Mikrobiyol Bul 2009; 43: Özgün Çalışma/Original Article

Transkript

1 Özgün Çalışma/Original Article Mikrobiyol Bul 2009; 43: KİSTİK FİBROZLU HASTALARDAN İZOLE EDİLEN PSEUDOMONAS AERUGINOSA İZOLATLARININ BİYOFİLM OLUŞTURMA YETENEKLERİNİN ARAŞTIRILMASI VE BU ÖZELLİĞİN GENOTİP VE ANTİBİYOTİK DUYARLILIĞI İLE İLİŞKİSİNİN BELİRLENMESİ* INVESTIGATION OF BIOFILM FORMATION AND RELATIONSHIP WITH GENOTYPE AND ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS WITH CYSTIC FIBROSIS Ahmet Yılmaz ÇOBAN 1, Alper ÇİFTCİ 2, Ertan Emek ONUK 3, Zayre ERTURAN 4, Yeliz TANRIVERDİ ÇAYCI 1, Belma DURUPINAR 1 1 Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Samsun. (cobanay2003@yahoo.com.tr) 2 Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Samsun. 3 Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Hastalıklar ve Klinik Bilimleri Bölümü, Samsun. 4 İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul. ÖZET Pseudomonas aeruginosa, kistik fibroz (KF) lu hastalarda tedavisi oldukça güç olan solunum yolu enfeksiyonlarına neden olmaktadır. Hastalığın ileri dönemlerde enfeksiyona neden olan P.aeruginosa suşları ise genellikle mukoid fenotipte olup, bakteriyi çevreleyen yoğun miktardaki aljinat polisakkaridi, bakterinin akciğer hücrelerine yapışmasını kolaylaştırmakta ve biyofilm oluşumu sayesinde bakteriyi bağışıklık sisteminin hücrelerinden korumaktadır. Bu çalışmanın amacı, KF lu hastalardan izole edilen P.aeruginosa izolatlarında biyofilm varlığının araştırılması ve biyofilm oluşturma özelliklerinin genotip ve antibiyotik duyarlılık profilleri ile ilişkisinin araştırılmasıdır. Çalışmada KF lu hastalardan izole edilen 60 adet P.aeruginosa izolatının biyofilm oluşumu Kongo Red agar ve Christensen yöntemiyle araştırılmış; suşların genotipleri RAPD-PCR (Random amplification of polymorphic DNA-polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemiyle, in vitro antibiyotik duyarlılıkları ise disk difüzyon yöntemiyle belirlenmiştir. Çalışmamızda, P.aeruginosa suşlarının %33.3 (20/60) ünün biyofilm oluşturduğu saptanmış, biyofilm üreten 20 izolatın 9 u, biyofilm üretmeyen 40 izolatın ise 16 sı mukoid özellik göstermiştir. İzolatların %70 lik benzerlik katsayısı göz önü- * Bu çalışma 33. Türk Mikrobiyoloji Kongresi (22-25 Ekim, Bodrum) nde poster olarak sunulmuştur. Geliş Tarihi: Kabul Ediliş Tarihi:

2 Kistik Fibrozlu Hastalardan İzole Edilen Pseudomonas aeruginosa İzolatlarının Biyofilm Oluşturma Yeteneklerinin Araştırılması ve Bu Özelliğin Genotip ve Antibiyotik Duyarlılığı ile İlişkisinin Belirlenmesi ne alınarak RAPD ile genotiplendirilmesi sonucu 19 adet küme (A-S) ve bunlardan beşine ait alt küme (K1, K2, N1, N2, Q1, Q2, R1, R2, S1, S2) olmak üzere toplam 24 adet genotip tespit edilmiştir. Bu gruplardan dokuzu biyofilm üreten, 15 i de biyofilm üretmeyen izolatlardan oluşmaktadır. Biyofilm üreten suşların çoğunun K1 (n= 5) ve K2 (n= 6), üretmeyen suşların ise L (n= 8) ve O (n= 7) genotip grubunda toplandığı izlenmiştir. Biyofilm üreten ve üretmeyen izolatların antibiyotik duyarlılıkları değerlendirildiğinde, gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark belirlenmemiş (p> 0.05), her iki gruba da etkinliği en düşük ilaç tobramisin, etkinliği en yüksek ilaç piperasilin/tazobaktam olarak bulunmuştur. Sonuç olarak; biyofilm üreten izolatlar ile üretmeyen izolatların genotipik olarak farklı gruplarda yoğunlaştığının belirlendiği bu çalışmanın verilerinin, daha geniş izolat sayılarıyla ve çok merkezli çalışmalarla desteklenmesi gerektiği kanısına varılmıştır. Anahtar sözcükler: Pseudomonas aeruginosa, biyofilm, kistik fibroz, genotiplendirme. ABSTRACT Pseudomonas aeruginosa is a frequent cause of respiratory infections in cystic fibrosis (CF) patients. P.aeruginosa strains isolated from these patients have often a mucoid phenotype at advanced disease. This mucoid structure contains a dense amount of alginate type polysaccharide which facilitates bacterial attachment to lung epithelia and provides protection from the immune system due to biofilm formation. The aims of this study were to investigate the biofilm formation and the relation of this property with genotype and antibiotic susceptibilities of P.aeruginosa strains isolated from CF patients. The biofilm formation was determined by using the Congo Red agar and Christensen methods. RAPD-PCR (Random amplification of polymorphic DNA polymerase chain reaction) and disc diffusion methods were used for genotyping and antibiotic susceptibility testing, respectively. Biofilm production was found positive in 33.3% (20/60) of P.aeruginosa tested. While 9 of these 20 isolates were of mucoid colony morphotype, among the 40 biofilm negative isolates mucoid colony was detected in 16 of them. RAPD genotyping based on 70% similarity yielded 19 (A-S) clusters and subtypes related to five of these clusters (K1, K2, N1, N2, Q1, Q2, R1, R2, S1, S2) making up a total of 24 genotypes. Nine of these genotypes composed of biofilm positive isolates and 15 were biofilm negative ones. Most of the biofilm positive strains belonged to K1 (n= 5) and K2 (n= 6) genotypes while biofilm negative isolates were in the L (n= 8) and O (n= 7) genotypes. The comparison of antibiotic susceptibilities in both groups revealed no statistically significant difference (p> 0.0%). However, highest rate of resistance was detected for tobramycin and lowest rate for piperacillin/tazobactam. The data obtained from this study indicated that biofilm negative and positive P.aeruginosa isolates clustered in different groups. These results should be supported with larger scale multi-center studies which may provide information about P.aeruginosa dynamics in CF lungs. Key words: Pseudomonas aeruginosa, biofilm, cystic fibrosis, genotyping. GİRİŞ Kistik fibroz (KF) lu hastaların akciğerinde kalın bir mukus tabakasının olması, buradaki oksijen miktarını azaltmaktadır. Buna ek olarak nötrofil infiltrasyonu, metabolik olarak aktif bakteriler ve epitelyal hücreler, çevredeki oksijenin hızla azalmasına neden olmaktadırlar. Oksijen miktarındaki azalmanın mukoid olmayan Pseudomonas aeruginosa suşlarının mukoid hale geçmesine ve bunun sonucunda da biyofilm oluşumuna neden olduğu düşünülmektedir 1. P.aeruginosa KF hastalarında önemli bir mortalite ve morbitide nedenidir. Bu hastaların akciğerlerinde bulunan P.aeruginosa suşları zaman içerisinde fenotipik olarak farklılaşma göstermektedir. Enfeksiyona neden olan suşlar erken dönemde mukoid yapıda de- 564

