AKUT GASTROE TERİTİ OLA 5 YAŞ ALTI ÇOCUKLARDA ROTAVİRÜS SUŞLARI I PCR İLE TİPLE DİRİLMESİ VE BELİRLE E TİPLERİ KLİ İK AĞIRLIK DERECESİ İLE İLİŞKİSİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ A KARA Ü İVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ AKUT GASTROE TERİTİ OLA 5 YAŞ ALTI ÇOCUKLARDA ROTAVİRÜS SUŞLARI I PCR İLE TİPLE DİRİLMESİ VE BELİRLE E TİPLERİ KLİ İK AĞIRLIK DERECESİ İLE İLİŞKİSİ Dr. Anıl AKTAŞ TAPISIZ ÇOCUK E FEKSİYO HASTALIKLARI BİLİM DALI YA DAL UZMA LIK TEZİ Tez Danışmanı Prof Dr. Ülker DOĞRU A KARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ A KARA Ü İVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ AKUT GASTROE TERİTİ OLA 5 YAŞ ALTI ÇOCUKLARDA ROTAVİRÜS SUŞLARI I PCR İLE TİPLE DİRİLMESİ VE BELİRLE E TİPLERİ KLİ İK AĞIRLIK DERECESİ İLE İLİŞKİSİ Dr. Anıl AKTAŞ TAPISIZ ÇOCUK E FEKSİYO HASTALIKLARI BİLİM DALI YA DAL UZMA LIK TEZİ Tez Danışmanı Prof Dr. Ülker DOĞRU Bu tez Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından proje numarası ile desteklenmiştir A KARA

3

4 Ö SÖZ Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları yandal eğitimim süresince bilgi ve tecrübeleri ile bana yol gösteren, tüm hayatım boyunca daima örnek alacağım, tez danışmanım ve çok değerli hocam Sayın Prof. Dr. Ülker Doğru başta olmak üzere, bu yolda ilerlememde bana çok büyük emek veren, yardımlarını esirgemeyen ve birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum değerli hocalarım Prof Dr. Erdal İnce ve Doç Dr. Ergin Çiftçi ye bütün kalbimle teşekkürlerimi sunarım. Sadece yan dal arkadaşım değil aynı zamanda ablam olan Doç. Dr. Nurşen Belet e, sevgili arkadaşım Uzm Dr. Halil Özdemir e, Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları Kliniği tüm hemşire ve personeline bütün desteklerinden dolayı teşekkür ederim. Tezimin yürütülmesinde, yeterli örnek toplanması ve saklanmasında destek sağlayan Prof. Dr. Ahmet Derya Aysev ve Uzm. Dr. Haluk Güriz e ve Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Cebeci Hastanesi Merkez Laboratuvarı Mikrobiyoloji birimi personeline teşekkürlerimi sunarım. Tezimin en zor aşamasında, örneklerin çalışılmasında bütün donanımı, sıcaklığı ve içtenliği ile yanımda olan Doç Dr. Zeynep Ceren Karahan a, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı doktor ve personeline ve ayrıca istatistik aşamasındaki değerli desteklerinden dolayı Doç Dr. Atilla Halil Elhan a emeklerinden dolayı teşekkürlerimi sunarım. Hayatım boyunca verdikleri emek ve sevgi ile beni bu günlere getiren ve fedakarlıklarını hiçbir zaman esirgemeyen değerli aileme ve son olarak bana varlıkları ile destek ve güç veren sevgili eşim ve CAN ım oğluma sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Dr. Anıl AKTAŞ TAPISIZ ii

5 İÇİ DEKİLER KABUL VE ONAY... i ÖNSÖZ... ii İÇİNDEKİLER... iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... iv ŞEKİLLER DİZİNİ... v TABLOLAR DİZİNİ... vi 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Patojenin tanımı Virüsün yapısı Sınıflandırma Patogenez İmmünoloji Bulaşma Klinik bulgular Epidemiyoloji Tanı Tedavi Korunma GEREÇ VE YÖNTEM BULGULAR TARTIŞMA SONUÇLAR ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR iii

6 SİMGELER VE KISALTMALAR ELISA ELISPOT EM IF IFN IL KF LA NSP ORS PAGE RFLP RT-PCR SG I SG II SGI SGII VP : Enzyme-Linked İmmunsorbent Assay : Enzyme-Linked İmmunosorbent Spot : Elektron mikroskobi : İmmünofloresan : İnterferon : İnterlökin : Kompleman fiksasyon : Lateks aglutinasyon : Non-strüktürel protein : Oral Rehidrasyon Solüsyonu : Poliakrilamid jel elektroforezi : Restriction fragment length polymorphism : Reverse transcription polymerase chain reaction : Subgrup I : Subgrup II : Genogroup I : Genogroup II : Viral protein iv

7 ŞEKİLLER Şekil 1. Rotavirusun 11 genomik segmentinin poliakrilamid jel elektroforezindeki görünümü... 4 Şekil 2. Rotavirusun yapısı... 6 Şekil 3. Şekil 4. Şekil 5. Şekil 6. Rotavirusun VP7 bölgesine ait 1062 bp uzunluğundaki genom bölgesi Rotavirusun VP4 bölgesine ait 876 bp uzunluğundaki genom bölgesi RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların yaşlara göre dağılımı RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların aylara göre dağılımı Şekil 7. VP4 multiplex PCR ürünleri Şekil 8. VP7 multiplex PCR ürünleri v

8 TABLOLAR Tablo 1. Rotavirüs gastroenteriti sayısal skorlama sistemi Tablo 2. Ayaktan ve Yatan Hastaların Yaş ve Skor Puanı Açısından Karşılaştırılması Tablo 3. RT-PCR ile belirlenen G genotiplerinin dağılımı Tablo 4. RT-PCR ile belirlenen P genotiplerinin dağılımı Tablo 5. RT-PCR ile belirlenen her iki G ve P tiplerinin dağılımı Tablo 6. G genotiplerine göre klinik skor puanları Tablo 7. G genotiplerine göre yatan ya da ayaktan hasta sayıları vi

9 1. GİRİŞ VE AMAÇ Rotavirüsler tüm dünyada 5 yaş altı çocuklarda görülen ishallerin, özellikle de hastaneye yatışlara ve ölümlere neden olan ağır ishallerin en sık nedenidir. Dünyada her yıl milyonlarca çocuk rotavirüs ishali nedeni ile polikliniklere başvurmakta, yaklaşık 2 milyonu hastaneye yatırılmakta ve kadarı rotavirüs gastroenteritine bağlı hayatını kaybetmektedir. Rotavirüsler 5 yaş altı çocuklarda aşı ile korunabilir hastalık ölümleri arasında, pnömokoklardan sonra ikinci sırayı almaktadır (1). İnsanda sadece grup A, B ve C rotavirüsler hastalığa neden olur. En yaygın görülen ve bebeklerdeki ağır gastroenteritlerin %21-65 inin sebebi grup A rotavirüs enfeksiyonlarıdır. İnsan grup A rotavirüs suşları arasında 27 P tipi ve 19 G tipi tanımlanmıştır. Dünyadaki epidemiyolojik çalışmalarda VP7 serotipleri G1, G2, G3, G4 ile G9 ve VP4 serotipleri P4, P6 ile P8 bütün rotavirüs enfeksiyonlarının %96 sından sorumlu tutulmaktadır (2). Beş yaş altı çocuklardaki akut viral gastroenteritlerin ilk sıradaki nedeni olan rotavirüsler, gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerdeki morbiditeleri ve gelişmekte olan ülkelerdeki mortaliteleri nedeni ile çok önem taşırlar. Gelişmiş ülkelerde mortalite düşük olmasına rağmen morbidite oranı yüksektir ve hospitalizasyon oranları da %20-60 gibi oldukça yüksek olup gelişmekte olan ülkelerdekine benzer bulunmuştur (3). Rotavirüs enfeksiyonu asemptomatik olabileceği gibi ağır dehidratasyon sonucunda ölüme de neden olabilir. Rotavirüs enfeksiyonunun klinik seyrinde hastalığın ağırlık derecesini tanımlayan skorlama sistemleri kullanılmaktadır (4). Ancak tam olarak hiçbir G ya da P tipinin klinik ağırlık derecesi ile ilişkisi net olarak ortaya konamamıştır (5). Kişisel ve toplumsal hijyenin iyileştirilmesi ve temizlik uygulamalarına rağmen rotavirüs enfeksiyonuna bağlı morbidite ve mortalitede azalma sağlanamamıştır. Hastalığın sıklığı ve ağır seyri nedeni ile rotavirüse karşı aşı geliştirilmiş ve birçok ülkede lisans almıştır. Günümüzde G1P[8] tipinden oluşan 1

10 monovalan ve G1, G2, G3, G4,WC3 ve P[8] den oluşan pentavalan 2 tip oral canlı zayıflatılmış rotavirüs aşısının kullanımı ülkemiz dahil çok sayıda ülkede onaylanmıştır. Her iki aşının koruyucu etkinliği ciddi ishale karşı %85-98 arasındadır. Rotavirüs aşısı ABD, Venezuella, Brezilya, Meksika ve Avusturya gibi ülkelerde çocukluk çağı aşı takvimine girmiştir. Buna karşılık Avrupa ve birçok ülkede rotavirüs aşıları lisans almasına rağmen ulusal aşılama programına henüz konulmamıştır ve rotavirüs aşısının aşılama programına konulmasından önce çocuklarda görülen gastroenteritlerde rotavirüs enfeksiyonlarının önemini ortaya koyan epidemiyolojik çalışmalar devam etmektedir. Rotavirüs aşısından beklenen ciddi rotavirüs hastalığından koruması, hastaneye yatışları ve ekonomik kayıpları azaltması ve ölümleri en aza indirmesidir (6). Grup A rotavirüslerinin G ve P genotiplemesi, rotavirüs aşısı yapımından önce prevalan suşların tespiti ve aşılama programları sonrası aktif sürveyans çalışmaları ile genotipik değişimlerin izlenmesinde önem taşır. Buna ilaveten rotavirüs aşısının rutin uygulamaya girişinden önce her ülke için rotavirüs morbidite ve mortalite oranları, rotavirüs gastroenterit prevalansı, yaşa özgü insidans ve hospitalizasyon oranlarının analiz edilmesi gerekir (7,8). Bu çalışmanın amacı; 1. Akut gastroenteritli çocuklarda rotavirüs enfeksiyonlarının moleküler epidemiyolojisini araştırmak, 2. Rotavirüs tiplerinin klinik ağırlık derecesine etkisini belirlemek, 3. Ülkemiz açısından sürveyans ve aşılama çalışmalarına ışık tutmaktır. 2

