ÖZEL EGE LİSESİ ÇEVRESEL ÖRNEKLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİ BAKTERİLERİN ARAŞTIRILMASI VE HALK SAĞLIĞI AÇISINDAN ÖNEMİ

Transkript

1 ÖZEL EGE LİSESİ ÇEVRESEL ÖRNEKLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİ BAKTERİLERİN ARAŞTIRILMASI VE HALK SAĞLIĞI AÇISINDAN ÖNEMİ HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Deniz ERGÜL İsmet Eren SADİ 2012 İZMİR

2 İÇERİK LİSTESİ Sayfa Projenin Amacı 2 1. Giriş Antibiyotiklerin Keşfi ve Günümüzdeki Durumu Antibiyotikler Bizi Nasıl Korur? Antibiyotik Direnç Mekanizmaları 6 2. Yöntem Örnek Alımı Mikroorganizma İzolasyonu Salmonella İzolasyonu Selektif Olmayan Zenginleştirme Selektif Ön Zenginleştirme Selektif Katı Ortamda Üreme E.coli İzolasyonu Disk Difüzyon Yöntemi 10 3.Bulgular 11 4.Sonuçlar ve Tartışma Teşekkür Kaynaklar 17 1

3 Projenin Amacı: Bu projenin amacı, İzmir körfezinden alınan su ve sediment örneklerinde su kirliliğinin mikrobiyal göstergesi olan enterik bakterileri tespit etmek; bunların antibiyotik dirençliliklerini belirlemek, antibiyotiğe dirençliliğin halk sağlığı açısından önemini vurgulamak ve antibiyotik direncinin gelişiminin engellenmesine yönelik yapabileceklerimizi ortaya koymaktır. 1. Giriş: 1.1. Antibiyotiklerin Keşfi ve Günümüzdeki Durumu Paul Ehrlich, 1909 yılında arsenik bazlı bir madde bulmuş ve bu maddeye Salvarsan adını vermiştir. Bu maddenin, erken dönemde bel soğukluğu hastalığının tedavisinde etkili olduğu bulunmuştur. Ardından Louis Pasteur, 19. Yüzyılın ortalarında bazı mikroorganizmaların diğerlerini öldürdüğünü, daha sonra 1928 yılında Alexander Fleming bu maddenin stafilokokların gelişimini önlediğini belirtmiştir ve bu mantara Penicillium notatum adını vermiştir lı yıllarda Oxford Üniversitesi nden iki bilim adamı bu kültür sıvısından penisilin adını verilen mucizevi özellikleri olan ilk antibiyotiği izole ederek insanlığın hizmetine sunmuştur. Bu arada bir İsveç bilim adamı olan Daniel Bovert de 1937 yılında sülfonamid adlı sentetik kimyasal maddenin enfeksiyonlarla mücadelede bugüne kadar geliştirilecek olan pek çok antibiyotiğe ilham kaynağı olmuştur. Pasteur ün mikroorganizmalarla ilgili bu mucizevî buluşu, antibiyotikler için tam anlamıyla altın çağın bir başlangıcı olmuştur. Penisilin ve sülfonamidlerden sonra özellikle lı yıllar arasında, başta daha geniş spektrumlu penisilinler olmak üzere hızla yeni antibiyotikler geliştirilmeye ve birçok enfeksiyon hastalığı başarıyla tedavi edilmeye başlanmıştır. Bunların arasında, antibiyotiklerin isim babası olan Selman A. Waksman ın bulduğu ve tüberküloz tedavisinde çığır açan streptomisin de bulunmaktadır lı yılların sonlarına doğru Antibiyotiğe dirençli plazmidlerin bulunuşu ile Amerika Birleşik Devletleri sağlık bakanlığına bağlı Gıda ve İlaç Kurumu (FDA) yeni ilaç çalışmalarına başlamıştır lı yıllardan bugüne kadar ise bakterilerin antibiyotiğe olan direncinin önlenemeyen artışının engellenmesi için biyokimyasal ve genomik çalışmalar hız kazanmıştır (Şekil 1) 2