3 Çoban AY, Çiftci A, Onuk EE, Erturan Z, Tanrıverdi Çaycı Y, Durupınar B. ğilken, daha sonra mukoid fenotip baskın hale gelmektedir. Bu değişim mukoid suşların aşırı miktarda aljinat üretimine bağlıdır. Aljinat, bakterinin akciğer hücrelerine tutunmasını sağlamak ve biyofilm oluşturarak antimikrobiyal ilaçlardan korumak suretiyle, mukoid suşların daha ciddi enfeksiyonlar oluşturmasına neden olur. Bu maddenin ayrıca, polimorfonükleer hücre kemotaksisini ve kompleman aktivasyonunu inhibe ettiği, bakteriyi nötrofil ve makrofaj fagositozundan da koruduğu gösterilmiştir 2. Bu çalışmada, KF lu hastalardan izole edilen P.aeruginosa suşlarında biyofilm varlığının araştırılması ve biyofilm oluşturma özelliğinin genotip ve antibiyotik duyarlılık profilleri ile ilişkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. GEREÇ ve YÖNTEM Suşlar Çalışmaya, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Bölümüne gönderilen 42 KF hastasının solunum yolu örneklerinden izole edilen 60 P.aeruginosa izolatı dahil edildi. Klinik örneklerde üreyen değişik fenotipteki koloniler ayrı ayrı değerlendirildiğinden, bazı hastalara ait birden fazla izolat çalışıldı. İzolatlar kanlı agar besiyerine ekilerek bir gece 37 C de inkübe edildi. Üreyen kolonilerin saf olup olmadığı kontrol edildikten sonra triptik soy agara ekim yapıldı ve petriler 37 C de 24 saat inkübe edildi. Biyofilm Üretiminin Belirlenmesi Bu amaçla Kongo Red Agar ve Christensen yöntemleri kullanıldı 3-5. Her suş için her iki test üç defa tekrar edildi. Kongo Red besiyeri; 1 l besiyeri içerisinde 10 g agar, 50 g sakkaroz, 37 g beyin kalp infüzyon buyyonu ve 0.8 g Kongo kırmızısı olacak şekilde hazırlandı. Suşlar bu besiyerine tek koloni düşecek şekilde ekilerek 37 C de 24 saat inkübe edildi. Bu süre sonunda siyah koloni oluşturan suşlar biyofilm pozitif, pembe renkli ya da renksiz koloniler ise biyofilm negatif olarak kabul edildi (Resim 1). Slime Faktör Negatif (-) Slime Faktör Pozitif (+) (-) (+) (+) (+) Resim 1. Kongo Red Agar ve standart tüp yönteminde biyofilm oluşturan ve oluşturmayan izolatlar (izolat 19). 565

4 Kistik Fibrozlu Hastalardan İzole Edilen Pseudomonas aeruginosa İzolatlarının Biyofilm Oluşturma Yeteneklerinin Araştırılması ve Bu Özelliğin Genotip ve Antibiyotik Duyarlılığı ile İlişkisinin Belirlenmesi Christensen yönteminde kullanılan besiyerini hazırlamak amacıyla, 37 g triptik soy buyyon 1000 ml saf su içinde eritildikten sonra ph sı ayarlandı ve 2 şer ml olacak şekilde tüplere dağıtıldı. İncelenecek suşlar bu besiyerine ekilip 37 C de 24 saat inkübe edildi. Daha sonra tüpler boşaltıldı ve %0.25 lik safranin çözeltisinden 2 şer ml eklenerek 5 dakika bekletildi. Süre sonunda tüplerin içindeki solüsyon boşaltıldı ve tüpler bir gece kurumaya bırakıldı. Değerlendirmede, tüp duvarında pembe-kırmızı renkli film tabakasının görülmesi, biyofilm oluşumunun göstergesi olarak kabul edildi. Tüpte