Prof.Dr. Ayhan ELİÇİN danışmanlığında, İlkay BARITCI tarafından hazırlanan İvesi Koyun Irkında Genetik Çeşitlilik ile Verim Özellikleri Arasındaki İli

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ İVESİ KOYUN IRKINDA GENETİK ÇEŞİTLİLİK İLE VERİM ÖZELLİKLERİ ARASINDAKİ İLİŞKİLER İlkay BARITCI ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır

2 Prof.Dr. Ayhan ELİÇİN danışmanlığında, İlkay BARITCI tarafından hazırlanan İvesi Koyun Irkında Genetik Çeşitlilik ile Verim Özellikleri Arasındaki İlişkiler adlı tez çalışması 30/11/2007 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy çokluğu ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Zootekni Anabilim Dalı nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Başkan: Prof.Dr. Ayhan ELİÇİN Ankara Üniversitesi, Zootekni Anabilim Dalı İmza: Üye: Prof.Dr. Gürsel DELLAL Ankara Üniversitesi, Zootekni Anabilim Dalı İmza: Üye: Prof.Dr. Cengiz SANCAK Ankara Üniversitesi, Tarla Bitkileri Anabilim Dalı İmza: Üye: Doç.Dr. Mehmet Ali YILDIZ Ankara Üniversitesi, Zootekni Anabilim Dalı İmza: Üye: Doç.Dr. Birol DAĞ Selçuk Üniversitesi, Zootekni Anabilim Dalı İmza: Yukarıdaki sonucu onaylarım. İmza: Prof.Dr. Ülkü MEHMETOĞLU Enstitü Müdürü

3 ÖZET Doktora Tezi İVESİ KOYUN IRKINDA GENETİK ÇEŞİTLİLİK İLE VERİM ÖZELLİKLERİ ARASINDAKİ İLİŞKİLER İlkay BARITCI Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Zootekni Anabilim Dalı Danışman: Prof.Dr. Ayhan ELİÇİN Bu araştırma, Güneydoğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü nde kayıtlı olarak yetiştiriciliği yapılan 81 baş İvesi ırkı koyundan elde edilen DNA örneklerinde gerçekleştirilmiştir. OarFCB20, OarFCB128 ve OarFCB304 mikrosatelit lokuslarında genetik polimorfizm değerlerinin incelendiği araştırmada OarFCB20 lokusunda baz arasında 16, OarFCB128 lokusunda bazlar arası 11 ve OarFCB304 lokusunda bazlar arasında ise 22 adet allel gözlenmiştir. Laktasyon süt verimleri bakımından gruplandırılan İvesi koyun ırkından koyunlarda gruplara özgün olarak tespit edilen alleller, OarFCB20 lokusunda yüksek verim grubu 110 bazlık allel ve OarFCB128 lokusunda orta verim grubu 108 baz allelidir. Genel grubu için gözlenen heterozigotluk değerleri, OarFCB20 lokusunda 0,901; OarFCB128 lokusunda 0,654 ve OarFCB304 lokusunda ise 0,667 olarak hesaplanmıştır. Araştırmada hesaplanan parametreler; Genel için ortalama allel sayısı 16,33; Düşük grupta 9,33; Orta grupta 12,67 ve Yüksek grupta 14 olarak belirlenmiştir. Ortalama beklenen heterozigosite gruplar için sırasıyla 0,8646; 0,8505; 0,8570 ve 0,8793 olarak hesaplanmıştır. Polimorfik Bilgi İçeriği (PIC) değerleri de sırasıyla 0,8451; 0,8159; 0,8252 ve 0,8490 olarak bulunmuştur. 2007, 59 Sayfa Anahtar Kelimeler: İvesi, mikrosatelit, genetik çeşitlilik, laktasyon süt verimi i

4 ABSTRACT Ph.D. Thesis RELATIONSHIPS BETWEEN GENETIC POLYMORPHISM AND YIELD PROPERTIES IN AWASSI SHEEP ilkay BARITCI Ankara University Graduate School of Natural and Applied Science Department of Animal Science Supervisor: Prof.Dr. Ayhan ELİÇİN This study were established on 81 blood samples obtained from Awassi sheep raised under record in Southeast Anatolian Research Institute. In this study, microsatellite genetic polymorphisms were investigated in OarFCB20, OarFCB128 and OarFCB304, observed 16 alleles in bases; 11 alleles in bases and 22 alleles in bases, respectively. Private alleles in Awassi sheep which were grouped by lactation milk yield were 110 base in OarFCB20 high group and 108 bases in OarFCB128 moderate group. Observed heterozygosities for general group were calculated in OarFCB20, in OarFCB128 and in OarFCB304 locus. Parameters researched in this study were Mean Allel Numbers in general group, 9.33 in low group; in moderate group and 14 in high group. Mean Expected Heterozygosities were ; ; and , respectively. Polymorphic Information Content (PIC) values were found ; ; and , respectively. 2007, 59 pages Key Words: Awassi, microsatellite, genetic polymorphism, lactation milk yield ii

5 TEŞEKKÜR Bu çalışmanın hazırlanmasında ve yürütülmesinde önerileri ile yardımcı olan danışman Hocam Prof.Dr. Ayhan Eliçin ve Prof.Dr. Gürsel Dellal a, materyal temin aşamasında yardımcı olan Yard.Doç.Dr. Nihat Tekel, Yard. Doç.Dr. Deniz Şireli ve Dr. Orhan Yılmaz dostlarıma, DNA izolasyon çalışmasını birlikte yaptığımız Araş.Gör. Hasan Meydan a, PCR ve kapilar elektroforez aşamalarının yürütüldüğü REFGEN laboratuarı personeli Ahmet Reşat Türkyılmaz a teşekkürlerimi bir borç bilirim. Uzakta olsalarda, destekleri ile hep yanımda olan aileme ve beni candan seven mesai arkadaşlarıma da teşekkür ediyorum. İlkay BARITCI Ankara, Kasım 2007 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii ŞEKİLLER DİZİNİ... v ÇİZELGELER DİZİNİ... vi 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ÖZETLERİ Biyolojik Çeşitlilik Genetik çeşitlilik Tür çeşitliği Ekosistem çeşitliliği Ekolojik olaylar ve işlevler çeşitliliği Canlılarda Genom Büyüklükleri (C Değerleri) C değeri Paradoksu Ökaryotlarda Genom Organizasyonu Ökaryotlarda DNA Tekrar Dizileri Mikrosatelitler Mikrosatelit polimorfizmleri Mikrosatelit lokuslarının izolasyonu Doğru mikrosatelitlerin seçimi Tekrar tipi Tekrar uzunluğu Ölçüm ve belirleme Mikrosatelitlerin yorumlanması Genetik Çeşitlilik Ölçüsü Heterozigosite F IS, F IT ve F ST Parametreleri Kaynak Özetleri MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem Hayvan gruplarının belirlenmesi Kan örneklerinin alınması Genomik DNA izolasyonu Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kapilar elektroforez İstatistik analizler için kullanılan paket programlar ARAŞTIRMA BULGULARI TARTIŞMA VE SONUÇ OarFCB20 Lokusunun Değerlendirilmesi OarFCB128 Lokusunun Değerlendirilmesi OarFCB304 Lokusunun Değerlendirilmesi Genel Değerlendirme KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ iv

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Ökaryotik genomun organizasyonu (Page and Holmes 2000) Şekil 2.2 Farklı tip ardışık tekrar dizilerinin kromozomal yerleşimleri (Strachan and Read 1999) Şekil 2.3.a. Hatasız dinükleotid tekrarları, b. Hatalı dinükleotid tekrarları; nokta mutasyonu okla gösteriliyor, c. Karışık mikrosatelit; GT/CA dan GA/CT ye geçiş gösteriliyor (Hoelzel 1998) Şekil 4.1 OarFCB20 lokusuna ait örnek elektroforeogramlar Şekil 4.2 OarFCB128 lokusuna ait örnek elektroforeogramlar Şekil 4.3 OarFCB304 lokusuna ait örnek elektroforeogramlar v

8 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Farklı bakteri taksonlarında genom büyüklükleri (Li and Graur 1991)... 8 Çizelge 2.2 Farklı taksonlarda genom büyüklükleri (Li and Graur 1991)... 9 Çizelge 2.3 Ökaryotlarda DNA tekrar dizilerinin genel özellikleri (Page and Holmes 2000) Çizelge 3.1 Laktasyon süt verimleri için tanımlayıcı değerler Çizelge 3.2 Laktasyon süt verimine ait varyans analizi tablosu Çizelge 3.3 Düzeltilmiş laktasyon süt verimlerine ait tanımlayıcı değerler Çizelge 3.4 Tampon çözeltilerin molaritesi/miktarı ve içerikleri Çizelge 3.5 Lokuslara ait özellikler Çizelge 3.6 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) programı Çizelge 4.1 OarFCB20 lokusunda allel frekans değerleri Çizelge 4.2 OarFCB128 lokusunda allel frekans değerleri Çizelge 4.3 OarFCB304 lokusunda allel frekans değerleri Çizelge 4.4 Mikrosatelit lokuslarında genetik parametre değerleri Çizelge 4.5 OarFCB20 lokusunda F IS değerleri Çizelge 4.6 OarFCB128 lokusunda F IS değerleri Çizelge 4.7 OarFCB304 lokusunda F IS değerleri Çizelge 4.8 Lokuslarda heterozigotluk durumlarına göre tanımlayıcı değerler Çizelge 4.9 Lokuslarda gruplara göre homozigot/heterozigot tanımlayıcı değerleri Çizelge 4.10 Lokuslararasında heterozigotluk durumlarına göre tanımlayıcı değerler. 49 vi

9 1. GİRİŞ Biyolojik süreçlerin insan yaşamında kullanımı insanlık tarihi kadar eski bir geçmişe dayanır. Bu anlamda geleneksel biyoteknoloji, insan toplulukları tarafından temelindeki bilimsel mekanizma bilinmeden, yazılı tarihin başından bu yana ekmek yapımında, alkollü içeceklerin mayalandırılmasında, kültür bitkilerinin ve evcil hayvanların ıslahında yüzyıllardır uygulanmaktadır (Anonim 2007a). Başlangıçta zanaatsal bir yaklaşımla kullanılan bu süreçlerin temel biyolojik bilimlerde 18. yüzyılda ortaya çıkan gelişmelere paralel olarak bilimsel ve teknolojik kontrolü devreye girmiştir. Biyoteknoloji; biyoloji ve teknoloji kelimelerinden türetilerek, bilinen ilk tanımı; 1919 yılında Karl ERSHY tarafından biyolojik sistemlerin yardımıyla hammaddelerin yeni ürünlere dönüştürüldüğü işlemlerdir şeklinde yapılmıştır (Anonim 2007a). Moleküler biyoloji ve moleküler genetik bilimlerinde 1950 li yıllardan itibaren ortaya çıkan gelişmeler, 1970 li yıllarda biyoteknoloji alanında meyvesini vermeye başlamıştır. Buna bağlı olarak da moleküler düzeyde yapılan genetik manipulasyonlarla verimliliğin ve üretkenliğin artırıldığı, yeni ürünlerin üretilebildiği modern biyoteknoloji doğmuştur. Gelişmiş ve modern tekniklerin biyolojik sistemlere uygulandığı günümüzde, mutasyon uygulamaları ve/veya rekombinant DNA teknolojisinin yardımıyla geliştirilen mutant ve transgenik organizmalar (genetik mühendisliği teknikleriyle genetik yapısı değiştirilmiş organizma) hemen her alanda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bu gelişmelere paralel olarak biyoteknolojinin tanımı da değişikliğe uğrayarak canlıların, canlı sistemlerin ve biyolojik işlemlerin bilim ve mühendislik teknikleri uygulanarak, mal ve hizmet üretmek amacıyla kullanılması şeklinde tanımlanır olmuştur. Birleşmiş Milletler Biyolojik Çeşitlilik Sözleşmesi altında yer alan, 2004 yılında yürürlüğe giren Cartagena Biyogüvenlik Protokolü nde modern biyoteknoloji rekombinant DNA ve nükleik asitin hücrelere ya da organellere doğrudan enjekte edilmesini içeren in vitro nükleik asit teknikleri ya da geleneksel ıslah ve seleksiyonda kullanılmayan teknikler olan ve doğal fizyolojik 1