11 2. GE EL BİLGİLER 2.1. PATOJE İ TA IMI Rotavirüsler, ilk olarak 1972 yılında, Avustralya da Ruth Bishop adlı mikrobiyolog ve arkadaşları tarafından non-bakteriyel ishali olan bir çocuğun duodenal aspiratında tekerlek benzeri partiküller olarak elektron mikroskobisi (EM) yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir (9). Flewett ve arkadaşları 1974 yılında tekerlek gibi görünüşünden dolayı virüse rotavirüs ismini vermiştir (10). İlerleyen yıllarda daha kolay ve uygun tanısal tekniklerin gelişmesi ile çocukluk çağı ishalinin en yaygın sebebi olarak bilinen rotavirüs hakkında önemli bilgiler kaydedilmiştir VİRÜSÜ YAPISI Rotavirüs, oldukça geniş bir aile olan Reoviridae ailesinini bir üyesidir. Bu ailenin genel özelliği olarak zarfsız, ikozahedral yapıda, protein kapsidlidir. Yaklaşık 100 nm çapında, 11 segmentli, çift sarmallı bir RNA virüsüdür. Dış kapsid, iç kapsid ve çekirdek olmak üzere 3 katmandan oluşur. Viral genom, viral protein (VP)1 ve VP3 ile birlikte merkezde bulunur, bunu hemen çevreleyen iç tabaka VP2 denoluşur. Dış kapsid VP7 (G proteini) ve VP4 (P protein) olmak üzere 2 proteinden oluşur. Her bir rotavirüs genom segmenti yapısal olan veya yapısal olmayan bir viral protein (VP) kodlar. Genom segmentinin altısı virüs partiküllerinde bulunan yapısal proteinleri (Viral proteinler; VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 ve VP7) diğer altı segment ise yapısal olmayan proteinleri (Non-strüktürel protein; NSP1-6) kodlar. Yalnızca 11. segment 2 protein kodlar (11). 3

12 Şekil 1. Rotavirüsün 11 genomik segmentinin poliakrilamid jel elektroforezindeki görünümü VP4 yapısal proteini 775 amino asit uzunluktadır ve 4. segment tarafından kodlanır. VP4 rotavirüsün yüzeyinde bulunan çıkıntı spike proteinidir ve dış kapsid yüzeyinden yaklaşık 80Å içeri uzanır. VP4 hücreye bağlanma, penetrasyon, hemaglutinasyon, nötralizasyon ve virulans gibi pek çok önemli fonksiyona sahiptir (12). VP7 yapısal proteini 9. segment tarafından kodlanır. Viral kapsidin dış katmanını ve toplam virion kütlesinin %30 unu oluşturur. VP7 hücreye bağlanma ve girme sürecinde VP4 ü modüle eder ve VP4 ün bağlanmasından sonra hücrenin yüzey molekülleri ile etkileşime girer. Dış kapsidin içerdiği VP4 (P proteini) ve VP7 (G proteini) proteinleri nötralizan antikorların ve tip spesifik antikorların hedefidir ve rotavirüs serotiplerinin belirlenmesinde kullanılır (2). Minor çekirdek proteini olan VP1 proteini 1. segment tarafından kodlanır. Merkezi çekirdeğin küçük bir bileşeni olup toplam virion kütlesinin %2 sini oluşturur. Farklı rotavirüsların karşılaştırılması ile VP1 in amino asit ve protein seviyelerinin yüksek derecede korunmuş olduğu görülmüştür. VP1 en büyük 4

13 polipeptiddir. VP2 yapısal proteini 2. segment tarafından kodlanır ve iki minör protein olan VP1 ve VP3 ile birlikte rotavirüsün iç çekirdeğini oluşturur. VP2 iç çekirdekte en bol bulunan proteindir ve dsrna ile etkileşim halindedir. VP2 proteini rotavirüs çekirdek yapısının oluşumunda ve fonksiyonunda önemli bir rol oynar. Viral RNA ya bağlanarak çift zincirli RNA nın kapsidle kaplanmasında ve replikasyonun gerçekleşmesinde görevi vardır (13). VP3 yapısal proteini 3. segment tarafından kodlanır. Çekirdeğin minor bileşenidir. Diğer viral polimerazlar ile dizi homolojisine sahiptir ve guaniltransferaz ve metiltransferaz aktivitesine sahiptir. VP5 rotavirüsün korunmuş hidrofobik bir bölgesine yerleşmiş ve virüsün hücreye girişinde önemli bir rol oynayan proteindir. VP6 proteini 6. segment tarafından kodlanır. VP6 genomun transkripsiyonu için önemlidir. VP6 yapısal ve immünolojik role sahip olup virüs kapsid bütünlüğünün sağlanmasında ve korunmasında önemli bir rol oynar. VP6 nın doğrudan enzimatik aktivite göstermemesine rağmen transkripsiyon için kesinlikle gerekli bir major iç kapsid polipeptidi olduğu belirlenmiştir. VP6 grup spesifik antijenik determinanttır (14). Rotavirüsün yapısal olmayan proteinlerinden NSP1 proteini 5. segment tarafından kodlanır. Şimdilik rolü tam olarak bilinmemekle birlikte doğal immün cevabın modülasyonunda bir role sahip olduğu düşünülmektedir. NSP2 proteini 8. segment tarafından kodlanır. RNA replikasyonunda ve paketlenmesinde bir role sahip olduğu ileri sürülmüştür. Yapılan çalışmalar nükleozid trifosfataz aktivitesine de sahip olduğunu göstermiştir (14). NSP3 proteini 7. segment tarafından kodlanır. Protein sentezinin translasyonunu artırıcı, viral replikasyonda ve virüsün barsak ve diğer dokulara yayılımında bir role sahiptir. Dizi analiz sonuçlarına göre NSP3 ün memelilere ait rotavirüs şuşlarında %75 oranında korunmuş olduğu görülmüştür (14). NSP4 proteini 10. segment tarafından kodlanır ve 175 amino asitten oluşan bir glikoproteindir. Pek çok çalışmada NSP4 ün viral enterotoksin olduğu kanıtlanmıştır. Viral partikülün olgunlaşmasında önemli bir adım olan endoplazmik retikulumdan subviral çift katmanlı partikülün tomurcuklanması için intraselüler 5

14 reseptör olarak görev yapar. NSP4 membran destabilizasyonuna sebep olarak plazma membranının permeabilitesini değiştirir ve epitelyum hücrelerin yüzeyleri arasındaki sıkı bağlantıları tight junction bozarak intraselüler kalsiyum seviyesini artırır. NSP4 ün VP4 ve VP6 ile etkileşimde bulunduğu gösterilmiştir. Rotavirüsün virulansı ve toksijenik aktivitesindeki modifikasyonlar bu bölgedeki amino asit değişiklikleri ile ilişkilendirilmiştir (14). İnsan ve hayvan rotavirüslerinin NSP4 genlerinin dizileri belirlenmiş ve kıyaslanmıştır. Dizi analizleri, birbirinden farklı 5 NSP4 genotipinin [A (KUN), B (Wa), C (AU-1), D (EW) ve E (avian-like)] olduğunu göstermektedir. Genotip A, B, C ve D memelilerden elde edilirken genotip E avian rotavirüs suşundan identifiye edilmiştir. Genotip A, B ve C insanlarda tespit edilmiştir. NSP4 geninin A ve B genotiplerin immün cevaptaki rolü henüz tam tanımlanamamıştır ve rotavirüs aşısının stratejisinde bu genin önemli olup olmadığı halen bilinmemektedir (15). NSP5 proteini 11. segment tarafından kodlanır. NSP5 in fosforilasyon ve glikolizasyon olmak üzere iki post-translasyonal modifikasyonu tanımlanmıştır. NSP6 nın rolü tam olarak açık değildir, fakat rotavirüs replikasyonunda anahtar bir rol oynadığı düşünülmektedir (16). Şekil 2. Rotavirusun yapısı 6

15 2.3. SI IFLA DIRMA Rotavirüsler kapsid proteinin antijenik özelliğine göre serolojik olarak grup, subgrup ve serotiplere sınıflandırılır. VP6 proteininindeki farklılıklara göre A dan G ye (A, B, C, D, E, F, G) kadar adlandırılan 7 gruba ayrılır (17). Rotavirüs grup A, B ve C hem insanlarda hem de hayvanlarda bulunurken rotavirüs grup D, E, F ve G yalnızca hayvanlarda bulunur. Grup A, B ve C rotavirüsları %20-60 arasında değişiklik gösteren amino asit homolojisine sahiptir. Grup A rotavirüsleri yine VP6 da bulunan farklı epitoplar ile subgruplara ayrılabilir. İnsan rotavirüs suşlarının çoğu subgrup I ve II ye aittir. Grup A subgrup II, subgrup I e göre daha sık görülür (18). Rotavirüs genomunun segmentleri tek bir hücrede 2 farklı rotavirüs suşunun koenfeksiyonu ile yeniden eşleşme oluşmasına izin verir. Bu özelliği G ve P proteinlerinin pek çok kombinasyonlarının oluşmasına aracılık eder. Böylece genotip çeşitliliği meydana gelir. Her bir rotavirüs grubu genetik olarak "yeniden eşleşme" yeteneğine sahiptir, fakat yeniden eşleşme farklı gruplar arasında ortaya çıkmaz (16). Grup A rotavirüsları jel elektroforezisinde 11 RNA segmentinin mobilitesine göre iki farklı elektroferotip paterni gösterir. Hızlı göç edenler uzun (long) elektroferotip ve yavaş göç edenler kısa (short) elektroferotip olarak adlandırılır. Grup A rotavirüs G1, G3 ve G4 serotipleri genellikle tipik olarak subgrup II ve uzun elektroferotip, G2 ise subgrup I ve kısa elektroferotip profili gösterir (19). Monoklonal antikorlar kullanılarak yapılan nötralizasyon testi ile rotavirüsler her bir grup içinde serotiplere sınıflandırılır. Serotip spesifik antijenler iki dış kapsid proteini olan VP4 ve VP7 dir. VP7, bir glikoproteindir ve VP7 ile G serotipleri (G; glikoprotein) belirlenir. Virüsün yüzeyindeki spike proteini olan VP4 P tip antijenini belirleyen bir proteindir. Hem VP4 hem de VP7 tip spesifik koruyucu nötralizan antikor oluşumunu uyarır. Rotavirüslerin sınıflandırılmasında VP4 ve VP7 tipleri ikili sistem olarak kullanılır. Grup A rotavirüslerin şimdiye kadar 19 G genotip (G1-G19) ve 14 G (G1-G14) serotipi tespit edilmiş olup en az 11 G serotipinin (G1 G6, G8 G12) insanları enfekte ettiği belirlenmiştir (17). 7