boya tabakasının bulunmaması ve boşaltılan sıvı seviyesindeki boya kalıntısı ise biyofilm üretimi negatif olarak değerlendirildi (Resim 1) 3-7. İzolatların Genotiplendirilmesi (Random Amplification of Polymorphic DNA; RAPD Analizi) P.aeruginosa izolatlarının genomik DNA ekstraksiyonu kaynatma yöntemiyle gerçekleştirildi. Bu yönteme göre, 100 C lik kaynar suda 10 dakika süreyle bekletilen 500 µl distile su içerisindeki bakteri süspansiyonları, rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Elde edilen süpernatan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) nda hedef DNA olarak kullanıldı. ERIC2 primeri (5 -AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3 ) kullanılarak yapılan random amplified polymorphic DNA (RAPD) -PCR de 2 mm MgCl 2, 3 mm dntp karışımı, 1.5 IU Taq polimeraz, 25 pmol primer, 200 µl Triton X-100, 5 µl 10X PCR tamponu içeren 50 ml lik PCR karışımı hazırlandı 8. Amplifikasyon koşulları olarak 94 C de 5 dakika ön denatürasyonu takiben; 94 C de 1 dakika, 36 C de 1 dakika, 72 C de 3 dakika olmak üzere 35 döngü ve 72 C de 10 dakika son uzama aşaması kullanıldı. PCR ürünlerinin görüntülenmesi için %2 agaroz içeren jel elektroforezi uygulandı ve ürünler ultraviyole transillüminatörde görüntülendi 8 (Resim 2). Bantlar, Bio Rad Quantity One programı kullanılarak incelendi ve izolatlar arasındaki genetik yakınlık %70 lik benzerlik katsayısına göre, UPGAMA, Dice coefficient metodu ile dendrogram çizilmek suretiyle hesaplandı (Şekil 1) Resim 2. İzolatların RAPD profilleri. 566

5 Çoban AY, Çiftci A, Onuk EE, Erturan Z, Tanrıverdi Çaycı Y, Durupınar B A B C D E F G H I J K1 K2 L M N1 N2 O P Q1 Q2 R1 R2 S1 S2 Şekil 1. İzolatların RAPD profilleri ve UPGAMA, Dice Coefficient yöntemine göre Dendogram Analiz sonuçları. Antibiyotik Duyarlılık Testi Tüm izolatların meropenem, imipenem, levofloksasin, seftazidim, piperasilin/tazobaktam, siprofloksasin ve tobramisine karşı in vitro duyarlılıkları Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tarafından önerilen disk difüzyon yöntemiyle belirlendi

6 Kistik Fibrozlu Hastalardan İzole Edilen Pseudomonas aeruginosa İzolatlarının Biyofilm Oluşturma Yeteneklerinin Araştırılması ve Bu Özelliğin Genotip ve Antibiyotik Duyarlılığı ile İlişkisinin Belirlenmesi İstatistiksel Yöntemler Biyofilm üreten ve üretmeyen izolatların antibiyotik duyarlılıkları istatistiksel olarak Kikare ve Fisher in kesin testi ile karşılaştırılarak değerlendirildi. BULGULAR Çalışılan P.aeruginosa izolatlarında biyofilm üretimi %33.3 (20/60) oranında bulunmuştur (Resim 1). Biyofilm üreten 20 izolatın 9 u, biyofilm üretmeyen 40 izolatın ise 16 sı mukoid özellik göstermektedir. KF hastalarından izole edilen P.aeruginosa izolatlarının RAPD profilleri, fenotipik özellikleri, biyofilm oluşturmaları ve in vitro antibiyotik duyarlılıkları Tablo I ve Tablo II de sunulmuştur. Tabloda görüldüğü gibi 1-5, 8, 11 ve 12 no lu hastaya ait birden fazla izolatın RADP profilleri farklı olarak belirlenmiştir. Altı no lu hastaya ait 3 izolattan 2 si aynı RAPD profiline sahipken biri farklı olarak saptanmıştır. Test edilen 7, 9, 10 ve 13 no lu