TC. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ ADLİ TIP ENSTİTÜSÜ İNSERSİYON/DELESYON (INDEL) MARKIRLARI VE TÜRKİYE POPULASYONU ARZU DÜVENCİ

Transkript

1 TC. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ ADLİ TIP ENSTİTÜSÜ İNSERSİYON/DELESYON (INDEL) MARKIRLARI VE TÜRKİYE POPULASYONU ARZU DÜVENCİ 1

2 GİRİŞ Adli olayların aydınlatılmasında biyolojik örneklerin kimliklendirilmesi çok önemlidir. Adli bilimlerde kullanılan genetik işaretlerin başında STR sistemleri gelmektedir. Ancak bugün özellikle aşırı degrade olmuş veya az miktarda DNA içeren biyolojik delillerin analizinde yeterli değildir. Bu durumda SNP ler ve INDEL lerden yararlanılabilir. 2

3 İNSERSİYON/DELESYON (INDEL) İnsersiyon/delesyon veya yaygın olarak INDEL adı verilen genetik varyasyonlar, DNA dizisine baz dizisinin eklenmesi ya da çıkması şeklinde oluşur. Baz dizisinin çıkması sonucu oluşan versiyonuna delesyon, baz dizisinin eklenmesi sonucu oluşan versiyonuna ise insersiyon adı verilmektedir. delesyon TCAGCAACAACACAGTCATATTTAGCTCTACCACAGTGTG GCAACAACACAGTCATATCCATTCTCAATTAGCTCTACCACAGTGTG insersiyon 3

4 İNSERSİYON/DELESYON (INDEL) DNA da meydana gelen İnsersiyon/delesyonlar sonucu mutasyonlar ve polimorfizmler oluşur. DNA daki bu değişiklikler fenotipi etkiliyor ise mutasyon olarak, bu değişiklikler fenotipi etkilemiyor sadece genetik çeşitlilik sağlıyor ise polimorfizm olarak adlandırılmaktadır. Polimorfizm sonucu meydana gelen farklılıklar kuşaktan kuşağa Mendel yasalarına göre aktarılırlar. Polimorfik bir sistemin adli bilimlerde kimliklendirme amaçlı kullanılabilmesi için o sistemin populasyonda en az %1 sıklıkta görülmesi gereklidir. 4

5 İnsersiyon/Delesyon (INDEL) Polimorfizmi İnsan DNA sındaki polimorfizmin büyük çoğunluğunu oluşturan tek baz değişimi (SNP ler) veya daha fazla bazın insersiyonu ve delesyonuna dayalı polimorfizmler olarak iki gruba ayırmak mümkündür. Bunlar nokta mutasyonları ve çerçeve kayması mutasyonları şeklinde oluşan kalıtımsal değişimler meydana getirirler. Nokta mutasyonunda sadece bir baz mutasyona uğrar ve Tek Nükleotid Polimorfizmini (SNP, Single Nüleotid Polymorfizm) oluştururlar. Çerçeve kayması mutasyonu, baz dizisinin insersiyonu (eklenmesi) veya delesyonu (çıkması) şeklindedir. 5

6 İNSERSİYON/DELESYON (INDEL) Küçük INDEL Büyük INDEL 1. Küçük INDEL ler: Sadece birkaç bç lik uzunluktaki dizinlerdir. Bu INDEL ler polimorfizm göstermesinin yanında daha çok hastalıklarla ilgili varyasyonları oluşturur. Bunun nedeni, genin kodlama bölgesinde INDEL dizinin okumada bozulmaya neden olması ve protein dizisinin değişmesine yol açmasıdır. 2. Büyük INDEL ler: Birkaç kilobaz (kb) uzunluğu aşan dizinlerdir. Bu tip varyasyonlar genomda sanılanın aksine sıklıkla görülmektedir. Adli kimliklendirmede kullanılan ve SNP polimorfizmi kadar olmasa da genom içinde 1000 den fazla bilinen INDEL ler bu varyasyonlardan oluşmaktadır. 6

7 İnsersiyon/Delesyon (INDEL) Polimorfizmi Tüm insan genomunun yaklaşık 3.2 milyon baz olduğu ve tahminlere göre yaklaşık 2700 bazda bir ortaya çıkan, hem kodlama yapan hem de yapmayan bölgelerinde yaklaşık 1 milyon SNP olduğu düşünülmektedir. Genetik varyasyonları belirlemek için yapılan çalışmalar daha çok SNP ler üzerinde yoğunlaşmış olsa da son yıllarda INDEL polimorfizmi üzerinde de çalışmalar yapılmaktadır. 7

8 İnsersiyon/Delesyon (INDEL) Polimorfizmi Özelliklede 2002 yılında Marshfield Tıp Araştırma Vakfında, James Weber ve arkadaşlarının insan genomu üzerinde 2000 in üzerinde dialelik insersiyon/delesyonu karakterize etmesiyle, dialelik indellerin insan polimorfizminin %8 ini oluşturduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışma sonucunda toplamda %71 INDEL in aleller arasında 2, 3, veya 4 nükleotid uzunluk farkı varken sadece %4 ünde 16 nükleotid uzunluk farkı çıkmıştır. 8

9 İnsersiyon/Delesyon (INDEL) Polimorfizmi Bir başka çalışma olan Mills ve arkadaşlarının 2006 yılında yaptıkları çalışmayla insan indel varyasyon haritasını çıkararak 7.2 kb da bir görüldüğünü genomda SNP den sonra en sık rastlanan ikinci polimorfizim şeklinin INDEL ler olduğunu bildirmişlerdir. Bu da bilinen 15 milyon genetik varvasyonun 3 milyonunun INDEL lerin oluşturduğunu gösterir. Bu çalışma sonucunda İndellerin %36 sı DNA da promoter bölgede, intronlarda ve eksonlarda yerleşmiştir. 9

10 İnsersiyon/Delesyon (INDEL) Polimorfizmi Adli amaç için uygulanacak INDEL analizinin avantajlı özellikleri; duyarlı olması, tekrarlanabilirliği, doğruluğu, bozulmuş örneklerde yüksek performans göstermesi, multipleks yapılabilme kapasitesi, zaman, maliyet, 10

11 İnsersiyon/Delesyon (INDEL) Polimorfizmi İNDEL lerin düşük mutasyon ve yüksek heterozigotluk oranının olmasından, dışlama ve ayrım gücünün yüksek olmasından ayrıca bozunmuş ve eser miktardaki örneklerde başarılı tiplendirme yapabilmesinden dolayı yeni nesil genetik varyasyonlar olan INDEL ler üzerine daha birçok çalışma yapılacağı düşünülmektedir. Kısacası SNP haritalarına INDEL lerin eklenmesi genom genetik haritaların çözünürlüğünün artırılmasına ve hastalığa neden olan lokuslardaki yerinin bulunmasına yardımcı olabilir. 11

12 İnsersiyon/Delesyon (INDEL) Polimorfizmi Ayrıca kimlik tespiti dahil olmak üzere özellikle nesep tayininde ve kitlesel felaket kurbanlarının akrabalık ilişkilerinin saptanmasında, gelecekte genetik çalışmalarda INDEL lerin yaygın bir şekilde kullanılacaktır. Bir nevi günümüzde DNA profillemesinde kullanılan SNP ve STR polimorfizmine İnsersiyon/Delesyon (INDEL) polimorfizmi alternatif oluşturacaktır. 12

13 Türkiye Popülasyonu Çalışmada aralarında akrabalık ilişkisi bulunmayan Türkiye nin tüm bölgelerini yansıtacak şekilde çalışmaya rıza gösteren sağlıklı 250 kişiden onam alınan kan örnekleri kullanıldı. DNA örneklerinde 30 INDEL lokusunun multiplex (çoklu) amplifikasyonu yapıldı. 13

14 Türkiye Popülasyonu Otozomal kromozomlar üzerinde bulunan 30 INDEL lokusunun optimizasyonu yapılarak söz konusu lokusların Türkiye deki polimorfizmi belirlendi. 14

15 Otozomal 30 INDEL lokusunun 250 kişi üzerinde Genemapper IDX v.1 (Life Technologies) analiz programı kullanılarak genotipi belirlendi. 15

16 Kadın DNA'sına ait elektroforegram görüntüsü 16

17 Erkek DNA'sına ait elektroforegram görüntüsü 17

18 VERİLERİN ANALİZİ GENETİX v , Arlequin v , Promega PowerStats Excel Dosyası, MedCalc MEGA 5.1, 18

19 İSTATİSTİKSEL BULGULAR Alel Frekansları 250 kişide 30 INDEL lokusunun alel sıklığı Arlequin v yazılım programı kullanılarak yapıldı. 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 D77-/+ D45-/+ D131-/+ D70-/+ D6-/+ D111-/+ D58-/+ D56-/+ D118-/+ D92-+ D93-/+ D99-/+ D88-/+ D101-/+ D67-/+ D83-/+ D114-/+ D48-/+ D124-/+ D122-/+ D125-/+ D64-/+ D81-/+ D136-/+ D133-/+ D97-/+ D40-+ D128-/+ D39-/+ D84-/+ DIP- DIP+ 19

20 Hardy-Weinberg Dengesi Arlequin v programında 30 INDEL lokusunun p-değerleri hesaplandı ve Hardy-Weinberg dengesine bakıldı. P değerinin anlamlılığının değerlendirilmesinde; P 0.05 ise, sapma önemlidir ve popülasyonda denge yoktur. P 0.05 ise, sapma istatistiksel olarak anlamlı değildir ve popülasyon dengededir. 20

21 Adli İstatistik Parametreleri Otozomal 30 INDEL lokusunun ayrım gücü (PD), eşleşme olasılığı (Pm), polimorfik bilgi içeriği (PIC), dışlama gücü (PE), tipik babalık indeksi (TPI) gibi adli istatistik parametreleri Promega PowerStats excel dosyası kullanılarak hesaplandı. 21