10 üreme veya rekombinasyon engellerinin üstesinden gelen, sınıflandırılmış familyanın ötesinde hücrelerin füzyonu şeklinde tanımlanmıştır (Anonim 2007a). Modern biyoteknolojide, yalnızca canlılar değil, canlı sistemler ve biyolojik işlevler de girdi olarak kullanılabilmektedir. Geleneksel biyoteknolojinin ürünleri insanın yalnızca temel ihtiyaçlarına cevap verebilirken, modern biyoteknolojinin ürün ve hizmetleri tıpta (insan veya hayvan genlerinin aktarıldığı bakteriler tarafından fermantasyon yoluyla elde edilen ilaçlar, gen terapisi vb.), sanayide, tarımda (transgenik bitkiler) ve hayvancılıkta (transgenik hayvanlar) çok değişik amaçlarla kullanılabilmektedir. Bu teknikle, teoride doğada bulunan herhangi bir canlı hücredeki (bakteri, böcek, hayvan, bitki vb.) bir karakter diğer bir canlıya aktarılabilmektedir. Bir anlamda her canlı türü potansiyel olarak, biyoteknolojik gelişmeler için ayrı değeri olan bir biyolojik zenginlik ve gen kaynağıdır (Anonim 2007a). Çok geniş bir uygulama alanı olan biyoteknolojiyi, uygulandığı biyolojik varlıklara göre adlandırmak mümkündür. Bitki biyoteknolojisi; bitki, organ, doku ve hücrelerinin yapay besi ortamlarında kültürü, çoğaltılması ve bunların genetik olarak değiştirilmesini kapsar. Bilindiği gibi tarımsal ürünler binlerce yıldır geliştirilmektedir. Bunlar ilk olarak yiyecek, hayvan yemi, lif ve ilaca ihtiyacı olan insanlar tarafından yapılmıştır. İnsanlar yüksek verimli olan bitkileri toplayarak yetiştirdiler. Bu seçim işlevi, kalıtımın bilimsel özelliklerinin anlaşılmaya başlanmasından çok önceleri, ürün ıslahının devam ettirici gücü oldu. Genler geleneksel bitki ıslahı yöntemleriyle (melezleme, mutasyon, poliploidi ve seleksiyon), akraba türlerden veya cinslerden ürünlere aktarıldı. Bazı durumlarda, bu aktarım işlemi bitkiler arasında, normalde gerçekleşme olasılığı çok düşük olan veya hiç bulunmayan, zorunlu tozlaşma veya melezleme yolu ile gerçekleştirildi. Fakat bütün genetik müdahaleler ve değişimler geleneksel ıslahta akraba tür veya cinsler arasında olmuştur. Yeni teknolojiyle genetik olarak değiştirilmiş organizmalarla yapılacak ıslahta türler arası gen aktarımı sadece akraba türlerle kısıtlı olmayıp herhangi iki canlı arasında yapılabilmektedir. Gen mühendisliği yoluyla yeni bir genetik kimliğe bürünmüş olan tek bir hücre, hücre kültürü ve doku kültürü teknikleriyle, son özelliği hiç bozulmadan milyonlarca sayıda çoğaltılabilir. Bunların 2

11 her biri pazarlanabilir, laboratuarlarda ve arazide büyütülebilir. Özel büyüme ortamlarında istenilen ürünü vermeleri sağlanabilir (Anonim 2007a). Hayvan ve bitki biyoteknolojisinin uygulama alanları olarak aşağıdakileri sayabiliriz; herbisitlere, böceklere, virüslere dayanıklı transgenik bitki geliştirilmesi, hastalıklara dayanıklılığın artırılması, erkek kısır bitkilerin üretimi ve strese (Soğuk, kuraklık vb) dayanıklılığın artırılması (Anonim 2007a). Moleküler genetik alanındaki gelişmeler hayvan ıslahına da aynı şekilde yansımıştır. Artık bütün dünyada ekonomik önemi olan çiftlik hayvanlarında, moleküler genetik teknikleri kullanılarak, hayvanların verim özellikleri, yüksek karakterleri tespit edilerek, bu özelliklerin populasyonlarda artırılması çalışmaları yapılmaktadır. Bunu yapmak için de mevcut populasyonların genetik yapılarının belirlenmesi gerekmektedir. Populasyonların genetik yapıları belirlenirken önceleri protein düzeyinde çalışmalar yapılmaktaydı. Gelişen bilim ve teknoloji ile birlikte çalışmalar DNA düzeyine inmiştir. DNA düzeyindeki çalışmalarda en çok kullanılan markerlerden biri de mikrosatelitlerdir. Dünyanın birçok ülkesindeki araştırıcılar, kendi ülkelerine özgü hayvan populasyonlarında mikrosatelit markerleri kullanarak çalışmalar yapılmaktadır. Son yıllarda sığır, koyun ve keçi DNA sında birçok yeni genetik polimorfizm gösteren bölgeler bulunmuştur. Türkiye de DNA düzeyindeki çalışmalar oldukça yeni sayılabilecek durumdadır. Bu çalışmanın amacı koyunlarda polimorfik olduğu daha önceden tespit edilmiş çeşitli mikrosatelitlerin polimorfizmlerinin analiz edilmesi ve bunların Türkiye yerli ırkı olan İvesi koyun ırkında süt verimi bakımından oluşturulan üç ayrı verim grubu içinde belirlenerek gruplar arasında mikrosatelit lokuslar bakımından farklılığın ortaya konulması amaçlanmıştır. 3

12 2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Biyolojik Çeşitlilik Biyolojik çeşitlilik, ekosistemlerin insanlığın gönenci için zorunlu olan yaşam destek sürecini sürdürebilme yeteneğinin ve sağlıklı çevrenin bir göstergesidir. İster kültürel isterse ekolojik boyutuyla olsun çeşitlilik; bir sisteme renk, güzellik, çeşni katan, istikrar, güç ve canlılık kazandıran dinamik bir özelliktir. Biyoçeşitlilik tüm canlı gruplarında ve organizasyon seviyelerinde yaşamın çeşitliliğini ifade etmektedir (Anonim 2007b). Biyolojik çeşitliliğin; Genetik, Tür, Ekosistem, Ekolojik olaylar ve işlevler çeşitliliği olmak üzere dört ana bölümden oluştuğu söylenebilir (Anonim 2007b) Genetik çeşitlilik Bir türün veya populasyonun tüm üyelerinin sahip olduğu genlerin oluşturduğu bütüne gen havuzu denir. Gen havuzunda genlerin bir ya da daha fazla biçimi bulunur. Aynı genlerin farklı formları allel olarak adlandırılır. Allel çeşitliliği, populasyonların genetik çeşitliliği sayılmaktadır (Anonim 2007b). Polimorfizm: Bir populasyonda veya populasyonlar arasında, bir genin allelleri ya da bir kromozomun homologlarıyla birleşen çeşitli fenotipik formların varlığı yani bir lokusta bir allelden fazlasının bulunması olgusudur. Diğer bir ifade ile bir populasyonda bir lokusta bulunan allellerin, en az %5 inin farklılık göstermesidir (Camp and Arms 1984, Becker and Deamer 1991, Bourdon 1997, Goldstein and Schlötter 2000). İnsan vücut çatısı özelliklerindeki belirgin farklılıkların da net olarak gösterdiği gibi DNA diziliminde normal bir değişkenlik vardır. DNA dizilimindeki değişkenlik, yani polimorfizm, yaklaşık her 500 nükleotidde bir görülür. Kuşkusuz, her genomda DNA kopma ve eklenmeleri ve tek baz değişiklikleri vardır. Sağlıklı toplumlarda bu 4

13 değişiklikler kodlanmış proteinin işlevinde herhangi bir değişikliğe neden olmayan noktalarda veya DNA nın kodlayıcı olmayan bölgelerinde görülür (Murray et al. 1996). Polimorfizm kavramı, fenotip veya karakterler üzerine önemli bir bakış açısı kazandırmaktadır. Kulak kepçelerinin şeklindeki varyasyon, kolayca gözlenebilen bir polimorfizm örneğidir (Anonim 2007b). Kromozom, protein veya DNA yapısındaki bireysel farklılıklar, çoğunlukla laboratuar metotları ile belirlenebilir. Fakat herhangi bir DNA nükleotid varyasyonunun bir hastalık mutasyonu mu yoksa bir polimorfizm mi olduğunu belirleyen; genin yapı ve ifade durumudur. Fonksiyonu etkileyen karakterler nadirdir ve hastalık olarak gözlenir; hastalık oluşturmayan varyasyonlar ise ortaktır ve karakter, varyant veya polimorfizm olarak adlandırılır (Wilson 2000). Heterozigotluk derecesi: Populasyonda heterozigot genlerin yüzdesi veya oranı olarak tanımlanır. Her gen lokusu, bir allelin birbirinin aynı iki kopyasını (homozigot) ya da farklı 2 allelin birer kopyasını (heterozigot) taşımaktadır. Polimorfik gen lokusu için 5 bireyin 2 si heterozigot ise heterozigotluk, 2/5=0,4 veya %40 olarak hesaplanır. Diğer 23 gen lokusu polimorfik olmadığı veya tek bir allele fikse olduğu durumda, bu gen lokuslarında heterozigotluk mümkün değildir. 24 gen için her bir genin heterozigotluk değerinden, ortalama heterozigotluk hesaplanabilir. Böylece, ortalama heterozigotluk; 0,4 (polimorfik lokus) (diğer 23 lokus) = 0,4/24 (0,017) olarak hesaplanır (Anonim 2007b). Heterozigotluk, bir türe ait genetik çeşitliliğinin (Ht; Ht=Hs+Dst); ne kadarının türü oluşturan her bir populasyonun kendi içindeki genetik çeşitlilikten (Hs), ne kadarının populasyonlar arasındaki çeşitlilikten (Dst) kaynaklandığını değerlendirmek için kullanılmaktadır (Anonim 2007b). Bir türün genetik çeşitliliği daha çok populasyonlar arasındaki çeşitlilikten kaynaklanıyor ise, türün genetik çeşitliliğinin sürdürülebilmesi için çok sayıda farklı populasyonun korunma altına alınması gerekmektedir. Diğer taraftan, genetik çeşitlilik 5

14 daha çok her populasyonun kendi içindeki çeşitlilikten kaynaklanıyor ise, farklı populasyonların korunma altına alınmasının öncelikli olmadığı söylenebilir (Anonim 2007b). Genetik çeşitliliği fazla olan türlerin değişen çevre şartlarına uyum sağlama olasılığı, diğer türlerden daha fazladır. Genetik çeşitlilik, bir türün devamlılığının sigortasıdır (Anonim 2007b) Tür çeşitliği Biyolojik tür kavramı; doğal koşullar altında birbirleriyle çiftleşebilen ve üreme yeteneğine sahip yavru yetiştirme potansiyelinde olan bireylerin ait olduğu taksonomik bir birimdir (Anonim 2007b). Shannon çeşitlilik indeksi, sadece bir ekosistemde bulunan tür sayısını değil, aynı zamanda bu türlerin göreceli yoğunluğunu da dikkate alır. Bir ekosistemdeki tür sayısı, sadece tür zenginliğini ifade eder, çeşitliliği açıklamaz (Anonim 2007b). Örneğin; A ve B ekosistemlerinin her ikisinde de 3 tür (X, Y, Z) bulunduğunu düşünelim. Bu durumda, her iki ekosistemin tür zenginliği birbirine eşittir. Yalnız, A ekosistemindeki türlerin göreceli yoğunluklarının birbirine çok yakın olduğunu (X:40, Y:30, Z:40), B ekosistemindeki türlerin göreceli yoğunluklarının ise birbirinden çok farklı olduğunu (X:90, Y:10, Z:10) düşündüğümüzde, A ekosistemi B ekosistemine göre daha çeşitlidir. Çünkü B ekosisteminde, bireylerin çoğu bir türe aittir (Anonim 2007b). Tür çeşitliliği, bir bölgedeki bitki ve hayvan türleri ile alttürlerinin sayısını ve yoğunluğunu ifade eder. Ancak, tür çeşitliliği ele alınırken taksonomik çeşitlilik de göz önünde bulundurulmalıdır. İncelediğimiz iki bölge de aynı sayıda tür içerebilir. Ancak bu bölgelerden biri sadece cins düzeyinde tek bir takson içerirken, diğeri cins düzeyinde 2 veya daha çok taksona sahip olabilir. Bu örnekte, tür sayısı aynı olmasına rağmen tür çeşitliliği ikinci durumda daha fazladır (Anonim 2007b). 6

15 2.1.3 Ekosistem çeşitliliği Belli bir alanda yaşayan ve birbirleriyle sürekli etkileşim içinde olan canlılar ile bunların cansız çevrelerinin oluşturduğu bütüne ekosistem denir. Büyük, küçük tüm ekosistemler şu temel öğelerden oluşur. - Canlı Öğeler (üreticiler, tüketiciler ve ayrıştırıcılar) - Cansız Öğeler (inorganik maddeler, organik maddeler ve fiziksel koşullar) Bir ekosistemin nerede bittiğine ve bir diğerinin nerede başladığına karar vermek, daha doğrusu bir ekosistemin sınırlarını belirlemek çok zordur (Anonim 2007b). Aralarındaki sınırlar belli olsa bile, ekosistemleri farklı tipler halinde sınıflandırmak çok zordur. İki farklı ekosistemin tek bir ekosistem tipi olarak değerlendirilebilmesi için, aralarındaki benzerliğin ne kadar olması gerektiği belirlenmelidir (Anonim 2007b). Ekosistem çeşitliliği, önce habitat çeşitliliğinin, sonra da tür çeşitliliğinin ortaya çıkmasını sağlayan önemli bir faktördür. Bir bölgedeki ekosistemlerin, daha küçük ölçekte de habitatların çeşitliliği, biyolojik çeşitliliğin kaçınılmaz bir parçasıdır (Anonim 2007b) Ekolojik olaylar ve işlevler çeşitliliği Ekolojik olaylar ve işlevler çeşitliliği, biyolojik çeşitliliğin işlevsel boyutunu oluşturur. Genlerin, türlerin ve ekosistemlerin birbirleri ve çevreleri ile etkileşimleri, ekolojik süreçlerle sağlanmaktadır. Böylece süreçler çeşitliliği biyolojik çeşitliliğin bileşenleri arasındaki karşılıklı dengeyi ve düzeni sağlar (Anonim 2007b). 2.2 Canlılarda Genom Büyüklükleri (C Değerleri) Haploid genomdaki DNA miktarı, genom büyüklüğü veya C değeri olarak tanımlanmaktadır. Bu değer her tür için karakteristik olup tür içinde sabittir. C değerleri hem prokaryot hem ökaryot türleri arasında oldukça çeşitlilik göstermektedir (Li and 7