16 Rotavirüsün VP4 segmentine göre en azından 27 farklı P genotipi bulunmaktadır. İnsanlardan izole edilen 12 P tipi (P1A[8], P1B[4], P2A[6], P2C[6], P3[9], P4[10], P5A[3], P6[1], P8[11], P11[14], P12[19] ve P[25]) vardır. P serotiplerinin tanısı için baculovirüs ta eksprese edilen VP4 antijenine karşı geliştirilen tip spesifik antikorlar kullanılarak Grup A rotavirüslarının şimdiye kadar en az 17 P serotipi tanınmıştır, bunlardan 3 tanesi subtiptir (14 P serotip, 1A, 1B ve 2-14). İnsanları enfekte ettiği bulunan P serotipleri ise şimdilik sekiz tane olup P1A, P1B, P2A, P3, P3B, P4, P5 ve P8 dir. İnsanlarda en yaygın P genotipleri, P[8] ve P[4] dür, sırasıyla P1A ve P1B serotiplerine karşılık gelir. P serotipleri ve P genotipleri arasında korelasyon tam kurulmamış olduğundan P serotipleri sadece numara ile yazılırken P genotiplerinin numarası parentez içinde belirtilir. P tiplerinin isimlendirilmesinde alternatif olarak P1A[8] gibi hem serotip hem de genotip numarası yazılabilir. G serotipleri ve genotipleri arasında korelasyon olduğundan dolayı her ikisinde de sadece numarası yazılır (16). Rotavirüs suşlarının dizilerinin direkt karşılaştırılmaları ile bütün homolog genom segmentleri arasındaki genetik akrabalık RNA-RNA arasındaki hibridizasyon ile tespit edilmektedir (20). RNA-RNA hibridizasyon insan ve hayvan suşları arasında yakın tür içi ilişkileri göstermede veya doğal olarak ortaya çıkan rotavirüs reassortant suşları doğrulamada kullanılır. Referans suşlar olarak üç insan A genogrubu rotavirüs suşu olan [Wa (P1A[4], G1), DS-1 (P1B[4], G2) ve AU-1 (P3[9], G3)] kullanılmaktadır. Genetik olarak yeniden eşleşme sırasında virüsün genomik segmentleri kısmen veya tamamen ayrılabilir ve prototip virüstan oldukça farklı olabilir. Farklı genogruplar arasındaki yeniden eşleşmeler ile şimerik virüsler oluşturabilir ve kolayca bir genogruba yerleştirilemez. Buna ilaveten genom segmentlerinin takımı prototip virüslerden kısmen veya tamamen farklı olabilir ve kolayca tanısı yapılamaz. Pek çok hayvan genogrupları identifiye edilmiştir, fakat bunların birbirleri ve insan suşları ile ilişkileri tamamen açıklanmamıştır. İnsan ve hayvan rotavirüs suşlarının dizi analizinde olağan dışı rotavirüs suşlarının sayısının nadir olduğu açığa çıkarılmıştır ve bazı suşların nükleik asit hibridizasyon yöntemleri kullanılarak etkili bir şekilde taranamayan reassortant olaylardan türemiş şaşırtıcı genom kompozisyonuna sahip olduğu gösterilmiştir (21). 8

17 Son zamanlarda filogenetik analiz çalışmaları gerçekleştirilmiş ve grup A rotavirüslerinin 11 genom segmentinin her birinin dizisi tanımlanmıştır. Bu analiz temeline dayanarak VP4, VP7 ve NSP4 için önerilen sınıflandırma sistemi değiştirilmiş ve VP1, VP2, VP3, VP6, NSP1, NSP2, NSP3 ve NSP5/6 için yeni sınıflandırma sistemi uluslararası standartizasyonda gerçekleştirilmiştir (22) PATOGE EZ Rotavirüs enfeksiyonunda patolojik değişiklikler hemen daima ince barsağa sınırlıdır. Rotavirüs enfeksiyonu, enterosit vakuolizasyonu ve kaybı gibi hafif lezyonlardan ince bağırsak epitelinde villöz atrofiye neden olan yaygın hücresel nekroz ve kript hiperplazisine kadar değişen daha belirgin değişikliklere neden olabilir. İnce barsak epitel fonksiyonundaki değişiklik, su ve iyon kaybına yol açarak sulu ishale sebep olur (14). Virüs partikülleri hücre sitoplazmasında replike olarak kansız bol miktarda inflamatuvar olmayan ishale yol açar. Hastalığın semptomları ile histolojik lezyonlar arasında korelasyon gözükmemektedir. Rotavirüs ishalinin önceleri sadece enterosit hasarı sonucu gelişen malabsorbsiyona bağlı ozmotik ishal olduğu kabul edilirken günümüzde rotavirüs ishalinin birçok mekanizmalarla geliştiği bilinmektedir ve hem viral hem de konak faktörleri hastalığın oluşmasında etkilidir (14). Rotavirüsün patojenitesini belirleyen viral faktörler birçok hayvan deneyinde araştırılmıştır (23). NSP4, rotavirüs patogenezinde en ilgi çekici faktörlerden biri olan bir viral enterotoksindir. Yenidoğan farelerde NSP4 ün barsakta histolojik değişikler oluşmadan önce ishali enterotoksin olarak artırdığı gösterilmiştir. NSP4, Ca 2+ u endoplazmik retikulumdan mobilize ederek intrasellüler Ca 2+ konsantrasyonunu artırır ve hücresel elektrolit dengesini bozar. Artan hücre içi kalsiyum, hücre iskelet yapısında değişikliğe, disakkaridazların sentezlerinin azalmasına, sodyum ve solüt transferinin inhibisyonuna neden olmaktadır. Bu sırada NSP4 ün ortama salınımı gerçekleşmekte ve diğer hücrelerde de toksin etkisi ortaya çıkmaktadır. Enterik sinir sisteminin uyarılması da rotavirüs patogenezinde rol oynayabilir (24). 9

18 2.5. İMMÜ OLOJİ Rotavirüse karşı immün cevap, hem doğal hem de hücresel ve humoral bağışıklığı kapsayan kazanılmış immün cevabı içermektedir. Hayatın ilk birkaç yılında rotavirüs ile birçok enfeksiyonlar oluşabilir. İlk enfeksiyon genellikle daha şiddetli geçmekte ve enfeksiyonun sayısı arttıkça şiddeti de azalmaktadır. İlk enfeksiyon, özellikle ciddi rotavirüs ishaline karşı yüksek oranda korur. Semptomatik veya asemptomatik geçirilen ilk rotavirüs enfeksiyonu sonraki rotavirüs ile ilişkili ishale karşı %73-87 arasında korur. İkinci bir rotavirüs enfeksiyonundan sonra gerek asemptomatik gerekse semptomatik olsun hafif veya şiddetli enfeksiyona karşı tamamen (%100) koruma sağlanır (25,26). Rotavirüs enfeksiyonuna karşı başlıca serotip spesifik homotipik nötralizan antikorlar enfeksiyonunun ilk iki haftası içinde gelişir. Bu immüniteye rotavirüsün 2 dış kapsid proteini olan VP4 ve VP7 antikorları aracılık eder. Her iki protein de dış kapsidin bileşenleri olup nötralize edici antikorların üretimini harekete geçirmede birbirlerinden bağımsızdır. Farklı serotiplere karşı da düşük düzeyde heterotipik antikor cevabı oluşur. Fakat çoğunlukla enfekte eden suşa göre değişir. Örneğin: G2 serotipleri başlıca homotipik antikor cevabı oluştururken G1, G3 ve G4 homotipik ve heterotipik antikor cevabı oluşturur. Homotipik antikor cevabı muhtemelen heterotipik antikorlara göre daha uzun sürelidir. Buna karşılık aynı serotiple reenfeksiyonların ortaya çıktığı gösterilmiştir, ancak primer enfeksiyona göre daha az ciddidir. Heterotipik koruma için muhtemel birkaç açıklama vardır. Birincisi, lokal IgA antikorları VP4 ve VP7'deki çapraz reaksiyon gösteren epitopları tanımlar ve diğeri ise, iç kapsid proteini olan VP6'daki antikorların korumayı sağlamasıdır ve üçüncü bir ihtimal ise, çapraz reaksiyon veren virüs-spesifik sitotoksik T lenfositlerinin korumada yer almasıdır, ancak rotavirüs enfeksiyonunda sitotoksik T lenfositlerinin rolü henüz tam olarak bilinmemektedir (27). Nötralizan antikorlar yaş ve virüs ile karşılaşma ile artar. Çocukların 3 yaşına kadar %90 ında bir veya daha fazla rotavirüs tipine karşı antikorlar bulunmaktadır ve 4 yaşına kadar bu oran %100 ü bulur. Rotavirüs antikor düzeyleri doğumda yüksektir, 3-6 aya kadar azalır, 2-3 yaşında pik yapar. Rotavirüs antikorlarının 10

19 erişkinlerde de yüksek prevalansta seyretmesi virüs ile subklinik enfeksiyonların oluştuğunu gösterir. Yaşlılar ise muhtemelen immünitenin azalmasına bağlı olarak ciddi hastalığa karşı duyarlıdırlar (28). Rotavirüs ile enfeksiyon yaşam boyu süren güçlü bir humoral IgG immün yanıtı harekete geçirir. IgG yanıtı kolayca oluşurken, genellikle rotavirüs enfeksiyonundan korunma lokal IgA antikorları tarafından sağlanır. Rotavirüs spesifik total serum IgG titreleri değil, fakat total serum rotavirüs IgA nın özellikle ciddi ishale karşı koruyuculuğu ile ilgili olarak total rotavirüs serum IgA varlığının sekretuvar komponente bağlı serum immünglobulinlerin (Ig) varlığı ile korele olduğu bulunmuştur. Bu antikorlar büyük ihtimalle bağırsak kaynaklı polimerik IgA dır ve barsakta fazla olan IgA seruma ulaşır. Spesifik olarak sekretuvar komponente bağlı olan rotavirüs IgA antikorları enfeksiyondan sonra 4 aydan kısa bir süre içinde serumdan kaybolur. Üstelik enfeksiyondan yaklaşık 1 hafta sonra serumda bulunan immünglobuline bağlı rotavirüs sekretuvar komponentinin miktarı duedonal sıvıdaki miktar ile koreledir. Böylece enfeksiyondan sonraki 4 ay içinde bulunan total rotavirüs spesifik serum IgA varlığının intestinal IgA ile iyi korele olduğu gözükmektedir (29,30). Rotavirüs tarafından enfeksiyona karşı korunmadan sorumlu immün mekanizmalar hala iyi bilinmemektedir. İntrasellüler sitokin flow-sitometri assay ve ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) kullanılarak yapılan insan rotavirüs spesifik T-hücre yanıtı çalışmalarına göre; hem sağlıklı hem de rotavirüs ile enfekte erişkinlerde interferon (IFN)-gama salgılayan CD4+ ve CD8+ rotavirüs-spesifik T hücreleri bulunur. Rotavirüs gastroenteritli çocuklarda bu hücrelerin sayısı düşüktür veya tespit edilemez. Sonuçta, rotavirüs spesifik CD4+ T hücreleri tarafından salgılanan sitokin paterni açık değildir, fakat hem T-helper 1 (TH1) hem de TH2 paterni olabilir (31). 11

20 2.6. BULAŞMA Rotavirüs insandan insana en sık fekal oral yolla bulaşır. Bulaşma kontamine eşyalarla da olabilir. Çocuklar rotavirüs enfeksiyonu ve hastalığı için büyük risk grubunu oluşturmasına rağmen rotavirüs enfeksiyonu yetişkinlerde de ortaya çıkabilir. Bu kişiler özellikle küçük çocuklar ile yakından ilişkide bulunan, kişisel hijyenin zayıf olduğu çocuk yuvaları ve yaşlıların bulunduğu bakım evlerinde olan, sık seyahat eden veya hastanede yatan erişkinlerdir (32). Virüs oldukça bulaşıcı olmasından dolayı rotavirüsün yayılmasını kontrol altına almak çok zordur. Enfekte insanların dışkısında /ml kadar enfeksiyon partikülü bulunur ve enfeksiyonun olabilmesi için yaklaşık 1-10 kadar partikülün olması yeterlidir. Virüsün yayılmasında kusma da önemli bir rol oynamaktadır. Hem semptomatik hem de asemptomatik hastalar genellikle 7-10 gün boyunca rotavirüs partiküllerini etrafa yayarlar. Bu süre özellikle immün yetmezliği olan kişilerde bazen birkaç haftayı bulabilir. Virüs oda ısısında dışkıda aylarca, çevresel yüzeylerde ise günlerce canlı kalabilir. Rotavirüs ile enfekte olmuş metal ve plastik gibi yüzeylerde virüs canlılığını uzun süre koruyabilir. Rotavirüsün transmisyonunda en etkili yüzeyler tuvalet ve lavabodur. Rotavirüs çevrede uzun süre stabil kaldığından kontamine yüzeylere temas veya kontamine su ve yiyeceklerle de rotavirüs bulaşabilir. Rotavirüs partikülleri insan eli üzerinde saatlerce canlılığını koruyabilir. Musluk suyu zayıf bir dezenfektandır. Bu yüzden eller kesinlikle sabunla yıkanmalıdır. Temiz su kullanımı ve dikkatli el yıkama virüsün bulaşmasını azaltmada önemlidir. Kontamine yüzeylerin hemen dezenfekte edilmesi gerekir. Rotavirüs dezenfektanlara oldukça dirençlidir. Fenol, %2 formalin, %5 lysol, %6 H2O2 ve %80-95 etanol etkili dezenfektanlardır. Ayrıca %1 sodyum hipoklorid etkilidir, ancak fekal materyal aktivitesini azaltabilir, bu sebeple dezenfeksiyondan önce yüzeyler deterjanla temizlenmelidir. Klorheksidin, kloroform, eter ve ph 4-9 a dirençlidir (33). 12