hastalara ait birden fazla izolatın RAPD profillerinin aynı olduğu saptanmış, ancak bu izolatların in vitro antibiyotik duyarlılık profillerinin birbirinden farklı olduğu belirlenmiştir (Tablo I). Tablo I. Birden Fazla Pseudomonas aeruginosa İzole Edilen Hasta Suşlarının RAPD Profili, Fenotipik Özelliği, Biyofilm Üretimi ve İn Vitro Antibiyotik Duyarlılık Sonuçları Hasta no Suş no RAPD profili Fenotip Biyofilm IPM MEM CIP LVX CAZ NN TZP 1 5 K2 M + S S I I S S S 50 N1 NM - S S S S S S S 11 K1 M + S S S S S I S 59 M M - S S S S S S S 25 L NM - R R S S R R S 2 45 G M - S S S S S S S 46 N2 NM - S S S S S S S 3 52 S2 NM - S S S S S S S 10 K1 NM + S S S S S I S 4 19 I NM + S S S S S R S 56 D NM - S S S S S S S 5 3 K2 M + S S S S S S S 31 O NM - S S S S S S S 6 21 L NM - S S R R S S S 13 H NM + S S S S S R S 26 L M - S S S S S S S 7 40 P M - S S I I S R S 41 P NM - S S I R S S S 8 4 K2 NM + S S S S S I S 23 L M - S S S S S S S 58 E NM - R R S S R R S 9 32 O NM - R R S S R R S 33 O M - S S I I S S S A M + S S S S S S S 15 A NM + S S R R S S S 568

7 Çoban AY, Çiftci A, Onuk EE, Erturan Z, Tanrıverdi Çaycı Y, Durupınar B. Tablo I. Birden Fazla Pseudomonas aeruginosa İzole Edilen Hasta Suşlarının RAPD Profili, Fenotipik Özelliği, Biyofilm Üretimi ve İn Vitro Antibiyotik Duyarlılık Sonuçları (devamı) Hasta no Suş no RAPD profili Fenotip Biyofilm IPM MEM CIP LVX CAZ NN TZP O M - S S R R S S S 47 N2 NM - S S R R S S S B NM - S S S S R R S 20 Q1 M + S S S S S S S G M - S S S S S S S 44 G NM - S S S S S I S M: Mukoid, NM: Nonmukoid, IPM: İmipenem, MEM: Meropenem, CIP: Siprofloksasin, LVX: Levofloksasin, CAZ: Seftazidim, NN: Tobramisin, TZP: Piperasilin/tazobaktam, RAPD: Random amplified polymorphic DNA. Tablo II. Tek Bir Pseudomonas aeruginosa İzole Edilen Hasta Suşlarının RAPD Profili, Fenotipik Özelliği, Biyofilm Üretimi ve İn Vitro Antibiyotik Duyarlılık Sonuçları Hasta no Suş no* RAPD profili Fenotip Biyofilm IPM MEM CIP LVX CAZ NN TZP 1 12 H M + S S S S S S S 2 16 Q2 NM + R S S S S S S 3 6 K2 M + S S S S S I S 4 8 K1 NM + S S S S S S S 5 1 K2 NM + S S S S S S S 6 18 C NM + I R I R R R S 7 2 K2 NM + S S S S I S S 8 17 J M + S S S S S I S 9 7 K1 M + R S S S S S S R2 NM - S S S S S S S F M - S S S S S R S R2 NM - S S S S S S S R1 NM - S S S S S I S S1 M - S S S S S S S N1 M - S S S S S S S R2 NM - R R R R R R S S2 NM - S R R R R R S R2 NM - S S S S S I S N2 NM - S S S S S S S F M - S S S S S I S O M - S S S S S R S O NM - S S S S S S S P NM - S S S S S S S L M - S S S S S S S L NM - R R S S R R R L NM - S S S S S S S L M - S S S S S S S O M - S S I I S S S 29 9 K1 NM + S S S S S S R * Tablo III te yer alan izolat numaraları. M: Mukoid, NM: Nonmukoid, IPM: İmipenem, MEM: Meropenem, CIP: Siprofloksasin, LVX: Levofloksasin, CAZ: Seftazidim, NN: Tobramisin, TZP: Piperasilin/tazobaktam, RAPD: Random amplified polymorphic DNA. 569

