Antibiyotikle Beslenen Tavuklardan Alınan Kanların Bakterilerde Direnç Oluşumuna Olan Etkisinin İncelenmesi

Transkript

1 Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi TR Yıl: 2017 Cilt: 15; Sayı: 1; Sayfa: Antibiyotikle Beslenen Tavuklardan Alınan Kanların Bakterilerde Direnç Oluşumuna Olan Etkisinin İncelenmesi Çiğdem Eda Balkan *1, Demet Çelebi 2, Özgür Çelebi 3 1 Kafkas Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Kars 2 Atatürk Üniversitesi Veteniner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Erzurum 3 Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Erzurum ÖZET Çalışmamızdaki hedefimiz antibiyotikle beslenen tavuklardan alınan kanların bakterilerin direnç gelişimine olan etkisinin incelenmesidir. Çalışmamızda 20 li gruplar halinde 4 grup tavuk kullanıldı. Tavuklar 30 gün süreyle Tetrasiklin 30 mg/kg, Penisilin 20mg/kg, Sulfonamid 30 mg/kg ve Florokinolon 40 mg/kg grubu antibiyotiklerle beslenilerek kanları alındı ve bu kanlarla hazırlanan kanlı besiyerlerine daha önceden duyarlılığı bilinen E. coli, Stafilokok spp., Citrobacter spp. ve Klebsiella spp. bakterileri pasajlanarak daha önce ki duyarlılıklarına göre değişimleri gözlemlendi. Bakterilerin duyarlılıklarının önceki duyarlılıklarıyla karşılaştırınca; antibiyotikle beslenen tavukların kanlarından hazırlanan besiyerine pasajlanan E. coli de Trimetoprim sulfometoksazol direncinin oluştuğu gözlemlenmiştir. Çalışmamızdaki sonuçlara göre antibiyotikle beslenen tavukların kanlarında bu antibiyotikllerin bulunmasıyla karşılaşacakları bakterilerde direnç oluşturabilecekleri anlaşılmıştır. Anahtar Kelimeler: Antibiyotik, direnç, tavuklar GİRİŞ Günümüzde, özellikle hayvansal protein veriminin arttırılması için, hayvan yetiştiriciliğinde hastalıkların eradike edilmesi ve hayvanlarda gelişmeyi hızlandırıcı etkisi dolayısıyla yahut da hayvansal gıdaların verimini arttırmak amacıyla antibiyotik ve benzeri maddelerin kullanımının oldukça yaygınlaşmış olduğu bilinmektedir(1-3). Antibiyotiklerin hayvansal besinlerdeki kalıntılarının tespitinin yapılması kontrolü ve yasal düzenlemeler sağlamak amacıyla çeşitli bilimsel çalışmalar yapılmaktadır (4, 5). Etlerde antibiyotik kalıntılarını tespit etmek için çeşitli yöntemler önerilmektedir. Bu yöntemler, kimyasal ve mikrobiyolojik yöntemler olabilir (6-11)Günümüzde bu yöntemlerden rutin olarak en çok kullanılanları çalışmamızda da olduğu gibi mikrobiyolojik yöntemlerdir. (12,13) * Yazışmalardan sorumlu yazarın e-posta adresi: cigdemedabalkan@gmail.com 1

2 Hayvansal gıdalara eklenecek katkı maddeleri ve antibiyotikler konusunda ülkeler yasal çerçevede kendi hükümlerini belirlemişlerdir. Türkiye de Gıda Maddeleri Tüzüğü nde 1980 yılında yapılan değişiklikle antibiyotik içeren sütlerin insan besini olarak kullanılamayacağı belirtilirken süt dışında kalan besin maddelerinde antibiyotik kalıntılarının bulunması halinde tolerans düzeylerinin ne olacağına ilişkin bir kayıt belirtilmemiştir (14, 15). Türk Gıda Kodeksi 2013 yılı resmi gazetesinde yayınlanan 4. Madde ye göre; tek başına gıda olarak tüketilmeyen, belirli bir teknolojik amaca yönelik olarak hammaddenin, gıda veya gıda bileşenlerinin işlenmesi sırasında kullanılan, son üründe kendisinin veya türevlerinin kalıntılarının bulunması istenmediği halde, teknik olarak kaçınılmaz olan; ancak kalıntısı sağlık açısından risk oluşturmayan ve son üründe teknolojik bir etkisi olmayan maddelerin kullanımı yapılabilir bu açıdan antibiyotikler kalıntı bırakan katkı