21 2.7. KLİ İK BULGULAR Hemen her çocuk 5 yaşından önce rotavirüs ile enfekte olmakta, enfeksiyonu semptomatik veya asemptomatik olarak geçirebilmektedir. Rotavirüs enfeksiyonların %20-40 kadarı asemptomatiktir. Asemptomatik enfeksiyonlar sıklıkla 3 aylıktan küçük bebeklerde görülür. Hastalığın ciddiyetini hem viral hem de konağa ait faktörler etkileyebilir. Viral faktörler arasında VP4 ün bazı alellerinin asemptomatik hastalıkla ilişkili olduğu düşünülmektedir. Malnutrisyon ve yaş gibi konak faktörleri de rotavirüs enfeksiyonunun ciddiyetini etkilemektedir. Malnutrisyon ince bağırsağın düzelmesini geciktirir. Semptomatik rotavirüs enfeksiyonu genellikle yaşa bağlıdır. Yaş ilerledikçe rotavirüs enfeksiyonlarının ciddiyeti ve sayısı azalır. Villus epitel hücreleri üzerindeki rotavirüs bağlayan reseptörlerin miktarının yaşla birlikte azaldığı hayvan çalışmalarında gösterilmiştir. Buna karşılık erişkinlerde enfeksiyonun asemptomatik veya az belirtilerle seyretmesi daha çok immünitenin kazanılmasıyla ilişkilidir. Rotavirüs ile sekonder enfeksiyonlar klinik olarak daha hafif veya asemptomatik şekildedir (25). Hastalığının inkübasyon süresi 1-4 gündür. Rotavirüs enfeksiyonu çocuklarda hafif ateş (%60-65) ve kusma (%60-70) ile başlar. Ateş genellikle o C de 1-2 gün sürer. Önemli dehidratasyon varsa ateş daha yüksek olabilir. Genellikle 1-3 gün süren kusmayı ani başlayan sulu ishal izler. Günde kez olan sulu ishal genellikle 5-8 gün sürer ve ağır sıvı kayıplarına yol açabilir. Karın ağrısı görülebilir. Bazı vakalarda hızlı ve ciddi dehidratasyon özellikle 2 yaşından küçük çocuklarda ölümlere sebep olmaktadır. Gelişmiş ülkelerde hastanede yatan premature bebeklerin büyük risk altında olduğu gösterilmiştir. Maternal antikorun koruyucu etkisinden dolayı 4-6 aydan küçük yeni doğanlarda enfeksiyonlar sıklıkla asemptomatik olup vakaların sadece %10-20 sinde semptomatiktir ve genellikle hafiftir. Ancak prematüre bebeklerde ciddi enfeksiyonlar görülebilir. Anne sütü ile beslenen çocuklarda hastalığın ciddiyeti ve süresi azalır (34,35). Akut gastroenteritlerin yaygın görülen özellikleri arasında dehidratasyon, elektrolit kaybı, metabolik asidoz, beslenme yetersizliği ve bez bölgesi dermatiti gibi belirtiler rotavirüs enfeksiyonunda görülebilir. İmmun yetmezliği olan çocuklarda 13

22 barsak dışı yayılım oldukça yaygın olup hastalık daha ağır seyreder (14). Rotavirüs enfeksiyonları sadece gastrointestinal yolla sınırlı olmayıp hem immün kompetan kişiler hem de immün eksikliği olan enfekte çocuklarda rotavirüs antijen veya viral RNA nın kan, beyin omurilik sıvısı, karaciğer, safra kanalı, mezenterik lenf nodülleri, dalak, böbrek, boğaz ve akciğer gibi birçok ekstraintestinal yerlerde tespit edildiği bildirilmiştir (36). Rotavirüs gastroenteritine sahip çocuklardan alınan serum örneklerinin %43-66 sında viremi görülür (37). Birçok çalışmada rotavirüs gasroenteriti olan çocuklarda santral sinir sistemi enfeksiyon sıklığı %2-5.7 arasında değişmektedir (38). Ağır rotavirüs gastroenteriti olan çocuklarda sekonder bakteriyemi ve candidemi komplikasyonu da gelişebileceği unutulmamalıdır (39) EPİDEMİYOLOJİ Rotavirüsler tüm dünyada bebek ve küçük çocuklardaki gastroenteritlerin en önemli nedenidir. Gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde benzer sıklıkta görülür (40). Dünyada her yıl 5 yaş altı 140 milyon çocuk rotavirüs ile enfekte olmakta, yaklaşık 25 milyonu kliniklere başvurmakta 2 milyonu hastaneye yatırılmakta ve ortalama çocuk rotavirüse bağlı hayatını kaybetmektedir. Bir başka deyişle 5 yaşına altında rotavirüs gastroenteriti olan her 5 çocuktan 1 i kliniklere başvurmakta, her 65 çocuktan 1 i de hastaneye yatırılmakta ve yaklaşık olarak her 293 çocuktan 1 i de rotavirüs gastroenteriti sebebiyle ölmektedir. Bu oran tüm 5 yaş altı çocuklarda görülen ölümlerinin %20 sini oluşturmaktadır (1). Rotavirüs ölümlerinin %80 den fazlası Güney Asya ve Afrika gibi az gelişmiş bölgelerde görülmektedir (3). Gelişmiş ülkelerde ise mortalite düşük ancak morbidite yüksektir. Rotavirüsler tüm dünyada ishale bağlı hospitalizasyonun da en önde gelen sebebidir. Hastaneye yatırılması gereken gastroenterit vakalarının %20-60 ından rotavirüsün sorumlu olduğu gösterilmiştir. Rotavirüs ishaline bağlı hospitalizasyonların oranı gelir seviyesininin artması ile artan bir eğilim göstermektedir (41,42). İnsanlarda hastalık yapan grup A, B ve C rotavirüsleridir. Çocuklarda rotavirüs enfeksiyonlarının çoğuna grup A rotavirüsler sebep olur. Grup A rotavirüs enfeksiyonlarının çoğu endemik olmasına rağmen özellikle hastane ve kreşlerde 14

23 salgınlara sebep olabilir. Grup B rotavirüsü en çok erişkinlerde hastalık yapar, yeni doğan ve çocuklarda semptomatik enfeksiyonlarda nadiren tespit edilir. Grup C rotavirüs, sporadik ishal vakaları ile ilişkilidir, salgınlara nadiren sebep olur. Başlıca besin kaynaklı çocukluk çağı ishali ile ilişkilidir. Grup C rotavirüsleri tüm dünyada bulunmaktadır. İngiltere, Japonya, Asya, Brezilya ve Avrupa da Grup C rotavirüs ishal salgınları bildirilmekle birlikte grup A rotavirüslerinden daha az yaygındır. Brezilya da yapılan bir çalışmada akut gastroenteriti olan hastaneye başvuran 5 yaşın altındaki çocukların %1 inde tespit edilmiştir. Grup D, E, F ve G rotavirüs enfeksiyonları insanlarda gastroenterit ile ilişkili değildir. Rotavirüsün geniş konak dağılımı vardır. İzolatların çoğu yeni doğan hayvanlarda ishale sebep olmaktadır. Grup A rotavirüsları hemen hemen bütün hayvanları enfekte eder. Sığır ve domuz grup B ve C rotavirüsları tespit edilmiştir (41). Rotavirüs enfeksiyonu ılıman iklimlerde tipik olarak kış mevsiminde görülürken tropikal bölgelerde rotavirüs ishali bütün yıl boyunca gözlenir. Global olarak en çok görülen epidemiyolojik önemi olan 5 rotavirüs tipi G1P[8], G3P[8], G4P[8] ve G2P[4] ve G9P[8] bütün suşların %90 dan fazlasını oluşturur. Baskın serotipler, yıldan yıla ve bölgeden bölgeye değişmektedir. Epidemiyolojik çalışmalar bir bölgede de her yıl baskın rotavirüs tiplerinin değişebildiğini göstermiştir. Dünyanın farklı yerlerinde yeni ve nadir serotipler belirli zaman dilimlerinde artıp azalabileceğinden sürekli epidemiyolojik izlem gereklidir (8) TA I Dışkıda rotavirüsün tespiti için pek çok yöntem geliştirilmiştir. Konvansiyonel yöntemler ile virüsün belirlenmesi için dışkı örneklerinin hastalığın ilk 4 günü içinde alınması uygundur. Semptomların başlangıcından 8 gün sonra toplanan örnekler nadiren virüs içerir. Ancak virüs atılımı semptomların süresine bağlı olarak 3 haftaya kadar da sürebilir ve bu süre içinde daha yüksek sensitiviteye sahip moleküler yöntemlerle (RT-PCR; reverse transcription polymerase chain reaction) virüs tespit edilebilir (14).. 15

24 Elektron mikroskobi (EM) rotavirüsün dışkı materyalinde direk olarak görüntülenmesi ve patognomonik iki ve üç tabakalı rotavirüs partiküllerinin hızlı idendifikasyonu için uygundur. Rotavirüs partikülleri akut gastroenterite sebep olan enterik adenovirüslar, norovirüs, sapovirüs ve astrovirüslardan farklı bir morfolojik görünüme sahip olduklarından bu yöntem yüksek bir avantaja sahiptir (43). Rotavirüsün tespiti için yalnızca birkaç örnek araştırılmak istenildiğinde EM en hızlı tanı metodudur, çünkü dışkı örnekleri direkt olarak fosfotungistik asit ile boyanarak birkaç dakika içinde incelenebilir, ancak bu yöntem genellikle rutinde kullanılmaz. Grup A rotavirüsü önceden proteolitik enzim olan tripsin ile muamele edilirse veya besiyerine düşük düzeyde tripsin ilave edilirse hücre kültüründe üretilebilir, ancak daha çok araştırma amacıyla bazı merkezlerde yapılmaktadır. Hücre kültüründe rotavirüsün üretilmesi nötralizasyon yöntemiyle rotavirüs serotiplerinin belirlenmesine izin verir (14). Çeşitli otomatize yöntemler dışkı örneklerinde rotavirüsün belirlenmesi için uygundur. Pek çok laboratuvarda Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ve lateks aglutinasyon (LA) testleri oldukça yüksek sensitiviteye sahip olması, özel ekipmanlara gereksinim duyulmadan kolay uygulanabilir olması, hızlı sonuç vermesi ve spesifik olmayan reaksiyonlar için bir kontrol grubuna sahip olması sebebiyle rotavirüs tanısında yaygın olarak kullanılan testlerdir (43,44). Dışkı örneklerinde rotavirüs antijenlerinin tespiti için ELISA ve LA kitleri ticari olarak mevcuttur. Rotavirüs LA testinin ELISA testine göre sensitivitesi daha düşük olup ELISA testinin sensitivitesi %98-100, spesifitesi %100 ü bulurken LA testinin sensitivitesi %85-90, spesifitesi %100 dür. Ticari ELISA ve LA testleriyle gastroenteritlerin en yaygın sebebi olan sadece rotavirüs Grup A tespit edilir. Serolojik testlerden özellikle ELISA testi rotavirüs spesifik IgM, IgA ve IgG antikor cevabının tespiti için kullanılabilir (14). Grup A rotavirüsleri G serotiplerinin tespiti için G1-G4 tip spesifik monoklonal antikorlara dayanan ticari ELISA testleri epidemiyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. G5, G8, G9 ve G10 gibi diğer tiplerinin belirlenmesi için genotipleme testleri kullanılır (45). Grup A rotavirüs subgrup I ve II tespiti için VP6 üzerindeki iki farklı epitop için spesifik monoklonal antikorların kullanıldığı 16