16 Graur 1991, Strachan and Read 1999, Freeman and Herron 1998, Lewin 2000; Page and Holmes 2000). Bakterilerin farklı türlerinin genom büyüklükleri yani C değerleri incelendiğinde yaklaşık 20 kat değişkenlik gösterdiği görülmektedir (Çizelge 2.1). Bu değerler hücre içi zorunlu parazitlerde ~6x10 5 iken birçok mavi-yeşil algde ~6x10 7 civarındadır. Bakterilerin sahip oldukları gen sayısının yaklaşık arasında değiştiği bilinmektedir. Diğer bir deyişle bakteri türleri arasında C değerlerinde gözlenen değişkenlik ile gen sayısı bakımından gözlenen değişkenlik uyumlu görülmektedir. Nitekim bakteri genomunda kodlamayan DNA bölgelerinin fazla olmaması yani %8-12 civarında olması da bu uyumu desteklemektedir (Li and Graur 1991, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Çizelge 2.1 Farklı bakteri taksonlarında genom büyüklükleri (Li and Graur 1991) Takson Genom büyüklükleri (kb) Oran (En yüksek / En düşük) Öbakteriler Gram negatif Gram pozitif Mavi-yeşil algler Mikoplazmalar Arkeobakteriler C değeri Paradoksu Ökaryotların C değerleri, prokaryotların C değerlerine nazaran oldukça büyüktür. Bunun istisnai durumları da mevcuttur. Örneğin bir maya olan Saccharomyces cerevisiae, birçok gram pozitif bakteri ve mavi-yeşil algden daha küçük genom büyüklüğüne sahiptir (Li and Graur 1991, Freeman and Herron 1998, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Bununla beraber ökaryotların C değerleri arasındaki değişkenlik, prokaryotlarda gözlenenden oldukça fazladır. Ökaryotlarda C değerleri 8,8x10 6 bç den 6,9x10 11 bç ne kadar değişebilmektedir yani genom büyüklükleri arasında kat bir değişkenlik 8

17 söz konusudur (Çizelge 2.2) (Li and Graur 1991, Freeman and Herron 1998, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Çizelge 2.2 Farklı taksonlarda genom büyüklükleri (Li and Graur 1991) Takson Genom büyüklükleri (kb) Oran (En yüksek / En düşük) Tek hücreliler Kamçılılar Silliler Kök bacaklılar Mantarlar Hayvanlar Süngerler Halkalı solucanlar Yumuşakçalar Kabuklular Böcekler Derisi dikenliler Çenesizler Kıkırdaklı balıklar Kemikli balıklar Kurbağalar Sürüngenler Kuşlar Memeliler Bitkiler Algler Eğreltiler Çıplak tohumlular Kapalı tohumlular En fazla çeşitlilik özellikle tek hücrelilerde ~ ve kökbacaklı amiplerde ~ kat gibi yüksek seviyede görülmektedir. Bunun aksine memeliler, kuşlar ve sürüngenlerin C değerlerinde gözlenen çeşitlilik yaklaşık 2-4 kat gibi oldukça düşük seviyededir (Li and Graur 1991, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Canlılarda her filumdaki en düşük DNA miktarına sahip canlı, o filum için gerekli minimum C değeri olarak alınmaktadır. Minimum C değerleri kıyaslandığında, canlılarda genom büyüklüğü arttıkça organizmanın gelişmişlik seviyesinin (organizmal kompleksite) de arttığı görülmektedir. Ancak evrimsel ağacın üst basamaklarındaki yüksek ökaryotik canlılara baktığımızda, DNA miktarı ile organizmal kompleksite 9

18 arasındaki uyumun kaybolduğu da gözlenmektedir. Örneğin amfibilerden X. Ieavis ile insanın aynı genetik kompleksiteye (DNA uzunluğu) sahip olmalarını gelişmişlik seviyeleri ile açıklamak mümkün değildir. Böcek, amfibi ve bitki türleri arasında bile C değerlerinde ~ kat farklılıkların bulunduğu da görülmektedir (Li and Graur 1991, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Türler arasında genom büyüklükleri bakımından gözlenen yüksek orandaki çeşitliliği ne organizmal kompleksite ne de taşıdıkları kodlayıcı gen sayısı ile ilişkilendirmek mümkün olmadığı için ortaya oldukça ilginç bir durum çıkmaktadır. Örneğin memeli türleri ile kıyaslandıklarında, evrimsel açıdan daha basit canlılar olan birçok protist türünde DNA miktarının memelilerinkinden daha fazla olması organizmal kompleksiteyi yansıtmamaktadır. Buna ilaveten komplekslikleri bakımından birbirine yakın türlerin ve hatta fenotipik olarak birbirlerinden ayırt edilemeyen ikiz türlerin bile C değerleri birbirlerinden farklı olabilmektedir. Bu çelişki yani, genomdaki genetik bilgi (genetik kompleksite) ile organizmal kompleksite arasında belirgin bir ilişkinin bulunmaması C değeri paradoksu (çelişkisi) olarak ifade edilmektedir (Li and Graur 1991, Freeman and Herron 1998, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). 2.4 Ökaryotlarda Genom Organizasyonu C değeri çelişkisinin nedenlerini anlayabilmek amacıyla mukayeseli olarak ökaryotik canlılarda DNA/DNA hibridizasyon çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalardan birinde Britten ve Kohne 1968 yılında, DNA yeniden birleşme (hibridizasyon/reassosiasyon) kinetiklerinin analizi sonucu ökaryotik genomlarda farklı Cot değerleri ile karakterize edilebilen yüksek derecede tekrarlayan DNA, Orta derecede tekrarlayan DNA ve Tek kopya DNA olmak üzere üç farklı tip DNA dizilerinin bulunduğunu göstermişlerdir (Li and Graur 1991, Freeman and Herron 1998, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Yüksek derecede tekrarlayan DNA dizileri birkaç 100 bç lik tekrar birimlerinin ortalama defa tekrarlanması sonucu meydana gelmektedir. Orta derecede tekrarlayan DNA dizilerinin ise yaklaşık bç uzunluğundaki tekrar 10

19 birimlerinin yaklaşık 100 defa tekrarlanmasıyla oluştukları görülmektedir (Li and Graur 1991, Freeman and Herron 1998, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Organizmaların sahip oldukları gen sayıları ile organizmal kompleksiteleri arasında pozitif korelasyon görülmektedir. Ökaryotlarda kodlayan genlerin sayısı yaklaşık olarak den e kadar değişmektedir. Gen sayısında gözlenen bu 33 katlık çeşitliliğin, C değerleri arasındaki katlık çeşitliliği açıklamak için yetersiz kaldığı da açıkça görülmektedir. Ökaryotlarda kodlayıcı ve düzenleyici dizilerin genomik oranının yaklaşık %3 gibi çok düşük seviyede olduğu gösterilmiş bulunmaktadır. Bu durumda geriye kalan %97 gibi oldukça yüksek seviyede kodlamayan dizilerin varlığı C değeri çelişkisini güçlendirmektedir. Diğer bir deyişle, ökaryotik genomun büyük bir çoğunluğu herhangi bir genetik bilgi içermeyen DNA dan oluşmaktadır. Ökaryotlarda bu kodlamayan DNA dizilerinin miktarı 3x10 6 bç den 1x10 11 bç ne kadar değişmektedir (x ) (Li and Graur 1991, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Şekil 2.1 Ökaryotik genomun organizasyonu (Page and Holmes 2000). Ökaryotlarda genomik organizasyon Şekil 2.1 de özetlenmektedir. Farklı organizmalar arasında, kodlayan ve kodlamayan DNA bölgelerinin ortalama uzunlukları arasındaki farklılıklar ile bu organizmaların gen uzunlukları ve genom 11

20 büyüklükleri arasında da belirgin bir ilişki bulunmamaktadır. Fakat rdna daki genlerin tekrar derecesi ile genom büyüklükleri arasında pozitif bir ilişki bulunmuştur (Page and Holmes 2000). Genomda kodlayan DNA dizileri içinde yer alan ve tekrarlamayan DNA segmentleri, tek kopya DNA veya özgün DNA olarak isimlendirilmekte ve yapısal gen olarak kabul edilmektedirler. Kodlamayan ökaryot DNA dizilerinin büyük bir kısmını oluşturan tekrar dizilerinin herhangi bir ürünü yoktur. Herhangi bir ürün kodlamamasına rağmen çok sayıda tekrarlar içeren bu diziler her zaman ilgi konusu olmuştur (Li and Graur 1991, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Bu diziler hakkında bildiklerimiz arttıkça, ökaryotik genoma şekil veren evrimsel mekanizmalar hakkında da daha fazla bilgi sahibi olacağımız açıktır. Örneğin, bu dizilerin bazılarının tamamen kendi yararları için genom içerisinde dağıldıkları tartışılmaktadır ve bu nedenle söz konusu diziler bencil DNA olarak adlandırılmaktadır. Hatta bu dizilerin bazıları, diğer genlerin fonksiyonlarını engellemek suretiyle, kendi kopya sayılarını artırdıkları için ultrabencil DNA olarak düşünülmektedir. Ayrıca kodlamayan tekrar dizilerinin niteliği ve tekrar sayılarındaki türe özgü farklılıklar, genomik büyüklüklerin aynı filumda yer alan türler arasında farklılık göstermesinin başlıca sebebi olarak kabul edilmektedir (Page and Holmes 2000). 2.5 Ökaryotlarda DNA Tekrar Dizileri Ökaryotlarda DNA tekrar dizileri, genom içinde ardışık veya dağılmış olarak bulundukları gibi farklı uzunluklarda da olabildikleri ve genellikle aynı tekrar birimlerinden oluşmalarına rağmen farklı kompozisyondaki nükleotit dizilerinden de oluşabildikleri bilinmektedir. Herhangi bir genomda kodlamayan DNA dizileri içinde yer alan tekrar dizilerinin oranı farklı taksonlarda çeşitlilik göstermektedir. Bu oranlar mayada %20 iken, memelilerde %60, bitkilerde ise %80 civarındadır (Li and Graur 1991, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Ökaryotlarda DNA tekrar dizilerinin genom içindeki lokalizasyonlarına göre, genel olarak lokalize ardışık tekrar dizileri ve dağılmış tekrar dizileri şeklinde iki gruba 12

21 ayrıldığı da bilinmektedir. Ökaryotlarda DNA tekrar dizilerinin genel özellikleri Çizelge 2.3 de verilmektedir. Çizelge 2.3 Ökaryotlarda DNA tekrar dizilerinin genel özellikleri (Page and Holmes 2000) DNA Tekrar dizileri Tekrar (kopya) Sayısı Organizasyon Satelit DNA Yüksek derecede tekrarlanan (> 10 4 ) Ardışık tekrar Minisatelit ve mikrosatelitler Orta derecede tekrarlanan Ardışık tekrar Hareketli Elementler Orta ve yüksek derecede tekrarlanan Dağılmış Birçok ökaryotik genomun birbiri ardınca, yüksek derecede tekrarlayan DNA dizilerini içerdikleri görülmektedir. Örneğin bir kanguru türü olan Dipodomys ordii genomunun %50 si üç tip tekrar dizisi ailesinden oluşmaktadır: AAG (240 milyon kez), TTAGGG (220 milyon kez) ve ACACAGCGGG (120 milyon kez). Bu aileler tamamen homojen değildir ve konsensus dizilerinde bir veya iki nükleotidlik farklılık bulunduran varyant formları da içermektedir. Nitekim TTAGGG ailesi tekrarlarının bazı birimlerindeki dizilerin TTAGAG olduğu bilinmektedir. Fakat yine de yüksek derecede tekrar eden ve ardışık olarak genomun belirli bir bölgesinde lokalize olan bu diziler aynı nükleotid kompozisyonuna sahip olarak kabul edilir. Söz konusu diziler CsCl yoğunluk gradyanı ile ayrıldıklarında, esas DNA bandından ve smear oluşturan çeşitli uzunlukta diğer heterojen kompozisyondaki DNA fragmanlarından, bir veya daha fazla sayıda kalın bantlar şeklinde ayrılırlar. Bu nedenle bu diziler satelit DNA olarak isimlendirilirler. Satelit DNA dizilerinin ayırıcı özellikleri arasında yaklaşık bç lik tekrar bloklarından oluşması, tekrar bloklarının farklı tekrar dizileri taşıması, tekrar dizilerinin heterojen olması sayılabilir (Li and Graur 1991, Strachan and Read 1999, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Bazı türlerde, yüksek derecede tekrarlayan ardışık diziler farklı kromozomlarda dağılmış olarak bulunurken, bazı türlerde ise bu dizilerin yerleşimlerinin özel kromozomlara sınırlandığı görülmektedir. Örneğin satelit DNA dizilerinin Drosophila nasutoldes genomunun %60 ını oluşturduğu ve dört kromozomdan yalnızca birinde lokalize olduğu görülmektedir (Li and Graur 1991, Strachan and Read 1999, Lewin 2000, Page and Holmes 2000). Satelit DNA genellikle işe yaramayan DNA olarak kabul 13