8 Kistik Fibrozlu Hastalardan İzole Edilen Pseudomonas aeruginosa İzolatlarının Biyofilm Oluşturma Yeteneklerinin Araştırılması ve Bu Özelliğin Genotip ve Antibiyotik Duyarlılığı ile İlişkisinin Belirlenmesi İzolatların %70 lik benzerlik katsayısı göz önüne alınarak RAPD ile genotiplendirilmesi sonucu 19 adet küme ve bu kümelere ait 24 adet genotip tespit edilmiştir (Resim 2). Bu gruplardan 9 u biyofilm üreten, 15 i de biyofilm üretmeyen izolatlardan oluşmaktadır (Tablo III). Bu sonuç, biyofilm üretmeyen izolatlardaki genotipik çeşitlilik ve polimorfizmin daha fazla olduğunu düşündürmektedir. Biyofilm üreten izolatların çoğunun K1 (n= 5) ve K2 (n= 6) genotip grubunda toplandığı izlenmiştir. Biyofilm üreten ve üretmeyen izolatların antibiyotiklere in vitro duyarlılıkları değerlendirildiğinde, gruplar arasında anlamlı bir fark belirlenmemiş (p> 0.05), her iki gruba da etkinliği en düşük ilaç tobramisin, etkinliği en yüksek ilaç piperasilin/tazobaktam olarak bulunmuştur (Tablo IV). Tablo III. İzolatların RAPD Profillerine ve Biyofilm Üretme Özelliklerine Göre Dağılımı RAPD profili Sayı % Suş no Biyofilm üretimi A , 15 + B C D E F , 54 - G , 44, 45 - H , 13 + I J K , 8, 9, 10, 11 + K , 2, 3, 4, 5, 6 + L , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 - M N , 50 - N , 47, 48 - O , 30, 31, 32, 33, 34, 35 - P , 41, 42 - Q Q R R , 37, 38, 39 - S S ,

9 Çoban AY, Çiftci A, Onuk EE, Erturan Z, Tanrıverdi Çaycı Y, Durupınar B. Tablo IV. Biyofilm Üreten ve Üretmeyen İzolatların İn Vitro Antibiyotik Duyarlılıklarının Karşılaştırılması Duyarlı Orta duyarlı Dirençli Antibiyotikler B + /B - B + /B - B + /B - p İmipenem 17/35 1/0 2/5 > 0.05 Meropenem 19/34 0/0 1/6 > 0.05 Siprofloksasin 17/31 2/4 1/5 > 0.05 Levofloksasin 17/31 1/3 2/6 > 0.05 Seftazidim 18/33 1/0 1/7 > 0.05 Tobramisin 12/26 5/4 3/10 > 0.05 Piperasilin/tazobaktam 19/39 0/0 1/1 > 0.05 B + : Biyofilm oluşturanların sayısı; B - : Biyofilm oluşturmayanların sayısı. TARTIŞMA KF, hastaların yaşam kalitesini düşüren mortalitesi yüksek önemli bir hastalıktır. İyon transport bozukluğu nedeniyle vücut salgıları yoğun, kıvamlı ve yapışkan haldedir. Özellikle akciğerde yoğun kıvamlı mukus oluşması solunum yollarında bakteriyel yerleşim için uygun bir ortam hazırlar 1. Bu hastalarda özellikle alt solunum yollarına ait enfeksiyonlar çocukluk çağından itibaren sık görülmeye başlar. İlk yıllarda etken sıklıkla Staphylococcus aureus iken sonraki yıllarda yerini P.aeruginosa ya bırakır. P.aeruginosa suşları başlangıçta mukoid olmayan özellikte iken zamanla mukoid fenotip baskın hale gelir. Mukoid suşlar, zengin polisakkarit yapısında olan aljinat içeren biyofilm tabakası oluşturmaktadır 2. Yoğun mukus tabakasının oksijen miktarını azaltması, lümen ve balgamın ölü polimorfonükleer lökositler içermesi, P.aeruginosa nın biyofilm oluşturması için biyolojik bir matriks gibi davranır. Aljinat oluşturma özelliği P.aeruginosa nın önemli bir virülans faktörü olup, biyofilm oluşturan suşların oluşturmayanlara göre akciğerde daha ciddi doku hasarına neden oldukları ve daha kötü bir prognoza sahip oldukları bilinmektedir 10,11. Ayrıca biyofilm oluşturan suşların, planktonik hücrelere göre bakterisidal antibiyotiklere kat daha az duyarlı olduğu rapor edilmiştir Aljinat üreten P.aeruginosa suşlarının yüksek antibiyotik direnci göstermesi nedeniyle, çeşitli antibiyotiklerin kombinasyon çalışmaları