4 Şekil 1. Antibiyotik Çağı Evreleri (Origins And Evolution Of Antibiotic Resistance, Mıcrobıology And Molecular Bıology Revıews,2010) Bugün dünyada yaklaşık çeşit antibiyotik bilinmektedir, bunlardan ayrıntılı olarak araştırılan ilaçların sayısı olup, bunların da ancak 100 kadarı aktif olarak klinik kullanımdadır. Fleming in mucizevî buluşundan bu yana enfeksiyonları önleyebilmek adına mikroorganizmalara karşı yıllar boyunca mücadele verildi. Ancak, her ne kadar sayısız zaferler kazanıldıysa da savaş henüz tam anlamıyla bitmiş değildir. Çünkü ne zaman yeni bir antibiyotik geliştirilse, o antibiyotiğe karşı neredeyse aynı hızda direnç gelişmektedir. Bakteriler savaş alanına her dönüşlerinde biraz daha değişime uğramış ve biraz daha güç kazanmıştır. Bizim direnç adını verdiğimiz bu durum, yeni antibiyotik geliştirilmesine ket vuran olumsuz etkenlerin başında gelmektedir. Bunun yanısıra hâlâ ilaçların istenmeyen etkilerinin, ilaç etkileşimlerinin ve maliyetlerinin önüne geçilebilmiş değildir. Son yıllarda, özellikle geniş spektrumlu beta-laktamaz kavramı ortaya çıktığından beri, penisilinlerin ve diğer beta-laktam grubu ilaçların kullanımında belirgin bir direnç sorunuyla karşı karşıya kalınmıştır. Bunun yanısıra beta-laktamlar arasında çapraz direnç gelişimi de bu ajanların güvenle kombine edilmelerini önlemektedir. Penisilinlerin kimyasal yapısını oluşturan beta laktam halkasını hidrolizleyen Beta-laktamaz enzimlerinin inhibitörlerinin geliştirilmesiyle direnç sorununun bir ölçüye kadar önüne geçilmeye çalışılmıştır. Ancak yine de ampisilin ve amoksisilin gibi aminopenisilinlerin Gram negatif bakterilere karşı etkinliği önemli ölçüde azalmıştır. Ayrıca, enterokoklarda aminoglikozidlere karşı direnç gelişimi söz konusudur. Öte yandan, son yıllarda metisiline dirençli stafilokoklar ortaya çıkmıştır. Vankomisine karşı son zamanlarda giderek artan bir enterokok ve stafilokok direncinden söz edilmektedir. Bu direnç vankomisine aminoglikozid eklemek suretiyle 3

5 önlenmeye çalışılmaktadır. Daha da önemlisi, çoklu ilaç direnci (multi drug resistance) sorunudur. Çoklu ilaç direnci bulunan Gram negatiflerin ve verem etmeni olan Mycobacterium tuberculosis suşlarının saptanması, hatta pnömokokların hem penisilinlere hem de makrolidlere karşı direnç kazanmış olması, günümüz antibiyotikleriyle tedavide başarıyı gölgeleyen faktörlerin başında gelmektedir. Antibiyotik dirençliliğinin doğada yayılımı büyük ölçüde insan kaynaklı (antropojenik) olup bu yayılımın nasıl gerçekleştiği Şekil 2. de gösterilmektedir. Şekil 2. Antibiyotik ve Antibiyotik Dirençliliğinin Yayılması (Origins And Evolution Of Antibiotic Resistance, Mıcrobıology And Molecular Bıology Revıews, 2010.) 4

6 1.2. Antibiyotikler Bizi Nasıl Korur? Antimikrobiyaller, bulaşıcı hastalıkların tedavisinde kullanılan, bakteri, virüs ve parazit gibi mikroorganizmaları öldürmek ya da baskılamak için kullanılan ilaçlardır. Antibiyotikler ise, sadece bakterilere karşı etki gösteren antimikrobiyal alt gruplarıdır. Antibiyotik, herhangi bir mikroorganizma tarafından, başka bir mikroorganizmayı öldürmek veya çoğalmasını durdurmak için üretilen her türlü maddedir. Antibiyotikler konak organizmanın hücrelerini değil daha çok patojenik mikroorganizmaları etkileyen seçici toksik maddelerdir. Seçici toksisite ilacın spesifik etki mekanizmasına dayanmaktadır. En seçici ajanlar, yalnızca prokaryotik hücrelerde bulunan yapıları (örneğin hücre duvarı) ya da fonksiyonları (örneğin folik asit sentezi) etkileyenlerdir. Az seçici antibiyotikler ise hem prokaryotik (bakteri) hem de ökaryotik hücrelerde (konak) gerekli fonksiyonlar olan protein ya da nükleik asit sentezini etkileyenlerdir. Antibiyotikler kimyasal yapılarına dayanılarak sınıflandırılırlar. Her bir antibiyotik sınıfı tipik bir çekirdek yapısıyla karakterize edilir ve sınıfın çeşitli üyeleri ikincil kimyasal yapıların ilavesiyle ya da çıkarılmasıyla ayırt edilir. Antibiyotikler aynı zamanda etkili oldukları bakteri spektrumunun genişliğine bağlı olarak dar, orta ya da geniş spektrumlu olarak da sınıflandırılırlar. Dar spektrumlu antibiyotikler bakterilerin sınırlı bir grubu için etkilidirler. Örnegin, penisilin sadece Grampozitif bakterilere karşı etkili iken, aminoglikozidler, sülfonamidler ve trimetoprim yalnızca aerobik bakterilere karşı etkilidir. Orta spektrumlu antibiyotikler genellikle bazı Gram-negatif bakterileri türlerine karşı azaltılmış aktiviteli maddeleri içermektedirler (örneğin; ampisilin, amoksisilin, birinci ve ikinci kuşak sefalosporinler). Geniş spektrumlu antibiyotikler, üçüncü kuşak sefalosporinler, tetrasiklinler ve kinolonlar gibi hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilere karşı etkili olan maddeleri içermektedirler. Antibiyotiklerin bakteriler üzerindeki etkileri aşağıda sıralanmıştır (Walsh, 2003); 1- Hücre duvarı sentezini engellemek, 2- Protein sentezini inhibe etmek, 3- DNA/RNA öncüllerinin (folat) sentezini inhibe etmek, 4- DNA/RNA sentezini inhibe etmek, 5- Membran proteinlerinin sentezini inhibe etmek. Penisilin, vankomisin, florokinolon ve sefalosporin gibi antibiyotikler bugün en çok kullanılan antibiyotiklerdendir. Bu antibiyotiklerin hepsi bakterilerin hücre çeperlerini zayıflatır. Bakterilerin hücre çeperleri uzun peptidoglukan zincirlerinden oluşmaktadır. Antibiyotikler bu molekülleri bir arada tutan peptit bağlarının sentezini önlerler. Bu durumda kullanılan hücre 5