maddeleri grubunda olduklarından kullanılması sakıncalı olabilecek gereken maddeler grubuna girmektedir (16). Buna karşın Amerika Birleşik Devletleri, İngiltere, Hollanda ve Fransa 1983 yılında antibiyotiklerin besi hayvanlarına belli koşullar altında verilebileceği görüşünde birleşmişlerdir (17-19)Günümüzdeki görüşleri ise FDA (Food and Drug Adminsitration) ın belirlediği ölçüde dirençli suşlar yaratmamak ilkesini gözetmek yönündedir (20). Hayvancılıkta antibiyotikler; hastalıkların azaltılması ve hastalıklardan koruma amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır. Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü(FAO) raporlarına dayanarak hazırlanan yayınlarda hayvanların %80 inin yaşamlarının belli dönemlerinde veya tamamında, tedavi esnasında, içme suları ve yemleri ile bu tür ilaçları aldıkları belirtilmektedir (21). Son yıllarda araştırmacılar, antibiyotiklere alternatif olabilecek doğal ve gelişmeyi hızlandırıcı madde arayışı içine girmişlerdir. Bu amaçla probiyotikler, organik asitler ve enzimlerin alternatif olarak kullanımı güncellik kazanmıştır (22). Bizim çalışmamızda da tavukların yemlerine çeşitli antibiyotikler katılarak 30 gün süre ile beslenmesi sağlandı ardından tavuklardan alınan kanlardan hazırlanan kanlı besiyerine antibiyotik duyarlılıkları bilinen çeşitli bakteri suşları ekilerek direnç kazanıp kazanmadıkları gözlemlendi. MATERYAL ve METOT Çalışmamızda 20 li gruplar halinde 4 grup tavuk kullanıldı. Tavukların besinlerine Tetrasiklin 50mg/kg, Penisilin 20mg/kg, Sulfonamid 60 mg/kg ve Florokinolon %40/kg grubu antibiyotiklerin ticari tabletleri günlük ezilerek eklendi. 30 günlük antibiyotik destekli beslenmenin sonunda tavukların kanları 31. günde hayvanlar itlaf edilmeden kanat altı jugular venden her hayvanın vücut ağırlığının % 1 inden daha az kadar (ortalama 2 kg olan bir hayvandan 10 ml) kan alınarak laboratuvara ulaştırıldı. 4 adet 1lt lik cam erlenmayerde kanlı agar için hazırlanmış temel besiyerine, (10*20=200 ml kan her grup için tek bir steril kapta toplanarak) her şişeye 200 ml kan eklenerek, besiyerleri plaklara döküldü ve UV ışığı altında sterilize edildi. Elimizdeki tüm tetrasiklin, penisilin, trimetoprim sulfometoksazol ve siprofloksasine duyarlı olduğu bilinen E. coli, Staphylococcus spp, Citrobacter spp, Klebsiella spp. hasta suşları bu besiyerlerine pasajlanarak her pasaj 24 saatlik inkübasyona bırakıldı. 2 gün üst üste 2

3 bu tavuk kanlı besiyerinde pasajları yapılan bakterilerin Muller Hinton besiyerinde antibiyotik duyarlılığı tekrar edildi. BULGULAR 1. Grup Tetrasiklin 2. Grup Penisilin 3. Grup Trimetoprim Sulfometoksazol 4.Grup Ciprofloksasin E. coli Duyarlılık çapı Dirençlidir Staphylococcus spp. Duyarlılık çapı 23 Citrobacter spp. Duyarlılık çapı Dirençlidir Klebsiella spp. Duyarlılık çapı Dirençlidir Dirençlidir 30mm Dirençlidir Dirençlidir 16mm 6mm ye düşmüştür. (Dirençli) 21mm 20mm 25mm 17mm 23mm *Çalışmamızda ticari antibiyotik emdirilmiş diskler kullanılmıştır. Çalışmamızda çıkan sonuçlara göre ; 18mm 22mm -Tetrasiklinle beslenen gruptan alınan kanla hazırlanan besiyerinde üreyen E. coli, Citrobacter ve Klebsiella spp. de bakterinin antibiyotik profilinde tetrasiklin direncinin düşük düzeyde de olsa geliştiği gözlemlenmiştir. -Penisilinle beslenen grupta Staphylococcus da direnç gelişimi gözlenirken diğer bakterilerde herhangi bir değişim gözlemlenmemiştir. -Sulfonamidle beslenen grupta da herhangi bir direnç profilinin gelişmediği gözlemlenmiştir. -Florokinolon