22 edilse de sentromer dizilerini oluşturduğu, kinetokor yapısında yer aldığı ve bölünme sırasında kromozomların ayrılmasında rol oynadığı kabul edilmektedir. Satelit dizilerden oluşan sentromer dizilerinin yapısal heterokromatin yapıda olduğu da bilinmektedir. Buna karşılık 2-5 bç ve bç uzunluğundaki daha kısa ardışık tekrar dizilerine sırasıyla mikrosatelitler (STR=Short Tandem Repeats) ve minisatelitler denilmektedir. Bu diziler satelit dizilere nazaran kromozomlar üzerinde türe özgü bir şekilde dağınık olarak bulunurlar. Mikrosatelitlerdeki tekrar dizileri yüksek homojenliğe sahiptirler (Li and Graur 1991, Debrauwere et al. 1997, Strachan and Read 1999, Lewin 2000, Page and Holmes 2000) (Şekil 2.2). Hareketli elementler bencil DNA grubuna girerler ve transpozisyon yoluyla genom içinde dağınık şekilde bulunurlar (Page and Holmes 2000, Gümüş 2002). Şekil 2.2 Farklı tip ardışık tekrar dizilerinin kromozomal yerleşimleri (Strachan and Read 1999) 2.6 Mikrosatelitler Mikrosatelitler ileri derecede polimorfik DNA markerleri olup, kanatlılar dahil birçok türde geniş bir uygulama alanına sahiptirler. Tüm genoma hemen hemen eşit dağılmış olmaları, genom haritalama projeleri için kullanışlı olmalarını sağlamaktadır. Populasyon genetiği, babalık ve akrabalık tayininde sahip oldukları yüksek çeşitlilik onları genetik bir marker haline getirmiştir. Mikrosatelitler, doğal populasyonların 14

23 yapılarının araştırılmasında gün geçtikçe daha çok önem kazanmaktadırlar (Hoelzel 1998, Beuzen et al. 2000, Goldstein and Schlötter 2000, Kaiser et al. 2000). Mikrosatelitler, 1-6 baz çifti uzunluğundaki tekrar ünitelerini içeren, kısa ardışık tekrarlı dizilerdir. Yüksek miktarda ökaryotik genomlarda bulunmakla beraber prokaryotlarda da düşük frekanslarda bulunmaktadırlar. 70 den fazla tekrar ünitesi içerebilirler ve tüm genom boyunca dağılmışlardır. Örneğin memelilerde en yaygın motif olan GT/AC, ortalama her 30 kilobazda bir ortaya çıkmaktadır (Hoelzel 1998, Beuzen et al. 2000). Mikrosatelitlerin genom içinde kodlayıcı ve düzenleyici fonksiyonları olduğu düşünülmektedir (Goldstein and Schlötter 2000) Mikrosatelit polimorfizmleri Mikrosatelit mutasyonları, DNA kayması olarak adlandırılan intramoleküler bir mutasyon mekanizmasının neden olduğu tekrar sayılarındaki değişikliklerdir. En yaygın mutasyonlar tek bir tekrar ünitesinin değişiklikleridir. Bu tür mikrosatelit mutasyonlarında, mutasyon sürecinin basamak basamak yorumlanma olanağı vardır. Belirlenen mutasyon oranları 10-3 den 10-6 ya kadar değişmektedir. Mikrosatelitlerin allelik durumu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile ortaya konmaktadır. Tekrar ünitelerine bitişik olan primerler PCR amplifikasyonu için kullanılmaktadır. Yüksek çözünürlükteki jeller üzerindeki veya kapilar elektroforez ile PCR ürünlerinin ölçülmesi; tekrar sayısını belirleme ve farklı alleller arasındaki tekrar sayılarındaki varyasyonu ortaya koyma olanağı sağlar (Hoelzel 1998, Beuzen et al. 2000) Mikrosatelit lokuslarının izolasyonu Mikrosatelit uzunluk varyasyonu, primer diziler kullanılarak PCR ile kolayca belirlenebilir. Bir tür için geliştirilen PCR primerleri, yakın türlerde de etkili olabilir. Mikrosatelitler kullanılarak oluşturulan genetik markerler, ekonomik özellikleri kontrol eden genlerin haritalanmasında önemli rol alırlar (Beuzen et al. 2000, Hale et al. 1998, Pirottin et al. 1999). 15

24 Herhangi bir mikrosatelit lokusunun amplifikasyonundan önce, spesifik primerlerin dizaynı için mikrosatelit lokusuna komşu DNA iplikçiğinin dizilim bilgisi sağlanmalıdır. Bazı model organizmaların mikrosatelit dizileri ve onlara komşu diziler, bilgisayar veri bankalarına kaydedilmektedir. Böylece çok sayıda tür için mikrosatelitlere özgü primer bilgisi içeren merkezler (ArkDB, EMBL ve Gen Bank gibi) oluşturulmaktadır (Hoelzel 1998). Mikrosatelit lokuslarının ve bunlara bitişik bölgelerin izolasyonu mikrosatelit analizlerinde ilk basamağı teşkil etmektedir. Genomik DNA dan mikrosatelitlerin izolasyonu için iki farklı protokol bulunmaktadır. Protokollerden biri mikrosatelit lokuslarının izolasyonu için yeterli ve kısmi bir genomik kütüphane kurmak için ana stratejiyi sağlamaktadır. Bu protokol sınırlı sayıda (30 dan az) dinükleotid lokusunun izolasyonu için önerilmektedir (Hoelzel 1998). Yukarıda da anlatıldığı gibi kısmi bir kütüphanenin görüntülenmesi az sayıda dinükleotidin izolasyonu için iyi çalışmaktadır. Bununla birlikte çok sayıda dinükleotid lokuslarının veya daha az bulunan tri veya tetranükleotid tekrarlarının izolasyonu yapılırken, tekrara özgü mikrosatelit motifi için zenginleştirilmiş bir kütüphanenin kurulması önerilmektedir. Bu şartlar ise ikinci protokol ile sağlanmaktadır. İlk protokolden temel farkı sadece bir mikrosatelit motifinin varlığı için ön seçime tabi tutulan DNA fragmanlarının dizileme vektörüne klonlanmasıdır. Bu nedenle daha az klon yeterli sayıda mikrosatelit lokusunu belirlemek için görüntülenme ihtiyacı duyar (Hoelzel 1998) Doğru mikrosatelitlerin seçimi Tekrar tipi Dinükleotid tekrarları genellikle en yaygın tekrar tipleridir. Memelilerde GT/AC, bitkilerde ise AA/TT ve AT/TA en sık rastlanan dinükleotid tekrarlarıdır. Bu dinükleotid tekrarlarının bolluğu onların mikrosatelit izolasyonlarını kolaylaştırmıştır. Dinükleotid tekrarlarının kullanımıyla ilgili en önemli mesele bunların PCR 16

25 amplifikasyonu boyunca tekrarlayan bantları üretme eğilimleri olup, bazen allellerin ayrılmasını güçleştirmektedir. Trinükleotid ve tetranükleotid tekrarları ise bu kadar yaygın olmamakla beraber, daha az tekrarlayan bant üretme eğilimine ve böylece de değerlendirme kolaylığına sahiptirler (Hoelzel 1998) Tekrar uzunluğu İnsanlardaki ilk sistematik çalışmalar, uzun mikrosatelitlerin ortalama olarak kısa olanlardan daha polimorfik olduğunu ortaya koymaktadır. Oysa sonraki çalışmalar bu durumu doğrulamamıştır. Bu nedenle kısa mikrosatelitlerin yapılacak analizlerde hesaba katılması önerilmektedir. Buna ilave olarak, ortalama mikrosatelit uzunluğu türe özgü değildir. Mikrosatelit tekrarının tek tekrar ünitelerindeki mutasyonlarla kesilmesi daha az çeşitliliğe neden olabilir. İki farklı tekrar tipi içeren mikrosatelitler daha az uzunluk varyasyonu göstermektedir. Fakat her bir tekrar ünitesinin nisbi frekanslarındaki değişiklikler, daha az homoplaziye bağlı olarak populasyon yapıları için ek bir anlayış sağlamıştır (Hoelzel 1998). Şekil 2.3.a. Hatasız dinükleotid tekrarları, b. Hatalı dinükleotid tekrarları; nokta mutasyonu okla gösteriliyor, c. Karışık mikrosatelit; GT/CA dan GA/CT ye geçiş gösteriliyor (Hoelzel 1998) 17

26 Ölçüm ve belirleme Mikrosatelit analizleri, uzama bölgelerini ve yan bölgeleri içeren tüm PCR ürünlerinin ölçülmesine bağlıdır. Eğer yan bölge dizisi uygunsa, tekrar sayısı yan nükleotidlerin çıkarılmasıyla bulunur ve kalan baz çiftinin, tekrar ünitesi sayısına bölünmesiyle hesaplanır. PCR ürünlerinin ölçümü ise poliakrilamid jel elektroforezi ve kapilar elektroforez ile gerçekleştirilir (Hoelzel 1998). PCR ürünleri, PCR reaksiyonunu takiben bilinen allellerinin karışımının düzenlenmesiyle ölçülebilmektedir. Bu yöntem özellikle PCR ürünleri DNA-DNA hibridizasyonuyla belirlenebildiğinde tercih edilmektedir (Hoelzel 1998) Mikrosatelitlerin yorumlanması Mikrosatelitler; cinsiyet tayini, babalık ve akrabalığın araştırılmasında çok gelişmiş bir marker sistemi sunmaktadır. Mikrosatelitlerin sahip olduğu yüksek çeşitlilik, ana ve yavrunun genotiplerinin karşılaştırılması ve babasal allelin tanınmasına olanak verir. Populasyondaki allel frekansına bağlı olarak paternal yansımalar hesaplanabilir ile 10-6 arasında değişen mutasyon oranları yüksek çözünürlükte yeterli polimorfizm elde edebilmektedir (Hoelzel 1998, Horng and Huang 2000). Araştırılan allel frekanslarından populasyonun tarihi hakkında bilgi edinmek için mikrosatelit çeşitliliğinin altında yatan mutasyon mekanizmasını anlamak gerekir. İn vitro ve in vivo çalışmalar göstermiştir ki bir mikrosatelit allelinin en yaygın mutasyonu tek bir tekrar ünitesinin kaybı ya da kazanımıdır. Bu uzunluk değişimleri muhtemelen intramoleküler bir seyir olan DNA kayması tarafından oluşturulmaktadır. Bir sonraki mutasyonun daha kısa mı yoksa daha uzun mu bir mikrosatelit alleli oluşturacağı hakkında bir öngörüde bulunmak mümkün değildir (Hoelzel 1998). Mikrosatelit mutasyon deseni, allozim varyasyon desenlerini açıklamak için yoğun olarak populasyon genetikçilerince kullanılan basamak basamak mutasyon modeline uyum göstermektedir. Bu temelde populasyon genetiğinde yaygın olarak kullanılan 18

27 mikrosatelit analizleriyle genetik mesafeyi ortaya çıkarmak mümkün olmaktadır. Bu genetik mesafeler R ST, delta mu veya D SW olarak adlandırılır (Hoelzel 1998). PCR ile çoğaltılmış bir mikrosatelit allelinin en yaygın görünümü, tek bir bant değil bir bantlar merdivenidir. Genellikle en yoğun bant, beklenen allel ölçüsünde ortaya çıkar. Tekrarlayan bantlar olarak ifade edilen ilave bantlar, genellikle orijinal allelden küçük olup, çok sayıda tekrar üniteleri ile uzunluk farkı gösterirler. Benzer şekilde tekrarlayan bantlar PCR amplifikasyonu boyunca in vitro DNA kaymasının sonucudur. Tekrarlayan bantların jel üzerinde azalan yoğunluğu DNA kayması dağılımının bir yansımasıdır. İn vitro DNA kayması oranları tekrar ünitesi uzunluğuyla azalmaktadır. Dinükleotid tekrarları, trinükleotid tekrarlarına göre daha çok tekrarlayan bant oluşturmaktadır (Hoelzel 1998). Tekrarlayan bantlara ilave olarak birçok mikrosatelit beklenen allel ölçüsünden fazla ilave bant göstermektedir. Bu Taq DNA polimerazın PCR ürününe bir A ekleten, terminal transferaz aktivitesinden ileri gelmektedir (Hoelzel 1998, Devrim 2002). 2.7 Genetik Çeşitlilik Ölçüsü Heterozigosite Geleneksel olarak populasyon genetikçileri tarafından kullanılan verilerin önemli bir kısmını, genlerin farklı formlarının bir populasyon içerisindeki göreceli frekansları oluşturmuştur. Mutasyonlar sonucu oluşan genin farklı formları allel olarak tanımlanır. Bir genin iki veya daha fazla sayıda allele sahip olması, populasyonun söz konusu gen bakımından polimorfizm gösterdiği anlamına gelir. Bir populasyonun genetik yapısındaki farklılıkların varlığı ve birden fazla farklılığın bir arada bulunması genetik polimorfizm olarak ifade edilir. Polimorfizmin temel özellikleri, genomun belli bir bölgesindeki baz çifti dizisindeki farklılıkların olması, bu farklılıkların o populasyonda kalıcı olması, yani bir sonraki nesile aktarılabilmesi ve sıklığının %l den az olmaması şeklinde özetlenebilir (Li and Graur 1991, Page and Holmes 2000, Nei and Kumar 2000). 19