yapılmıştır Tre-Hardy ve arkadaşları 15, biyofilm üreten suşlara karşı in vitro tobramisin ve klaritromisin kombinasyonunun sinerjistik etki gösterdiğini bildirmiştir. Bizim çalışmamızda ise, biyofilm oluşturan ve oluşturmayan gruplarda en fazla direnç tobramisine karşı saptanmış, her iki gruba da etkinliği en yüksek olan ilaç piperasilin/tazobaktam olarak bulunmuştur. Ancak çalışmamızda biyofilm üreten ve üretmeyen izolatların antibiyotiklere direnç oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark belirlenmemiş (p> 0.05), bu durumun suş sayısının azlığından ve/veya antibiyotiklerin biyofilm içindeki etkinliklerinin araştırılmamış olmasından kaynaklanabileceği düşünülmüştür. Birçok virülans faktörü gibi biyofilm oluşumunun da quorum sensing (QS) ile ilişkili olduğu ve QS inhibitörlerinin antimikrobiyal ilaçlarla kombine olarak tedavide değer taşıyabileceği düşünülmektedir 16,17. KF lu hastalarda kolonize olan P.aeruginosa suşları- 571

10 Kistik Fibrozlu Hastalardan İzole Edilen Pseudomonas aeruginosa İzolatlarının Biyofilm Oluşturma Yeteneklerinin Araştırılması ve Bu Özelliğin Genotip ve Antibiyotik Duyarlılığı ile İlişkisinin Belirlenmesi nın fenotipik özellikleri zaman içinde değişebileceği gibi, bir hastada bir veya daha fazla genotip de saptanabilmektedir. Şener ve arkadaşları 18, KF lu 20 hastadan izole ettikleri 130 P.aeruginosa suşunu RAPD-PCR yöntemiyle tiplendirmiş ve koloni morfolojileri ve antibiyotik duyarlılık paternleri farklı olan suşların aynı genotipe sahip olabileceğini bildirmiştir. Bu araştırmacılar ayrıca, tek bir hastanın birden fazla P.aeruginosa genotipi ile kolonize olabileceğini ve aynı merkezde takip edilen hastalar arasında çapraz kolonizasyonun da gerçekleşebileceğini ifade etmiştir 18. Yapılan literatür taramalarında, KF lu hastalardan izole edilen P.aeruginosa suşlarının biyofilm oluşturmaları ile genotipleri arasındaki ilişki hakkında kısıtlı bilgiye ulaşılmaktadır. Yang ve arkadaşları 8, 48 P.aeruginosa izolatında biyofilm üretimi ile genotip arasındaki ilişkiyi araştırmış ve D ve E genotipindeki izolatların güçlü biyofilm oluşturma özelliği gösterdiğini rapor etmiştir. Bizim çalışmamızın sonuçları da bu araştırmacıların elde ettiği veriler ile uyumlu olup, biyofilm oluşturan ve oluşturmayan izolatların farklı genotiplerde yer aldığı belirlenmiştir (Tablo III). Çalışmamızda, RAPD ile genotiplendirme sonunda 19 adet küme ve bu kümelere ait 24 adet genotip tespit edilmiştir. Bu gruplardan dokuzu biyofilm üreten (20 izolat), 15 i ise biyofilm üretmeyen (40 izolat) izolatlardan oluşmaktadır. Bu sonuca göre biyofilm üretimi negatif bulunan izolatlarda genotip çeşitliliği ve polimorfizm daha fazla gözlenmiştir. Çalışmamızda biyofilm üreten izolatların çoğunun K1 (5 izolat) ve K2 (6 izolat) genotip grubunda toplandığı izlenmiştir. Sonuç olarak; KF lu 42 hastanın solunum yolu örneklerinden izole edilen 60 P.aeruginosa izolatının değerlendirildiği çalışmamızda, biyofilm üretim oranı %33.3 (20/60) olarak tespit edilmiş, biyofilm üreten ve üretmeyen izolatların genotipik olarak farklı gruplarda toplandığı belirlenmiş ve biyofilm üretimi