7 çeperlerini zayıflatarak bakteriyi patlatırlar (lizis). Peptidoglikandan oluşan hücre çeperleri sadece bakterilerde bulunmaktadır, bu çeper yapısı hayvan hücresinde bulunmazken bitki hücrelerinde selülozdan oluşan hücre çeperi bulunmaktadır. Böylece, antibiyotikler sadece bakterilere zarar vermektedir. Streptomisin, eritromisin, tetrasiklin ve kloramfenikol gibi antibiyotikler bakteride ya protein sentezini engellerler ya da anormal proteinlerin sentezlenmesine yol açmaktadırlar. Antibiyotikler, bu etkileri bakterilerin ribozomlarına, daha doğrusu ribozomal RNA'nın alt birimlerine bağlanmak suretiyle yapmaktadırlar. Bakteri ribozomları ökaryotik ribozomlardan (insan ribozomları gibi) daha küçük oldukları için, bu tür antibiyotikler sadece bakterileri etkileyip konak canlıya zarar vermezler. Rifampisin ve antrasiklin gibi antibiyotikler ise nükleik asit sentezine müdahale ederler. Antrasiklinler, bunu DNA replikasyonunu engelleyerek yaparken, rifampisin bakteriyel transkripsiyonu önlemektedir. Bazı antibiyotikler ise patojen bakterileri hücre zarlarına müdahale ederek yok ederler. Hücre zarına yapılan müdahaleler, hücre zarının yapısını değiştirerek onun birçok özelliğini de kaybetmesine yol açar. Bu durum ise hücre sitoplazmasının hücre dışına akması gibi hücrenin yıkımıyla sonuçlanacak olaylara yol açabilir Antibiyotik Direnç Mekanizmaları Antibiyotik direnci, bir bakterinin antimikrobiyal bir ajanın öldürücü veya üremeyi durdurucu etkisine karşı koyabilme yeteneğidir. Antibiyotik direncinin yalnızca yaygın antibiyotik kullanımı sonucu oluştuğu değil, aynı zamanda bakterilerin olumsuz çevre koşullarında yaşamlarını sürdürmek için kullandığı savunma sürecinin bir parçası olduğu da belirtilmektedir. Günümüzde tüm dünyada bir yandan hızla yeni ilaçlar geliştirilmekte iken, öte yandan bunlara hızla direnç gösteren mikroorganizmalarla oluşan enfeksiyonlar bildirilmekte ve bu sorunun boyutları giderek büyümektedir. Bakterilerin antibiyotiklere karşı gösterdiği direnç mekanizmaları üç grup altında toplanabilir: 1- İlacın hedefinde değişiklik oluşması a) İlacın bakterideki reseptöre bağlanma yeteneğinde azalma olması b) İlaçtan etkilenmeyen farklı bir metabolik yolun kullanılması 2- Bakteride sentezlenen bir enzimle ilacın etkisizleştirilmesi 3- Bakteri hücresine giren ilaç miktarının azalması 6

