furovirus from Spanish sugar beet. International Microbiology, 2, Şiray, A Şeker pancarı Tarımı, Pankobirlik Yayınları. No: 2, Ankara. Tamada, T., Baba, T., Beet Necrotic Yellow Vein Virus from "Rhizomania" affected Sugar Beet in Japan. Annals of the Phytopathological Society of Japan 39: Tamada, T., Production and pathogenicity of isolates of Beet Necrotic Yellow Vein Virus with different numbers of RNA components. Journal of General Virology, 70, Tamada, T., Shirako, Y., Abe, H., Saito, M., Kiguchi, T., Harada, T., Production and pathogenicity of isolates of Beet Necrotic Yellow Vein Virus with different numbers of RNA components. Journal of General Virology, 70,

97 Tan, A.N., Ökten, E., Adapazarı ili ve çevresi şeker pancarı ekiliş alanlarında Heterodera Schachtıı Schmıdt, 1871 (Tylenchıda: Heteroderıdae) in Yayılışı Üzerine Araştırmalar. U. Ü. Ziraat Fakültesi Dergisi, 2008, Cilt 22, Sayı 1, 1-8. Tuitert, G., Epidemiology of Rhizomania disease of sugarbeet. Instituut voor Rationele Suikerproduktie. Nederland, 168. Vardar, B., Erkan, S., The first studies on detection of Beet Necrotic Yellow Vein Benyvirus in sugar beet in Turkey. Journal of Turkish Phytopathology, 21, 2-3, Ward, L., Fenn, M., Henry, C., Development of a direct detection method for Polymyxa sp. in Soil. American Society of Sugar Beet Technologists, Wauters, A., Maraite, H., Steyer, S., Extension of Rhizomania in Betteravier-Bruxelles, 30, 314, Webster, C.G., Wylie, S.J., Jones, M.G.K., Diagnosis of plant viral pathogens. Current Science, Vol, 86, No:12. Whitney, E.D., Duffus, J.E., Rhizomania (Beet Necrotic Yellow Vein Virus). Compendium of Beet Diseases and Insects, APS Pres, 76pp., USA. Winner, C., Viröse Wurzelbartigkeit (Rhizomania) der beta-rübe als herausforderung für forschung ung resistenzzühtung. Zuckerindustrie (Berlin), 109: Wintermantel W.M., Crook, T., Fogg, R., First report of Rhizomania disease of sugar beet caused by Beet Necrotic Yellow Vein Virus in Great Lakes Production Region. Plant Disease, Vol. 87, No.2, 201. Wisler, G. C., Liu, H. Y., Duffus, J. E., Beet Necrotic Yellow Vein Virus and its relationship to eight sugar beet furo-like viruses from the United States. Plant Disease, 78: Wisler, G.C., Lewellen, R.T., Sears, J. L., Liu, H.Y., Duffus, J.E., Spesificity of TAS-ELISA for Beet Necrotic Yellow Vein Virus and Its application for determing Rhizomania resistance in field- grown sugar beets. Plant Disease. 83: 9, Yılmaz, N.D.K., Erkan, S., Kastamonu Şeker Fabrikası şeker pancarı üretim alanlarında Rhizomania hastalığının bulunma durumu. Türkiye IX. Fitopatoloji Kongresi, 3-8 Eylül, Tekirdağ, Bildiri Özetleri, s.33. Yılmaz, N.D.K., Erkan, S., Şeker Pancarı (Beta vulgaris var. saccharifera) nda Rhizomania Hastalığı. OMÜ. Ziraat Fakültesi Dergisi, 20(1):

98 Yılmaz, N.D.K., Yanar, Y., Study on the distribution of Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) in sugar beet growing area of Tokat Turkey. The Journal of Turkish Phytopathology, Vol.30, No.1, Yılmaz, N.D.K., Yanar, Y., Günal, H., Erkan, S. 2004a. Effects of soil properties on the occurence of Beet Necrotic Yellow Vein Virus and Beet Soilborne Virus on sugar Beet in Tokat, Turkey. Plant Pathology Journal 3(2), Yılmaz, N.D.K., Meunier, A., Schmit, J.F., Stas, A., Bragard, C., 2004b. Tokat ili şeker pancarı üretim alanlarında Beet Necrotic Yellow Vein Virus, Beet Soilborne Virus, Beet Virus Q ve Vektör Polymyxa betae Keskin in Multiplex Reverse Transcription-PCR yöntemi ile belirlenmesi. Türkiye I. Bitki Koruma Kongresi, 8-10 Eylül,Samsun, Bildiri Özetleri, s.174. Yılmaz, N.D.K., Meunier, A., Schmit, J.F., Stas, A., Bragard, C., Partial nucleotide sequence analysis of Turkish Isolates of Beet Necrotic Yellow Vein (BNYVV) RNA-3. Plant Pathology, 56, Yılmaz, N.D.K., Sökmen, M.A., Orta Karadeniz Bölgesi şeker pancarı üretim alanlarında belirlenen Beet Necrotic Yellow Vein Virus izolatlarında RNA- 5 in araştırılması. Türkiye II. Bitki Koruma Kongresi, Ağustos, Isparta. Bildiri Özetleri, s.303. Zizyte, M., Staniulis, J., Zitikaite, I., Identification of Beet Necrotic Yellow Vein Virus isolate detected in Lithuania. Agronomy Research 4, Zizyte, M., Kodze-Kucinskaite, I., Staniulis, J., Preparation of polyclonal antiserum to Beet Necrotic Yellow Vein Virus and its application for immunodiagnostics. Biologija, Vol. 55, No. 3-4,

99 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı: Handan ÇULAL KILIÇ Doğum Yeri ve Yılı: Isparta, 1975 Medeni Hali : Evli Yabancı Dil: İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise: Isparta Şehit Ali İhsan Kalmaz Lisesi ( ) Lisans: Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü, Bursa ( ) Yüksek Lisans: Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Anabilim Dalı, Isparta. ( ) Çalıştığı kurum/kurumlar ve Yılı: Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Isparta (2002-Devam ediyor) Yayınlar 1. Uluslararası hakemli dergilerde yayınlanan makaleler (SCI & SSCI & Arts and Humanities) Yardımcı, N., Eryiğit (Çulal), H., 2005 New record of Apple mosaic virus on apple cultivars in south-west Turkey. Australasian Plant Pathology, Volume 34, issue 4,603. Yardımcı, N., Eryiğit (Çulal), H., Identification of Cucumber Mosaic Virus in Tomato (Lycopersicon esculentum) growing areas in the North-West Meditarrenean Region of Turkey. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, Volume 34: Yardımcı, N., Çulal, H., Occurence and Incidence of Prunus Necrotic Ringspot Virus, Arabis Mosaic Virus and Apple Mosaic Virus on Oil Rose (Rosa 89