25 ELISA testi geliştirilmiştir. Akut gastroenteritli hastalardan en çok izole edilen grup A rotavirüs P1A ve P1B serotiplerinin araştırılması için de ELISA testleri vardır. Ancak VP4 antijeninde çapraz reaktif epitoplar bulunduğundan ELISA ile serotip ayırımı tam olmayabilir. Bu sebeple daha çok genotipleme metodları tercih edilir (45). Hücre kültürü, poliakrilamid jel elektroforezi ve polimeraz zincir reaksiyonu gibi testler tanıda nadiren kullanılır. Serolojik tanı için kompleman fiksasyon, nötralizasyon, immünfloresan testleri tanı için tavsiye edilmemesine rağmen araştırma amaçlı kullanılabilir. Önceleri rotavirüs serotiplendirilmesi için hiperimmün serum ile yapılan nötralizasyon testleri kullanılmış, ancak nötralizan antikorlar daha çok dış kapsidin majör proteini olan VP7 ye yönelik olduğundan VP4 serotiplerinin ayırımı etkin bir şekilde yapılamamıştır. Rotavirüsün tespiti için dot hibridizasyon yöntemi membran üzerinde ısı ile denatüre olmuş ve işaretlenmiş tek zincirli rotavirüs traskriptlerinin insitu hibridizasyonu temel alınarak geliştirilmiştir. Yöntem oldukça yüksek spesifiteye sahiptir ve elde edilen sonuçlar EM, ELISA ve RNA analizi gibi diğer testler ile elde edilen sonuçlar ile uygundur. Dışkı örneklerinin çeşitli dilüsyonlarında rotavirüsün tespiti için ELISA ve dot hibridizasyonun karşılaştırıldığı çalışmalarda dot hibridizasyon yönteminin doğrulayıcı ELISA yöntemine göre kez daha fazla sensitif olduğu görülmüştür (46). Rotavirüs grup A nın tespit edildiği tanı testleri arasında gerçek zamanlı polimeraz zincir rekasiyonu (RT-PCR) en önemlisidir ve antijen tespit metodlarına göre çok daha duyarlıdır. Bu yöntem standart elektroferotip yöntemlerinden kez, hibridizasyon yönteminden ise 5000 kez daha duyarlıdır. Bu yöntemle ishalin başlangıcından 4-57 gün sonrasına kadar virüsün atılımı belirlenebilir (45). Rotavirüs tespiti için RT-PCR testinin kullanımı ELISA yöntemi ile tiplendirilemeyen rotavirüs pozitif örneklerin genotiplendirilmesi için uygundur. Rotavirüs aşısı yapımından önce prevalan suşların tespiti ve sonra yeni rotavirüs tiplerinin ortaya çıkışının izlenmesinde grup A rotavirüslarının G ve P genotiplemesi önem taşır. Grup A rotavirüslarının G ve P genotiplemesi için spesifik cdna probları ile nükleik asit hibridizasyon testi, RFLP (restriction fragment length polymorphism), tip spesifik 17

26 primerler ile yapılan RT-PCR, nested RT-PCR, multiplex RT-PCR ve oligonükleotid mikroarray hibridizasyon testleri kullanılır. Genotipleme testlerinden en çok RT-PCR kullanılmaktadır. Grup B ve C rotavirüsların tanısı için RT-PCR testi birçok çalışmada kullanılmıştır. Rotavirüs genomunun poliakrilamid jel elektroforezi (polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE) ile nongrup A rota virüsları, grup A rotavirüslarından ayırt edilebilir. Sensitivitesi %90 dan fazla ve spesifitesi %100 dür. Grup A rotavirüsün kısa elektroferotipleri genellikle subgrup I ve uzun elektroferotipleri ise subgrup II ile ilişkili bulunmuştur. Epidemiyolojik çalışmalarda elektroferotipleme viral bulaşmayı izlemede faydalıdır (46). Rotavirüs enfeksiyonunun serolojik cevabının ölçümünde kompleman fiksasyon (KF) testi, immünfloresan (IF) testi, ELISA, nötralizasyon, hemaglutinasyon inhibisyon ve immünositokimyasal boyama testleri de uygundur. KF testi 6-24 aylık hasta çocuklar arasında antikor cevabını belirlemede diğer testler kadar etkili iken 6 aydan küçük yeni doğanlarda ve yetişkinlerde etkili bir test değildir. Bu yaş grubunda IF, ELISA IgG, ELISA IgM ve ELISA IgA daha etkilidir. Çünkü IgA plasentaya geçemez. Rotavirüs ELISA IgA özellikle pasif olarak elde edilmiş anneye ait IgG antikorlarına sahip olan yenidoğanlarda serolojik cevabın gösterilmesinde oldukça etkilidir (47) TEDAVİ Rotavirüs gastroenteritinin tedavisinde amaç ishal ve kusma sonucu oluşan sıvı ve elektrolit kaybını yerine koymaktır. Sıvı tedavisi yaşa ve sıvı kaybının derecesine göre yapılır. Dehidrate olmayan ve kusması devam etmeyen çocuklara yaşlarına uygun oral beslenmeye devam etmeleri önerilir. Dehidrate olmayan ve kusması devam eden çocuklara evde sıvı alımını veya oral rehidrasyon sıvılarını (ORS) önermede fayda vardır. Evde alınması tavsiye edilen sıvılar; su, anne sütü, çorba ve taze sıkılmış meyve sularıdır. Buna ek olarak her bir sulu dışkıda 10 ml/kg ve her bir kusmada 2 ml/kg kaybedilen gastrointestinal kaybı yerine koymak için oral rehidrasyon sıvısı verilmesi dehidratasyonun önlenmesinde büyük önem taşır (48). Dünya Sağlık Örgütü (WHO) standartlarına göre oral rehidrasyon sıvısı 18

27 formülü: sodyum 90 mmol/l; klorür 80 mmol/l; potasyum 20 mmol/l, sitrat 10 mmol/l ve glikoz 110 mmol/l olmak üzere toplam ozmolaritesi 310 mosm/l dir. Son yıllarda sodyum konsantrasyonu düşük oral rehidrasyon sıvılarının da etkili olduğu bulunmuştur (49). Eğer oral rehidrasyon, sıvı ve elektrolit kaybını yerine koymaz veya hastada ciddi dehidratasyon var ve şokta ise derhal intravenöz sıvı verilmelidir. Bazı çocuklar şiddetli dehidrate olduğunda eğer abdominal distasyon, barsak tıkanması, aşırı kusma veya letarjiden dolayı oral rehidrasyon solüsyonları alamıyorsa intravenöz rehidrasyona ihtiyaç duyabilir. Genellikle hemodinamik stabilite sağlanıncaya kadar serum fizyolojik veya laktatlı ringer solüsyonu ml/kg verilir. Daha önceden klinik denemeler sonucu pek çok çocuğun başlangıçta 30 ml/kg intravenöz sıvının alınımından sonra oral rehidrasyon sıvılarını tolere etmeye başlayabildiği belirlenmiştir. Şiddetli dehidrate olan çocuklar intravenöz sıvı alınımına kadar oral sıvı alınımını sürdürebilirler. Sıvı kaybı devam ettiği sürece kaybın derecesine göre sıvı desteği sürdürülmelidir. Ağır ishal ile ilişkili ölümler, oral rehidrasyon tedavisi ile başarılı bir şekilde azalmasına rağmen bazı çocuklar için problem olmaya devam etmektedir. Çünkü oral rehidrasyon tedavisi düşük kalorilidir ve rehidrasyon ortaya çıktıktan mümkün olduğu kadar kısa bir süre sonra beslenmeye başlanması tavsiye edilir. Klasik diyet olarak akut gastroenterit tedavisi için muz, pirinç ve elma püresi alınması bazı uzmanlar tarafından eleştirilmiş ve bu besinlerin düşük enerjili, az yağlı ve düşük proteinli olduğu belirtilmiştir. Çocukların yaşlarına uygun olarak kompleks karbonhidrat, et, yoğurt ve meyveleri içeren diyetleri tüketmeleri tavsiye edilmektedir (50). Anne sütü sağlıklı infantların beslenmesi için en iyi kaynak olmasına rağmen oral rehidrasyon solüsyonlarından daha fazla ozmolariteye ve daha az sodyuma sahiptir. Ayrıca anne sütünün karbonhidrat kaynağı olan laktoz, akut gastroenterite eşlik eden ciddi disakkaridaz eksikliğinin olduğu vakalarda uygun olmayabilir. Yine de anti-rotaviral özellikleri olan laktoferrin ve laktadherin ve anti-rotaviral IgA anne sütünde bulunduğundan rotavirüs akut gastroenteritine sahip bebeklerin anne sütü ile 19

28 beslenmesinin tedavide yararı vardır. Bütün akut gastroenteriti olan yenidoğan bebeklerin anne sütü ile beslenmeye devam etmesi tavsiye edilmektedir. Yenidoğan bebek dehidrate ise oral rehidrasyon solüsyonları veya intravenöz sıvı tedavisi gereklidir (48). Antiemetiklerin sedasyon, akatizi ve distoni gibi yan etkileri nedeni ile akut gastroenteritlerin tedavisinde rutin kullanılmaları önerilmemektedir. Antimotilite ve antisekretuvar ilaçların da ishale karşı kullanılması tavsiye edilmemektedir. Opiat ve antikolinerjik bazlı ilaçların çocuklar üzerindeki toksisitesi, letarji, invajinasyon koma ve hatta ölüm gibi yan etkileri belirlenmiştir (48). Pek çok geniş spektrumlu antiviral ilaçların etkinliği in vivo şartlarda rotavirüs replikasyonunun inhibitörü olarak araştırılmıştır. Anti-rotavirüs aktivitesine sahip çeşitli adenozin analogları bulunmuştur. Bu anologların viral mrna nın olgunlaşması için gerekli metilasyonu düzenlemede görevli olan S-adenozin homosisteinin hidroliz enziminin aktivitesini engelleyerek işlev gördüğü ileri sürülmüştür. Yapılan çalışmalarda raceadotril in (enkephalinaz inhibitörü) rotavirüs gastroenteritinin de içinde bulunduğu sulu ishali nedeniyle hastaneye yatan çocuk hastaların tedavisinde etkili olduğu gösterilmiştir, ancak bu konu ile ilgili daha fazla çalışmalara ihtiyaç vardır (51) KORU MA Rotavirüs gastroenteritlerinin görülme sıklığı ve ağır hastalık yükü nedeni ile hastalıktan korunma çok önem taşır. Korunmada anne sütü, el yıkama ve dezenfeksiyon gibi önlemlerin yeri olsa da, bakteriyel gastroenteritlerden korunmada önemli olan kişisel ve toplumsal hijyen kuralları rotavirüs enfeksiyonlarının önlenmesinde çok etkili değildir. Rotavirüsların sebep olduğu gastroenteritler, hijyen koşullarından bağımsız olarak, gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde benzer sıklıkta görülür. Bu sebeple rotavirüs ishalinin önlenmesinde tek etkili yöntem aşılamadır. Rotavirüs aşısından beklenen doğal rotavirüs enfeksiyonuna benzer immünite oluşturarak, orta ve ciddi enfeksiyona karşı koruması, hastane yatışları, ölümleri 20