grubuyla beslenen grupta da herhangi bir direnç gelişimine rastlanmamıştır. TARTIŞMA Antibiyotiklere direnç oluşturan genlerin plazmidler, transpozonlar ve integronlar aracılığıyla konak hücre bölünmesi sırasında vertikal olarak geçtiği gibi, karışık bakteriyel popülasyonlardaki aynı veya farklı tür ve soylardaki patojen veya apatojen bakteriler arasında transdüksiyon, konjugasyon veya transformasyon aracılığı ile horizontal olarak da geçtiği bilinmektedir (15, 22). Çalışmamız antibiyotikle beslenen hayvanların kanında antibiyotiklerin kalıntı bırakma süresi göz önüne alınarak pasajlar bu süre zarfında yapıldığından direncin primer olarak gösterilmesi açısından bir başlangıç çalışması niteliğindedir. Antibiyotik kullanımı besi hayvanları için patojenik olan bakteriler arasında direncin seleksiyonu ile infeksiyonların tedavisinde problemlere neden olduğu bilinmektedir. Bu durum zoonotik bakterilerde direnç gelişimi ile seyreden primer olarak tedavi 3

4 başarısızlığı ile ilerleyen bir halk sağlığı problemi oluşturmaktadır (23,24). Tedavisi gitgide zorlaşan bu dirençli suşların eradike edilmesi zorlaşarak hayvan yetiştiricilerinde yapılan çalışmalarda aynı suşların onları da enfekte ettiği bilinmektedir (23). Broyler tavuklarda yapılan araştırmalarda Florokinolon ve tetrasiklin grubu antibiyotiklerin kanatlılarda yaygın bir şekilde bulunması sonucu, bu antibiyotiklere karşı termofilik Campylobacter spp. nin artan oranda direnç kazandığı gözlenmiştir. Buna bağlı olarak kanatlı etlerinin, çoklu antibiyotik direnci gösteren enteropatojenik bakterilerin insanlara geçişinde önemli bir kaynak olduğu belirtilmiştir (24). Yapılan çalışmaların çoğu antibiyotikle beslenen tavuklarda etlerde ki kalıntının saptanması doğrultusundadır. Bunlara göre Rose ve ark., tavuk etlerinde dimetridazol ve ronidazol gibi nitroimidazol grubu ilaç kalıntılarının pişirme işlemine dayanıklı olduklarını saptamışlardır. Buna karşın, yumurtadaki kalıntılarının pişirme işlemi ile sırasıyla %14, %32 düzeylerinde azaldığını gözlemlemişlerdir (25). Baydan ve ark. etlik piliç dokularındaki florokinolon grubu ilaçlardan enrofloksasin kalıntıları üzerine çeşitli pişirme işlemleri (ızgara, tuzlu ve tuzsuz haşlama) ile -18 o C de farklı sürelerde (5, 20 ve 30 gün) muhafazanın etkisini araştırarak ızgara işleminin ilaç kalıntısının azalması yönünde olumlu bir etkiye neden olmadığı, haşlama işlemi ile ise dokudan suya geçiş şeklinde bir değişikliğin bulunduğu bildirilmiştir C de 5, 20, 30 gün muhafaza sonucu, kalıntı düzeyinin göğüs dokusunda sırasıyla %20, %65 ve %78; but dokusunda %7, %53.5, %78.5; karaciğer dokusunda %8.6, %47 ve %84 oranında bir azalma gösterdiği saptanmıştır (26). Van Egmond ve ark., domuz etinde çeşitli antibiyotik kalıntıları üzerine ısı işlemlerinin etkisini incelediklerinde, penisilin, amoksisilin, ampisilin, kloksasilin, oksitetrasiklin, doksisiklin, kolistin, dihidro-streptomisin ve sülfametoksazol kalıntılarının 134 o C de 3 atmosfer basınç altında 20 dakika süre ile sterilizasyon işlemi sonucunda tamamen yıkımlanmadığını ve yaklaşık %10 unun ette kaldığını saptamışlardır (27). Bu kapsamda ülkemizde yapılan çalışmalarda; Acet ve ark., oksitetrasiklin (20 mg/kg) ve tetrasiklin (50 mg/kg) ağız yoluyla broyler piliçlerine verilmesinin ardından, oksitetrasiklin kalıntılarına µg/g düzeyinde yalnız böbreklerde, tetrasiklin kalıntılarına µg/g düzeyinde plazma hariç tüm dokularda rastladıklarını bildirmişlerdir (28). Öbekçi, Tarım ve Köyişleri Bakanlığı bünyesinde yürütülmekte olan Kanatlı Etlerinde Ulusal Kalıntı İzleme Genelgesi doğrultusunda Türkiye nin değişik illerinden temin ettiği 200 tavuk eti ve 200 tavuk karaciğer örneğini HPLC tekniği ile tetrasiklin grubu antibiyotik (tetrasiklin, oksitetrasiklin ve klortetrasiklin) kalıntıları yönünden incelemiştir. Tavuk etlerinde %8.1 oranında oksitetrasiklin, %7 tetrasiklin ve %5.5 klortetrasiklin; tavuk karaciğerlerinde ise %74 oranında oksitetrasiklin, %47 tetrasiklin ve %5.5 klortetrasiklin kalıntısı bulunduğunu bildirmiştir. Kalıntı düzeylerinin, pozitif sonuç veren numunelerde tolerans limitlerinin altında bulunduğu belirtilmiştir (29). Avrupa Birliği nde yetiştiricilikte uygulanan ilaçların ve hayvansal ürünlerde antibiyotik kalıntılarının kontrolüne dair olarak Council Directive 96/23/EC yönetmeliği çıkarılmıştır. Ülkemizde de konu ile ilgili yönetmelikler çıkarılmış ve Gıda, Tarım ve 4

5 Hayvancılık Bakanlığı tarafından uygulanmaya konulmuştur (30). Belirtilen ilgili yasal mevzuatlarda antibiyotikler ve diğer veteriner ilaçları kalıntıları için Maksimum Kalıntı Limiti (MRL) değerleri belirtilmektedir. MRL, insan ve hayvan yiyeceği olarak kullanılan ürünler üzerinde bulunmasına izin verilen kalıntı miktarıdır. Gıdalarla birlikte alınabilecek ilaç kalıntıları ve onların metabolitlerinin sağlık açısından herhangi bir riske neden olup olmadığının izlenmesi için kullanılmaktadır Eğer bir veteriner ilacı için belirlenmiş bir MRL yok ise bu durumda bu ilacın kalıntısının söz konusu gıda maddesinde bulunmaması gerekmektedir (31-33). SONUÇ Sonuç olarak, hayvanlarda üretimi arttırmak ya da olası hastalıkları önlemek amacıyla antibiyotiklerin kullanılmasıyla ilgili olarak yapılan çalışmalar besi hayvanlarında bu ilaçların kalıntılarının olduğunu göstermiştir. Çalışmamızda da bu doğrultu da antibiyotikle beslenen tavuklarda bu antibiyotiklerin kana geçtiği ve bu kanla hazırlanan besiyerlerinde üreyen bakteriler de de direnç gelişiminin başka faktörler araştırılmaksızın basit yöntemlerle gözlemlenebilmiştir. Bu durum gereksiz antibiyotik kullanımının hayvanlarda da rezistan suşların üremesini sağlayabileceğinin gösterilmesi açısından önemlidir. İnvitro duyarlılığın değişimi bize antibiyotikle beslenmenin kanda antibiyotiklerin yarıömrü sona ermeden bakterilerle temasa geçerse 30 gün gibi kısa bir süre de bile gözlemlenebilmesi açısından önemlidir. Elbetteki bu durum tavukların kümeslerde gündelik hayatlarını devam ettirirken karşılaştıkları enfeksyonlardan da kaynaklı olabilir. Deneyin bir ileriki safhasında yapılabilirse ortamın steril tutularak ve hayvanların tekli kafeslere konularak tekrarlanmasının direncin verdiğimiz antibiyotiklerden mi yoksa dışardan aldıkları farklı bir suşla mı oluştuğunu gözlemlememiz açısından daha faydalı olacağı görüşündeyiz. KAYNAKLAR 1-Booth, N.H., Veterinary Pharmacology And Therapeutics. 6th Ed., The Iowa State University Press, Ames. Iowa 2-. Huber, W.G., Tetracyclines. In Veterinary Pharmacology And Therapeutics. 6 Th Ed. The Iowa State University, Press. Ames, Iowa, Ülgen, T., Hayvansal kökenli gıda maddelerinde ve özellikle et ve et ürünlerinde mevcut antibiyotik ve benzeri maddelere karşı dayanıklı (rezistant) bakterilerin insan ve hayvan sağlığı yönünden önemi üzerine görüşler. A.Ü. Vet. Fak. Derg. XXI Cordle, M.K., Usda regulation of resudues in meat and poultry products. J. Anim. Sci., Kıdd, A.R.M., The veterinary use of chloramphenicol in the United Kingdom. Ann. Rech. Vet. 16, Acet, A,; Ateş, M.; Erganiş, O., Hayvansal dokularda antibiyotik kalıntılarının agar diffüzyon tekniği ile tayini. S.Ü. Vet. Fak. Derg. 3: Anonymous: Bulletin International Dairy Federation 220,

6 8-Arret, B.; Johnson, D.P., Kirschbaum, A.: Outline of details for microbiological assays of antibiotics. Second revision. J. of Ph. Sciences. 60,11 9-Büyükbay, F., Kasaplık hayvan etlerinde inhibitör maddelerin (antibiyotiklerin) araştırılması. Uzmanlık Tezi, Ankara 10-Dizbay, M.; Uçar, F., Farklı agar diffüzyon yöntemleri ile danalarda kloramfenikol kalıntılarının saptanması. ANKEM Derg. 1, Korkeala, H.; Sorvettula, O., Maki- Petays, O.; Hirn, J.: Comparison of different agar diffusion methods for the detection of residues in the kidneys of pigs treated with antimicrobial drugs. Meat Science. 9, Bogaerts, R.; Degroodt, J.M., Chloramphenikol residues in the urine for slaughtered animals. Microbilogical screening test for the detection. Fleischw., 64, Korkeala, H., 1982,. Sorvettula, O.; Maki- Petays, O.; Hirn, J.: Comarison of different agar diffusion methods for the detection of antimicrobial residues in slaughter animals. Acta Vet. Scand. 23, Canbazoğlu, M., Bilinçsiz antibiyotik kullanılmasının zararları, antibiyotik kullanılmış hayvansal ürünlerin insan ve hayvan sağlığı açısından sakıncaları. Etlik Vet. Mikro. Enst. Derg. 5, Gustafson RH, Bowen RE., Antibiotic use in animal agriculture. J. Appl. Microbiol., 83, MevzuatIliski=0 17-Frens, J.: 1985.Chloramphenicol in the situation. Ann. Rech. Vet., 16, Guest, G. B.: Use of chloramphenicol in the United States. Ann. Rech. Vet. 16, Küçükersan K., Büyütme faktörleri. Türk-Koop. Ekin, 20, Hayvansal Gıdalardaki Antibiyotik Ve Hormon Kalıntılarının İnsan Sağlığı Üzerine Olası Etkileri Ve Yasal Düzenlemeler Dr.Can 22-Küçükersan K., Büyütme faktörleri. Türk-Koop. Ekin, 20, Van den Bogaard AE, Stobberingh EE Epidemiology of resistance to antibiotics links between animals and humans. Int. J Antimic Agent;14(4): S.B. Levy, G.B. Fitzgerald and A.B. Macone. Spread to antibiotic resistance plasmids from chicken to chicken and from chicken to man. Nature 1976; 260: Rose MD, Bygrave J, Sharman M., Effect of cooking on veterinary drug residues in food. Part 9. Nitroimidazoles. Analyst., 124, Shakila RJ, Vyla SAP, Kumar RS, Jeyasekaran G, Jasmine GI., 2006: Stability of chloramphenicol residues in shrimp subjected to heat processing treatments. Food Microbiol., 23,

7 27-Van Egmond HJ, Nouws JFM, Schilt R, Van Lankveld-Driessen WDM, Streutjens- Van Neer EPM, Simons FGH., Stability of antibiotics in meat during a simulated high temperature destruction process. A-H/Egmond van pdf, Shakila RJ, Vyla SAP, Kumar RS, Jeyasekaran G, Jasmine GI., Stability of chloramphenicol residues in shrimp subjected to heat processing treatments. Food Microbiol., 23, Öbekçi J., Tavuk eti ve karaciğerlerinde tetrasiklin grubu antibiyotiklerin HPLC ile saptanması. Uzmanlık Tezi. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı. 30- European Commission, 1996; Türk Gıda Kodeksi, Türk Gıda Kodeksi, Sezer K., Tarımsal ürünlerde pestisit kalıntısının üretim sahasından satışa kadarki süreçte izlenmesi. Zirai Mücadele Merkez Araştırma Enstitüsü. abdgm.tarim.gov.tr /YDS /2012 /Mart /Sunumlar /3.pdf. 32- Sunay AE., Balda antibiyotik kalıntısı sorunu. Uludağ Arı. Derg., Yibar A.,Soyutemiz E., Gıda Değeri Olan Hayvanlarda Antibiyotik Kullanımı ve Muhtemel Kalıntı Riski. Atatürk Üniversitesi Vet. Bil. Derg.; 8(1):