8 a) Hücre zarında permeabilitenin azalması b) Aktif atım pompaları ile ilacın hücre zarından dışarı atılması Bir bakteri, bu mekanizmalardan bir veya birkaçını kullanarak, farklı etki mekanizmalarına sahip antibiyotiklere karşı direnç kazanabilmektedir. Bir mikroorganizmanın yapısı nedeni ile antibiyotiklere dirençli olması intrensek (doğal) direnç olarak tanımlanır. Bu tür direncin ilaç kullanımı ile ilgisi yoktur. Doğal direnç, bu mikroorganizmaların tür özelliği olarak ilacın hedefi olan yapıyı taşımamalarının veya ilacın yapısal bir özellikten dolayı hedefine ulaşamamasının bir sonucudur. Örneğin; ilacın dış membrandan geçememesi nedeni ile gram-negatif bakteriler vankomisine, enterokoklar sefalosporinlere ve aminoglikozidlere, anaerob bakteriler ise aminoglikozidlere doğal dirençlidirler. Kazanılan direnç ise DNA daki mutasyonlarla veya yeni bir DNA nın edinilmesiyle ortaya çıkmaktadır. Mutasyonlar genellikle bakterideki kromozomal bakterideki DNA da oluşmaktadır; ancak plazmid veya transpozonlardaki genlerde de olabileceği bilinmektedir. Mikroorganizmalar antibiyotikleri tolere edebilmek için antibiyotiklere karşı çesitli direnç mekanizmaları geliştirmişlerdir. Bazı mikroorganizmalar, aktif antibiyotiği parçalayan enzim üretirler. Örneğin; Stafilokok penisilin G ye onu parçalayan β -laktamaz ürettiği için dirençlidir. Gram-negatif bakteriler antibiyotiği parçalayan adenilleyici, fosforilleyici ya da asetilleyici enzimler ürettikleri için aminoglikozidlere dirençlidirler ve kloramfenikol asetiltransferaz enzimi üretirler ise kloramfenikole de dirençli olurlar Antibiyotikler çeşitli şekillerde sınıflandırılırlar. Hücre duvarı, protein sentezi ve nükleik asit sentezini inhibe eden bazı antibiyotikler şunlardır: Hücre Duvarı Sentezini İnhibe Edenler: β-laktamlar, Glikopeptidler, Penisilinler, Vankomisin, Sefalosporinler, Avoparsin, Karbapenemler, Teikoplanin Protein Sentezini İnhibe Edenler: Aminoglikozidler, Tetrasiklinler, Makrolidler, Streptograminler, Kloramfenikol, Streptomisin, Klortetrasiklin, Eritromisin, Virginiamisin, Neomisin, Oksitetrasiklin, Azitromisin, Quinupristin, Dalfopristin, Kanamisin, Klaritromisin, Pristinamisin, Gentamisin 7

9 Nükleik Asit Sentezini İnhibe Edenler : Kinolonlar, Sülfonamidler, Rifampisin, Siprofloksasin, Sülfamethoksaz, ol-trimetoprim, Norfloksasin 2. Yöntem: 2.1 Örnek Alımı: Araştırmada kullanılan örnekler İzmir körfezi kıyısındaki derelerden alınmıştır (Resim 1.) Bu örneklerin alındığı yerleri ve içeriği aşağıda belirtilmiştir: -AOSB Kanalı deresinden (5 numaralı dere) su örneği, -Mavişehir içinden geçen dereden su örneği ve sediment (çamur ) örneği, -Bostanlı deresinden (6 numaralı dere) su ve yosun örneği, -Manda çayından (11 numaralı dere) yosun örneği, -Melez çayından (13 numaralı dere) su, yosun ve kaya örneği. Resim 1. Kent Merkezindeki Büyük Dereler ( ) 8

10 Su örnekleri (1 er litre) steril serum şişelerine, sediment ve yosun örnekleri 50 ml lik steril falcon tüplerine konulmuştur Mikroorganizmaların İzolasyonu: Alınan tüm su örneklerine membran filtrasyon yöntemi uygulandı. Bu yöntemin prensibi su örneklerimizin içerdiği mikroorganizmaların büyüklüğünden daha küçük gözeneklere sahip membran filtre üzerinden vakum desteği ile süzülmesidir. Böylece örneklerimizin içerdiği bütün mikroorganizmalar membran filtre üzerinde tutulmuş olur. Bu amaçla tüm su örnekleri önce kaba filtreden daha sonra 0,45 µ luk ince filtreden geçirilerek süzüldü. Alınan kaya örneği üzerindeki yosunlar kazınarak alındı ve falcon tüpüne aktarıldı, üzerine melez çayından alınan su örneği ilave edilerek diğer sediment ve yosun örnekleri ile birlikte 5000 rpm de 20 dk santrifüjlendi Salmonella İzolasyonu: Salmonella izolasyonu TS ISO 6340 test prosedürüne göre gerçekleştirildi. Bu porsedüre göre Salmonella izolasyonu; i. Selektif olmayan zenginleştirme, ii. Selektif besiyerinde zenginleştirme, iii. Selektif katı kültür ortamına ekim olmak üzere 3 aşamada gerçekleştirilmektedir Selektif Olmayan Zenginleştirme: Az sayıda veya zarar görmüş hücrelerin de izole edilebilmesi için 25 ml örnek aseptik koşullarda 225 ml tamponlanmış peptonlu su (buffered peptone water) içine alınıp 24 saat 37 ºC'de inkübe edildi. Buffered peptone Water'ın Hazırlanışı: 1 litre distile su içine Peptone 10 g/l, NaCl 5g /L, Na 2 HPO 4 9 g /L sırasıyla ilave edilerek manyetik karıştırıcıda çözüldükten sonra 500 ml lik erlenlere 225ml ilave edilerek C de 15 dakika boyunca otoklavlandı Selektif Ön zenginleştirme: Ön zenginleştirme ortamından 0,1 ml alınarak 10 ml'lik Rappaport Vasiliadis Soya (RVS) Broth'a inokülüm yapıldı. RVS broth vortekste iyice karıştırıldıktan sonra 42 ºC'de 24 saat inkübe edildi. RVS broth ticari bir firmadan hazır olarak temin edildi. 9