29 önlemesi, morbidite ve ekonomik kayıpları azaltması ve hastalığın süre ve ciddiyetini hafifletmesidir (52, 53). İlk rotavirüs aşı çalışmalarında değişik hayvan rotavirüsları attenüe edilmiş daha sonra ise insan çalışmaları başlatılmıştır. Hayvan orjinli aşılarla ilgili başarısız deneyimlerin ardından reassortant aşı çalışmaları başlatılmıştır. İlk rutine sokulan insan-maymun reassortant rotavirüs aşısı (RotaShield) 1990'larda geliştirilmiş olup Amerika Birleşik Devletleri (ABD) ve Venezuella'da küçük çocuklarda şiddetli rotavirüs ishalini önlemede güvenli ve etkili olduğu gösterilmiş ancak ABD de 1.2 milyon doz aşı uygulamasından sonra 15 olguda invajinasyon gelişmesi nedeni ile piyasaya verildikten 1 yıl sonra, Ekim 1999 da, ruhsatı devam etmesine rağmen kullanımdan çekilmiştir (54). Rotashield aşısının geri çekilmesi yeni aşı geliştirme çabalarını artırmıştır. İki yeni rotavirüs aşısı monovalan Human Rotavirüs Aşısı (HRV) olan Rotarix (GlaxoSmithKline) ve Pentavalan Human-Bovine Reassortant Rotavirüs Aşısı (PRV) olan RotaTeq (Merck) ile ilgili etkinlik ve güvenilirlik çalışmaları tamamlanmış ve 2006 yılından itibaren bu 2 aşı 100 den fazla ülkede ruhsat alarak kullanıma girmiştir. Her iki aşının da güvenilir olduğu ve invajinasyonle ilişkili olmadığı gösterilmiştir. Herhangi bir rotavirüs ishaline karşı %70, şiddetli rotavirüs ishaline karşı ise %90 koruma sağladığı gösterilmiştir (54). Rotavirüs aşılarının, hastane yatışlarını (%96), acil servis başvurularını (%93), iş gücü kayıplarını (%87) azalttığı gösterilmiştir (54,55). Monovalan Human Rotavirüs Aşısı (HRV, RIX4414 suşu, Rotarix), insan rotavirüs suşu G1P1A[8] tipinden oluşan canlı attenüe monovalan bir aşı olup virulan rotavirüs suşu G1P1A[8] tipi doku kültürlerinde birçok pasaj yapılarak attenüe edilmiştir. Barsakta iyi replike olur ve dışkı ile atılır. Rotarix korunmada homotipik antikor yanıtı kadar heterotipik antikor yanıtını uyarır. Monovalan human rotavirüs aşısı (HRV) ile G1 in yanısıra G2, G3, G4 ve G9 gibi diğer serotiplere karşı da nötralizan antikor yanıtı oluşmaktadır (56-60). Rotarix aşısının 6 haftalıktan itibaren oral yolla 2 doz (minimum 4 hafta arayla) uygulanması önerilir. HRV, 2-8 o C de depolanmalı ve saklanmalıdır. Diğer çocukluk aşıları ile birlikte uygulanabilir. 21

30 Monovalan human rotavirüs aşısının immünojenisitesi ve güvenilirliği ilk kez Belçika da erişkinlerde ve Almanya da 1 yaş üstü çocuklarda denenmiştir. Daha sonra, Finlandiya da bebeklerde bir pilot çalışma başlatılmıştır. Bu çalışmada; 2 ve 4. ay şemasıyla 2 doz uygulandığında, HRV nin etkinliğinin %73, ağır rotavirüs gastroenteritine karşı koruyuculuğunun ise %90 dan fazla olduğu olduğu gösterilmiştir (57). Güney Amerika da yapılan daha geniş, çift kör, plasebo-kontrollü çalışmada ise HRV aşısının etkinliği ve barsak tıkanması riski değerlendirilmiştir. On bir Güney Amerika ülkesinin katıldığı ve bebeğe aşı ( bebek aşı grubu) ve plasebo ( bebek plasebo grubu) verilen çalışmada HRV, 2 ve 4. ayda bebeklere 2 doz uygulanmıştır. Her hangi bir aşı dozundan sonraki 31 gün içinde plasebo grubunda 9, aşı grubunda 3 barsak tıkanması vakası saptanmıştır. HRV nin ilk dozundan sonra 100 günlük izlem periyodunda (bebekler 6 aylık olduğunda) aşı grubunda 9, plasebo grubunda ise 16 barsak tıkanması vakası görülmüştür. Çalışma grubundaki infantın 1 yıllık izleminde, aşının ağır rotavirüs gastroenteritine karşı koruyuculuğunun %85, ağır dehidratasyonla seyreden rotavirüs gastroenteritine karşı koruyuculuğunun ise %100 olduğu saptanmıştır. Monovalan human rotavirüs aşısı, G1 serotipine karşı (%92) etkili olduğu gibi G3 (%88), G4 ve G9 (%91) serotiplerine karşı da yüksek oranda koruyuculuk sağlamaktadır. G2 tipine karşı ise %41-67 koruyuculuk sağladığı gösterilmiştir (59). Pentavalan Human-Bovine Reassortant Rotavirüs Aşısı (PRV, RotaTeq), 5 insan-sığır reassortant rotavirüs suşundan oluşan pentavalan, canlı attenüe bir aşıdır. Ensık görülen insan rotavirüs gerotiplerini (G1, G2, G3, G4 ve P1A[8]) içerir. İnsan barsağında Rotarix suşlarına göre daha az replike olur. RotaTeq aşısı beş insan-sığır reassortant rotavirüs suşundan oluşmakta olup sığır rotavirüs suşu WC3 (P7[5]G6) kullanılmıştır. Bu aşının fazla sayıda serotip içerecek şekilde formüle edilmesindeki amaç yüksek koruyucuk sağlamaktır. RotaTeq 2 ml sıvı formdadır ve oral yolla 3 doz (2, 4 ve 6 aylık) halinde uygulanır. İki doz arasında en az 4 hafta olması önerilir. Aşılamaya 6-12 haftada başlanmalıdır. İlk dozun 12 haftadan büyük bebeklere uygulanmasının güvenilirliği yoktur. Aşılama 32. haftaya kadar tamamlanmalıdır (60). 22

31 PRV aşısının barsak tıkanması riskini değerlendirmek amacıyla, 2001 yılında Finlandiya ve ABD de plasebo kontrollü bir çalışma uygulanmıştır. Bu çalışmada, 6-12 haftalık bebeklere 4-10 hafta arayla 3 doz (en son aşı dozu 32 haftayı geçmeyecek sekilde) PRV veya plasebo uygulanmıştır. Daha sonra, Orta Amerika ülkeleri, İsveç, Almanya, Belçika, İtalya ve Tayvan ın da katılımıyla çalışmaya alınan bebek sayısı e ulaşmıştır. Bu geniş çalışma grubunda, her hangi bir aşı dozundan sonraki 42 gün içinde plasebo grubunda 5, aşı grubunda 6 barsak tıkanması vakası saptanmıştır. PRV nin ilk dozundan sonra 1 yıllık izlem periyodunda aşı grubunda 12, plasebo grubunda ise 15 barsak tıkanması vakası bildirilmiştir. Barsak tıkanması için relatif risk 42 gün içinde 1.6 (%95 CI, ) ve 1 yılda 0.9 (%95 CI, ) dur (59). RotaTeq Avrupa ve Amerika da lisans almış olup yapılan ilk çalışmalarda rotavirüs ile ilişkili ishale karşı yaklaşık %75 koruyucu ve ciddi ishale karşı %90 dan fazla etkili olduğu bulunmuştur. Hospitalizasyonu %96 ve kliniklere başvuruları %86 oranında azaltmaktadır (60). Sonuç olarak, yaklaşık bebek üzerinde yapılan çalışmalar her iki yeni rotavirüs aşısının da (monovalan HRV ve PRV) ishal, özellikle ciddi ishale karşı etkin ve güvenli bir korunma sağladığını göstermektedir. İki yeni rotavirüs aşısı Rotarix ve Rotateq 2008 yılı itibariyle 100 den fazla ülkenin bulunduğu Avrupa, Amerika, Meksika, Latin Amerika ülkeleri, Orta Doğu, Asya ve Afrika ülkelerinde lisans alarak kullanıma girmiştir. Ülkemizde de bu iki yeni rotavirüs aşısı lisans almış ve kullanıma girmiştir. Bu iki aşı dışında, dünyanın birçok bölgesinde (Çin, Kore, Endonezya, Almanya ve Brezilya) rotavirüs aşı geliştirme çalışmaları sürdürülmektedir. Lanzhou lamb rotavirüs (LLR) aşısı 2000 yılında Çin de Lanzhou Enstitüsü tarafından üretilen monovalan canlı attenüe oral aşıdır. LLR aşısında kullanılan kuzu rotavirüsu P[12]G10 tipinde olup ilk kez 1985 de izole edilmiştir ve hücre kültüründe pasajlar yapılarak attenüe edilmiştir. Çin de lisans alan bir aşıdır, Aşı tek doz oral yolla 2-24 aylık çocuklara verilir. Tek doz aşının etkinliği %73.3 bulunmuştur ve aylık çocuklarda etkiniğin %80.9 oranla 2-11 aylık çocuklara göre (%60) daha yüksektir (60). 23

32 Aşı gelişimine başka bir yaklaşım yeni doğanlarda asemptomatik enfeksiyona sebep olan bazı rotavirüs suşlarının kullanılmasıdır. İnsan neonatal rotavirüs P2A[6]G3 suşu faz II çalışmasında 3, 5 ve 7 aylık bebeklere üç doz oral olarak verilmiş ve koruyuculuğu %54 bulunmuştur. Aşının etkinliğinin artırılması için çalışmalar sürmektedir. Diğer neonatal suşlardan ikisi Hindistan da yeni doğanlardan izole edilen 116E suşu P8[11]G9 ve I321 suşu P8[11]G10 canlı aşı adayları olup preklinik çalışmaları yapılmaktadır. Bu neonatal aşı suşları (Bharat BioTech, Ltd) 116E ve I321 doğal olarak oluşan insan-sığır reassortant rotavirüsleridir (61). Rotavirüs enfeksiyonlarına karşı inaktif rotavirüs suşları veya baculovirüs ta eksprese edilen virüs benzeri partiküllerin kullanılarak oral aşıların geliştirilmesi için çalışmalar da vardır ve hayvan modellerinde test edilmektedir. Ayrıca rotavirüsün bakterilerde eksprese edilen birçok yapısal proteinlerinden oluşan subünit aşıların üretimi ve DNA aşıları için de çalışılmaktadır (62). 24