22 İSTATİSTİKSEL BULGULAR Popülasyonlar Arası Lokus Bazındaki Farklılıklar 30 INDEL lokusunun Türkiye popülasyonu ile diğer popülasyonların (Kuzey Doğu İtalya, Polonya, Finlandiya, Güney Kore, Tayvan, Somali) makalelerinden elde edilen alel frekanslarından yararlanılarak Arlequin v yazılım programı kullanılarak Fisher s Exact Test ile popülasyonlar arası p-değeri bakımından lokus bazındaki farklılık belirlendi. Tayvan (126) Finlandiya (151) Somali (175) Polonya (122) İtalya (200) Kore (373) Türkiye (250) 22

23 Fisher s Exact Test Sonucu South Korea D97, D40, D128,D39, D84, D122, D125, D64, D81, D118, D93, D99, D67, D131, D111, D56 Italy - Finland D48, D93, D99, D77 Somali Taiwan Poland D138, D84, D114, D124, D122, D125, D81, D99, D88, D101, D45, D131, D70, D111 D40,D128,D39, D48,D122,D64,D81, D118, D99, D131, D111 D131 23

24 İSTATİSTİKSEL BULGULAR Popülasyonlar Arası Genetik Uzaklık (F ST ) 1000 Genome INDEL verilerinin bulunduğu Ensemble ( veri bankasından söz konusu lokuslardan diğer popülasyonlara ait 15 INDEL lokusuna ait 15 INDEL ( HLD45, HLD131, HLD58, HLD99, HLD88, HLD101, HLD83, HLD114, HLD48, HLD81, HLD136, HLD133, HLD128, HLD39, HLD84) lokusunun genotip bilgilerine ulaşılmıştır. Türkiye popülasyonu ile Avrupa, Amerika, Güney Asya, Doğu Asya, Afrika popülasyonlarına ait genotip veriler kullanılarak 15 INDEL lokusu için Arlequin ver programı yardımıyla ortak Fst değerleri hesaplandı. 24

25 INDEL lokuslarının popülasyonlar arası genetik uzaklık (Fst) değerleri Türkiye Avrupa Amerika Güney Asya Doğu Asya Afrika 15 INDEL n:250 n:503 n:347 n: 489 n:504 n:661 Türkiye Avrupa Amerika Güney Asya Doğu Asya Afrika Fst değeri küçük, orta düzey, büyük, 0.25 den büyük ise çok büyük bir genetik farklılaşma 25

26 Filogenetik Ağaç Çizimi İSTATİSTİKSEL BULGULAR Türkiye popülasyonuna ile Avrupa, Amerika, Güney Asya, Doğu Asya, Afrika popülasyonlarına ait genotip veriler kullanılarak INDEL lokusları için bulunan Fst değerleri ile Mega 5.1 programında komşu birleştirme yöntemi kullanılarak filogenetik ağaç çizildi. 26

27 Filogenetik Ağaç Çizimi Guney Asya Dogu Asya Turkiye Avrupa Amerika Afrika

28 SONUÇ Türk populasyonu için yüksek polimorfizm gösteren 30 INDEL (Amelogenin X, Amelogenin Y ve HLD77, HLD45, HLD131, HLD70, HLD6, HLD111, HLD58, HLD56, HLD118, HLD92, HLD93, HLD99, HLD88, HLD101, HLD67, HLD83, HLD114, HLD48, HLD124, HLD122, HLD125, HLD64, HLD81, HLD136, HLD133, HLD97, HLD40, HLD128, HLD39, HLD84) lokusundan oluşan Investigator DIPplex Kit (Qiagen) in adli bilimlerde kullanılabileceği belirlenmiştir. Bu çalışma bulguları Türk Toplumu nun Avrupa Toplumu na genetik olarak daha yakın olduğunu göstermiştir. Bu lokuslar Türk kriminal laboratuvarlarında babalıkakrabalık testlerinde ve degrade DNA örneklerinin analizinde de kullanılabilecektir. 28

29 SONUÇ INDEL lerin, özellikle olay yerinden az miktarda veya bozunmuş olarak gelen biyolojik materyallerde hatta antropolojik ve arkeolojik araştırmalarda, STR lokusları ile tiplendirme yapılamadığı durumlarda ve SNP ye göre daha kısa zamanda ve az maliyetle başarılı bir çoğalma yapılabilmesi gibi özellikleri açısından adli bilimlerde kullanımı zamanla artacaktır Yinede INDEL lokuslarının STR ya da SNP sistemlerine alternatif oluşturabilmesi için yaygın bir şekilde kullanılması, hem diğer somatik kromozomlar hem de cinsiyet kromozomları üzerindeki daha çok INDEL noktasının araştırılması gerekir. 29

30 BENİ DİNLEDİĞİNİZ İÇİN TEŞEKKÜR EDERİM 30