11 Selektif Katı Ortamda Üreme: İnkübasyondan sonra üreme olan RVS ortamlarından Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD)'a çizgi ekim yöntemine göre ekim yapıldı ve petriler 24 saat boyunca 37 ºC'de inkübasyona bırakıldı. XLD Agarın Hazırlanması: Erlene tartılan 55 gr toz haldeki XLD agara 1lt distile su ilave edildikten sonra manyetik karıştırıcıda ısıtılarak çözdürüldü ve sıcaklık 45 ºC'ye düşene kadar su banyosunda bekletildi ve petrilere dökülüp kurumaya bırakıldı E.coli İzolasyonu: Ön zenginleştirme ortamından 0,1 ml alınarak içinde durham tüpleri bulunan 10 ml lik FTS (fizyolojik tuzlu su) içine aktarılarak 10-2 den 10-6 ya kadar seyreltmeler yapıldı. Türk Standartları Enstitüsü (TSE) ve Uluslararası Standartlar Örgütü (ISO) nun koliform grubu mikroorganizma aramak için kullanılan standart analiz yöntemlerine göre örnek hazırlanıp fizyolojik tuzlu su (FTS) ile dilüsyonu yapıldıktan sonra 5 dilüsyondan 3 er adet Lauril Sülfat Triptoz Broth (LSTB ) besiyerine 1 er ml ekim yapıldı. 37 O C de 24 saat bekletildikten sonra pozitif sonuç veren türler muhtemel koliform olarak değerlendirildi. İkinci aşamada pozitif sonuç veren bu tüplerden Briliant Green Laktoz Broth (BGBB) besiyerine 1 er ml ekim yapıldı. 35 O C de 48 saat bekletildikten sonra pozitif sonuç veren tüpler koliform grup olarak doğrulandı. Son olarak pozitif sonuç veren bu tüplerden Eozin Metilen Blue (EMB) Agar a çizgi ekimleri yapıldı ve petriler 24 saat boyunca 37 O C de inkübasyona bırakıldı. Her iki ortamda (XLD ve EMB) üreyen karışık koloni halinde bulunan mikroorganizmalardan, tek koloni oluşturmak amacı ile tekrar XLD ve EMB ortamlarına çizgi ekimleri yapıldı Disk Difüzyon Yöntemi: İzole edilen enterik mikroorganizmaların antibiyotik duyarlılık testleri Kirby-Bauer Disk Difüzyon yöntemine göre yapıldı. Bu organizmalar nutrient agarda çoğaltıldıktan sonra ortama ekilen bakteri miktarını aynı tutabilmek amacı ile %0,85 NaCl içinde 0,5 Mc Farlanda miktarına ayarlandı ve Müller Hinton Agara steril eküvyonla ekim yapıldı. Ekim yapıldıktan sonra antibiyotik diskleri aseptik koşullarda pens yardımı ile agar üzerine yerleştirildi. Antibiyotik diskleri yerleştirildikten sonra petriler 37 ºC'de 24 saat inkübasyona bırakıldı. Çalışmamızda hastalık tedavisi ve koruma amaçlı olarak sık kullanılan amoksisilin, sefimiksin, sefoksitin, kloromphenikol, eritromisin, gentamisin, kanamisin, nalidiksik asit, netilmisin, streptomisin, tetrasiklin ve trimethoprim olmak üzere 12 farklı antibiyotik kullanıldı. 10

12 3. Bulgular: Salmonella için yapılan izolasyon prosedürü sonucunda alınan altı örnekte bu bakteri türü izole edilemedi. Besiyerinde üreyen kolonilerin hangi bakteri türleri olduğu XLD besiyerindeki koloni rengi, koloni morfolojisi ve ortamdaki renk değişikliği kriterlerine bakılarak MERCK Mikrobiology Manual kaynağı temel alınarak teşhis edildi (Tablo1). Bu bakterilerin XLD ortamında büyüyebilen Klebsiella pneumoniae ve Proteus mirabilis türleri olduğu belirlendi. AOSB Kanalı Deresinden alınan su örneğinden Klebsiella pneumoniae ve Proteus mirabilis, Mavişehir içinden geçen dereden alınan su ve sediment örneğinden Klebsiella pneumoniae ve Escherichia coli, Bostanlı Deresi nden alınan su ve yosun örneklerinden Klebsiella pneumoniae, Manda Çayından alınan yosun örneğinden Escherichia coli ve Melez Çayından alınan su, sediment ve kaya örneklerinden de Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis ve Escherichia coli izolasyonu gerçekleştirildi (tablo 1). Tablo 1.XLD besiyerinde büyüyebilen bakteriler ve koloni özellikleri (Merc, Microbiology Manuel, 12. Baskı). Test Mikroorganizmaları İnokulum Siyah Ortamdaki Renk Koloni Rengi (cfu/ml ) Merkez Değişikliği Escherichia coli ATCC >105 sarı yok sarı + çökelti Enterobacter cloacae ATCC sarı yok sarı + çökelti Klebsiella pneumoniae ATCC sarı yok sarı + çökelti Shigella flexneri ATCC renksiz yok - Shigella sonnei ATCC renksiz yok - Salmonella typhimurium ATCC renksiz var yok Salmonella enteritidis NCTC renksiz var yok Proteus mirabilis ATCC sarı var sarı/turuncu 11

13 Resim 2. EMB agarda tipik E.coli kolonileri Resim 3. XLD agarda tipik Proteus mirabilis kolonileri Resim 4. XLD agarda tipik Klebsiella pneumoniae kolonileri 12

14 Disk difüzyon yöntemine göre seçilen üç bakterinin on iki antibiyotiği de karşı duyarlı olduğu görüldü (Tablo 2). Tablo 2. İzole edilen E.coli, Klebsiella ve Proteus türlerinin antibiyotik dirençleri. ORGANİZMA ADI ANTİBİYOTİK ADI Escherichia Klebsiella Proteus coli pneumoniae mirabilis Amoxycillin 25µg S S S Cefixime 5µg S S S Cefoxitin 30µg S S S Chloramphenicol 30 µg S S S Erythromycin 15µg S S S Gentamicin 10µg S S S Kanamycin 30µg S S S Nalidixic Acid 30µg S S S Netilmicin 30µg S S S Streptomycin 10µg S S S Tetracycline 30µg S S S Trimethoprim 5µg S S S (S: Duyarlı) İzole edilen E.coli (Resim 5.), Klebsiella (Resim 7.) ve Proteus (Resim 6.) türlerinin antibiyotiğe dirençlerini gösteren resimler aşağıda verilmiştir. Resim 5. E.coli Resim 6. Proteus mirabilis 13

15 Resim 7. Klebsiella pneumoniae 4. Sonuçlar ve Tartışma: Çalışmamızda elde edilen veriler dikkate alındığında; 1. Körfeze akan derelerden alınan beş örnekte, insan bağırsağında yaşayan ve mikrobiyolojik kirliliğin indikatörü olan Escherichia coli yanında toprak ve su örneklerinde doğal olarak bulunabilen Proteus mirabilis ve Klebsiella pneumoniae gibi enterik bakteriler saptanmıştır. Bu durum E. coli saptanan derelerin kontrol edilemeyen bir şekilde kanalizasyon atıkları ile kontamine olduğunu göstermektedir. 2. E. Coli nin Mavişehirden geçen derede, Manda çayında ve Meles çayında bulunması, diğer enterik patojenlerin de (Salmonella, Shigella, Vibrio vb.) bu yerlerde bulunabileceğini ve bu durumun halk sağlığı açısından tehdit unsuru olacağını işaret etmektedir. Salmonella dışındaki diğer patojenlerin izolasyonuna yönelik bir yöntem çalışmamızda uygulanmamıştır. Fakat Salmonella sp. izolasyonuna yönelik yapılan işlemlerde hiçbir örnekte Salmonella türü saptanamamıştır. E. coli ve Salmonella saptanmayan yerlerin kanalizasyon atıklarıyla kontamine olmadığını ve bu yerlerin halk sağlığı açısından yüksek oranda korunduğunu, hasta veya hastane orijinli bir bulaşıklığın kontrol altına alındığını göstermektedir. 3. Temsili olarak seçilen üç bakteri türünün antibiyotiklere duyarlılıkları incelendiğinde ise kullanılan 12 antibiyotiğin de üç bakteri türünde etkili olduğu, diğer bir deyişle onları kullanılan antibiyotik konsantrasyonlarının üç bakteri türü üyelerini de öldürdüğü bulunmuştur. Çalışmamızda antibiyotik dirençliğinin halk sağlığı ve ekonomik önemimi vurgulamak için hastane örnekleri yerine çevresel örnekler seçilmiştir. Bu bizim hem doğal 14

16 ortamlardaki mikrobiyolojik kirliliği araştırmamıza hem de antibiyotiğe dirençliliğin çevresel bakteri izolatlarındaki dağılımını incelememize fırsat tanımıştır. Antibiyotiklere karşı direnç gösteren bakteriler dünyada ve ülkemizde hastanelerin de önemli bir sorunu haline gelmiştir. Antibiyotiklerin yanlış ve bilinçsiz kullanımı sonucu penicilin dirençli Streptococcus pneumoniae, vancomisin dirençli Enterococci (VRE), çoklu dirence sahip Salmonella ile Mycobacterium tuberculosis ve methisilin dirençli (MRSA) türlerinin gelişimine hastane orjinli örneklerde çok sık rastlanılmaktadır. ABD deki Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (Centers for Disease Control and Prevention s CDC ) ve Ulusal Sağlık Güvenliği Ağı nın (National Healthcare Safety Network - NHSN ) 2007 yılında yaptığı çalışmalarda S. aureus izolatlarının % 56.2 sinde oksasiline, Enterococci lerin %33.3 ünde ise vancomisine karşı dirençlilik saptanmıştır. Ulusal Hastane Enfeksiyonları Takip Sisteminin (National Nosocomial Infections Surveillance System- NNIS-ABD ) yaptığı çalışmalar antibiyotik dirençli türlerin özellikle hastanelerin yoğun bakım ünitelerinde yüksek oranda bulunduğunu göstermektedir ve 2003 yılları verileri karşılaştırıldığında bu oranın Enterococ ların vankomisine direncinde %12, S. aureus un metisiline direncinde % 11 arttığı bildirilmiştir. Aynı zaman diliminde üçüncü kuşak sefalosporin lere karşı dirençlilik, Klebsiella pneumoniae türünde % 47 ve Pseudomonas aeruginosa türünde % 20 oranında artmıştır. Dirençli bakterilerin ortaya çıkması, seleksiyonu ve yayılması hastanelerde hasta sağlığını tehdit etmektedir. Antibiyotiklere dirençli bakterilerin yol açtığı enfenksiyonlar hasta morbidite ve mortalitesinin artmasına ve dolasıyla hastaların hastanede yatış süresinin uzamasına neden olmaktadır. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi nin yaptığı çalışmalara göre, hastanelerden elde edilen patojen bakteri türlerinin %70 inin enfeksiyonların tedavisinde yaygın kullanılan antibiyotiklerden en az birine karşı dirençlilik gösterdiği görülmüştür. Antibiyotik dirençliliğindeki bu önlenemeyen artışın devamı halinde, hiçbir antibiyotiğin etki etmediği hastane patojenlerinin ortaya çıkma olasılığı gün geçtikçe arttırmaktadır. Dirençliliğin yayılmasını önlemek amacıyla doktorlar, hemşireler, eczacılar, veteriner, biyologlar ve hastalar başta olmak üzere tüm ilgililerin üzerine düşün görevler vardır. 1.Öncelikli olarak doktorların bir hastaya antibiyotik tedavisi uygularken önce mikrobiyolojik kültür ve antibiyogram tetkiklerini yapıp, sonuçlarına göre değerlendirmeleri gerekmektedir. 2 Eczacıların antibiyotikleri reçetesiz satmamaları gereklidir. Eczacılar veya doktorlar tarafından hastaların antibiyotikleri hangi dozlarda, hangi zaman dilimlerinde 15

17 ve ne kadar süreyle kullanacakları yönünde tam olarak bilgilendirilmeleri gereklidir. Antibiyotik kullanım sürecinin tümüyle tamamlanması gerektiği, aksi halde enfeksiyonun tekrarlayabileceği vurgulanmalıdır. 3.Hemşireler direncin yayılmasını durdurmak amacı ile el yıkama gibi hijyen kontrol önlemlerini titizlikle uygulanmasına yardımcı olmalıdır. 4.Veterinerler hayvansal gıda üretiminde antibiyotik kullanımı yoluyla direnç gelişimini ve yayılmasını engellemek için çeşitli önlemler almalıdır. Hayvanlarda koruma ve kilo artışına yönelik, yanlış antibiyotik kullanımı sonucunda ortaya çıkan dirençli patojenlerin insanları doğrudan enfekte edebileceği veya dolaylı olarak direnç genlerinin çevredeki diğer bakterilere yayılma tehlikesinin artacağı unutulmamalıdır. Antibiyotiklerin kilo artışı amacı ile kullanılması Avrupa Birliğinde yasaklanmıştır. Veterinerlik sektöründe antibiyotikler akılcı biçimde kullanılmalı ve mümkün oldukça sağlıklı hayvanlara antibiyotik vermekten kaçınılmalıdır. Ayrıca iyi hijyen uygulamaları ve enfeksiyon kontrol önlemleri ile hayvanların enfeksiyon hastalıklarına yakalanma sıklığının düşürülmesi de gerekmektedir. Diğer bir yandan çevresel örneklerdeki patojen mikroorganizmaların antibiyotik dirençlilik genlerinin yayılımına katkısı ne yazık ki göz ardı edilmektedir. Genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların ve bitkilerin en önemli özelliği bazı zararlılara karşı direnç genleri içermeleridir. Bu direnç genlerine karşı patojenlerin direnç geliştirmesi ve bu direnç genlerinin başka canlılara geçmesi hem çevresel hem ekonomik açıdan çok büyük bir sorundur. Bu amaçla genetiği değiştirilmiş organizma üreticileri bitkilerdeki direnç genlerini sürekli rekombine etmektedir. Bununla birlikte yeni antibiyotikler ve yeni etken madde ihtiyacı artmakta ve bunu sağlamak giderek zorlaşmaktadır. Benzer durum çevresel örneklerdeki bakterilerdeki direnç genleri için de söylenebilir. Çünkü bakteriler direnç genlerini birbirlerine tür içi ve tür dışı farklı metodlarla (konjugasyon, transformasyon) etkin bir şekilde aktarabilmektedir. Çevresel mikroorganizmalarda çoklu antibiyotik direncinin gelişmesinin, insan sağlığını korumakta kullandığımız yegane silah olan antibiyotiklerin etkisiz hale gelmesine ve sağlık giderlerinin artışına neden olması muhtemeldir. Antibiyotik direnç gelişimi ve yayılımına karşı yeni, daha etkili ve farklı etki mekanizmalarına sahip kimyasalların üretimi zaman alıcı ve oldukça pahalı bir süreçtir. 16

18 Araştırmamızda İzmir Körfezi kıyısındaki derelerden izole ettiğimiz mikroorganizmaların, yaygın olarak kullanılan antibiyotiklere karşı dirençlilik göstermemesi halk ve çevre sağlığı açısından olumlu ve istenilen bir sonuçtur. 5.Teşekkür: Proje çalışmalarımız sırasında teorik ve laboratuvar desteklerinden dolayı Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Doç.Dr. İhsan Yaşa ya, Duygu Erdoğan a, bize danışmanlık yapan Biyoloji öğretmenimiz Mesut Esen e, Bilim Kurulu Eş Başkanımız Dr. Ayşe Türker e ve her konuda destek olan okul yöneticilerimize, ailelerimize teşekkür ederiz. 6. Kaynaklar: Davies J., Davies D. (2010).Origins And Evolution Of Antibiotic Resistance, Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 74, No. 3p French G.L., (2010).The Continuing Crisis İn Antibiotic Resistance, International Journal Of Agents. Grundmann H., Klugman K. P., Walsh T., Ramon P.,Sigauque B., Khanh W., Laxminarayani R., Heddinik A., Stelling J. (2011). A Framework For Global Surveillance Of Antibiotic Resistance, Drug Resistance Updates Kuyucu N. (2007) Türkiye Çocuk Enfeksiyonları Dergisi, Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı Hastalıkları Anabilim Dalı, Mersin, 1: Özel Sayı 1; Levy S. B, O brien T. F. (2005) Global Antimicrobial Resistance Alerts And Implications Introductions, Clinical Infectiouns Diseases 41, S Madigan M. T., Martinko J. M., (2010). (C. Çökmüş, Çev.) Ankara: Palme. Marshall B. M., Ochieng D.J., Levy S.B., (2009). Commensals: Underappreciated Reservoir Of Antibiotic Resistance, Microbe, Volume 4, Number 5, 231. Martinez J.L., (2009) Environmental Pollution By Antibiotics And By Antibiotic Resistance Determinants, Environmental Pollution

19 Martinez J.L., (2009). The Role Of Natural Environments İn The Evolution Of Resistance Traits İn Pathogenic Bacteria. Proceedings of The Royal Society B. 276, Merck ( 2005). Micrbiology Manual 12 Th Edition. Mikrobiyolojik Analiz Yöntemlerinde Yeni Yaklaşımlar (1999). Özyurt T. (2011) İzmir ve Çevresinde Kanatlı Etlerinden İzole Edilen Salmonella Türlerinin Prevalansı ve Antibiyotiklere Karşı Dirençlerinin Belirlenmesi, Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi. Salmond, G. P. & Welch, M. (2008). Antibiotic Resistance: Adaptive Evolution. Lancet 372, S97 S103. Weber Jt (2010) Antimicrobial Resistance Beyond The Breakpoint. Cost Of Antimicrobial Resistance İn Healthcare Settings: A Critical Review Vol 6, Pp Web Siteleri: megep.meb.gov.tr/mte_program_modul/...pdf/524lt0016.pdf (Erişim tarihi: 23 Ocak 2012) (Erişim tarihi: 23 Ocak 2012) (Erişim tarihi: 23 Ocak 2012) 18