33 3. GEREÇ VE YÖ TEM Bu çalışmaya, Ocak 2008 ile Ocak 2009 tarihleri arasında Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları Bölümüne başvuran, 0-5 yaş arası akut gastroenteriti olan ve dışkı örneklerinde immünokromatografik test ile rotavirüs antijeni pozitif saptanan hastalar dahil edildi. Taze dışkıda grup A rotavirüs antijeni varlığı saptanan hastalara rotavirüs gastroenteriti tanısı konuldu. Hastalardan elde edilen dışkı örnekleri Revers Transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT- PCR) ile tiplendirme yapılıncaya kadar -70 C de saklandı Rotavirüs Antijen Tayini Taze dışkı örneklerinde rotavirüs antijen varlığı Certest, Biotec marka kalitatif immünokoromatografik test ile gösterildi. Dışkı örneği 1 ml tampon çözelti ile süspanse edildikten sonra yaklaşık 150 mikrol karışım kit içerisinde bulunan strip üzerine damlatıldı ve sıvının reaksiyon alanına doğru ilerlemesi beklenerek 10 dakika sonra değerlendirildi. Yeşil renkli kontrol bandına ek olarak T harfi ile belirlenen bölgede kırmızı bandın ortaya çıkması durumunda rotavirüs antijeni pozitif kabul edildi. Testler Ankara Üniversitesi Cebeci Hastanesi Merkez Mikrobiyoloji Laboratuvarı nda bir teknisyen tarafından uygulandı ve sonuçlar laboratuvar kayıt defterine kaydedildi. Çalışmaya dahil edilen tüm hastaların demografik özellikleri (yaş ve cinsiyet), başvurdukları ay, ölçülen en yüksek vücut sıcaklıkları, ishal ve kusma süreleri, günlük ishal ve kusma sayıları, dehidratasyon dereceleri, yatarak ya da ayaktan izlem gerekliliği, oral ya da parenteral hidrasyon gereksinimleri kaydedildi. Olguların hepsi Ruuska ve Vesikari (4) tarafından tanımlanan rotavirüs gastroenteriti sayısal skorlama sistemine göre değerlendirilerek 0-20 puan arası olacak şekilde skorlandı (Tablo 1). Bu skorlama sistemine göre 5 puan alanlar hafif, 6-10 arası puan alanlar orta, 11 puan alanlar ağır hastalık olarak kabul edildi. 25

34 Tablo 1. Rotavirüs gastroenteriti sayısal skorlama sistemi (4). Bulgular İshalin süresi (gün) > 6 Maksimum dışkılama sayısı/24 saat > 6 Kusmanın süresi (gün) 1 3 > 3 Maksimum kusma sayısı/24 saat > 5 Ateş < 37.0 o C o C o C > 39 o C Dehidratasyon Yok %1-5 > %6 Tedavi Yok Rehidratasyon Hastaneye yatış Puan Örnek toplama tamamlandıktan sonra saklanan dışkı örneklerinden sırası ile aşağıda belirtilen yöntemler doğrultusunda rotavirüs tipleri çalışıldı. 26

35 3.2. Gaita Örneklerinden Rna Ekstraksiyonu RNA ekstraksiyonunda asit guanidin tiyosiyanat/fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi kullanıldı. Total RNA izolasyon ajanı Trizol (Gibco BRL, Katalog no: ) kullanılarak, üreticinin önerileri doğrultusunda yapıldı. Tüm işlemler eldiven, maske ve gözlük kullanılarak gerçekleştirildi. Toplanan gaita örnekleri, fosfat ile tamponlanmış salin (PBS) solüsyonu içerisinde santrifüjlenek %20 oranında sulandırılarak süspanse edildikten sonra, bu süspansiyondan alınan 500 µl örnek, 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpü içerisinde eşit hacimde Trizol ile pipetaj yapılarak homojenize edildi. Homojenize edilen örnekler, oda ısısında dakika inkübe edilerek nükleoprotein komplekslerinin tamamen ayrışması sağlandı. Üzerlerine 0,2 ml kloroform eklenerek 15 saniye süreyle elde hızla çalkalandı ve oda ısısında 2-3 dakika inkübe edildi. Daha sonra örnekler x g de, +4 C de, 15 dakika santrifüjlendi. Santrifüj işlemi sonrasında en altta kırmızımsı renkli fenolkloroform fazı, ortada bir ara faz ve en üstte renksiz bir sıvı fazı olmak üzere üç faz elde edildi. RNA yı içeren en üstteki faz yeni bir tüpe alınarak 0,5 ml izopropil alkol içerisinde çöktürüldü. Örnekler oda ısısında 10 dakika inkübe edildikten sonra x g de, +4 C de, 10 dakika santrifüjlendi. Bu aşamada tüpün altı ve yanlarında RNA çöküntüsü gözlendi. Süpernatan atıldıktan sonra pellet 1 ml %75 etanol ile yıkandı. Örnek vortekslenerek karıştırıldı ve 7500 x g de, +4 C de, 5 dakika santrifüjlendi. Etanol uzaklaştırıldıktan sonra pellet 5-10 dakika oda ısısında kurumaya bırakıldı ve elde edilen RNA, RNase içermeyen su içerisinde birkaç kere pipetaj yapılarak ve 55 C de 10 dakika inkübe edilerek çözündürüldü cd A Eldesi cdna sentez kiti (Roche diagnostik, Almanya) ile A grubu rotavirüslerin VP7 ve VP4 gen bölgelerine spesifik primerler (Beg9, End9 ve con2, con3) kullanılarak, üreticinin önerileri doğrultusunda her örnek için iki ayrı cdna sentezi gerçekleştirildi. Bunun için, 5 µl RNA örneği toplam hacim 12,5 µl olacak şekilde, her bir primerden 1,5 µl (15 pmol) içerecek şekilde karıştırıldı. Hazırlanan karışım 65 C de 5 dakika inkübe edildikten sonra üzerine, kit içerisinde sunulan 5X 27

36 reaksiyon tamponu (4 µl), dntp karışımı (2 µl), revers transkriptaz enzimi (1 µl) ve Ribolock (0,5 µl) eklendi. Karışım, 42 ºC de 60 dakika, 72 ºC de 10 dakika bekletildikten sonra PCR yapılana kadar +4 ºC de muhafaza edildi VP7 (G) Genotiplerinin Belirlenmesi Bu amaçla, A grubuna ait olarak belirlenen örneklerden, literatürde belirtilen yöntem üzerinde minör değişiklikler yapılarak, iki aşamalı PCR reaksiyonu gerçekleştirildi (63). İlk aşamada Beg9 (5 GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC 3 ) ve End9 (5 GGT CAC ATC ATA CAA TTC TAA TCT AAG 3 ) primerleri kullanılarak elde edilen cdna lardan, yine aynı primerler kullanılarak gen9 bölgesinin tamamı (1062 bç) amplifiye edildi (Şekil 3). M NK Şekil 3. beg9 ve end9 primerleri kullanılarak gerçekleştirilen Rotavirüsün VP7 bölgesine ait 1062 bç uzunluğundaki genom bölgesi, M: 50 bç lik moleküler büyüklük belirleyici (Fermantas, Litvanya), 1-5: Hastalara ait PCR ürünleri, NK: negatif kontrol Bu amaçla, 50 µl toplam hacim içerisinde, 5 µl cdna, 2,5 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp karışımı, 30 pmol Beg9 ve End9 primerleri, 2,5 U Taq DNA polimeraz enzimi ve %7 BSA olacak şekilde reaksiyon karışımı hazırlandı. PCR şartları şu 28

37 şekilde gerçekleştirildi: 94 C de 2 dakika ilk denatürasyonu takiben, 30 siklus olacak şekilde 94 C de 1 dakika, 40 C de 2 dakika, 72 C de 2 dakika, son olarak 72 C de 7 dakika son uzama uygulandı. Elde edilen ürünler %2 lik agaroz jel elektroforezinde 100V altında 2 saat yürütüldükten sonra etidyum bromid ile boyanarak UV altında görüntülendi. Bu aşama sonunda gözle görülebilir bir amplifikasyon ürünü olmasa bile tüm PCR ürünleri 2. amplifikasyona tabi tutuldu. İkinci amplifikasyonda, VP7 tiplerini belirlemek üzere, 7,5 µl PCR ürünü, 15 pmol tiplendirme primerleri aat8 (5 GTC ACA CCA TTT GTA AAT TCG 3 ), abt1 (5 CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 3 ), act2 (5 CAA TGA TAT TAA CAC ATT TTC TGT G 3 ), adt4 (5 CGT TTC TGG TGA GGA GTT G 3 ), aet3 (5 CGT TTG AAG AAG TTG CAA CAG 3 ), aft9 (5 CTA GAT GTA ACT ACA ACT AC 3 ) ve RVG9 (5 GGT CAC ATC ATA CAA TTC T 3 ), 2,5 U Taq polimeraz, 2,5 mm MgCl 2, ve 0,2mM dntp karışımı içerecek şekilde 100 µl lik reaksiyon karışımı hazırlandı. PCR şartları şu şekilde ayarlandı: 94 C de 1dakika, 42 C de 2 dakika, 72 C de 1 dakika olacak şekilde 30 siklusu takiben 72 C de 7 dakika son uzama uygulandı. Elde edilen PCR ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutulduktan sonra etidyum bromid ile boyanarak UV altında görüntülendi. Elde edilen ürünün büyüklüğüne göre G1 (749 bç), G2 (652 bç), G3 (374 bç), G4 (583 bç), G8 (885 bç) ve G9 (306 bç) tipleri tespit edildi (63) VP4 (P) Genotiplerinin Belirlenmesi Bu amaçla, A grubuna ait olarak belirlenen örneklerden, literatürde belirtilen yöntem üzerinde minör değişiklikler yapılarak, iki aşamalı PCR reaksiyonu gerçekleştirildi (64). İlk aşamada con2 (5 ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC 3 ) ve con3 (5 TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A 3 ) primerleri kullanılarak elde edilen cdna lardan, yine aynı primerler kullanılarak gen4 bölgesinin tamamı (876 bç) amplifiye edildi. Bu amaçla, 50 µl toplam hacim içerisinde, 5 µl cdna, 2,5 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp karışımı, 30 pmol con2 ve con3 primerleri, 2,5 U Taq DNA polimeraz enzimi ve %7 BSA olacak şekilde reaksiyon karışımı hazırlandı. 29

38 PCR şartları şu şekilde gerçekleştirildi: 94 C de 2 dakika ilk denatürasyonu takiben, 30 siklus olacak şekilde 94 C de 1 dakika, 50 C de 2 dakika, 72 C de 2 dakika, son olarak 72 C de 7 dakika son uzama uygulandı. Elde edilen ürünler %2 lik agaroz jel elektroforezinde 100V altında 2 saat yürütüldükten sonra etidyum bromid ile boyanarak UV altında görüntülendi (Şekil 4). Bu aşama sonunda gözle görülebilir bir amplifikasyon ürünü olmasa bile tüm PCR ürünleri 2. amplifikasyona tabi tutuldu. Şekil 4. con 2 ve con 3 primerleri kullanılarak gerçekleştirilen Rotavirüsün VP4 bölgesine ait 876 bç uzunluğundaki genom bölgesi, M: 50 bç lik moleküler büyüklük belirleyici (Fermantas, Litvanya), 1-5: Hastalara ait PCR ürünleri, NK: negatif kontrol İkinci amplifikasyonda, VP4 tiplerini belirelemek üzere, 7,5 µl PCR ürünü, 15 pmol tiplendirme primerleri 1T-1 (5 TCT ACT TGG ATA ACG TGC 3 ), 2T-1 (5 CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC 3 ), 3T-1 (5 TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA 3 ), 4T-1 (5 TGA GAC ATC GCA ATT GGA C 3 ), 5T-1 (5 ATC ATA GTT AGT AGT CGC 3 ), HCR3 (5 TGA TTG AGC TTT TAA TGA TAT CAC 3 ) ve con3, 2,5 U Taq polimeraz, 2,5 mm MgCl 2, ve 0,2 mm dntp karışımı içerecek şekilde 100 µl lik reaksiyon karışımı hazırlandı. PCR şartları şu şekilde ayarlandı: 94 C de 1dakika, 50 C de 2 dakika, 72 C de 2 dakika olacak şekilde 30 siklusu 30

39 takiben 72 C de 7 dakika son uzama uygulandı. Elde edilen PCR ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutulduktan sonra etidyum bromid ile boyanarak UV altında görüntülendi. Elde edilen ürünün büyüklüğüne göre P4 (345 bç), P6 (483 bç), P8 (267 bç), P9 (391 bç), P10 (583 bç) ve HCR3 (749 bç) tipleri tespit edildi (63,65) Az rastlanan (sığır/domuz kökenli) A grubu rotavirüslerin VP7 (G) Tiplendirmesi G tiplendirmesi yapılamayan örnekler, sıklıkla sığır/domuz kökenli olmakla beraber insanlarda da enfeksiyon yapabilen G tiplerini belirlemek üzere ilk gen4 amplifikasyonunu takiben elde edilen PCR ürünlerinin 5 µl si şablon olarak kullanılarak, Beg9, FT5 (5 CAT GTA CTC GTT GTT ACG TG 3 ), DT6 (5 CTA GTT CCT GTG TAG AAT C 3 ), HT8 (5 CGG TTC CGG ATT AGA CAC 3 ), ET10 (5 TTC AGC CGT TGC GAC TTC 3 ) ve BT11 (5 GTC ATC AGC AAT CTG AGT TGC 3 ) primerleri ile ikinci bir amplifikasyona tabi tutuldu. Reaksiyon karışımı, 25 µl toplam hacim içerisinde 2,5 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 10 pmol primer ve %8 BSA içerecek şekilde hazırlandı. PCR şartları 30 siklus olmak üzere şu şekilde uygulandı: 94 C de 1 dakika, 55 C de 2 dakika, 72 C de 1 dakika. Elde edilen ürünler, %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutularak etidyum bromid ile boyandıktan sonra UV altında görüntülendi. Elde edilen ürünün büyüklüğüne göre G5 (780 bç), G6 (500 bç), G8 (274 bç), G10 (715 bç) ve G11 (337 bç) genotipleri belirlenmiş oldu (66) Az rastlanan (sığır/domuz kökenli) A grubu rotavirüslerin VP4 (P) Tiplendirmesi P tiplendirmesi yapılamayan ancak A grubu olduğu belirlenen örnekler, sıklıkla sığır/domuz kökenli olmakla beraber insanlarda da enfeksiyon yapan P tiplerini belirlemek üzere ilk gen4 amplifikasyonunu takiben, elde edilen PCR ürünlerinin 5 µl si şablon olarak kullanılarak, con2, PNCDV (5 CGA ACG CGG GGG TGG TAG TTG 3 ), puk (5 GCC AGG TGT CGC ATC AGA G 3 ), posu (5 CTT TAT CGG TGG AGA ATA CGT CAC 3 ), pgott (5 GCT TCA ACG TCC TTT AAC ATC AG 3 ) ve pb223 (5 GGA ACG TAT TCT AAT CCG GTC 3 ) 31

40 primerleri kullanılarak ikinci amplifikasyona tabi tutuldu. Reaksiyon karışımı, 25 µl toplam hacim içerisinde 2,5 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 10 pmol primer ve %8 BSA içerecek şekilde hazırlandı. PCR şartları 30 siklus olmak üzere şu şekilde uygulandı: 94 C de 1 dakika, 55 C de 2 dakika, 72 C de 1 dakika. Elde edilen ürünler, %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutularak etidyum bromid ile boyandıktan sonra UV altında görüntülendi. Elde edilen ürünün büyüklüğüne göre az rastlanan P genotipleri olan PNCDV (sığır kaynaklı-620 bç), puk (sığır kaynaklı-552 bç), posu (domuz kaynaklı-500 bç), pgott (domuz kaynaklı-423 bç) ve pb223 (sığır kaynaklı-314 bç) belirlenmiş oldu (67). RT-PCR ile G ya da P tipleri belirlenemeyen hastalar çalışma dışı bırakıldı. Belirlenen rotavirüs G genotipleri ile klinik skor puanları arasındaki ilişki araştırıldı İstatistik İstatistiksel analizler SPSS programı kullanılarak Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik Anabilim Dalı nda yapıldı. Olguların istatistiksel değerlendirmeleri non parametrik testler ile yapıldı. Verilerin analizi için Mann Whitney-U, ki-kare ve medyan testleri kullanıldı. Belirlenen rotavirüs genotipleri arasında klinik skor puanı ve yatarak ya da ayaktan izlem açısından fark olup olmadığı Kruskal Wallis Testi (ANOVA) ile değerlendirildi. p<0.05 bulunan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Çalışmamız Helsinki deklarasyonu prensiplerine göre ve hastanemiz etik kurulundan alınan onay ile yürütüldü. Hasta aileleri çalışma ile ilgili olarak detaylı bir şekilde bilgilendirilerek ve onamları alınarak bu çalışmaya dahil edildi. Bu çalışma Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından proje numarası ile desteklendi. 32

41 4. BULGULAR Çalışma süresince Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Enfeksiyon Hastalıkları Bölümüne başvuran 5 yaş altı akut gastroenteriti olan 494 hastadan dışkıda immünokoromatografik yöntem ile rotavirüs antijen tayini istendi. Grup A rotavirüs antijeni pozitif saptanan toplam 137 (%28.1) hastanın dışkı örnekleri saklanarak demografik ve klinik verileri kayıt edildi. Bu gruptaki çocukların hiçbirine rotavirüs aşısı uygulanmamıştı. Saklanan 137 dışkı örneği daha sonra RT- PCR ile incelendiğinde 100 (%72.9) hastanın G ya da P genotipi belirlenebilirken tip tayini yapılamayan 37 hasta çalışma dışı bırakıldı. RT-PCR ile rotavirüs tipi belirlenen 100 hastadan 57 si (%57) erkek, 43 ü (%43) kız hasta idi. Hastaların ortanca yaşı 16 ay (5 gün-59 ay) olarak saptandı. Hastaların yaşlara göre dağılımı; <3 ay 13 hasta (%13), 3-5 ay arası 7 hasta (%7), 6-11 ay arası 14 hasta (%14), ay arası 34 hasta (%34), ay arası 12 hasta (%12), ay arası 6 hasta (%6), ay arası 14 hasta (%14) arasında idi. Olguların büyük çoğunluğu 24 ayın altındaki (n=68, %68) çocuklardan oluşuyordu. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların yaşlara göre dağılımı Şekil 5 ile gösterildi hasta sayısı < 3ay 3-5 ay 6-11 ay ay ay ay ay Yaş (ay) Şekil 5. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların yaşlara göre dağılımı 33

42 Olguların 38 i (%38) kış, 24 ü (%24) sonbahar, 25 i (%25) ilkbahar, 11 i (%11) yaz mevsiminde başvurdu. On dört hasta (%14) Ocak ayında, 10 hasta (%10) Şubat, 6 hasta (%6) Mart, 10 hasta (%10) Nisan, 9 hasta (%9) Mayıs, 4 hasta (%4) Haziran, 3 hasta (%3) Temmuz, 4 hasta (%4) Ağustos, 2 hasta (%2) Eylül, 8 hasta (%8) Ekim, 14 hasta (%14) Kasım, 14 hasta (%14) da Aralık aylarında başvurdu. Rotavirüs enfeksiyonu tüm yıl boyunca görülmekle birlikte sonbahar ve kış aylarında pik yaptığı görüldü. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların aylara göre dağılımı Şekil 6 ile gösterildi hasta sayısı Ocak Şubat Mart Nisan Mayıs Haziran Temmuz Ağustos Eylül Ekim Kasım Aralık Şekil 6. RT-PCR ile rotavirüs genotipi belirlenen hastaların aylara göre dağılımı Hastaların 58 i (%58) ayaktan izlenirken 42 si (%42) yatırılarak izlendi. Ayaktan izlenen 58 hastanın 15 (%25.9) inde rehidrasyon desteğine ihtiyaç duyulmaz iken 43 (%74.1) hastaya oral rehidrasyon önerildi. Yatırılarak izlenen 42 hastanın hepsine parenteral sıvı desteği verildi. Yatırılarak izlenen hastaların ortanca yaşı 11 ay (5 gün-59 ay), ayaktan izlenen hastaların ortanca yaşı ise 22 ay (3,5-59 ay) olarak bulundu. Her iki grup arasında ortanca yaş açısından istatistiksel olarak anlamlı fark vardı (p=0.002). Hastalar Vesikari tarafından tanımlanan rotavirüs ishali sayısal skorlama sistemine göre değerlendirildiğinde ortanca klinik skor puanı 10 (3-18) olarak bulundu. Beş puan ve altında alan 7 hasta (%7) hafif, 6-10 puan arasında alan 51 hasta (%51) orta, 11 puan alan 42 hasta (%42) ise ağır rotavirüs gastroenteriti 34

43 olarak kabul edildi. Ayaktan izlenen hastaların ortanca skor puanı 9 (3-14), yatırılarak izlenenlerin ortanca skor puanı ise 12 (4-18) olarak bulundu. Ayaktan ve yatırılarak izlenen hastaların ortanca skor puanları karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı fark vardı (p<0.001). Ayaktan ve yatan hastaların yaş ve klinik skor puanları açısından karşılaştırılması Tablo 2 de gösterildi. Olguların klinik skor puanları ile yaşları arasındaki ilişkiye bakıldığında anlamlı bir ilişki saptanamadı (p=0.649 r= ). Tablo 2. Ayaktan ve Yatan Hastaların Yaş ve Skor Puanı Açısından Karşılaştırılması Ayaktan Yatan P Yaş 22 ay (3-59 ay) 11 ay (5 gün-59ay) P=0.002 Klinik Skor Puanı 9 (3-14) 12 (4-18) P<0.001 Dışkı örneklerinden önce RT-PCR testi ile VP4 (P) ve VP7 (G) rotavirüs genomları ve ardından multipleks PCR testi ile P (VP4) ve G (VP7) genotipleri tespit edildi (Şekil 7 ve Şekil 8). Şekil 7. VP4 multiplex PCR ürünleri: M: 50 bç moleküler büyüklük belirteci (Fermentas, Litvanya), 1-3: P[6] (483 bç), 4: P[8] (267 bç), 5: P[6] (483 bç) + P[8] (267 bç), 6:P[4] (345 bç), 7: P[10] (583 bç), 8: HCR3 (749 bç), 9: P[8] (267 bç) + HCR3 (749 bç), NK: negatif kontrol. 35