28 Bir populasyonda polimorfizm görülen bir lokusta en yüksek frekansta bulunan allel yaban tip, daha nadir olarak gözlenen allel ise varyant tip olarak isimlendirilir. Allel sıklıklarının neden gözlendikleri şekilde olduğunu anlamak için, allel frekanslarının matematiksel modeller şeklinde ifade edilmesi gerekmektedir (Page and Holmes 2000). A ve a olarak ifade edilen iki allele sahip bir gen lokusu en basit modeli göstermektedir. Bu durumda söz konusu allellerin belli bir populasyon içindeki frekansları matematiksel olarak sırasıyla p ve q dur. DNA seviyesinde ortaya çıkan çok fazla miktardaki genetik çeşitliliğe geçmeden önce, basit görünmekle beraber, yalnızca iki allele sahip bir genin ele alındığı matematiksel model konunun anlaşılmasında ilk basamak olması bakımından önemlidir (Page and Holmes 2000). Üzerinde çalışılan organizmaların çoğu diploit olduğundan, bir gen her biri homolog kromozomların birinde bulunan iki allele sahiptir ve bireyler allel kombinasyonları düşünüldüğünde 3 farklı genotipe sahip olabilirler (AA, Aa ve aa). AA ve aa genotipindeki bireyler aynı tipteki allelleri taşıdıkları için homozigot, Aa genotipindeki bireyler ise farklı iki allel taşıdıkları için heterozigot olarak ifade edilirler. Heterozigot bireylerin fenotipi alleller arası ilişkiye bağlıdır. Bazı lokuslar itibariyle heterozigot bireylerde bir allel diğerine nazaran fenotipte daha fazla ifade bulur. Bu durumda söz konusu allel dominant (baskın), diğeri ise resesif (çekinik) ve bu tip alleller arası ilişki dominant-resesif allel ilişkisi olarak isimlendirilir. Dominant-resesif allel ilişkisinde (A>a) Aa genotipine sahip bir bireyin fenotipi AA genotipteki bireyle aynı olacaktır. Bu lokus itibariyle bir populasyonda genotipik frekansları (p, q) bulmak için dominant fenotipteki bireylerin genotipinin homozigot veya heterozigot olduğunu tespit etmek gerekmektedir. Heterozigot genotipli bireylerin fenotipinde şayet her iki allel birden aynı oranda ifade buluyor ise bu alleller kodominant (eşbaskın) olarak tanımlanırlar. Kodominans görülen karakterler itibariyle heterozigot bireylerin üçüncü bir fenotipi oluşturması heterozigot bireylerin kolayca tanımlanabilmesine olanak sağlar. Bu nedenle, populasyon genetiği çalışmalarında kullanılan protein ve DNA markerlerinin çoğu kodominanttır (Li and Graur 1991, Page and Holmes 2000). 20

29 Yukarıda belirtilen genotiplerin (AA, Aa ve aa) bir populasyon içerisindeki frekansları, f AA, f Aa ve f aa olarak ifade edilecek olursa, A ve a frekanslarını p ve q şeklinde hesaplamak kolay olacaktır. p=f AA +1/2f Aa, q=f aa +1/2f Aa p+q=l dir. Özetleyecek olursak bir allelin frekansı, o allel itibariyle populasyonda mevcut homozigotların frekansı ile heterozigotların frekansının yarısının toplamına eşittir (Li and Graur 1991, Page and Holmes 2000, Düzgüneş vd. 2003). Allel frekansları p ve q, bir populasyonda var olan genetik çeşitliliğin miktarının basit bir ifadesi olarak kullanılmaktadır. Ancak bir populasyonda herhangi bir lokusla ilgili olarak genellikle ikiden fazla allel bulunduğunda bunların frekansları ile ilgilenmek her zaman kolay olmayabilir. Bu nedenle, herhangi bir populasyondaki genetik çeşitliliğin ölçüsü olarak heterozigosite terimi kullanılır. Heterozigosite, bir populasyonda mevcut heterozigotların toplam frekansının ifadesidir. Heterozigosite aşağıda verilen basit formülle hesaplanmaktadır (Page and Holmes 2000). H = 1 m: Bir lokusta tespit edilen toplam allel sayısı X i : i. allelin sıklığıdır. m 2 X i i= 1 Heterozigosite, bir lokusla ilgili çok sayıda ve birbirine eşit frekansta alleller bulunduğu durumlarda en büyük değerini almaktadır (Page and Holmes 2000, Nei and Kumar 2000). Yakın zamana kadar, heterozigosite genellikle protein elektroforezi yoluyla tespit edilen elektroforetik mobiliteleri farklı olan allozimik enzimlere bağlı olarak allozim frekansları şeklinde tespit edilmiştir. Her ne kadar allozim çeşitlilikleri üzerindeki çalışmalar populasyon genetiği çalışmalarının temelini oluşturmuş olsa da, günümüzde yapılan populasyon genetiği çalışmaları, kesin ve doğrudan bilgilendirici olması 21

30 nedeniyle DNA seviyesindeki farklılıklar üzerinde yoğunlaşmış bulunmaktadır (Li and Graur 1991, Page and Holmes 2000, Nei and Kumar 2000). 2.8 F IS, F IT ve F ST Parametreleri Populasyonlar arası genetik farklılaşmanın en yaygın olarak kullanılan ölçüsü ise F ST (Fixation index) değeridir. Bir populasyondaki genetik çeşitliliğin ölçüsünün ise heterozigosite olduğu bilinmektedir. Herhangi bir polimorfik lokus için populasyonlar arası genetik farklılaşmanın belirlenmesinde kullanılan F ST değeri, bu lokus itibariyle farklı populasyonlarda belirlenen heterozigosite değerlerinin ikişerli olarak birbirlerinden ne kadar farklı olduğunun F istatistiği ile hesaplanması sonucu elde edilmektedir. F ST değeri ne kadar küçük ise söz konusu lokus için karşılaştırılan iki populasyonun birbirine o kadar yakın olduğu anlaşılır. F ST değerinin küçük çıkması için karşılaştırılan iki populasyonun heterozigositeleri arasındaki farkın küçük olması gerekmektedir ki bu da ancak iki populasyon arasında gen göçü olması durumunda söz konusu olmaktadır. Büyük F ST değeri ise tam tersi bir durumu ifade etmektedir. Başka bir ifadeyle herhangi bir lokus için karşılaştırılan iki populasyonun genetik açıdan birbirinden farklı olduğu anlaşılır (Nei and Kumar 2000, Page and Holmes 2000). H O : Alt populasyonlarda gözlenen heterozigotluk ortalamasını, H S : Alt populasyonlarda beklenen heterozigotluk ortalamasını ve H T : Toplam populasyonlardaki heterozigotluk ortalamasını ifade etmektedir (Nei 1987). F IS alt populasyonlarda birbirine yakın (akraba) olan bireylerin içinde homolog alleller arasındaki korelasyonları tanımlar. Yani alt populasyonlarda rastgele birleşen iki gametin müşterek atadan gelme ihtimalidir. Alt populasyonlardaki akrabalı yetiştirme katsayısı olarak tanımlanır. Alt populasyonlar içerisinde Hardy-Weinberg dengesinden sapmaların ölçülebilmesi için F IS alt populasyonlar seviyesinde bireylerin akrabalığına değinmektedir ve F IS =(H S -H O )/H S şeklinde hesaplanır (Nei 1987). F IT toplam populasyonda birbirine yakın bireyler içerisinde birbirinin yerini tutan allellerdeki korelasyonları tanımlar yani populasyon seviyesinde rastgele birleşen iki 22

31 gametin müşterek atadan gelme ihtimalini belirler. Populasyonların akrabalı yetiştirme katsayısı olarak tanımlanabilir. F IT ile alt populasyon içerisindeki akrabalığın etkileri ve alt populasyonları olan populasyonların etkileri hesaplanır. F IT toplam populasyon üzerinden Hardy-Weinberg dengesinden sapmaların ölçümüdür ve F IT =(H T -H O )/H T şeklinde hesaplanır (Nei 1987). F ST (F ST =(H T -H S )/H T )) alt populasyonlardaki genetik farklılıkların ölçümü için belirlenen bir değerdir. Bir lokus açısından populasyonları karşılaştırmada kullanılır. Alt populasyonlarda rastgele ele alınan iki gametin müşterek atadan gelme ihtimali olup alt populasyonlar arasındaki genetik farklılığın ölçüsüdür. 0 ile 1 arasında değer alır. Belirlenen değer 1 e ne kadar yakınsa alt populasyonlar müşterek atadan oldukça uzak demektir (Nei 1987). 2.9 Kaynak Özetleri Mikrosatelit polimorfizmi kullanılarak yapılan çalışmaların özet bilgileri aşağıda verilmiştir. Sekiz koyun mikrosateliti kullanılarak altı farklı koyun ırkında (Romney, Border, Leicester, Suffolk, İvesi, Avustralya ve Yeni Zelenda Merinosları) akrabalık ilişkisi olmayan ortalama bireyde yapılan çalışmada farklı ırklardan alınan örneklerin allel frekanslarının oldukça önemli farklılıklar gösterdiği bildirilmiştir. Bu allel frekanslarının çalışılan ırklardaki bir bireyi bile tanımlamak için doğruluğu yüksek sonuçlar verdiği bildirilmiştir. Allel frekenslarının farklılıkları kullanılarak soy ağacı çizilmiş ve çizilen ağaçta Merinosların bir grup; Border Leicester, Suffolk ve Romney ırklarının başka bir grup ve İvesi ırkının hepsinden farklı başka bir grup oluşturduğu gözlemlenmiştir. Merinos ve İngiliz ırkı koyunların protein polimorfizmi çalışmalarıyla da ayrımının başarıldığını, fakat belirli ırkların evrimsel ilişkilerinin mikrosatelit markerlerle daha iyi gösterilebileceği bildirilmiştir (Buchanan et al. 1994). Crawford et al. (1995) ilk kapsamlı koyun genom haritasını hazırlamışlardır. Koyun genomunun 2070 cm lik bölümünü kapsayan bu çalışmada, kullanılan markerlerin yedi 23

32 RFLP ve yedi protein markeri dışında hepsi mikrosatelit markerleridir. Mikrosatelit markerlerinden 19 u bilinen mikrosatelitler ve gerisi 86 koyun, 126 sığır ve bir geyik mikrosatelitinden oluşmaktadır. Bulunan önemli sonuçlardan birisi koyunların genetik olarak çok heterojenik yapıda olduğu şeklinde belirtilmiştir. Bundan üç yıl sonra 1998 yılında koyun genomunda ikinci generasyon linkage gen haritası yayımlanmıştır (de Gortari et al. 1998). Bu çalışmada 2-3 gen haritası birleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan 519 markerin 504 ü mikrosatelit markerleridir. Toplam gen haritasının uzunluğu 3063 cm, ortalama marker aralığı ise 6,5 cm bulunmuştur. Üçüncü generasyonun linkage haritası 1093 marker içermekte olup, 3500 cm uzunluğundadır ve markerler arası ortalama uzaklık 3.4 cm olarak tespit edilmiştir (Maddox 2000). Büyük boynuzlu koyun ırklarında populasyonlar ve bireyler arasındaki genetik çeşitliliği Major Histocompability Complex (MHC) ve mikrosatelit lokusları açısından aynı ırk ve bireylerde karşılaştırmışlar ve genetik çeşitliliğin MHC ve mikrosatelit markerleri yönünden benzer olduğunu gözlemlemişlerdir (Boyce et al. 1997). Ellegren et al. (1997) çalışmalarında polimorfik özellikteki mikrosatelitlerle yaptığı bir çalışmada 13 sığır, 14 koyun mikrosatelit markeri kullanılmışlar ve polimorfik olan markerlerden altı sığır mikrosatelitinin koyunlarda, yedi koyun mikrosatelitinin de sığırlarda monomorfik olduğu, heterozigotluk derecesinin oldukça yüksek düzeyde olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca bu iki tür arasında farklılığın boyutunun ve genetik çeşitliliğinin derecesi bakımından açıklayıcı bir ilişki sayılamayacağını ileri sürmüşlerdir. Muflonlarda (Ovis gmelini) mikrosatelitlerin genetik çeşitliliği belirlemedeki kapasitesinin araştırıldığı çalışmada, altı adet sığır mikrosateliti muflonda incelenmiş ve hepside polimorfik bulunmuştur. Çalışılan populasyonda örnek sayısının azlığına rağmen beş lokusta yüksek oranda genetik çeşitlilik gözlemişlerdir. Diğer genetik markerlere nazaran mikrosatelitlerin genetik yapıyı belirleme gücü muflon populasyonunda daha fazla tespit edilmiştir (Petit et al. 1997). 24

33 Gootwine et al. (1998) Booroola FecB geninin tek bir B alleli doğuran koyun başına kuzulama oranını %60 oranında artırmaktadır. BM1329 ve OarAE101 mikrosatelit lokusları Booroola geninin B alleli ile ilişkili iken İvesi populasyonunda nadir olarak görülmektedir. Bu durum FecB geni taşıyan Booroola-İvesi melezi koyunlarda Marker Destekli Seleksiyon çalışmalarında kullanımını sağlamaktadır. Nicoll et al. (1998) çalışmalarında Avustralya Poll Dorset ırkında Carwell lokusunun koyun 18. kromozomunda veya CSSM18 telomerik kısmında bulunduğuna dair kanıtlar elde etmişlerdir. Lokusun döllerde koyun türüne bağlı olmakla birlikte, bilinmeyen düzenleyici lokuslar nedeniyle çeşitli etkileri olduğu görülmektedir. Belirlenen bölgesi Callipyge lokusu ile allelik olduğu yönündedir. Ancak yalnızca göz kasını etkilemesi nedeniyle fenotipik etkisi sınırlı görülmektedir. Taşıyıcı koyunlarda, canlı ağırlığa göre düzeltilmiş verilerde 12. kaburgada 1,14 ile 3,30 cm 2 daha geniş göz kası alanına sahip iken %8 daha ağır göz kası tespit edilmiştir. Mikrosatelitlerin ebeveyn tayini için kullanıldığı araştırmalara da rastlanmaktadır. Bu konuda Luikart et al. (1999) çalışmaları şöyledir: Sekiz keçi mikrosateliti, dokuz sığır mikrosateliti ve beş koyun mikrosateliti olmak üzere toplam 22 adet mikrosatelit markeri kullanarak keçilerde ebeveyn tayini yaptıkları bilinmektedir. Saitbekova et al. (1999) 20 adet sığır mikrosatelit markeri kullanarak sekiz farklı İsviçre keçi ırkında genetik çeşitliliği araştırmışlar ve sığır mikrosatelitlerinin keçilerde de iyi randıman verdiğini belirtmişlerdir. Yapılan çalışmada İsviçre keçi ırklarının birbirleriyle genetik olarak yakın ilişkili olduğunu gözlemlemişlerdir. Araştırıcılar mikrosatelitlerin keçi ırkları arasındaki farklılığın gösterilmesinde kullanılabilecek çok güçlü markerler olduğunu ve ilerde populasyonların geçmişi ile ilgili yapacakları çalışmada yine mikrosatelitleri kullanacaklarını belirtmişlerdir. Beş adet sığır ve bir adet koyun mikrosateliti olmak üzere toplam altı mikrosatelit markeri ile Çin de bulunan beş yerli keçi ırkındaki genetik ilişkinin araştırıldığı bir çalışmada elde edilen sonuçların keçilerin tarihi geçmişi ve bulundukları coğrafyayla uyumlu olduğu belirtilmiştir (Yang et al. 1999). 25

34 Diez-Tascon et al. (2000) altı Merinos ırkı koyun populasyonu arasında mikrosatelit markerlerle genetik çeşitliliği araştırdığı çalışmalarında; 253 adet akrabalık ilişkisi olmayan birey ve 20 adet mikrosatelit markeri kullanılmıştır. Altı populasyon arasındaki genetik çeşitliliğin birbirine benzer sonuçlar verdiği, çalışılan markerlerden iki tanesinin Hardy-Weinberg dengesinden sapma gösterdiği bildirilmiştir. Bu iki markerin, pedigrisi bilinen numunelerle incelendiğinde yanlış sonuçlar verdiği belirlenmiş ve çalışmadan çıkarılmıştır. Ayrıca Portekiz Siyah Merinos populasyonunda yüksek derecede akrabalı yetiştirme sonucu heterozigotluğun çok düşük olduğu ve populasyonun risk altında bulunduğu bildirilmiştir. Farid et al. (2000) Kanada da yetiştirilen 10 adet koyun ırkında toplam 257 koyun kullanarak 10 mikrosatelit lokusu açısından koyunlarda ırk içi ve ırklar arası genetik çeşitliliğin seviyesini belirlemişlerdir. Bighorn koyunlarında 10 mikrosatelit markeri kullanarak yapılan bir çalışmada; 13 farklı bölgeden 279 adet koyun kullanılmış ve bu koyunlarda genetik çeşitlilik ve populasyon yapıları incelenmiştir. Çalışmada bütün lokuslar yönünden genetik çeşitliliğin önemli düzeyde olduğu belirtilmiştir. Araştırıcılar ayrıca populasyonlar arasındaki genetik farklılığın yüksek olduğunu, genetik ve coğrafi uzaklık arasında pozitif ilişki bulduklarını bildirmişlerdir (Gutiérrez-Espeleta et al. 2000). Arranz et al. (2001a) İspanya daki koyun ırklarında (Churra, Latxa, Castellana, Rasa- Aragonesa, Merinos ve İvesi) mikrosatelitleri kullanarak, bu ırklar arasında genetik farklılığı araştırmışlardır. Yapılan araştırmada Latxa ırkında kümeleşme en yüksek düzeydeyken, Merinoslarda en düşük seviyede bulunmuş, ayrıca Merinos ırkının özel bir gruplaşma gösterdiği ve diğer bazı ırklarla da yakın ilişkili olduğu gözlemlenmiştir. İspanyol koyun ırklarında yapılan bir çalışmada (Arranz et al. 2001b) 18 mikrosatelit markeri ve altı İspanyol yerli koyun ırkı kullanılarak genetik çeşitlilik araştırılmış ve Merinos koyun ırkı her lokusta görülen allel sayısının en yüksek olması bakımından en yüksek genetik çeşitliliği gösterirken, Latxa ırkında genetik çeşitlilik en düşük düzeyde gözlemlenmiştir. Aynı araştırıcılara ait başka bir çalışmada (Arranz et al. 1998) 26

35 İspanyol koyun ırkları arasındaki genetik ilişki mikrosatelit markerlerle araştırılmış ve beş İspanyol ırkı koyun, 19 mikrosatelit markeri kullanılmış, ayrıca İvesi koyun ırkı referans ırk olarak kullanılmıştır. Aynı şekilde Merinos ırkında genetik çeşitliliğin en fazla olduğu ve en düşük varyasyonunda Awassi ırkında gözlendiği bildirilmiştir. İvesi ırkı ile İspanyol ırkları arasında büyük bir farklılığın olduğu gözlemlenmiştir. Çalışma sonuçlarına göre de morfolojik verilerin tek başına ırklar arası genetik ilişkinin tanımlanmasında yetersiz olduğu, genetik markerleri de içine alan çalışmaların bu konuda büyük fayda sağlayacağı bildirilmiştir. Arruga et al. (2001) Raga Aragonesa ırkı koyunlarda babalık testi için dört mikrosatelit lokusu kullanmışlar, heterozigotluğun oldukça yüksek olduğunu gözlemlemişlerdir. Sonuçta mikrosatelitler ile serum transferrin lokusunun birlikte kullanılmasıyla babalık tayininde %97,2 oranında doğru sonuçlar alınabileceğini belirtmişlerdir. İspanyol Churra koyun ırkında pedigri dizaynı ile altıncı kromozomda süt verimini etkileyen QTL (Quantitative Trait Loci) lokuslarının varlığını belirlemek için yapılan çalışmalarında; sekiz üvey kardeş familyasında süt verimi, protein verimi ve protein yüzdesinde sapma değerlerinden yararlanarak 11 mikrosatelit ve QTL lokuslarının etkileri incelenmiştir. Regresyon yönteminin uygulandığı Çoklu QTL Model haritalama yöntemi esasına dayanan QTL analizi yapılmıştır. Kabul edilebilir eşik değerler, çoklu testler için düzeltme değerleri ile permütasyon testlerinden belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar kazein kümesininde bulunduğu altıncı koyun kromozomundaki bölgenin süt verim özelliklerini ve kısıtlı olarak protein yüzdesinde etkili olduğunu göstermiştir (Diez Tasco et al. 2001). Hedrick et al. (2001) Tiburon Adası ndaki Desert Bighorn koyunlarında mikrosatelit ve MHC lokuslarını kullanarak yaptıkları bir çalışmada, Tiburon Adası ndaki populasyonda genetik çeşitliliğin Arizona bölgesindeki aynı ırka ait alt gruplardan daha az olduğunu gözlemlemişlerdir. Ayrıca Tiburon populasyonuyla, Arizona daki örnekler arasında genetik uzaklığın fazla olduğunu ve bu durumun populasyondaki genetik sürüklenmeden kaynaklanabileceğini, bunun sebebinin de populasyonun oluşumunda az 27

36 sayıda aynı erkek bireylerin kullanılmasından ve bilinmeyen diğer etkilerden kaynaklanabileceğini belirtmektedirler. Stahlberger-Saitbekova et al. (2001) 16 koyun, dokuz sığır ve altı keçi mikrosateliti kullanarak, İsviçre koyun ırklarındaki genetik ilişkiyi araştırmışlardır. Ayrıca yedi İsviçre koyun ırkına ilave olarak, bir yaban tipi Muflonu çalışmaya dahil etmişlerdir. Bütün yerli koyun ırklarında ortalama heterozigotluğun oldukça yüksek olduğunu, Muflonda ise en düşük olduğunu belirtmişlerdir. Bütün sığır, keçi ve koyun mikrosatelit markerlerinin koyunlarda iyi sonuçlar verdiğini gözlemlemişlerdir allel sayısı ile BM1818, INRA063, MAF70 ve OarJMP29 lokuslarının yüksek derecede bilgi verici olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca OarFCB193 lokusunun 107 baz çifti uzunluğu ile %92 lik bir frekansla Muflonda özel bir allele sahip olduğu gözlemlenmiştir. Özel allellerin diğer koyun ırklarında da bulunduğu fakat frekanslarının %10 u geçmediği belirtilmiştir. Türkiye deki yerli (Akkaraman, İvesi ve Kıvırcık) ve melez (Konya Merinosu ve Türkgeldi) toplam beş koyun populasyonu kullanılarak yapılan bir çalışmada (Soysal vd 2001) toplam 174 birey, üç mikrosatelit markeri yönünden incelenmiştir. Yapılan çalışmada toplam 45 adet allel gözlemlenmiş, populasyonların Hardy-Weinberg dengesinde ve varyasyonun yüksek olduğu bildirilmiştir. Grigaliunaite et al. (2003) yaptıkları çalışmalarında; M.Ö yıllara kadar dayanan Baltık ülkeleri koyun yetiştiriciliğinin, günümüz Batı ırklarının Baltık ırklarında görülen gelişmelerden ağırlıklı olarak etkilendiğini söylemişlerdir. Kaba yapağılı Litvanya, Siyah yüzlü Litvanya, Siyah başlı Litvanya, Estonya Ruhnu, Beyaz Başlı Estonya, Siyah Başlı Estonya ve Estonyan Saaremaa ırklarında; 195 bireyde birbirleriyle bağlantısız 15 mikrosatelit marker kullanılarak populasyonlar arası varyasyon ve mikrosatelit markerlerin ebeveyn testinde kullanılırlığını araştırmışlardır. Allel sayıları, gözlenen (H göz ) ve beklenen (H bek ) heterozigositluk değerleri hesaplanmıştır. Lokuslarda ortalama allel sayıları 4,4 ile 10,9 allel gösterdiği için bütün lokuslar polimorfiktir. Irklarda 3,9 (Estonyan Ruhnu) ile 8,3 (Beyaz Başlı Estonya) arasında değişen ortalama allel sayıları az sayıda olan Baltık ırklarında bile ebeveyn testinde 28

37 kullanımını sağlamaktadır. Estonya Saaremaa ırkı hariç diğer ırklarda ortalama beklenen ve ortalama gözlenen heterozigotluk değerleri arasında farlılıklar yüksek bulunmamıştır. Çalışılan populasyonlarda Estonyan Ruhnu ırkı düşük genetik değişim göstermektedir. Grafik yöntemler ve Wilcoxon İşaret Sıralama Testi ile Bootleneck testi uygulanarak populasyon genişliğindeki azalmalar incelenmiştir. Yalnızca Estonya Ruhnu populasyonu allel frekanslarında düşük mod-yüksek sapma göstermesi populasyon genişliğinde muhtemel azalmayı belirtmektedir. İtalya nın merkezinde Viterbo ilinde yetiştirilen 17 adet sürüde genetik varyasyonun dağılımının belirlenmesi için 11 polimorfik mikrosatelit değerleri kullanılmıştır. Örnek genişliği lokus sayılarının uygunluğu bootstrap prosedürü ile kontrol edilmiştir. Elde edilen veriler sürü içinde ve sürüler arasında genetik varyasyonu ve sürüdeki akrabalığın belirlenmesi için kullanılmıştır. Sürüler arasında genetik ilişkilerin belirlenmesi için Nei genetik uzaklık değerlerine Temel Bileşenler Analizi uygulanarak belirlenmiştir. Genetik analizler bazı sürülerde homozigotların çoğunluğunu göstermiştir. Genetik verilerin en yüksek olabilirlik testlerinde kullanımı ile uygun ıslah yöntemlerinin belirlenmesi araştırılmıştır. Sürüler arasında genetik varyasyonu artırmak için uygulanacak uygun çiftleştirme stratejisi geliştirmek için örnek bir çalışmadır. Elde edilen sonuçların diğer evcil türlerde de kullanımının mümkün olduğunu belirtmişlerdir (Pariset et al. 2003). Bulut (2004) tarafından hazırlanan doktora tez çalışmasında yedi farklı koyun populasyonunun (Konya Merinosu, Karacabey Merinosu, Akkaraman, Alman Siyah Baş (ASB), Hasmer, Hasak ve ASB x AK melezi) genetik yapısını araştırmak için 169, diğer araştırıcılardan temin edilen Kıvırcık ve Dağlıç populasyonlarının verilerinin de ilavesiyle toplam 226 adet bireyden edilen verileri kullanmıştır. Bu populasyonların genetik yapılarını belirlemek amacıyla üç mikrosatelit lokusu (OarFCB20, OarJMP29 ve OarJMP58) incelenmiş ve toplam 49 adet allel, Kıvırcık ve Dağlıç populasyonlarıyla birlikte toplam 61 adet allel gözlenmiştir. Akkaraman, Hasak, Hasmer, Kıvırcık ve Dağlıç populasyonlarında olmak üzere toplam 11 adet özel allele rastlanmıştır. Populasyonların heterozigotluk düzeylerine bakıldığında ortalama gözlenen heterozigotluğun (Ho) 0,762-0,857 (dokuz populasyon birlikte 0,707-0,857) arasında 29

38 olduğu, ortalama beklenen heterozigotluğun (He) ise hem kendi populasyonlarımızda hem de Kıvırcık ve Dağlıç verilerinin ilavesinde 0,790-0,867 arasında olduğu görülmüştür. F istatistikleri populasyonların Hardy-Weinberg dengesinde olduğunu göstermiştir. Populasyonlar için hesaplanan F IS değerlerinin -0,051-0,088 (Kıvırcık ve Dağlıç verilerinin ilavesiyle -0,051-0,148) arasında değiştiği ve Kıvırcık hariç (P<0,01) bütün populasyonlar için istatistiksel olarak önemsiz (P>0,05), F ST değerlerinin ise (0,053, Kıvırcık ve Dağlıç verilerinin ilavesiyle 0,071) istatistiksel olarak önemli olduğu belirlenmiştir (P<0.001). Çalışma sonucu olarak; çalışılan ırklar ve ilave edilen Kıvırcık ile Dağlıç ırklarında, populasyonlar içi ve populasyonlar arası genetik çeşitliliğin yüksek olduğu görülmesine karşın, faktöriyel birleştirici analiz sonuçlarında sadece Kıvırcık, Alman Siyah Baş ve Dağlıç populasyonlarının farklı gruplar oluşturduğu, diğer populasyonların ise tek bir grupta toplandığı belirlenmiştir. Cerit et al. (2004) 140 adet Kıvırcık ırkı koyundan elde edilen DNA örneklerinde 10 adet mikrosatelit lokusunda polimorfizmlere baktıkları çalışmalarında; OarFCB129 lokusunun, genel populasyonda Hardy-Weinberg dengesinden belirgin bir sapma eğiliminde olduğu gözlemlenmiştir (P=0,0037; P<0,05). Her lokus için beklenen ve gözlenen heterozigotluk oranı, dışlama gücü, ayrımlama gücü ve uyuşma olasılığı hesaplamışlardır. STR/mikrosatelit lokusları içinde en yüksek heterozigotluk değeri 0,857 ile OarHH41 lokusunda gözlenirken, en düşük değer 0,650 ile OarFCB266 lokusunda görülmüştür. En yüksek dışlama olasılığı 0,71 ile OarHH41 lokusunda gözlenirken, en düşük değer 0,36 ile OarFCB266 lokusunda saptanmıştır. En yüksek ayrımlama gücü 0,968 ile OarHH41 lokusunda gözlenirken, en düşük değer 0,820 ile OarFCB266 lokusunda gözlemlenmiştir. Uyuşma olasılığında ise en yüksek değeri veren lokuslar OarFCB266, OarHH64 ve OarHH51 olurken, en düşük değerler OarHH41, OarFCB19 ve OarFCB20 lokuslarında saptanmıştır. Bu çalışmada kullanılan lokusların kombine ayrımlama ve dışlama gücü değerleri 10 lokusun tamamı kullanıldığında sırası ile 0, ve 0, olarak gözlenmiştir. Araştırıcılar bu lokuslar içerisinde OarHH41, OarFCB19, OarFCB20, OarVH110, OarFCB128, OarFCB48 ve OarFCB129 lokuslarının yüksek ayrımlama ve dışlama gücüne sahip olduğunu ve kolaylıkla tiplenebilmeleri açısından akrabalık ilişkilerinin saptanmasında kullanılmalarının önerilebileceğini bildirmişlerdir. 30

39 Koban (2004) hazırladığı doktora tez çalışmasında, Türkiye yerli koyun ırklarında mevcut genetik çeşitliliği mikrosatelit DNA lokusları kullanılarak incelenmiştir. Devlet Üretme Çiftlikleri, üniversite üretim çiftlikleri ve yerel yetiştiricilerin elinde bulunan sürülerden yerli ve melez 11 Türk ırkı (Akkaraman, Morkaraman, Kıvırcık, İvesi, Dağlıç, Karayaka, Hemşin, Norduz, Kangal, Konya Merinosu ve Türkgeldi) ile bireyleri Irak'tan getirilmiş yabancı bir ırkı (Hamdani) temsil eden toplam 423 örnek bu çalışmada kullanılmıştır. Öncelikle üretim çiftliklerinden toplanan populasyonlardan akrabalık derecesi yüksek bireylere ait veriler yakınlık (Kinship) analizinin sonuçları doğrultusunda çıkartılmıştır. Genetik varyasyonun ölçütlerinden beklenen heterozigotluk (HE) 0,686 ile 0,793 arasında, ortalama gözlenen allel sayıları (OAS) ise 5,8 ile 11,8 arasında değişmiştir. Türkiye üzerinde allel frekans dağılımları Neolitik Gruplarca Yayılma Modeli'nin beklediği gibi bir değişim göstermemiştir. F ST indeksi Akkaraman, Karayaka ve Dağlıç'ta aynı ırkın farklı populasyonlarındaki farklılaşmayı ölçmek için kullanılmıştır ve yetiştirme çiftliğinden alınan Akkaraman1'in diğer iki Akkaraman populasyonundan istatistiki önemde (P<0,001) farklı olduğu bulunmuştur. F IS indeksi ile ırklar Hardy- Weinberg dengesi açısından test edilmiş, Akkaraman1, İvesi, Morkaraman ve Hemşin'de Hardy-Weinberg den sapma tespit edilmiştir. Mokeküler Varyans Analizi (AMOVA) toplam genetik varyasyonun büyük bir kısmının (~%90) bireyler içinde ayrışarak paylaşıldığını göstermiştir. Paralel sonuçlar bireylerarası genetik ilişkinin incelendiği faktöriyel benzerlik analizi ve allel paylaşım uzaklığı ile de elde edilmiş ve ırklararası belirgin bir fark görülmemiştir. DA genetik uzaklığı ile çizilen NJ ağacı ve Temel Bileşenler Analizi ise populasyonlar arası farklılaşmayı incelemek için kullanılmıştır. Delaunay örgüsü ırklar arasında dört adet (ikisi coğrafi bariyer ile paralel) genetik sınır belirlemiştir. Sonuçların hepsi Kıvırcık'ın diğerlerinden çok farklı olduğu yönündedir. Mantel ve Bottleneck testleri istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç ortaya koymamıştır. Avrupa ırklarının çoğuna genetik olarak en yakın bulunan ırk Kıvırcık ırkı olup, Türk ırklarında Avrupa ırklarından farklı ve yüksek bir genetik çeşitlilik belirlenmemiştir. Bunun nedeninin son yıllarda koyun sayısında yaşanan hızlı düşüşün olabileceği ileri sürülmüştür (Koban 2004). 31

40 Soysal vd. (2005a) en erken evcilleştirilen koyun ırklarının olası komşu ırklardan olan Türkiye yerli koyun ırklarının gelecekte koyun ırklarının gelişiminde önemli genetik özelliklere sahip olduğunun düşünüldüğünü belirttikten sonra, koruma stratejilerinin belirlenmesi için genetik varyasyon özelliklerinin belirlenmesi zorunluluğuna değindikleri çalışmalarında, Kıvırcık, İvesi, Akkaraman gibi saf ve melez ırklar olan Türkgeldi ve Konya Merinosunda karşılaştırmalı olarak mikrosatelit lokusları analiz etmişlerdir. Gözlenen heterozigotluk değerlerinin (0,6673-0,7822) diğer ırklarda elde edilen değerlere göre yüksek olması ırkların evcilleştirme merkezine yakın olduğunu düşündürmektedir. Allel paylaşım değerlerinden yararlanarak çizilen Komşu Birleştirme Ağacı (NJ) ırklar arası ilişkinin yüksek olmadığını göstermiştir. Genetik farklılığın belirtisi olan F ST değerleri önemli bulunmuştur. Üç mikrosatelit lokusu bakımından üç ırkı ve melez ırkları belirlemede İvesi, Kıvırcık-Türkgeldi ve Akkaraman-Konya Merinosu üç grup oluşturmuştur. Soysal vd. (2005b) yaptıkları diğer bir araştırmada OarFCB304, OarFCB20 ve MAF65 mikrosatelit lokuslarında mikrosatelit DNA polimorfizmi kullanılarak Kıvırcık, Akkaraman, İvesi, Türkgeldi ve Konya Merinosu koyun ırklarında yapağı özellikleri (uzunluk, mukavemet, incelik, elastikiyet vb.) bakımından farklılıkları araştırmışlar, homozigot ve heterozigot yapılar bakımından farklılıkları incelemişlerdir. Türkiye yerli koyun ırklarında genetik ilişkiyi üç ana hattında mtdna analizi ile açıklamaya çalışmışlardır. 30 mikrosatelit lokusunda genetik varyasyon belirlenmiştir. Varyasyon parametreleri ırklararasında yüksek varyasyonu belirtmektedir. Ortalama allel sayıları 7,8 ile 10,4 arasında değişirken heterozigotluk 0,69 ile 0,74 arasında değişmiştir. Irk içindeki varyasyondan kaynaklanan ırklararasında belirgin farklılıklar gözlenmektedir. Bütün ırklarda 75 adet özgün allel belirlemişlerdir. Hemşin ırkında genetik varyasyon ırkın sayısındaki azlıktan dolayı düşük bulunmuştur. Ortak allel oranları (%54,8 ile %69.5) ve gen akımı değerleri (5,98 ile 28,32) ırklar arasında farklılığın belirtisi olarak bildirilmiştir (Gutiérrez-Gil et al. 2006). Mukesh et al. (2006) Kuzey Batı Hindistan ın kurak ve yarı kurak bölgelerinde yetiştirilen Nali ve Chokla ırkı ile Doğu Hindistan da tuzlu balçık bölgelerde yetiştirilen 32

41 Garole ırkı koyunlar FAO MoDAD programı tarafından tavsiye edilen 11 koyuna özgü mikrosatelit markerler bakımından inceledikleri çalışmalarında; mikrosatelit analizi sonucu üç ırkında yüksek allelik ve gen çeşitliliğine sahip olduğunu saptamışlardır. Nali ırkı (6,27 ve 0,65) Chokla (5,63 ve 0,64) ve Garole (5,63 ve 0,59) ırkından fazla ortalama allel sayısı ve gen varyasyonu göstermiştir. Akrabalı yetiştirme değeri (F IS, Chokla 0,286, Nali 0,284, Garole 0,227) ırklar içinde yüksek ilişkiyi gösterirken heterozigot azlığının da belirtisidir. Ölçülen F istatistik değerleri sıfırdan farklı değerler göstermiştir (P<0,05). Bütün lokuslar arasında F ST (0,183) yüksek değerleri ırklararası büyük farklılık derecesini izah etmektedir. Irklar arasında F ST ve Nm değerleri dikkate alındığında, Nali ve Chokla ırkları (F ST =%6,62 ve Nm=4,80) çok yakın olarak gözlenirken diğer ırklarda; Garole ve Nali (F ST =%20,9 ve Nm=1,80) ırkları ve Garole ve Chokla (F ST =%21,4 ve Nm=1,71) olarak belirlenmiştir. Bunlara ek olarak ırklararası genetik benzerlik ve populasyon yapısını belirlemek için yapılan genetik uzaklık değerleri, filogenetik analiz ve bireysel belirleme testi Garole ile diğer ırklar arasındaki farklılıkları açıklamaktadır. Garole ırkının belirlenen bu genetik farklılık değerleri bu ırkın koruma altına alınması gerektiğini göstermektedir. Hindistan ın kuzey batı bölgelerinde kurak ve yarı kurak alanda yetiştirilen halı yapağısı veren, kahverengi yüzlü, kısa kuyruklu Nali ve Chokla koyun ırklarında populasyonun yapısı ve genetik varyasyonu FAO tarafından tavsiye edilen 25 koyuna özgü mikrosatelite marker kullanarak belirledikleri çalışmada elde edilen sonuçlarda; (Allel varyasyonu Nali ırkında 5,52, Chokla ırkında 5,32; gen varyasyonu Nali ırkında 0,651, Chokla ırkında ise 0,657) yüksek oranda genetik varyasyon belirlenmiştir. Genetik benzerliklerin belirlenmesinde kullanılan parametrelerde farklılığın az olduğu belirlenmiştir. Genetik farklılık değeri (F ST =0,083) çok düşük bir değer bulunurken %70,4 gibi yüksek ortak allel yüzdesi ve Nei s genetik uzaklık değerleri de (DS=0,229 ve DA=0,168) olarak bulunmuştur. Gen akımı değeri (Nm=3,896) birbirlerine yakın coğrafik alanlarda yetiştirilen bu ırkların benzerliklerinin kaynağında önemli rol oynamıştır. Populasyon akrabalı yetiştirme ölçüleri de (F IS ; Nali=0,397, Chokla=0,299; F IT =0,40) yetiştirilen ırklarda yüksek akrabalı yetiştirme ve yüksek genetik homojenite olduğunu göstermiştir (P<0,05). Mikrosatelitlere göre karşılaştırmada ırklar arasında elde edilen yakın genetik ilişki Rajasthani (Bikaneri grubu) koyunlarında elde edilen 33

42 bilgileri doğrulamaktadır. Elde edilen verilerden yararlanarak ıslah programlarına ve hayvan kaynakları koruma çalışmalarına yön verilmesinde belirleyici bilgiler sağlanacağını bildirmişlerdir (Sodhi et al. 2006). Peter et al. (2007) Avrupa ve Ortadoğu da 15 ayrı ülkede yetiştirilen yerli ve melez 57 adet koyun ırkının populasyon yapısı ve genetik varyasyonu 31 mikrosatelit marker ile inceledikleri araştırmalarında ortalama beklenen heterozigotluk değerleri 0,63 (British Exmoor Horn) ile 0,77 (Albanian Ruda) arasında değişmektedir. Güneydoğu Avrupa ve Ortadoğu koyun ırkları Batı ve Kuzeybatı Avrupa ırklarına göre önemli derecede varyasyona sahip bulunmuşlardır. Genetik farklılıklar (h) %5,7 olarak bulunurken heterozigotluk eksikliği (f) bütün lokuslarda (P<0,001) gözlenmiştir. Temel Bileşenler Analizi ve Bayesian modeline dayalı kümeleme analizi Güneydoğu ve Kuzeybatı ayrımını ayrıca Ortadoğu yağlı kuyruklu, Güneydoğu Avrupa ve Batı/Kuzeybatı Avrupa ırklarının ayrıldığını göstermektedir. Son gruplar ile Merinos ve Alpin grupları arasında az farklılık gözlenmiştir. Çoğu küme arasındaki ayrımın oluşmamasının nedeninin melezleme ve/veya değişimlerden kaynaklanabileceğini belirtilmektedir. 34

43 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Çalışmanın materyalini Güneydoğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü nde (Diyarbakır) kayıtlı olarak yetiştiriciliği yapılan 81 baş İvesi ırkı koyun oluşturmaktadır. 3.2 Yöntem Hayvan gruplarının belirlenmesi Hayvan gruplarının belirlenmesinde, Güneydoğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü İşletmesinde tutulan 2005 yılı süt kontrol kayıtlarından faydalanılmıştır. Üç kontrol döneminde (Aylık) ölçülen ikişer adet sabah ve akşam süt verimlerinden elde edilen günlük süt verimi ortalaması, gün ve kontrol sayısına çarpılarak bulunan laktasyon süt verim değerlerine göre gruplandırılmıştır. İşletmede kayıt altında yetiştirilen mevcut 234 koyunun süt verimlerine ait tanımlayıcı değerler Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1 Laktasyon süt verimleri için tanımlayıcı değerler İşletme Geneli Düşük Orta Yüksek Örnek Geneli n Ortalama (kg) 74,55 54,28 77,26 100,81 77,45 Standart Hata 1,43 1,83 1,44 3,52 2,54 Standart Sapma 21,86 9,49 7,47 18,29 22,83 Varyans 477,9 90,02 55,73 334,34 521,38 Varyasyon Katsayısı (%) 29,32 17,48 9,66 18,14 29,48 Minimum (kg) 29,93 35,07 58,65 51,64 35,07 %25'lik dilim (kg) 58,01 46,15 74,01 93,11 58,46 Ortanca Değer (kg) 75,85 55,35 77,82 98,31 77,8 %75'lik dilim (kg) 89,75 59,56 83,18 109,41 93,22 Maksimum (kg) 160,3 69,89 91,33 160,27 160,27 Laktasyon süt verimlerine yapılan varyans analizi (Çizelge 3.2) sonucu etkileri önemli bulunan yaş ve laktasyon süresi çevre faktörlerine göre düzeltme yapıldıktan sonra elde 35

44 edilen verim değerlerinden (Çizelge 3.3); rasgele örnek seçilerek Yüksek, Orta ve Düşük verimli olmak üzere üç grup oluşturulmuştur. Çizelge 3.2 Laktasyon süt verimine ait varyans analizi tablosu Varyasyon KaynağıSerbestlik DerecesiKareler Top.Düzeltilmiş Kareler Top. Düz. Kareler Ort. F Doğum Tipi 2 716,6 213,8 106,9 0,24 0,785 Yaş ,5 6386,6 1064,4 2,41 0,028 Laktasyon süresi ,1 4695,1 4695,1 10,620,001 Hata , ,5 442 Genel ,7 Çizelge 3.3 Düzeltilmiş laktasyon süt verimlerine ait tanımlayıcı değerler İşletme Geneli N 23 4 Ortalama (kg) Standart Hata Varyan s Varyasyo n Katsayısı Min. (kg) Maks. (kg) 58,4 1,35 426,06 35,36 17,13 137,49 Düşük 27 39,0 1,43 55,04 19,02 23,34 48,85 Orta 27 59,1 1,20 39,17 10,59 49,6 68,62 Yüksek 27 84,3 2,72 199,42 16,74 69,33 137,49 Örnek Geneli 81 60,8 2,34 443,8 34,64 23,34 137,49 P Seçilen gruplar arasında yapılan varyans analizi sonucu gruplar arasındaki farklılıklar istatistiksel (P<0,01) olarak önemli bulunmuştur Kan örneklerinin alınması Bu çalışmada kullanılan kan örnekleri steril ve tek kullanımlık iğneler ile 10 ml lik EDTA lı tüplere boyun toplardamarından alınmıştır. Hayvanlardan alınan kanlar soğuk zincirde laboratuvara getirilerek genomik DNA izolasyonu yapılıncaya kadar -20 ºC de saklanmıştır Genomik DNA izolasyonu 36

45 Genomik DNA molekülünün izolasyonunda Miller et al. (1988) tarafından bildirilen DNA izolasyon protokolü laboratuvar ortamında optimize edilerek aşağıda açıklandığı şekilde uygulanmıştır. -20 ºC de muhafaza edilen kan örnekleri derin dondurucudan çıkartılarak çözülene kadar oda sıcaklığında (24-25 ºC) bekletilmiştir. Her bir kan örneğinden 500 µl alınarak 1,5 ml lik ependorf tüp içine konulmuştur. Örneklerin üzerine 1 ml Eritrosit Lysis Tampon Çözeltisi ilave edilmiş ve kısa bir süre vortekslenerek 10 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. Bekletme süresinin sonunda örnekler rpm de 10 dk. santrifüj edilmiştir. Ependorf tüplerin üst kısmında toplanan sıvı kısım dikkatli bir şekilde uzaklaştırılmıştır. Dipte kalan peletlerin rengi gözlenerek peletlerin rengi beyaz olana kadar Eritrosit Lysis Tampon Çözeltisi ile tekrar (en fazla 3 kez) muamele edilmiştir. Peletlerin üzerine 1 ml Fizyolojik Tampon Çözeltisi eklenmiş ve kısa bir süre karıştırılmıştır. Örnekler rpm de 10 dk. santrifüj edilmiş ve santrifüj sonunda sıvı kısım dikkatli bir şekilde tekrar uzaklaştırılmıştır. Peletlerin üzerine 300 µl Lysis TE Tampon Çözeltisi eklenmiş ve peletlerin iyice çözünmesi sağlanmıştır. Çözülen peletlerin üzerine 100 µl SDS (%10) solüsyonu ve 5 µl Proteinaz K (10 mg/ml) eklenerek hafifçe karıştırılmış ve 65 ºC de 1,5 saat su banyosunda tutulmuştur. İnkübasyon süresince her 15 dakikada bir hafifçe karıştırılmıştır. İnkübasyondan çıkarılan örneklerin üzerine 200 µl 6M NaCl çözeltisi eklenerek 15 dk. vortekslenmiştir. Örnekler rpm de 10 dk. santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda üstte kalan ve DNA moleküllerini içeren sıvı kısım yeni bir ependorf tüp içine koyulmuştur. Örnekler rpm de 10 dk. tekrar santrifüj edilerek yine üstte kalan sıvı kısım yeni bir ependorf tüp içine alınmıştır. Örnekler üzerine örnek hacminin iki katı hacimde (yaklaşık 1 ml) %99 luk saf etil alkolden ilave edilmiştir. Etil alkol ilave edildikten sonra ependorf tüpü DNA iplikçikleri kümeleşinceye kadar 4-5 kez hafifçe karıştırılmıştır. Kümeleşen DNA iplikçiklerinin tüpün dibine çökmesi için tüp rpm de 5 dk. santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda etil alkol uzaklaştırılarak tüpün dibine çökmüş olan DNA peletinin üzerine 1 ml %70 lik etil alkol ilave edilerek rpm de 2 dk. santrifüj edilmiştir. Santrifüj işleminden sonra tüpün üstünde yer alan 37

46 alkol uzaklaştırılmıştır. Tüp içindeki alkolün tamamen uzaklaşmasını sağlamak amacıyla örnekler çeker ocak içinde kurumaya bırakılmıştır. Tamamen kuruyan örnekler üzerine 50 µl TE Tampon Çözeltisi ilave edilerek DNA peletinin çözülmesi için bir gece +4ºC de bekletilmiştir. Genomik DNA izolasyonunun miktar ve saflık kontrollerinin yapılmasında NanoDrop Spektrofotometre (ND 1000) den yararlanılmıştır. Spektrofotometre ölçümleri sonucunda 260/280 dalga boylarında 1,8-2,0 saflık ile miktar olarak 50 ng/µl değerinin üzerinde bulunan DNA molekülleri PCR işlemi yapılıncaya kadar +4 ºC de muhafaza edilmiştir. Çizelge 3.4 Tampon çözeltilerin molaritesi/miktarı ve içerikleri Tampon Çözelti Molarite/Miktar İçerik Eritrosit Lysis 0,32 M 10 mm 5 mm Sukroz EDTA MgCl 2 Fizyolojik 75 mm NaCl Lysis TE TE 6M NaCl Çözeltisi 25 mm 500 mm 20 mm 10 mm 10 mm 1 mm 5,64 g 10 ml ye tamamlanır EDTA Tris-HCl EDTA NaCl Tris EDTA NaCl Deiyonize ddh 2 O Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kapilar elektroforez Çalışmada PCR karışımı 10x Buffer (GeneMark), 3mM MgCl 2 (GeneMark), 0,2 mm dntp (Fermantes), geri ve ileri primer 20 pmol/µl, Taq polimeraz (Genmark) 1,25 U, 75 ng/µl DNA) her bir örnek için toplam hacim 50 µl olacak şekilde 0,5 ml lik steril ependorf tüplerine hazırlanmıştır. Her PCR reaksiyonunda 2 adet negatif kontrol (DNA örneği ilave edilmemiş bir tüp) ve 2 adet pozitif kontrol (daha önce yarı otomatik sekans cihazında aynı gen bölgeleri yönünden çalışılmış, allel uzunlukları bilinen DNA örnekleri) kullanılarak hem kontaminasyon olup olmadığı, hem de yükseltgenmenin 38

47 doğruluğu kontrol edilmiştir. PCR reaksiyonu için optik densiteleri önceden hesaplanan TE içinde çözdürülen DNA solüsyonlarından her örnek için 5 µl kullanılmıştır. Çizelge 3.5 te çalışmada kullanılacak mikrosatelit lokuslara ait çeşitli özellikler gösterilmiştir. Çizelge 3.5 Lokuslara ait özellikler Lokus OarFCB20 OarFCB128 OarFCB304 Erişim Numarası L20004 L01532 L01535 Kromozom 2p 2q 19 Geri Primer AAATGTGTTTAA CAGCTGAGCAACTA CCCTAGGAGCTTT GATTCCATACAGTG AGACATACATGCG CAATAAAGAATCGG İleri Primer GGAAAACCCCC ATTAAAGCATCTTC CGCTGCTGTCAA ATATATACCTATAC TCTTTATTTCCTCGC CTGGGTCAGGG Tekrar bölgesi (TG)15 (GT)15 (CT)11(CA)15 Lokusların çoğaltılmasında Çizelge 3.6 da verilen PCR programı uygulanmıştır. PCR işlemi sonucunda örneklerin kontrolü %2 lik agaroz jellerinde yapılmıştır. PCR ürünleri 1/10 oranında sulandırılarak, 1 µl PCR ürününe, 12 µl Formamide, 0,5 µl Size Marker Tamra 500 (GeneScan-500 TAMRA Size Standart Applied Biosystems) eklenerek karıştırıldı. Karışım 95 ºC de 2 dk. inkübe edilerek elektroforez işlemi gerçekleştirilinceye kadar +4 ºC de saklanmıştır. Çizelge 3.6 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) programı Sıcaklık - Süre Aşama 95 o C 5 dk. Ön denaturasyon (DNA eksenlerinin birbirlerinden ayrılması) 95 o C 30 s. Denaturasyon (DNA eksenlerinin birbirlerinden ayrılması) 55 o Annealing (Primerin komplementer kalıp DNA ekseni C 30 s. 25 döngü bölgesine bağlanması) 72 o C 30 s. Uzama (DNA bölgesinin sentezinin yapılması) Son Uzama (Üzerinde durulan DNA bölgesinin sentezinin son 72 o C 10 dk. kez yapılması, Taq polimerazın PCR bölgesine polya eklemesi) Formamid ile muamele edilmiş örnekler ABI-310 Genetik Analiz cihazında POP4 polimeri kullanılarak C filtrede yürütülen örneklerden lokusların allel uzunlukları belirlenmiştir. 39

48 3.2.5 İstatistik analizler için kullanılan paket programlar Çalışılan mikrosatelit lokuslarına ait allel uzunlukları belirlendikten sonra, bu allel uzunluk verileri mikrosatelit lokuslarına ait populasyonlar içi genetik çeşitlilik, heterozigotluk düzeyleri, Wright ın F istatistik değerleri GENETIX 4.05 programı ve Hardy-Weinberg dengesine uyum, Polimorfik Bilgi İçeriği (PIC) Cervus programı kullanılarak analiz edilmiştir. Ayrıca yapılan analizler Genepop ve Arlequin paket programlarında tekrarlanmıştır. Kullanılan programlara ait web sayfaları aşağıda listelenmiştir. - Genetix 4.05: - Cervus : - Arlequin : - Genepop : 40

49 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ABI-310 Genetik Analiz cihazında elde edilen ölçüm değerleri kapilar elektroforeogramlar olarak elde edilmiştir. Şekil 4.1, 4.2 ve 4.3 te lokuslara ait örnek elektroforeogramlar gösterilmiştir. Şekil 4.1 OarFCB20 lokusuna ait örnek elektroforeogramlar 41

50 Şekil 4.2 OarFCB128 lokusuna ait örnek elektroforeogramlar 42

51 Şekil 4.3 OarFCB304 lokusuna ait örnek elektroforeogramlar Lokuslar için elde edilen mikrosatelit allel genişlikleri literatür bilgileri ve lokus gözlemleri dikkate alınarak çalışılan tüm lokuslar için çift değerler alacak şekilde düzeltilerek Cervus, Genepop, Arlequin ve Genetix paket programlarında analizleri 43