ile in vitro antibiyotik duyarlılığı açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır. Bu verilerin, farklı bölgelerden izole edilen daha geniş suş sayılarıyla ve çok merkezli olarak yapılacak çalışmalarla desteklenmesi gerektiği düşünülmüştür. KAYNAKLAR 1. Wagner VE, Iglewski BH. P.aeruginosa biofilms in CF infection. Clin Rev Allergy Immunol 2008; 35: Ryder C, Bryd M, Wozniak DJ. Role of polysaccharides in Pseudomoas aeruginosa biofilm development. Curr Opin Microbiol 2007; 10: Akyar I, Fidan I, Rota S, Türet S. Koagülaz negatif stafilokoklarda slime faktör yapımının üç farklı yöntemle araştırılması, tür tayini ve antibiyotik direnci. Mikrobiyol Bul 1998; 32: Arciola CR, Montanaro L, Baldassarri E, Borsetti E, Cavedagna D, Donati E. Slime production by staphylococci isolated from prosthesis-associated infection. New Microbiol 1999; 22: Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, et al. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiol 1985; 22: Stepanovic S, Vukovic D, Dakic I, Savic B, Svabic-Vlahovic M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J Microbiol Methods 2000; 40: Woznicova V, Votava M, Skalka B. Comparison of 2 methods of detecting slime production by coagulase negative staphylococci. Cesk Epidemiol Microbiol Imunol 1993; 42: Yang W, Shi L, Jia WX, et al. Evaluation of the biofilm-forming ability and genetic typing for clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa by enterobacterial repetitive intergenic consensus-based PCR. Microbiol Immunol 2005; 49:

11 Çoban AY, Çiftci A, Onuk EE, Erturan Z, Tanrıverdi Çaycı Y, Durupınar B. 9. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved Standard M2-A , CLSI. Wayne, PA. 10. Lee B, Haagensen JA, Ciofu O, Andersen JB, Hoiby N, Molin S. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol 2005; 43: VanDevanter DR, Van Dalfsen JM. How much do Pseudomonas biofilms contribute to symptoms of pulmonary exacerbation in cystic fibrosis? Pediatr Pulmonol 2005; 39: Battan PC, Barnes AI, Albesa I. Resistance to oxidative stress caused by ceftazidime and piperacillin in a biofilm of Pseudomonas. Luminescence 2004; 19: Hill D, Rose B, Pajkos A, et al. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J Clin Microbiol 2005; 43: Tre-Hardy M, Mace C, El Manssouri N, Vanderbist F, Traore H, Devleesschouwer MJ. Effect of antibiotic coadministration on young and mature biofilms of cystic fibrosis isolates: the importance of the biofilm model. Int J Antimicrob Agents 2009; 33: Tre-Hardy M, Vanderbist F, Traore H, Devleeschouwer MJ. In vitro activity of antibiotic combinations against Pseudomonas aeruginosa biofilm and planktonic cultures. Int J Antimicrob Agents 2008; 31: Ramsey DM, Wozniak DJ. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Mol Microbiol 2005; 56: Winstanley C, Fothergill JL. The role of quorum sensing in chronic cystic fibrosis Pseudomonas aeruginosa infections. FEMS Microbiol Lett 2009; 290: Sener B, Köseoğlu O, Ozçelik U, Kocagöz T, Günalp A. Epidemiology of chronic Pseudomonas aeruginosa infections in cystic fibrosis. Int J Med Microbiol 2001; 291: