BİYOMOLEKÜLER ALGILAMAYA YÖNELİK ELEKTROKİMYASAL SENSÖRLERİN TASARIMI VE UYGULAMALARI

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOMOLEKÜLER ALGILAMAYA YÖNELİK ELEKTROKİMYASAL SENSÖRLERİN TASARIMI VE UYGULAMALARI Analitik Kimya Programı Doktora Tezi Uzman Eczacı Hakan KARADENİZ Danışman Doç. Dr. K. Arzum ERDEM GÜRSAN İzmir 2008

2 II

3 III ÖNSÖZ Çalışmalarımdaki değerli katkılarından dolayı başta, danışmanım Sayın Doç. Dr. K. Arzum ERDEM GÜRSAN olmak üzere, Analitik Kimya Anabilim dalı başkanı Sayın Prof. Dr. M. Şengün ÖZSÖZ ve Anabilim Dalındaki diğer Öğretim Üyelerine teşekkür eder, saygılarımı sunarım. Çalışmalarım sırasında maddi destek sağlayan Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Merkezi (TÜBİTAK) ve Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fon Saymanlığına, doktora eğitimim boyunca maddi ve manevi destek sağlayan TÜBİTAK- Yurt İçi Doktora Burs Programı na teşekkür ederim. Her zaman desteklerini gördüğüm değerli çalışma arkadaşlarıma ve manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen aileme teşekkür ederim. İzmir Uzm. Ecz. Hakan KARADENİZ Mayıs 2008

4 IV İÇİNDEKİLER I.BÖLÜM...1 GENELBİLGİLER ELEKTROKİMYA Elektrokimyasal tabakalar: Elektrokimyasal tabakaların elektrisel olarak incelenmesi : Elektrokimyasal bir olayda kütle aktarım yolları Elektroanalitik yöntemler Voltametri ve esasları Voltametride kullanılan uyarma sinyalleri Voltametrik cihazlar Voltametride kullanılan referans elektrotlar Voltametride kullanılan çalışma elektrotları: Karbon elektrotlar Metal elektrotlar Voltametrik akımlar Elektrokimyasal bir olayda faradayik işlemler Voltametrik teknikler : Dönüşümlü Voltametri : Diferansiyel Puls Polarografisi : BİYOSENSÖR Biyosensör Çeşitleri: İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler Biyosensör tasarımında kullanılan moleküller ve yapıları...35

5 V Nükleik asitler ve DNA: DNA ile ilgili bazı terimlerin tanımlamaları DNA baz dizilişlerinin yazılımı ile ilgili temel.. bilgiler İnterkalasyon Nükleik asit hibridizasyonu DNA biyosensörleri: DNA biyosensörlerinin sınıflandırılması DNA biyosensörlerinde prob dizilerinin elektrot yüzeyine tutturulma yolları Pasif adsorbsiyon yoluyla prob tutturulması (ıslak.. adsorbsiyon yöntemi) Elektrostatik yolla prob tutturulması Kovalent yolla prob tutturulması Avidin-biyotin etkileşimi nedeniyle streptavidin kaplı yüzeye biyotinle işaretlenmiş prob tutturulması Elektrokimyasal genosensörler ile DNA dizi algılama yöntemleri İndikatöre dayalı DNA dizi algılama yöntemleri İnterkalatör madde ile DNA bazları ile etkileşen molekül ile İndikatörsüz DNA dizi algılama yöntemleri NANOTEKNOLOJİ Nanoteknolojinin kullanım alanları Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)... 58

6 VI 6. DNA çip teknolojisi II. BÖLÜM...61 GEREÇ VE YÖNTEM Kullanılan cihazlar Kullanılan kimyasal maddeler Echinomisin (ECHI) hakkında genel bilgi Kullanılan çözeltilerin hazırlanışı Oligonükleotit çözeltilerinin hazırlanışı Ag-NP lere dayalı deneylerinde kullanılan oligonükleotit dizileri Manyetik partiküllere dayalı deneylerinde kullanılan oligonükleotit dizileri MWCNT-SPE sistemine dayalı deneylerinde kullanılan oligonükleotit dizileri Tampon çözeltilerin hazırlanışı Kullanılan yöntem Kullanılan elektrotların hazırlanışı Kalem ucu grafit (PGE) elektrodunun hazırlanışı CNT modifiye SPE hazırlanışı Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA analizine yönelik çalışma Gümüş nanopartiküllerin (Ag-NP) sentezi ve mikroskobik karakterizasyonu Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesi...69

7 VII Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının dönüşümlü voltametri (CV) tekniği ile incelenmesi Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği ile incelenmesi Ag-NP üzerine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA'nın elektrokimyasal tayini DNA konsantrasyonundaki değişimin Ag-NP ve guanin yükseltgenme sinyaline dayalı yanıta olan etkisinin incelenmesi Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesi Ag-NP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin incelenmesi Manyetik partiküllere (MB) dayalı elektrokimyasal DNA hibridizasyonun indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine yönelik çalışmalar ECHI'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesi ECHI'nin elektrokimyasal davranışının dönüşümlü voltametri (CV) tekniği ile incelenmesi ECHI'nin elektrokimyasal davranışının diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği ile incelenmesi Manyetik partiküllere (MB) dayalı indikatörlü ve indikatörsüz elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayini ECHI sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini Guanin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini...76

8 VIII Adenin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrot (MWCNT-SPE) kullanılarak DNA hibridizasyonun elektrokimyasal tayinine yönelik çalışma MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonu MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA'nın elektrokimyasal tayini MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA prob konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisinin incelenmesi MWCNT-SPE yüzeyine HBV DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine yönelik çalışma HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalar Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon yanıta olan etkisinin incelenmesi III. BÖLÜM...81 BULGULAR Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA analizine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular Ag-NP'lerin mikroskobik karakterizasyonunda elde edilen bulgular Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde elde edilen bulgular Ag-NP üzerine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA'nın elektrokimyasal tayininde elde edilen bulgular

9 IX DNA konsantrasyonundaki değişimin Ag-NP ve guanin yükseltgenme sinyaline etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular Ag-NP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular Manyetik partiküllere(mb) dayalı DNA hibridizasyonunun indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ECHI'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesine ilişkin bulgular Manyetik partiküllere (MB) dayalı indikatörlü ve indikatörsüz elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayinine ilişkin bulgular ECHI'nin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular Guanin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular Adenin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrot (MWCNT-SPE) ile DNA hibridizasyonun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonuna ilişkin bulgular MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA nın elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular.98

10 X MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA prob konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisine ilişkin bulgular MWCNT-SPE yüzeyinde HBV DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalarda elde edilen bulgular Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon yanıtına olan etkisinin incelenmesine ilişkin bulgular IV. BÖLÜM TARTIŞMA Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA analizine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular ile ilgili tartışma Ag-NP'lerin mikroskobik karakterizasyonunda elde edilen bulgular ile ilgili tartışma Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde elde edilen bulgular ile ilgili tartışma Ag-NP yüzeyine tutturulan DNA konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular ile ilgili tartışma Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular ile ilgili tartışma Ag-NP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular ile ilgili tartışma Manyetik partiküllere(mb) dayalı DNA hibridizasyonunun indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma 107

11 XI ECHI'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma Manyetik partiküllere (MB) dayalı DNA hibridizasyonunun indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma ECHI'nin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma Guanin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilşkin bulgular ile ilgili tartışma Adenin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilşkin bulgular ile ilgili tartışma Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrot (MWCNT-SPE) ile DNA hibridizasyonun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonuna ilişkin bulgular ile ilgili tartışma MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA nın elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA prob konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma MWCNT-SPE yüzeyinde HBV DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular ile ilgili tartışma

12 XII HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalarda elde edilen bulgular ile ilgili tartışma Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon yanıtına olan etkisinin incelenmesine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma V. BÖLÜM SONUÇ VE ÖNERİLER ÖZET ABSTRACT YARARLANILAN KAYNAKLAR Arş. Gör. Uzm. Ecz. Hakan KARADENİZ in Özgeçmişi...144

13 XIII ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1: Elektrot yüzeyindeki tabakaların şematik olarak gösterilmesi 12 Şekil 2: Elektrot yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabaka..14 Şekil 3: Elektrokimyasal bir olayda kütle aktarım yollarının şema ile gösterilmesi...15 Şekil 4: Voltametride kullanılan potansiyel uyarma sinyalleri...18 Şekil 5: Üçlü elektrot sistemi içeren potansiyostatın şematize edilmesi.19 Şekil 6: Üçlü elektrot sisteminin şematize edilmesi 20 Şekil 7: Kullanılan çalışma ortamına göre çalışma elektrotları için seçilen potansiyel aralıkları..23 Şekil8: Grafit tozunda bulunan karbon moleküllerinin dizilimi..24 Şekil 9: Karbon pastası elektrodu.24 Şekil 10: Perde baskılı karbon (Grafit) elektrot...25 Şekil 11: Kalem Grafit Elektrot ve grafit elektrodun yüzeyinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görüntülenmesi.. 26 Şekil 12: Altın elektrot Şekil 13: (a) Dönüşümlü voltametride elektroda uygulanan gerilimin zamana karşı grafiği ; (b) Dönüşümlü voltametride elde edilen akım-gerilim eğrisi...29 Şekil 14: Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri; (a) Analog cihazlarda diferansiyel puls voltametrisi için kullanılan uyarma sinyali; (b) Diferansiyel puls voltametrisinde elde edilen bir voltamogram.31 Şekil 15: DNA Çift Sarmal Yapısı.37 Şekil 16: DNA yapısında bulunan baz, şeker ve fosfat gruplarının şematize edilmesi..38

14 XIV Şekil 17: Düzlemsel yapıya sahip bir molekülün çift sarmal DNA baz çiftleri arasına yerleşmesi (interkalasyon) 40 Şekil 18: Nükleik asit hibridizasyonu 41 Şekil 19: İnterkalatör bir hibridizasyon indikatörü ile DNA dizi algılanması; (1) indikatör ile etkileşme, (2) elektrokimyasal ölçüm Şekil 20: DNA bazlarından biriyle etkileşen bir hibridizasyon indikatörü ile DNA dizi algılanması; (1) indikatör ile etkileşme, (2) elektrokimyasal ölçüm...50 Şekil 21: İndikatörsüz DNA dizi algılama yöntemi; (1) elektrokimyasal ölçüm..51 Şekil 22: Karbon nanotüpler (CNT); (A) tek duvarlı ve (B) çok duvarlı..54 Şekil 23: Taramalı elektron mikroskobunun (SEM) şematik görünüşü..58 Şekil 24: Affimetrix firmasına ait mikroarray görünümü 60 Şekil 25: Nanopartiküllerin TEM görüntüsü ( x büyütme) 81 Şekil 26: Çözeltideki gümüş nanopartiküllerin SEM görüntüsü (x büyütme) 82 Şekil 27: Ag-NP lerin partikül büyüklüğü dağılımı..83 Şekil 28: (A) Dönüşümlü voltametri (CV) ve (B) diferansiyel puls voltametrisi (DPV) tekniği kullanılarak, Ag-NP lerin elektrokimyasal davranışlarını gösteren voltamogramlar.84 Şekil 29: Amino ile işaretlenmiş DNA varlığında elde edilen, (NP) gümüş ve (G) guanin oksidasyon sinyallerini ve (K) sadece ABS tamponu içinde alınan ölçüm sinyalini gösteren voltamogram (kontrol)..85 Şekil 30: Amino işaretli DNA oligonükleotidlerinin farklı konsantrasyonlarında gözlenen gümüş ve guanin sinyalleri: (A) Histogramda nanopartiküllerin yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda metalik gümüşün (a) guaninin (b) yükseltgenme sinyalleri gösterilmektedir. (B) Grafikte

15 XV nanopartiküllerin yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda, gümüşün (NP) ve guaninin (G) yükseltgenme sinyalleri gösterilmektedir.. 87 Şekil 31: Farklı tampon çözeltilerinin yanıt üzerine olan etkisini gösteren histogram. Nanopartiküllerin yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda gümüşün ve guaninin yükseltgenme sinyalleri Şekil 32: Çeşitli oranlarda seyreltilmiş gümüş nanopartiküllerin yanıta olan etkisi: (a) DNA yokluğunda, (b) 50 µg/ml DNA varlığında Ag-NP lerin yükseltgenme sinyali ve (c) guanin yükseltgenme sinyali.89 Şekil 33. (A) ECHI nin dönüşümlü voltametri tekniği ile elde edilen voltamogramı; (a) ECHI sinyali (b) ECHI içermeyen PBS tamponundan gelen sinyal (kontrol); (B) Farklı ECHI konsantrasyonlarında diferansiyel puls voltametri tekniği ile ölçülen ECHI sinyallerine ait konsantrasyon-akım eğrisi...91 Şekil 34. Hibridizasyon varlığında ölçülen (E) ECHI, (G) guanin ve (A) adenin sinyallerini gösteren voltamogram; (1) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu varlığında elde edilen sinyaller, (2) sadece prob varlığında elde edilen sinyaller..92 Şekil 35: (A) Hibridizasyon varlığında ölçülen ECHI sinyallerini gösteren (A) DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) histogram Şekil 36: Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren (A) DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren histogram. 95

16 XVI Şekil 37: Hibridizasyon varlığında ölçülen adenin sinyallerini gösteren (A) DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) Hibridizasyon varlığında ölçülen adenin sinyallerini gösteren histogram Şekil 38: SEM görüntüleri; MWCNT-SPE, (a) hızlandırma potansiyeli 20,0 KV, çözünürlük 200 µm; (b) hızlandırma potansiyeli 30,0 KV, çözünürlük 500 nm; yüzeyine 100 µg/ml dsdna modifiye edilmiş MWCNT-SPE, (c) hızlandırma potansiyeli 10,0 KV, çözünürlük 100 µm; (d) hızlandırma potansiyeli 10,0 KV, çözünürlük 10 µm.98 Şekil 39: (a) DNA içermeyen ve kovalent bağlanma çözeltisi varlığında elde edilen sinyal (kontrol); (b) boş ABS...99 Şekil 40: (a) 20 µg/ml amino işaretli DNA prob varlığında elde edilen yükseltgenme sinyali; (b) boş ABS 100 Şekil 41: Farklı konsantrasyonlarda amino işaretli DNA prob dizisi kullanılarak DPV tekniği ile ölçülen guanin sinyallerini gösteren (A) voltamogramlar ve (B) histogram Şekil 42: Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren (A) DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) histogram..102 Şekil 43: Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren (A) DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) histogram Şekil 44: Hedef DNA konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisi ve kalibrasyon eğrisi 104

17 I. BÖLÜM GİRİŞ Moleküler algılama yöntemlerinde kaydedilen gelişmeler ve yeni teknolojik ürünlerle sonuçlanabilecek çalışmaların hızla ortaya çıkması sonucunda, biyomoleküler algılamaya yönelik yeni teknolojilerin oluşturulması gündeme gelmiştir. Aslında her şey bir canlı hücresindeki genetik şifre olarak tanımlanan deoksiribonükleik asitin (DNA), 1953 yılında Watson ve Crick tarafından bulunmasıyla başlamıştır (32). Hücre çekirdeğinde yer alan DNA, bir insanın göz renginden ten rengine, vücut yapısından boyuna kadar çeşitli fiziksel özelliklerini belirlemenin yanı sıra, sağlığı ve yaşam süresi gibi kişinin genetik yapısı konusunda önemli rol oynayan bir biyomoleküldür. Günümüzde kullanılmakta olan klasik metotlarla yapılan tayinler genellikle genlerin doğrudan baz dizisi analizi veya DNA hibridizasyonun tespiti esasına dayalıdır. Bu yöntemlerin bazılarında radyoaktif boyalar kullanılmaktadır. Fakat bu boyar maddelerin kullanılması, kullanım güçlüğü, yüksek maliyet ve radyasyona maruz kalınması gibi nedenlerle önemli sakıncalar doğurmaktadır (122). Örneğin, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniğinin kullanıldığı yöntemler, yüksek maliyet ve sürenin uzunluğu nedeniyle rutin analizler için uygun değildir. Jel elektroforezi tekniği ise çok toksik olan etidyum bromür maddesinin kullanımı nedeniyle sakıncalıdır. Son dönemlerde, bilinen klasik yöntemlere alternatif olacak elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarımı gündeme gelmiştir. Elektrokimyasal sensörlerin yapılarına enzim, doku, nükleik asit vb. gibi biyolojik maddeler eklendiği zaman elektrokimyasal sensörlerin en yaygın kullanım alanlarından biri olan BİYOSENSÖRLER oluşur. Biyo

18 2 (biyolojik kökenli) ve sensör (algılayıcı) kelimelerinden oluşan biyosensör, biyomoleküllerin çeşitli ortamlarda izlenmesinde, kalitatif ve/veya kantitatif tayinini mümkün kılan cihaz olarak tanımlanabilir. Biyosensör tasarımında mutlaka bir biyolojik malzeme kullanılır ve gerçekleşen biyomoleküler etkileşimin sonucunda çok seçici, çok hassas ve çok daha hızlı ölçüm yapabilmektedir. Nükleik asitlerden oluşan tanıma yüzeyleri, analitik kimya alanında her geçen gün daha ilgi çekici konular halini almaktadır (8,147,148). Bu gelişme ile elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin (genosensörlerin= gene dayalı sensörlerin) gelecekte hasta başında yapılacak doktor gözetimindeki analizlerde çok önemli bir rol oynayacağı düşünülmektedir (134). Elektrokimyasal yöntemlerle birlikte DNA nın nitel ve nicel analizini yapma amacına yönelik tasarlanan (10-12,17-19,64,104,105,137) biyosensörlerde tanıma yüzey katmanı olarak DNA kullanılmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (18,19,22,23,27, 87,92,107,122,148). Moleküler tanı yöntemlerindeki ilerlemelere mikrofabrikasyon teknolojisindeki gelişmelerin eklenmesi sonucunda, mikroçip teknolojisi gündeme gelmiş ve bu teknoloji, insan genom projesinin tamamlanması ile ivme kazanmıştır. Mikroçip teknolojisi ile binlerce gen veya ürünleri (RNA ve proteinler gibi) arasındaki ilişkiyi bir çip (yonga) üzerinde, eş zamanlı olarak araştırabilmek ve genetik şifremizi taşıyan nükleik asitlerin nasıl çalıştığımızı anlamamız mümkün olacaktır. Klinikte ve hasta başında gerçekleştirilecek DNA analizlerinde kullanılacak küçük boyutlarda ve tüm sağlık ekibinin kolayca kullanabileceği yeni cihazların tasarımları, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki bazı büyük firmalar tarafından başlatılmıştır yılında S. Mikkelsen in dizi seçici

19 3 DNA sensörleri ile yapmış olduğu kalıtsal hastalıkların tayini projesi Amerika Birleşik Devletleri tarafından korunmaya alınmış olup, kullandığı teknolojinin lisansını Clinical Micro Sensors Inc. (CMS) adlı Amerikan şirketi satın almış ve böylelikle DNA çiplerinin hayata geçirilmesi için ilk çalışmalar başlamıştır. Başta Amerika Birleşik Devletleri olmak üzere, dünya üzerinde birçok firma tarafından DNA çiplerine yönelik araştırmalar yürütülmekte, ve özellikle nanoteknolojinin gündeme gelmesiyle çalışmalar yoğun bir şekilde bu yönde devam etmektedir. (33,91,92,122). Nanoteknoloji, nanometre ölçeğindeki fiziksel, kimyasal ve biyolojik olayların anlaşılması, kontrolü ve üretimi amacıyla, fonksiyonel malzemlerin, cihazların ve sistemlerin geliştirilmesini amaçlayan disiplinlerarası bir bilim dalıdır. Nanoteknolojinin günümüzde diğer bilim dallarına sağladığı avantajlar ve bunu takiben hemen hemen her alanda hızlı bir ilerlemenin kaydedilmesi sonucunda, bilim ve teknolojide yeni ufuklar açılmaya başlanmıştır. Nanoteknoloji ile üretilen nanopartikül, nanotüp ve nanokablolar gibi gelişmiş fizikokimyasal özelliklere sahip nanomalzemeler, biyomoleküler algılamaya yönelik elektrokimyasal sensörlerin daha seçici ve daha hassas bir şekilde geliştirilebilmesi açısından büyük önem taşımaktadır (16,24,46,48,55,58,68,73,82,85,89,90,96,102,118,120,153). Nanometre büyüklüğündeki nanomalzemeler sensör tasarımlarında; (1) enzim, DNA ve protein vb. gibi biyolojik moleküllerin elektrot yüzeyine doğrudan bağlanmasını kolaylaştırmak, (2) elektrokimyasal reaksiyonları hızlandırmak, (3) biyomalzemeleri nanobarkotlarla etiketlemek, (4) biyomoleküler etkileşim/tanıma reaksiyonu sonucunda oluşan sinyalin duyarlılığını arttırmak, ve (5) tanıma yüzeyi ve/veya çevirici bölümün küçültülebilmesi sayesinde,

20 4 biyosensörlerinde boyut olarak minyatürize edilebilmesi amacıyla kullanılmaktadır (42,46,77,85,90,96,109,116,130,135,136,153). Çalışmanın konusu ve amaçları: Son 10 yılda, nanopartiküller, nanotüpler ve diğer nanomalzemelere dayalı sensörlere artan bir ilgi bulunmaktadır (7,24,46,48,58,68,69,82,89,109,120). Çeşitli tekniklerle nükleik asitlerin nanopartikül yüzeyine tutturulması ve bunların elektrokimyasal sensör teknolojisinde kullanılmaları yaygınlaşmaktadır (4,29,44,47,57,102,138, ,150,151,155). Wang ve arkadaşları tarafından DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini streptavidin kaplı altın (Au) nanopartiküller kullanılarak gerçekleştirilmiştir (150). Authier ve arkadaşları tarafından, PCR amplikonlarından human cytomegalovirus virüsün elektrokimyasal tayini, altın nanopartikül ile işaretlenmiş DNA prob kullanılarak yapılmıştır (4). Cai ve arkadaşları tarafından gümüş nanopartiküllere dayalı DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini, asit çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (57). Ayrıca, nanopartiküllere dayalı DNA analizinin etkin manyetik ayırma sayesinde gerçekleştirilebildiğine dair kayıtlar literatürde mevcuttur (138,141,142). Wang ve arkadaşları tarafından, manyetik ayırma sayesinde seçimli bir DNA analizinin kullanılan nanopartikülden gelen gümüş sinyalinin V da, perde baskılı elektrotlar ile ölçülmesiyle başarıyla gerçekleştirilebildiği gösterilmiştir (151). Wang ve arkadaşlarının diğer çalışmasında ise, DNA analizi için kadmiyum sülfür nanopartikülleri kullanılmıştır (142).

21 5 Çalışmamızın ilk bölümünde, gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) tutturulmuş DNA nın elektrokimyasal tayini, hem gümüşün hem de DNA nın elektroaktif bazı olan guaninin yükseltgenme sinyali tek kullanımlık kalem grafit elektrot (PGE) ölçülerek gösterildi. Gümüş nanopartiküllere dayalı bir yöntemle elektrokimyasal DNA analizi, hem metal nanopartikülden gelen sinyal (herhangi bir katalizör ya da asidik çözelti kullanılmadan) hem de guanin sinyali ölçülerek ilk defa çalışmamızda başarıyla gerçekleştirilmiştir ve literatürde bu konuda bir kayda rastlanılmamıştır. Kullanılan bu nanopartiküllerin mikroskobik karakterizasyonu, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile, elektrokimyasal davranışları ise dönüşümlü voltametri (CV) ve diferansiyel puls voltametri (DPV) teknikleri kullanılarak incelendi. Gümüş nanopartikül yüzeyine tutturulmuş amino işaretli kısa DNA dizilerini (oligonükleotitlerin) içeren örneğin içersine tek kullanımlık grafit sensörün daldırılması ve pasif adsorpsiyon yöntemiyle nanopartikül ile işaretli DNA nın elektrot yüzeyine tutturulma basamağını, aynı ölçüm aralığında gümüş ve guanin sinyallerinin ölçülmesi işlemi izledi. Ayrıca, gümüş nanopartikül yüzeyine tutturulan DNA dizisinin konsantrasyonu ve DNA dizisinin çeşitli fonksiyonel gruplarla işaretlenmesi, kullanılan Ag-NP konsantrasyonu ve tampon çözeltinin etkisi gibi deneysel parametrelerdeki farklılığın yanıta olan etkisi araştırıldı. Elektrokimyasal DNA hibridizasyon sensörleri, çeşitli bulaşıcı hastalıkların erken tanısında kullanılabilir (103,134) ve bu analitik cihazlar yardımıyla, dizi seçimli hibridizasyon olayları, doğrudan guanin/adenin yükseltgenme sinyali üzerinden (44,47,140,143), ya da DNA bazları ile kompleks oluşturan bazı antibiyotikler, metal kompleksleri gibi elektroaktif hibridizasyon indikatörleri kullanılarak (24,48,55,58,68,76,82,102,118) tayin edilebilir.

22 6 Manyetik partiküllere dayalı etkin ayırma ve elektrokimyasal sensörlerinin birlikte kullanıldığı çift tabaka tekniklerinin kullanımına, son 10 yıldır artan bir ilgi bulunmaktadır (44,108,123,138,140,143,145). Bu çalışmalarda kullanılan partiküller, paramanyetik partiküller olup, sıvı fazdan küçük bir mıknatıs yardımıyla kolayca ayrılabilmekte ve mıknatıs çözeltiden uzaklaştırıldığında, partiküller sıvı faz içinde tekrar kolayca dağılabilmektedir (44,108). Dizi seçimli DNA hibridizasyonu, enzimle işaretli (108,138) ve herhangi bir işaretlemenin olmadığı sistemlerde (46,143), ya da metal nanopartiküllerle kombine tasarımlanmış manyetik partiküllere dayalı elektrokimyasal sensörler (123,140) ile etkin manyetik ayırma sayesinde ve düşük tayin sınırları içersinde analiz edilebilmektedir. Wang ve arkadaşları tarafından, manyetik partiküllere dayalı bir yöntemle göğüs kanseri genindeki 1 no lu mutasyonun (BRCA1) elektrokimyasal tayinine yönelik bir sensör teknolojisi rapor edilmiştir (143). Wang ve arkadaşlarının bir diğer çalışmasında ise aynı genin elektrokimyasal tayini, streptavidin-alkalen fosfataz enzimine dayalı biyomanyetik yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir (138). Antitümör etkili bir antibiyotik ilaç olan Echinomisin (ECHI) (131) bisinterkalasyon ile çift sarmal ve tek sarmal DNA (dsdna ve ssdna) ile etkileşmesi, damlayan civa elektrodu (HMDE) ile incelenmiştir (64). Jelen ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilen bu çalışmada (64), dsdna ve ssdna varlığında ölçülen ECHI indirgenme sinyalleri arasında anlamlı bir farklanma olduğu, dolayısıyla ECHI nin, DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayininde kullanılabilecek ümit verici bir indikatör olabileceği rapor edilmiştir. Karadeniz ve arkadaşları tarafından, altın elektrot yüzeyine tutturulmuş kısa DNA dizilerine dayalı hibridizasyonun tayininde, ECHI nin hibridizasyon indikatörü olarak

23 7 kullanılabilirliği başarıyla gösterilmiştir. Bu çalışma, literatürde bir çok çalışmada hibridizasyon indikatörü olarak kullanıldığı rapor edilen [Co(phen) 3 ] 3+ (23) varlığında, aynı deneysel koşullarda tekrarlanmış ve elde edilen sonuçlar birbiriyle karşılaştırıldıktan sonra, ECHI nin bir hibridizasyon indikatörü olarak üstünlükleri ortaya konulmuştur (76). Çalışmamızın ikinci bölümünde, streptavidin-biotin etkileşmesine dayalı manyetik partiküllerin yüzeyinde DNA hibridizasyonu, hem elektroaktif indikatör olan ECHI nin sinyali, hem de guanin ve adenin sinyallerinin DPV tekniği kullanılarak ölçülmesiyle gerçekleştirildi. Manyetik partiküllere dayalı elektrokimyasal hibridizasyon tayini, literatürde ilk defa ECHI ye ait yükseltgenme sinyali üzerinden bu çalışmada gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, tek kullanımlık grafit elektroda ve biyomoleküler algılamaya dayalı geliştirilen sensör teknolojisinde, DNA hibridizasyon tayini için izlenen ECHI, guanin ve adenin e ait yükseltgenme sinyallerinin aynı ölçüm aralığında gösterilmesi ilk defa çalışmamızda gerçekleştirilmiştir ve literatürde bu konuda bir kayda rastlanılmamıştır. Öncelikle, ECHI nın elektrokimyasal davranışı grafit elektrot kullanılarak dönüşümlü voltametri tekniği ile incelendi. DNA hibridizasyonunun tayinindeki seçimlilik, hedef dizi yerine, rastgele dizi (NC) ve bir bazı hedeften farklı dizi (MM) kullanılmasıyla araştırıldı. Nanopartikül, nanotüp ve nanokablolar gibi gelişmiş fizikokimyasal özelliklere sahip nanomalzemeler, elektrokimyasal sensörlerin daha seçici ve daha hassas bir şekilde geliştirilebilmesi açısından büyük önem taşımaktadır (16,24,46,48,55,58,68,73,82,85,89,90,96,102,118,120,153). Sensörlerin çevirici kısımlarının karbon nanotüp (CNT) gibi nanomalzemelerle tasarımı sonrasında, genişletilmiş yüzey alanına sahip olması, elektron transferinin hızlı olması ve

24 8 uzun ömürlü olması nedeniyle, geliştirilen CNT e dayalı elektrokimyasal sensörün DNA analizlerine yönelik kullanımı, giderek yaygınlaşmaya başlamıştır. (46,55,82,90,109,130,144). BRCA1 DNA geninin elektrokimyasal tayini, Wang ve arkadaşları tarafından (144), çok duvarlı CNT (MWCNT) modifiye edilmiş camsı karbon elektrot (GCE) kullanılarak, 100 fmol gibi düşük bir tayin sınırı ile gerçekleştirimiştir. Nükleik asitlerin elektrokimyasal tayini, karbon nanotüp pasta elektrodu kullanılarak gösterilmiştir (111). Ayrıca, yüksek hassasiyet ve düşük maliyete sahip CNT modifiye edilmiş kalem grafit elektrot (CNT-PGE) tasarımı, literatürde ilk defa Erdem ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiş (46) ve bu çalışmada, elektrokimyasal DNA analizi ile birlikte dizi seçimli DNA hibridizasyonu herhangi bir indikatör kullanılmaksızın, guanin sinyalindeki değişim izlenerek başarıyla tayin edilmiştir. Son yıllarda tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrotlar çok yaygın şekilde kullanım alanı bulmuştur. Özellikle DNA biyosensör teknolojisinin geleceği olan DNA mikroçip teknolojisine uygulanabilirliği açısından oldukça başarılı sonuçlar veren bu elektrotlar geleceğin elektrotları olarak gösterilmektedir (21). Perde baskılı elektrotların tekrarlanabilir sonuçlar vermesi ve µl gibi çok düşük miktarlarda örnek kullanılması gibi avantajlarının yanında, diğer elektrotlara kıyasla uzun fabrikasyon süresi ve yüksek maliyete sahip olması gibi dezavantajları bulunmaktadır. MWCNT modifiye perde baskılı elektrot (SPE) ile tek sarmal DNA (ssdna) ve maya trna sının elektrokimyasal tayini, Ye ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir (154). Ayrıca diğer bir çalışmada, SWCNT-SPE ye dayalı amperometrik glukoz biyosensörü tasarımlanmıştır (121).

25 9 Çalışmamızın son bölümünde, herhangi bir elektroaktif indikatör kullanılmaksızın DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini, karbon nanotüp modifiye perde baskılı elektrotlar (MWCNT-SPE) ile gerçekleştirildi. MWCNT- SPE yüzeyinin mikroskobik karakterizasyonu, DNA yokluğunda ve varlığında incelendi. Elektrot yüzeyine optimum konsantrasyondaki DNA nın immobilizasyonu incelemek için, amino ile işaretlenmiş DNA prob konsantrasyon farklılığının yanıt üzerindeki etkisi araştırıldı. Dizi seçimli hibridizasyonunun CNT e dayalı elektrokimyasal sensör teknolojisine yönelik bir uygulamasını göstermek amacıyla, Hepatit B virüsünü (HBV) temsil eden spesifik kısa DNA dizileri (oligonükleotitler) kullanıldı. Çok az bir örnek ile MWCNT-SPE yüzeyinde gerçekleştirilen HBV DNA hibridizasyonun tayini, HBV prob ile hedef dizi arasındaki hibridizasyon sonucunda guanin yükseltgenme sinyalinin, DPV tekniği ile ölçülmesiyle gerçekleştirildi. Ayrıca, tayin sınırı, seçimlilik ve tekrarlanabilirlik gibi deneysel parametreler incelendi. Tek kullanımlık grafit elektrot sistemine dayalı çalışmamızın birinci bölümünde, gümüş nanopartiküller ile işaretlenmiş DNA nın tayini, ikinci bölümünde manyetik partiküller kullanılarak indikatörlü ve indikatörsüz DNA hibridizasyonu tayini, ve çalışmamızın karbon nanotüp modifiye perde baskılı elektrot sistemine dayalı üçüncü bölümünde, HBV DNA hibridizasyonunun indikatörsüz olarak elektrokimyasal tayini gerçekleştirildi. Tez çalışmamızda farklı elektrokimyasal sensör teknolojileri ile biyomoleküler algılamaya yönelik uygulamaları, çift sarmal DNA (dsdna) ve kısa DNA dizileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Böylece gelecekte kimya, malzeme bilimi, moleküler biyoloji vb. birçok bilim alanın kapsamında; kısacası,

26 10 multidisipliner bir alanda tasarımlanabilecek ve kullanabilecek sensör teknolojisine katkı sağlanabilmesi amaçlanmıştır. Malzeme biliminin ürettiği ve güncel uygulamalar olarak literatürde karşımıza çıkan nanopartiküller, manyetik partiküller ve karbon nanotüplerin elektrokimyasal sensör teknolojisine getirdiği avantajlar kullanılarak; (1) boyutları küçültülerek hassasiyetleri arttırılmış olan malzemelere dayalı elektrokimyasal sensör teknolojilerinin tasarım ve uygulamalarını göstermek ve (2) multidisipliner alanda araştırma yapacak araştırmacılara kaynak oluşturacak bir tez çalışması hedeflenmiştir. Çalışmamızda tasarımlanan biyomoleküler algılamaya yönelik elektrokimyasal sensör teknolojisinin hazırlık aşamasının kolay olması, güvenilir ve seçimli sonuçlar vermesi, kullanılan malzemenin özelliği sebebiyle küçültülmeye ve seri üretime uygulanabilir olması sebebiyle, gelecekte piyasaya sürülecek DNA çip teknolojisine öncülük edeceği ümit edilmektedir.

27 11 GENEL BİLGİLER 1. ELEKTROKİMYA Madde ile elektrik enerjisi arasındaki etkileşmeyi, bu etkileşimin sonucunda oluşan kimyasal enerjinin fiziksel enerjiye dönüşümü gibi kimyasal ve fiziksel değişimleri inceleyen bilim dalı, elektrokimya olarak tanımlanır (1). Elektrokimyasal tepkimeler, yükseltgenme-indirgenme türü tepkimelerdir, elektron transferi söz konusudur ve elektrokimyasal hücre adı verilen bir hücrede yürütülür. Analizi yapılacak çözelti, bir elektrokimyasal hücrenin parçası olduğunda çözeltinin elektrokimyasal özelliklerine dayanan bir grup kantitatif analitik yöntemin incelenmesi elektroanalitik kimya nın kapsamına girmektedir. Elektroanalitik teknikler çok düşük tayin sınırlarına ulaşabilirler ve elektrokimyasal yöntemlerin uygulanabildiği sistemler hakkında, bilgileri de içeren çok fazla sistemi karakterize eden bilgiler verirler. Elektroanalitik yöntemler diğer analiz yöntemlerine göre bazı üstünlüklere sahiptirler. Birincisi, elektrokimyasal ölçümler çoğu kez bir elemente, moleküle veya tepkime sonunda oluşan ürüne özel bir yükseltgenme basamağı için spesifiktir. Elektroanalitik yöntemlerin ikinci bir önemli üstünlüğü de, kullanılan cihazların nispeten ucuz olmasıdır (1, 14). Bir elektrokimyasal tepkimenin oluşabilmesi için, incelenen maddeyi içeren bir çözelti, maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrot sistemi ve bu elektrotları birbirine bağlayan bir çevirim sistemi gereklidir. Çözelti olarak elektriksel iletkenliği sağlamak amacıyla tampon çözelti kullanılır. Çeşitli elektrolitik yöntemler ile doğru akım (DC), diferansiyel puls (DPV), dönüşümlü

28 12 voltametri (CV) vb. de belirli potansiyel aralığında tarama yapılarak meydana gelen akım şiddeti ölçülür. Akım, difüzyona bağlı olarak oluştuğundan dolayı burada ölçülen difüzyon akımıdır. Difüzyon, elektrot yüzeyinin yakınındaki difüzyon tabakasında oluşur ve akımın şiddeti, difüzyon hızı ile doğru orantılıdır Elektrokimyasal Tabakalar Elektrokimyasal ölçüm yapılırken elektrot yüzeyi ile analizlenecek örnek çözeltisi arasında heterojen tabakalar meydana gelmektedir. Bunun nedeni, elektrot, kendisine bitişik olan çözelti tabakasındaki bir türe elektron verebilmesi veya o tabakadan elektron alabilmesidir. Genel olarak karıştırılan sistemlerdeki heterojen tabakaların bileşimi Şekil 1 de görülmektedir: Şekil 1: Elektrot yüzeyindeki tabakaların şematik olarak gösterilmesi.

29 13 Türbülent akış tabakası: Elektrottan uzak çözelti yığınında gözlenir. Laminar akış bölgesi: Yüzeye yaklaştığında bir laminer akışa geçiş olur. Laminar akışta sıvı tabakaları elektrot yüzeyine paralel bir yönde birbiri üzerine kayarlar. Nernst difüzyon tabakası: Elektrot yüzeyinden δ cm uzakta, laminer akımının hızı sıvı ile elektrot arasındaki sürtünmeden dolayı sıfıra yaklaşır ve bunun sonucunda da elektrot çevresindeki ince, durgun bir çözelti tabakası oluşur. Genellikle bu çözelti tabakası, cm kalınlığında olabilir Elektrokimyasal Tabakaların Elektriksel Olarak İncelenmesi Elektroda pozitif bir potansiyel uygulandıktan hemen sonra eğer elektrodun yüzeyinde reaksiyona girebilecek aktif bir tür yoksa, hızlı olarak sıfıra düşecek anlık bir akım dalgası oluşacaktır. Bu akım her iki elektrodun da yüzeyinde bir negatif yük fazlalığı (veya eksikliği) yaratan bir yükleme akımıdır. Fakat, iyonik hareketliliğin bir sonucu olarak elektrotlara bitişik olan çözelti tabakalarında derhal bir zıt yüklenme oluşur. Bu etkileşim Şekil-2a da gösterilmektedir. Elektrodun yüzeyinde, uygulanan pozitif potansiyelin bir sonucu olarak pozitif yük fazlalığı oluşmuştur. Yüklü çözelti tabakası iki kısımdan oluşmaktadır : 1- bir yoğun iç tabaka (d 0 dan d 1 e), bu tabakada elektrot yüzeyinden uzaklaşıldıkça ortaya çıkan potansiyel mesafe ile doğru orantılı olarak azalır, 2- bir difüze tabaka (d 1 dan d 2 e), burada elektrot yüzeyinden uzaklaşıldıkça ortaya çıkan potansiyel üstel olarak azalır (Şekil-2b). Elektrot yüzeyindeki ve yüzeye bitişik çözeltideki bu yük topluluğu bir elektriksel çift tabaka olarak adlandırılır.

30 14 Şekil 2: Elektrot yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabaka 1.3. Elektrokimyasal Bir Olayda Kütle Aktarım Yolları Bir elektrokimyasal hücrenin çalışması sırasında maddenin elektrot yüzeyine aktarım yolları üç şekilde gerçekleşmektedir (115). Bu kütle aktarım yolları: 1- Elektriksel göç (MİGRASYON): Elektriksel alanın etkisi ile oluşan bir aktarım yoludur. 2- Karıştırma (KONVEKSİYON): Karıştırma veya titreştirme sonucunda oluşan kütle aktarım yoludur. 3- Difüzyon: Elektrot yüzeyindeki sıvı filmi ile çözelti arasındaki konsantrasyon farklarından kaynaklanan bir kütle aktarım yoludur. Deneysel koşullara bağlı olarak bunlardan bir tanesi veya birkaçı kütle aktarımına katkıda bulunabilir.

31 15 Şekil 3: Elektrokimyasal bir olayda kütle aktarım yollarının şema ile gösterilmesi Elektroanalitik Yöntemler Çok çeşitli elektroanalitik yöntemler önerilmektedir. Bunlardan en yaygın kullanılanlar aşağıda gösterilmektedir. Bu yöntemler ara yüzeyde gerçekleşen yöntemler ve tüm analiz ortamında gerçekleşen yöntemler olarak ikiye ayrılırlar. Ara yüzeylerde gerçekleştirilen yöntemlerin daha genel bir kullanım alanı vardır. Ara yüzey yöntemleri, elektrot yüzeyleri ve bu yüzeylere hemen bitişik olan ince çözelti tabakası arasındaki ara yüzeyde oluşan olaylara dayanmaktadır. Tüm analiz ortamı yöntemleri aksine çözeltinin tamamında oluşan olaylara dayalıdır ve ara yüzey etkilerinden kaçınmak için her yola başvurulur.

32 16 Ara yüzey yöntemleri, elektrokimyasal hücrelerin akımın varlığında veya yokluğunda işleyişine göre statik ve dinamik olmak üzere iki ana sınıfa ayrılırlar Voltametri ve Esasları Elektroda uygulanan gerilimin bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesine dayanan elektrokimyasal yönteme voltametri denir (1). Uygulanan gerilimin ölçülen akım değerlerine karşı çizilen grafiğine voltamogram denir. Voltametride, herhangi bir maddenin elektrokimyasal davranışını incelemek için elektroda uygulanabilecek gerilim aralığının sınırları, kullanılan çalışma elektrodunun ve kullanılan çözücü ve elektrolit türlerine bağlıdır. Tarihsel olarak, voltametri Çekoslavak kimyacı Jaroslav Heyrovsky tarafından 1920 lerin başında geliştirilen ve voltametrinin özel bir tipi olan

33 17 polarografi tekniğine dayanarak geliştirilmiştir (1). Voltametrinin hala önemli bir kolu olan polarografinin diğer voltametrik tekniklerden en büyük farkı, çalışma elektrodu olarak bir damlayan cıva elektrodun (DCE) kullanılmasıdır. Voltametri, inorganik, fiziko ve biyokimyacılar tarafından çeşitli ortamlarda oluşan yükseltgenme ve indirgenme işlemlerinin incelenmesi, yüzeydeki adsorpsiyon işlemlerinin araştırılması ve kimyasal olarak modifiye edilmiş elektrot yüzeylerinde gerçekleşen elektron aktarım mekanizmalarının aydınlatılması gibi analitik olmayan amaçlar için de oldukça yaygın bir şekilde kullanılmaktadır Voltametride Kullanılan Uyarma Sinyalleri Elektrokimyasal hücreye değiştirilebilir potansiyelde sinyaller uygulanır. Bu uyarma sinyalleri, karakteristik akım cevaplarını oluşturur (1). Voltametride en çok kullanılan dört uyarma sinyalinin şekli, şekil 4 de verilmiştir. Bunlar; doğrusal taramalı, diferansiyel puls, kare dalga ve üçgen dalgadır.

34 Şekil 4: Voltametride kullanılan potansiyel uyarma sinyalleri. 18

35 Voltametrik Cihazlar Voltametrik analizde kullanılan sistem, elektrokimyasal hücre, analizlenecek madde ve destek elektrolit adı verilen çözelti içersine daldırılmış üç elektrottan oluşan sistemin potensiyostata bağlanmasıyla hazırlanmıştır. Şekil 5: Üçlü elektrot sistemi içeren potansiyostatın şematize edilmesi.

36 20 Şekil 6: Üçlü elektrot sisteminin şematize edilmesi. Üçlü elektrot sistemi, çalışma elektrodu, referans elektrot ve yardımcı elektrottan oluşmaktadır. 1) Çalışma elektrodu: Yüzeyinde analizlenecek maddenin yükseltgendiği veya indirgendiği elektrottur. Biyosensör tasarımında çalışmanın amacına göre değişkenlik gösterebilir. 2) Referans elektrot: Referans elektrot, potansiyeli deney süresince sabit kalan bir elektrottur. Ag/AgCl referans elektrot veya doygun kalomel elektrot (DKE) kullanılabilir. 3) Yardımcı elektrot: Pt bir tel veya bir civa havuzu şeklinde olan ve elektriğin çözelti içinden çalışma elektrotuna aktarılmasını sağlayan karşıt elektrottur. Bu elektrot, çalışma elektrotu ile bir çift oluşturan, fakat ölçülen potansiyelin büyüklüğünün tayininde rol oynamayan bir elektrottur.

37 Voltametride Kullanılan Referans Elektrodlar (Karşılaştırma Elektrotları) Çalışılan çözeltinin bileşimine duyarsız olan ve elektrokimyasal çalışmalar sırasında potansiyeli dış ortamdan etkilenmeyen elektrotlardır (1,49,112,115,122). Elektrokimyada ilk olarak Standart Hidrojen Elektrot (SHE) referans elektrot olarak kullanılmıştır. Fakat hazırlanması zor bir elektrot olduğu için kullanımı çok yaygın değildir. Kullanılan referans elektrot çeşitleri şunlardır; Kalomel Referans Elektrot: Kalomel (Hg 2 Cl 2 ) ve metalik civadan oluşmuş bir karışım ve KCl çözeltisinden oluşur. Bu elektrodun potansiyeli, klorür iyonlarının aktifliğine bağlıdır. Hazırlanışı çok kolaydır. En yaygın olan ve içersinde doygun KCl çözeltisi bulunan Doygun Kalomel Elektrot (DKE) tur. Potansiyeli, Standart Hidrojen elektroduna (SHE) göre 25 0 C de + 0,244 V olarak bulunmuştur. Diğer kalomel elektrotlara oranla sıcaklık katsayısı daha büyüktür. Gümüş-Gümüş Klorür Referans Elektrot: En yaygın kullanılan referans elektrotlardan biri olan gümüş-gümüş klörür referans elektrot, bir gümüş telin, elektrolitik yoldan AgCl ile kaplanması ile klorür iyonu içeren bir çözeltiye daldırılarak ile elde edilir. Doygun KCl çözeltisi kullanıldığı zaman standart hidrojen elektroduna göre potansiyeli, +0,222 V dur.

38 22 Civa-Civa(1)Sülfat Referans Elektrot: Bu elektrot, doygun kalomel elektroda benzemektedir. Potansiyeli, sülfat iyonlarının aktifliği ile belirlenir. Bir referans elektrot, kolay hazırlanabilmeli, potansiyelin sıcaklıkla değişim katsayısı küçük olmalı, belli bir akım aralığında tersinir davranmalı; yani içinden küçük akımlar geçtiğinde bile gerilimi sabit kalmalıdır. Polarize edilemeyen bir elektrot olmalı, potansiyeli zamanla değişmemeli, doğru ve tekrarlanabilen bir potansiyel değeri hızlı bir şekilde okumalıdır Voltametride Kullanılan Çalışma Elektrotları Çalışma elektrodunun yapımında kullanılan iletken malzeme, platin ya da altın gibi inert bir metal; karbon, pirolitik grafit ya da camsı karbon; kalay oksit ya da indiyum oksit gibi yarı-iletken veya bir civa filmi ile kaplanmış bir metal olabilir. Bu elektrotlar çeşitli şekil ve büyüklükte olabilmektedirler ve biyosensör tasarımı için en uygun şekilde geliştirilmektedirler. Bu tür elektrotların kullanıldığı potansiyel aralığının tespiti çok önemlidir. Özellikle de bu potansiyel aralığı, sulu çözeltilerde sadece elektrot malzemesine değil, aynı zamanda bu elektrotların daldırıldığı çözeltinin bileşimine bağlı olarak da değişir. Pozitif potansiyel sınırları genellikle moleküler oksijen verecek şekilde, suyun yükseltgenmesi sonunda oluşan büyük akımlarca belirlenir. Negatif potansiyel sınırları yine suyun indirgenmesi sonunda oluşan hidrojenden kaynaklanır.

39 23 Şekil 7: Kullanılan çalışma ortamına göre çalışma elektrotları için seçilen potansiyel aralıkları Karbon Elektrotlar Karbon elektrotlar, özellikle çok ucuz olmaları ve geniş bir potansiyel aralığında çalışma yapılmasına olanak verdiğinden dolayı elektrokimyasal analizlerde sık kullanılır. Ancak, karbonun yüksek bir yüzey aktivitesi vardır ve bu nedenle organik bileşikler tarafından kolayca kirletilebilir. Hidrojen, hidroksil ve karboksil grupları ve hatta kinonlar karbon yüzeyinde bağlar oluşabilmektedir. Bu fonksiyonel grupların varlığı nedeniyle karbon yüzeyine birçok değişik madde tutturulabilir. Elektrokimya alanında çok önemli olan karbon elektrotlarının tüm çeşitlerinde yüzeylerinin düzgün bir şekilde hazırlanması gereklidir.

40 24 Karbon elektrotların çeşitleri: Karbon Pastası Elektrodu (CPE): Grafit tozunda bulunan karbon moleküllerinin düzlemsel ve aromatik halkalar halinde dizilimi Şekil 8' de görülmektedir. Zayıf π bağları ile birbirine bağlanmış olan bu tabakalar arasında hızlı bir elektron alışverişi olabilmektedir. Şekli 9 bir karbon pasta elektrodunun genel gösterimidir. CPE, ucuz olması, yüzey yenilenmesinin kolay olması, düşük artık akımlar oluşturması nedeniyle tercih edilmektedir. Bağlayıcı madde olarak, Nujol (mineral yağ), parafin yağı, silikon yağı ve bromonaftalen kullanılmaktadır. Elektrot aktivitesine pasta bileşiminin büyük etkisi vardır. Bağlayıcı organik sıvı oranı arttıkça, elektron transfer hızı azalmaktadır. Önemli bir sakınca olarak CPE, organik madde içeren bir çözeltiye daldırıldığı zaman karbon pastası çözeltide dağılabilir. (18,106,119). Şekil 8: Grafit tozunda bulunan karbon elektrodu. Şekil 9: Karbon pastası moleküllerinin dizilimi.

41 25 Perde baskılı karbon (grafit) elektrotlar (SPCE): Son yıllarda tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrotlar çok yaygın şekilde kullanım alanı bulmuştur. Özellikle DNA biyosensör teknolojisinin geleceği olan DNA mikroçip teknolojisine uygulanabilirliği açısından oldukça başarılı sonuçlar veren bu elektrotlar geleceğin elektrotları olarak gösterilmektedir (21). Tek kullanımlık bu elektrotların iyi tekrarlanabilirliğe sahip olması ve µl gibi çok düşük miktarlarda örnek kullanılması gibi avantajlarının yanında, diğer elektrotlara kıyasla uzun fabrikasyon süresi ve yüksek maliyete sahip olması gibi dezavantajları bulunmaktadır. Şekil 10: Perde baskılı karbon (Grafit) elektrot. Kalem Grafit Elektrot (PGE): Grafit uç içeren kalem elektrodun tekrarlanabilirliğinin daha iyi olması, daha düşük tayin sınırı, ucuz ve tek kullanımlık olması sebebiyle bu elektrodun kullanılmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (74,143).

42 26 Şekil 11: Kalem Grafit Elektrot ve grafit elektrodun yüzeyinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görüntülenmesi Metal elektrotlar: Platin ve altın (21,60,81,98,99) en çok tercih edilen elektrot tipleridir. Bu elektrotlar yüksek elektron transfer kinetiklerine ve geniş bir pozitif potansiyel aralığına sahiptirler. Şekil 12: Altın elektrot.

43 Voltametrik Akımlar Elektrot sistemine gerilim uygulandığında kapasitif akım ve Faradayik akım olmak üzere iki çeşit akım oluşur. 1- Kapasitif akım (i c ) : Bir elektrodun bir elektrolit çözeltisine daldırılması ve negatif yükle yüklenmesiyle çözeltideki pozitif yüklü iyonlar elektroda doğru çekilir. Böylece ara yüzeyde bir gerilim farkı oluşur. Ters işaretli yüklerin ara yüzeyin iki tarafında birikmesi ile bu bölgede bir elektriksel çift tabaka oluşur. Oluşan bu çift tabaka, bir kapasitör gibi davranır. Bu kapasitörü yüklemek için ortamda yükseltgenecek veya indirgenecek madde olmasa dahi bir akım oluşur. Bu akım reaksiyona bağlı değildir; sistemden kaynaklanır ki bu akıma kapasitif akım denir. Ne kadar düşük olursa, o kadar duyar ölçüm yapılır. Kapasitif akım fon akımın oluşmasına neden olan etkenlerden biridir. 2- Faradayik akım (i f ): Reaksiyondan kaynaklanan (analiz edilecek maddeden) akımdır. i = i f + i c olduğundan i c azalırsa duyarlılık artar. Genellikle 10-3 M ve üstünde; i c < i f dir ve çalışılabilir M da kısmen iyi sonuç alınır M ve üstünde ; i c >> i f olduğu için çalışılamaz Elektrokimyasal Bir Olayda Faradayik İşlemler Çözelti ve elektrot arasındaki yüzeyden akımın iletimi sırasında, elektrotlardan birinde yükseltgenme reaksiyonları olurken, diğerinde indirgenme reaksiyonu meydana gelir. Bu reaksiyonlarda ; O + ne - R O ve R nin, sırasıyla, redoks çiftinin, yükseltgenmiş ve indirgenmiş şeklini ifade ettiği tepkime ile gösterilmektedir. Termodinamik kurallarla kontrol edilen sistemlerde, elektrot potansiyeli, elektroaktif türün elektrot yüzeyindeki

44 28 derişiminin [C o (0,t) ve C R (0,t)], Nernst Denklemine (eşitlik 1.1) göre saptanmasında kullanılabilir. (1.1) E 0 = Redoks tepkimesi için standart potansiyel R = Gaz sabiti (8.314 JK -1 mol -1 ) T = Sıcaklık ( 0 K) n = Reaksiyonda transfer edilen elektron sayısı F = Faraday sabiti (96487 coulombs) Elektrot ara yüzeyinde meydana gelen redoks tepkimesi sırasında akım, elektronların doğrudan aktarımı yoluyla iletilir. Bir elektrottaki kimyasal madde miktarının geçen akımla doğru orantılı olduğunu ifade eden bu tip işlemlere, faradayik işlemler, bu şekilde oluşan akımlara da faradayik akımlar adı verilir. Analizlenecek madde ve ürünlerin konsantrasyonları yalnızca elektrot yüzeyinden uzaklığın bir fonksiyonu olarak ve Nerst tabakası içinde değişir Voltametrik Teknikler Dönüşümlü Voltametri Bu teknikle, gerilimin bir fonksiyonu olarak akım ölçülür. Sürekli değişen potansiyel değerlerine karşı belirli bir aralıkta akımdaki değişim grafiğe geçirilerek dönüşümlü voltamogram elde edilir. Dönüşümlü voltametri ile durgun sistemde ve üçlü elektrot sistemiyle çalışılır. Burada hızı difüzyon tayin eder. Analitin yükseltgenmesi ve indirgenmesi voltamogramda

45 29 gözlenebilmektedir. İlk olarak, potansiyel bir maksimuma kadar artar, daha sonra başlangıç değerine yine doğrusal olarak geri döner. Şekil 13: (a) Dönüşümlü voltametride elektroda uygulanan gerilimin zamana karşı grafiği ; (b) Dönüşümlü voltametride elde edilen akım-gerilim eğrisi. Doğru akımdaki gibi kapasitif akımın en küçük olduğu bölgede çalışılır. Duyarlılık 10-5 M ile sınırlıdır. Dönüşümlü voltametri, miktar tayini için uygun bir yöntem değildir, analizlenecek maddenin hangi potansiyelde nasıl davrandığı hakkında bilgi verir. Dönüşümlü voltamogramların şekli ve yapısında, seçilen potansiyel aralığının yanısıra, seçilen tarama hızının ve kaç defa tarama yapıldığının da etkisi vardır. Bir dönüşümlü voltamogramdaki indirgenme ve yükseltgenme arasındaki gerilim farkı E p ile ifade edilir. 57 E p = n mv

46 30 E p bu değere ne kadar yakın ise, tepkime reversible (tersinir); ne kadar uzaksa irreversible (tersinmez) olarak adlandırılır Diferansiyel Puls Voltametrisi Bu teknikle, yarı-dalga potansiyelleri 0,04 0,05 V kadar farklı olan maddeler için bile birbirinden farklı konumlarda pik maksimumları elde edilebilmektedir. Diferansiyel puls polarografisi, çok duyarlı bir yöntemdir ve tayin sınırı M arasındadır. 10 mv'luk veya 50 mv'luk bir puls civa damlasına uygulanır. Uygulanan pulsun belli bir zaman öncesi ve sonrasında, puls başına elde edilen akımdaki fark ( i), doğrusal olarak artan potansiyelin fonksiyonu olarak kaydedilir. Gözlenen diferansiyel eğri pik şeklinde olup, yüksekliği konsantrasyonla doğru orantılıdır.

47 31 Şekil 14: Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri; (a) Analog cihazlarda diferansiyel puls voltametrisi için kullanılan uyarma sinyali; (b) Diferansiyel puls voltametrisinde elde edilen bir voltamogram. Faradayik akımın yüksek, faradayik olmayan yükleme akımının ise düşük değerde olması duyarlılığın artmasıyla açıklanabilir. Örneğin potansiyel aniden 50 mv arttırıldığında, elektrodu çevreleyen yüzey tabakasında, eğer elektroaktif bir tür varsa, analizlenecek madde konsantrasyonunu yeni potansiyel tarafından istenen seviyeye düşürecek bir akım artışı gözlenir. Ancak bu potansiyel için gerekli olan denge konsantrasyonuna erişilince, akım difüzyonu karşılayacak bir seviyeye düşer ki buna difüzyon kontrollü akım denir. Puls polarografisinde akım ölçümü, bu akım artışı tamamen sona ermeden önce yapılır. Toplam akım, difüzyon akımından büyüktür. Damla değiştiğinde, çözelti yeniden analizlenecek madde yönünden homojen hale gelmektedir.

48 32 Gerilim pulsu ilk uygulandığı zaman damla üzerinde yük artışı nedeniyle faradayik olmayan akımda da bir dalgalanma olur. Bu akım zamanla azalır ve yüzey alanının çok az değiştiği damla ömrünün sonuna doğru sıfıra yaklaşır. Dolayısıyla akımı bu anda ölçmek suretiyle faradayik olmayan artık akım büyük oranda azaltılır ve sinyal/gürültü oranı artar. Bunun sonucunda duyarlılık da artar. Elektrokimya nın pek çok uygulama alanı vardır. Bunlardan biri Biyosensörlerdir. 2. BİYOSENSÖR Biyosensörler, biyolojik tepkimelerde hedef maddeleri algılamak için kullanılan küçük cihazlardır. Birbiri içine geçmiş biri biyokimyasal, diğeri elektrokimyasal özellikteki iki çeviriciden oluşmaktadır. Biyokimyasal kısmın görevi analizlenecek maddeyle etkileşerek onu tanımaktır. Bu tanıma olayının sonucunda bir biyokimyasal ürün de oluşabilmektedir. Biyosensörün ikinci kısmı olan elektrokimyasal kısım ise bu tanıma olayını ölçülebilir bir sayısal değere çevirmekle görevlidir (20,26,129). Şema 1: (I) Biyosensör yapısının şematize edilmesi ve (II) biyosensör yüzeyinde gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonların gösterilmesi.

49 Biyosensör Çeşitleri 2.2. İdeal Bir Biyosensörün Sahip Olması Gereken Özellikler İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler aşağıda sıralanmaktadır (59). Seçicilik: İdeal bir biyosensörde en önemli parametrelerden birisi, seçicilik özelliğidir. Eğer yeterli seçicilik mevcut değilse, bu eksiği giderecek uzun işlemler eklenmesi gerekir. Kullanım ömrü: Biyosensörün kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktör, biyolojik çeviricinin aktivitesindeki azalmadır. Bu durum ayrıca, biyosensörün kalibrasyon sıklığı, stabilite, tekrarlanabilirlik gibi diğer parametreleri de etkilemektedir. Kalibrasyon gereksinmesi: İdeal bir biyosensörün hiç kalibrasyona gerek duymaması, ya da en az kalibrasyona gereksinmesi istenir. Fakat bu özellik, teorikte planlandığı gibi değildir, pratikte gerçekleştirilememiştir. Kullanım ömürleri boyunca biyosensörler, sıklıkla kalibre edilmelidirler.

50 34 Tekrarlanabilirlik: İdeal bir biyosensör için, elektrodun aynı koşullar altında arka arkaya yapılan ölçümlerde hemen hemen aynı değerlerin okunması istenir. Pratikte pek mümkün olmayan bu durum göz önüne alınarak, yapılan çalışmalarda tekrarlanabilirlik parametresi mutlaka incelenmelidir. Tekrarlanabilirlik ne kadar iyi olursa, biyosensörün uygulamalarının o denli iyi olduğundan söz edilebilir. Kararlılık: Elektrot kararlılığının yüksek olması ideal biyosensörler için gereklidir. Kararlılık, kullanılan biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığına bağlıdır; ayrıca ph, ısı, nem, ortamdaki oksijen konsantrasyonu gibi parametrelerden de etkilenmektedir. Yüksek duyarlılık: Biyosensöre immobilize edilmiş biyolojik materyalin yalnız belirli maddelere karşı duyarlı olması, ideal biyosensörlerin özelliklerindendir. Yeterli düzeyde tayin sınırı: Tasarlanan bir biyosensörün tayin sınırının belirli bir konsantrasyon değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu sınır, elektrot yüzeyinin büyüklüğü, biyolojik materyalin tayin edilecek maddeye afinitesi, immobilize edilen madde miktarı gibi faktörlerden etkilenir. Geniş ölçüm aralığı: Biyosensör uygulamalarında ölçüm aralığı olarak adlandırılan bölge biyosensörlerden alınan akım-konsantrasyon eğrilerinin lineer olduğu konsantrasyon aralığıdır. Hızlı cevap zamanı: Bir biyosensör elektrodunun cevap zamanı elde edilen akım-zaman eğrilerinden anlaşılabilir. Örneğin elde edilen eğride basamakların şekli basık ve genişse cevap zamanı uzun (yavaş), tersi söz konusu ise cevap zamanı kısa (hızlı)'dır.

51 35 Hızlı geriye dönme zamanı: Geriye dönme zamanı, örneğin amperometrik çalışmalarda, ilk örnekten ne kadar süre sonra ikinci örneğin ölçülebileceğini belirler. Yani ilk örneğin ilavesinden sonra sabit akım değerleri kısa sürede gözlenebiliyorsa, ikinci örnekte aynı süre sonra ilave edilebilecektir. Basitlik ve ucuzluk: Tasarımı basit ve ucuz, kullanımı rahat biyosensörler ideal biyosensörlerdir. Bu nedenle ilk biyosensörlerdeki karmaşık ve de pahalı olan yapılar, daha sonra basitleştirilmiş ve mümkün olduğunca da ucuzlaştırılmıştır. Küçültülebilirlik ve sterilize edilebilirlik: Elektrotlarının sterilize edilebilmesi ve boyutlarının küçültülmesi biyosensör tasarımında önemlidir. Buna karşın, biyosensör yapısına giren biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığı, sterilizasyonu kısıtlayan en önemli parametredir Biyosensör Tasarımında Kullanılan Moleküller ve Yapıları Nükleik Asitler ve DNA Nükleik asitlerin primer yapısı, belirli tür ve sayıdaki nükleotidlerin belirli bir diziliş sırasına göre 3'-5' fosfodiester bağları ile birbirlerine bağlanarak polinükleotid zinciri oluşturmaları sonucu oluşmaktadır (30-32,114). Molekül içerisindeki nükleotid bağlarını parçalayan nükleaz enzimlerine endonükleaz, iki uçtan parçalayalanlara ise ekzonükleaz adı verilmektedir. DNA (Deoksiribonükleik asit) moleküllerine ait X-ışınları difraksiyon verilerinden ve Chargaff tarafından DNA molekülünde adenin (A) ve timin (T) miktarları ile guanin (G) ve sitozin (C) miktarlarının eşit olduğu belirlenmiştir. Buna dayanarak Watson, Crick ve Wilkins tarafından 1950 yıllarında DNA yapısı için çift zincirli heliks şeklindeki yapı modeli önerilmiştir. Bazları arasında yer alan hidrojen bağları tarafından çift sarmal DNA molekülünün iki zinciri birarada

52 36 tutulmaktadır. Çift zincirli sarmalda bazlar sarmal iç kısımda, fosfat ve şeker omurgası ise dış kısımda yer aldığı için, sarmalın iç kısmı hidrofobik, dış kısmı ise hidrofilik özelliktedir. Pürin ve pirimidin nükleotidleri arasındaki eşleşmeler son derece spesifiktir (A-T ve G-C şeklinde). Bu sayede, DNA yapısında yer alan bir polinükleotid zinciri daima ikinci zincirin tamamlayıcısı olduğundan, bir zincirdeki baz dizisi verildiğinde, ikinci zincirdeki baz dizisi bulunabilmektedir. DNA ısıtıldığında, heliks yapısı bozularak ikiye ayrılır. Denatürasyon adı verilen DNA heliks yapısının bozulması 260 nm dalga boyunda absorpsiyon ölçülerek gözlemlenebilmektedir. G ve C arasında üç hidrojen bağı (G C) bulunduğundan yüksek derişimde G ve C içeren DNA, iki hidrojen bağı taşıyan A ve T (A=T) bulunduran DNA yapısına göre daha yüksek sıcaklıkta denatüre olmaktadır. Uygun şartlar altında çift zincirli DNA tekrar oluşabilir, bu işlem renatürasyon olarak isimlendirilir.

53 37 Şekil 15: DNA çift sarmal yapısı Çift sarmal şeklindeki molekülün bir zinciri 5' 3' yönüne doğru, diğeri ise 3' 5' yönüne doğru olduğu için ters yönde paraleldir. Heliks içinde, iki zincirin arasındaki üç boyutlu sistemdeki ilişki, büyük oluk (majör) ve küçük oluk (minör) oluşturmak şeklindedir. Molekülündeki zincirler, çift sarmalın dış yüzeyindedir. Bu zincirlerden her biri kovalent bağlılığı sağlayan fosfodiester köprülerinin bulunduğu fosfat ve pentoz gruplarından oluşmuştur. DNA çift sarmalın her iki zinciri, pürin ve pirimidin bazlarının arasındaki hidrojen bağları ile bir arada tutulmaktadır.

54 38 Şekil 16: DNA yapısında bulunan baz, şeker ve fosfat gruplarının şematize edilmesi. Watson ve Crick tarafından 1953 yılında önerilen ilk DNA yapısı, sağa doğru yönelmiş, her dönüşte 10 nükleotidi bulunan ve küçük oluğa mükemmel yerleşen bağlı su ile stabilize olabilen yapıya sahiptir. DNA dehidrate edildiği zaman, yapısal değişikliğe uğrayarak A-DNA adını almaktadır. A-DNA da sağa doğru yöneliktir ve her dönüşünde 11 nükleotid bulunmaktadır. Çift sarmalın çapı, pentoz gruplarının yapılanmasıyla genişlemektedir. Bu durumun bir sonucu olarak DNA nın boyu kısalmaktadır (32).

55 DNA İle İlgili Bazı Terimlerin Tanımlamaları DNA Baz Dizilerinin Yazılımı İle İlgili Temel Bilgiler: (30) Oligonükleotit: Birden fazla nükleotidin yan yana gelmesiyle oluşur. Dinükleotitler; İki nükleotidin yan yana gelmesiyle oluşur. Trinükleotitler; üç nükleotidin yan yana gelmesiyle oluşur. Tekrarlayan oligonükleotidler: Polimer içindeki tekrarlayan oligonükleotidler, tekrarlayan tek bir bazı, tekrarlayan iki bazı ve ya üç bazı ifade eder. Tekrarlayan mononükleotide poly (A), dinükleotide poly (AT), trinükleotide poly (GAT) örnek verilebilir. Çift sarmal tekrarlayan polimerler: Nokta ile ayrılarak ifade edilen baz çiftlerinden oluşan ve 5 3 polaritesine sahip polimerlerdir. Örneğin, mononükleotit gösterilişine, poly(a).poly(t) (veya poly(da).poly(dt) şeklinde gösterilebilir), dinükleotid e poly(at).poly(at), trinükleotid e poly (GAT). Poly (ATC) örnek verilebilir. Baz çifti: Birbirinin karşılığı olan iki bazı ifade eder ve gösterilirken nokta ile ayrılır. Örneğin, A.T veya G.C baz çiftleri gibi. Prob: Baz dizisi belli olan oligonükleotit. Hedef dizi (Target): Prob dizisinin tam karşılığı olan oligonükleotit. Yanlış eşleşen dizi (Mismatch-MM): Bir bazı veya birden fazla bazı hedef dizisiden farklı olan oligonükleotit. Rastgele dizi (Non complementary-nc): Hedef dizisiden tamamen farklı baz dizilimine sahip oligonükleotit.

56 İnterkalasyon Düzlemsel bir halka sistemine sahip olan bazı maddelerin DNA baz çiftleri arasına yerleşerek, güçlü bir şekilde bağlanması olayıdır (9,50). Maddenin yapısına bağlı olarak, bu etkileşim dönüşümlü ya da dönüşümsüz şekilde gerçekleşmektedir (149). İnterkalasyon, DNA' da zincir kırılmasına yol açarak ve DNA senteziyle DNA' ya bağımlı RNA sentezini bozmaktadır. Bu maddeler Topoizomeraz (II) enzimini inhibe ederler. İnterkalasyon yapabilen bazı ilaçların etki mekanizmaları, bu şekilde açıklanmaktadır. Şekil 17: Düzlemsel yapıya sahip bir molekülün çift sarmal DNA baz çiftleri arasına yerleşmesi (interkalasyon) Nükleik Asit (DNA) Hibridizasyonu: Nükleik asit hibridizasyonu, baz çiftlerinin özel hibridizasyon koşullarına bağlı olarak kararlı bir dupleks molekülü oluşturmasıdır (8).

57 41 Şekil 18: Nükleik asit hibridizasyonu DNA BİYOSENSÖRLERİ (GENOSENSÖRLER, GENE DAYALI SENSÖRLER) Biyosensör tasarımında kullanılan dizi tanıma yüzeyleri, Analitik Kimya alanında yeni ve ilgi çekicidir (106,113,119,133). Bu tür tanıma yüzeyleri, sahip olduğumuz bilinen elektrokimyasal biyosensörlere yeni boyutlar kazandıracak ve gelecekte hasta başında veya doktor gözetimindeki analizlerde önemli bir rol oynayacaktır (133). Tanıma yüzeyi olarak DNA nın kullanıldığı biyosensörlere DNA biyosensörleri (genosensörler; gene dayalı sensörler) adı verilir (92,93,105,110,132). DNA tanıma yüzeyleri, dizisi belli hibridizasyon olaylarının izlenmesinde (81,137) veya bu yüzey ile etkileşime giren analizlenecek maddelerin (karsinojen madeler, ilaçlar, vb.) tayininde kullanılabilir (13,40,41).

58 DNA Biyosensörlerinin sınıflandırılması Günümüze dek tasarımı yapılan genosensörlerde iki temel konu üzerine yoğunlaşma görülmektedir; madde DNA etkileşmesine dayalı genosensörler ve DNA hibridizasyonuna dayalı genosensörler. Kimyasal maddeler veya radyasyon ile DNA nın etkileşmesi, maddelerin DNA ya kovalent bağlanması veya kovalent olmayan bağlanmalar (interkalasyon) ile sonuçlanabilir. Hibridizasyon tanısına yönelik genosensörler ise çeşitli bulaşıcı ve kalıtsal hastalıkların, mutasyonların ve mikroorganizmaların tayininde önemli rol oynamaktadır. Genosensörlerin sınıflandırılması şu şekildedir; A. Madde-DNA etkileşmesine dayalı DNA biyosensörleri İlaç, toksik maddeler vb. gibi bazı kimyasal maddelerin DNA ile etkileşimini inceleyerek ilaç tasarımı, çevresel toksik madde analizleri ve çeşitli kimyasal savaş ajanlarının tayininde kullanılmaktadır. İlaç-DNA etkileşmesine dayalı DNA biyosensörleri İlaç molekülleri ile DNA nın etkileşmesi ve bu etkileşimin tayini (5,28,43,45,75,94,117,125,), elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin uygulama alanına yeni bir boyut getirmiştir. Yeni sentezlenen ilaçların DNA ile etkileşmesinin tayini, kısa sürede ve hassas şekilde biyosensörlerle gerçekleştirilebilmektedir. İlaç molekülünün dsdna ile etkileşimi; negatif yüklü şeker-fosfat grubu ile elektrostatik olarak etkileşim, çift sarmalın büyük ve küçük oluklarına bağlanma veya interkalasyonla olabilmektedir. Özellikle etkisini DNA ya bağlanarak gösteren antikanser ilaçların etki mekanizmasının aydınlatılması mümkün olmaktadır.

59 43 Elektrokimyasal biyosensörlerle yapılan ilaç-dna etkileşmesine dayalı çalışmalarda; (1) DNA ile etkileşen ilacın kendi sinyalindeki değişim ve elde edilen sinyalde bir azalma veya artma gözlenmesi, (2) DNA bazları guanin veya adenin sinyalindeki değişim üzerinden duyarlı bir tayin yapılabilmektedir. Yeni antibiyotik, antiviral, antitümör ilaç ve antisens oligonükleotitlerine dayalı ilaç hedefleme çalışmalarına yön vermek veya bir ilaç hammaddesinin detaylı analizinin duyarlı şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak gibi amaçlarla madde- DNA etkileşmesine dayalı biyosensörler geliştirme çalışmaları devam etmektedir (13,40,41). Antikanser etkili bir ilaç olan Epuribisin in çift sarmal ve tek sarmal DNA ile olan etkileşmesi karbon pastası elektrodu (CPE) ile incelenmiştir (41). Antitümör etkili bir antibiyotik ilaç olan Echinomisin (ECHI) (54,76) nin çift sarmal ve tek sarmal DNA ile etkileşmesi damlayan cıva elektrodu (HMDE) ile incelenmiştir (64). Ayrıca, kısa DNA dizilerine dayalı hibridizasyonun tayininde, ECHI nin hibridizasyon indikatörü olarak kullanılabilirliği altın elektrot kullanılarak araştırılmıştır (76). Antitümör etkili bir antibiyotik ilaç olan Mitomisin C (MC) çift sarmal DNA ile olan etkileşmesi perde baskılı karbon elektrot (SPCE) ve tek kullanımlık kalem grafit elektrot (PGE) ile incelenmiştir (100). Ayrıca, yeni bir ilaç dağıtım sistemi olan mikroemülsiyon içerisine yüklenmiş MC nin çift sarmal DNA ile olan etkileşimi PGE ile incelenmiştir (75). Nanoteknoloji alanındaki yeni gelişmeler ile birlikte ilaç-dna etkileşmesinin tayininde kullanılan elektrokimyasal DNA biyosensörlerinde uygulanmaya başlanmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (46,97,124). Guo ve arkadaşları tarafından, klorpromazin (CPR) ve DNA arasındaki etkileşimin

60 44 elektrokimyasal DNA biyosensörleri ile tayininde MWCNT modifiye edilmiş altın elektrot kullanılmıştır (56). Bir antikanser ilaç olan dakarbazin (DCBN) nin etkileşim tayininde ise titanyum dioksit nanopartiküller kullanılarak elektrokimyasal tayin Song ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir (124). Kanser hücrelerinde berberin adlı ilacın dsdna ile olan etkileşimi, MWCNT kullanılarak perde baskılı elektrotlar (SPE) ile tayin edilmiştir (97). Toksik madde-dna etkileşmesine dayalı DNA biyosensörleri Toprak, su ve hava gibi çevresel örneklerin analizlerinde (25) DNA biyosensörü kullanımı son yıllarda yaygınlaşmaktadır. Toksik etkisi incelenecek madde, DNA ile sensör yüzeyinde veya çözelti bazında etkileşimi sonrasında, elde edilen sinyal farklanmaları incelenmektedir (78). Kimyasal savaş ajanlarının tayinine yönelik biyosensörler Kimyasal silah amacıyla kullanılan maddeler de benzer şekilde biyosensörlerle tayin edilebilir. Özellikle organofosfat bileşimine sahip maddelerin DNA ya verdikleri büyük hasar, biyosensör kullanarak saptanabilmektedir ve bu alanda Wang ve arkadaşları akışa enjeksiyon yöntemi kullanarak nitroaromatik patlayıcılar ve organofosfatlı sinir gazlarının tayinini tek kanal mikroçip sisteminde gerçekleştirmişlerdir (146).

61 45 B. DNA hibridizasyonuna dayalı DNA biyosensörleri DNA hibridizasyon tayini için tasarımı yapılacak biyosensörlerin; hedefteki tek bazdaki farklılığı yakalamaya imkan verecek şekilde seçimliliğe ve düşük tayin sınırına sahip olması gerekmektedir. 1. Bulaşıcı ve kalıtsal hastalıkların tanısına yönelik DNA biyosensörleri İnsan, virüs ve bakteri DNA sının baz dizilimlerinin aydınlatılmasıyla pek çok katılımsal hastalığa sebep olan mutasyonlar artık saptanabilmektedir. Diziye özgü DNA biyosensörleri, bir çevirim sistemi ile beraber DNA probundan oluşmuştur. Tek sarmal kısa oligonükleotit içeren ve aranan hedefin baz dizisinin karşılığı olan problar çözelti içerisinde kendisine seçimli bağlanacak kısmı seçerler ve hibritleşirler (60). Bu bağlanmanın tasarımı yapılan biyosensörlerle kısa sürede ve yüksek duyarlılıkta algılanması mümkün olmaktadır. Elektrokimyasal DNA biyosensörleri kullanılarak gerçekleştirilen elektrokimyasal ölçümlerde hibritin oluştuğu elektrot, bir elektroaktif indikatör ile etkileştirilir ve indikatörün hibrite bağlanma düzeyi belirlenir. Hibridizasyon oluşumundan sonra bu hibritle etkileşen indikatörün neden olduğu artan veya azalan elektrokimyasal yanıt, hibridizasyon tayinine yönelik bir sinyal olarak kabul edilir (79,84,139). Ayrıca çeşitli analizlerde DNA nın elektroaktif bazlarından hareketle indikatörsüz tayinler de yapılabilmektedir (47,83). Mikroorganizmaların tayinine yönelik DNA biyosensörleri Toprak, hava, su ve gıdalar içine karışan, hem doğal kaynakları hem de insan sağlığını tehtid ederek çeşitli hastalıklara yol açan mikroorganizmaların tayini için biyosensör tasarımları mevcuttur (53,69). Elektrokimyasal DNA

62 46 hibridizasyon tayini hastalık tayinlerine benzer şekilde gıda maddelerindeki mikroorganizmaların tanısı indikatörlü ve indikatörsüz olarak gerçekleştirilebilmektedir. Bu amaçla tayini yapılacak mikroorganizmanın gen haritasına göre problar seçilir (37). Çözelti ortamında prob ve hedef birbirini tanıyarak hibritleşir ve bu şekilde tayin yapılır DNA biyosensörlerinde prob dizilerinin elektrot yüzeyine tutturulma yolları DNA biyosensörlerinde bazlı kısa DNA dizileri (oligonükleotitler), prob olarak elektrot yüzeyine tutturulmaktadır (36,46,76). Hibridizasyon tayinin daha kolay gerçekleşmesi için, prob dizisinin elektrot yüzeyine güçlü ve düzenli bir şekilde bağlanması hedeflenmektedir Pasif adsorbsiyon yoluyla prob tutturulması (ıslak adsorbsiyon yöntemi) Kullanılan elektrodun, prob içeren analiz çözelti içersine daldırılarak probun elektrot yüzeyine adsorbe olması ilkesine dayanır (34,47,102). Basit ve otomasyona uygulanabilirliği kolay olan bir yöntemdir. Pahalı kimyasal madde kullanımı ve elektrokimyasal potansiyel uygulama basamaklarının ortadan kaldırılması nedeniyle ucuzdur ve tayin süresi de kısalmaktadır Elektrostatik yolla prob tutturulması Elektrot yüzeyine pozitif (+) potansiyel uygulanarak, negatif (-) yüklü fosfat omurgasına sahip olan DNA nın elektriksel çekim kuvvetleri sayesinde, elektrot yüzeyine paralel olarak tutunması ilkesine dayanır (100). Pahalı kimyasal maddeler kullanılmaması nedeniyle maliyeti düşük bir yöntemdir.

63 Kovalent yolla prob tutturulması Prob dizilerinin elektrot yüzeyine kovalent bağlanma ajanları kullanılarak, kovalent olarak tutturulması ilkesine dayanır (76,91,99). Bu şekilde yapılan tutturma işlemi ile elektrot yüzeyinde daha düzenli ve daha dayanıklı bir prob tabakası oluşmaktadır, bu da hibridizasyon tayininde çok önemli bir rol oynamaktadır. Ancak pahalı kimyasal maddeler kullanılması ve diğer yöntemlere oranla daha uzun bir işlem olması gibi dezavantajları bulunmaktadır Avidin-Biyotin etkileşimi nedeniyle streptavidin kaplı yüzeye biyotinle işaretlenmiş prob tutturulması Streptavidin ile kaplanmış çeşitli elektrot yüzeylerine ya da manyetik partiküller gibi yüzeyler üzerine, biyotin ile işaretlenmiş problar, streptavidin ve biyotin arasındaki güçlü afinite nedeniyle spesifik bir şekilde tutturulmaktadır (21,47,48,98,138) Elektrokimyasal Genosensörler ile DNA Dizi Algılama Yöntemleri Elektrokimyasal genosensörler, aranan hedefin baz dizisinin karşılığı olan baz gibi kısa bir baz dizimine sahip olan sentetik tek sarmallı DNA (ssdna) oligomerin (veya PROB olarak isimlendirilir), elektrot yüzeyine bağlanmasına dayanmaktadır. Hedefi içeren bir örnek çözeltisine sensörün uygulanması ile elektrot yüzeyinde hibrit oluşur. Elektrokimyasal ölçümlerde elektrot yüzeyinde oluşan hibrit iki yöntemle tayin edilir; bunlardan ilki bir elektroaktif indikatör aracılığıyla (örneğin bir redoks-aktif anyonik metal kompleksi) yapılan tayindir. Bu yöntemde yüzeyinde hibrit oluşan elektrot indikatörü içeren çözeltiye daldırılır ve indikatörün hibrite bağlanma düzeyi belirlenir (35-40,66,72,79,86). Diğer yöntem ise DNA bazlarından en elektroaktif

64 48 olan guanin bazının +1,0 V da verdiği yükseltgenme sinyalinin farklılanmasından yola çıkılarak yapılan tayindir (2,15,51,65,70,80,81) İndikatöre Dayalı Genosensörler ile Dizi Algılama Yöntemleri İndikatöre dayalı DNA dizi algılanması, DNA ya interkale olabilen (metal kompleksleri, antibiyotikler) (6,22,23) veya DNA dizisindeki bazlarla özgün olarak etkileşen (Metilen mavisi, Ru(bpy) 3+ 3, vb.) elektroaktif maddeler (indikatör) ile tayin edilebilmektedir (35-38,52,126,). Elektrokimyasal çeviriciler, hibridizasyon olayını analitik sinyale çevirmede etkin bir şekilde kullanılmaktadır. Elektrot yüzeyinde oluşan hibrit ile etkileşen indikatörün neden olduğu artan veya azalan elektrokimyasal yanıt ile hibridizasyonun tayini gerçekleştirilir (95,98,99). Elektroaktif bir maddenin indikatör olarak kullanılabilmesi için ssdna ve dsdna ile etkileşimi sonucu alınan yanıtlar arasında anlamlı bir fark olması gerekmektedir İnterkalatör molekül ile: İnterkalasyon; bir maddenin DNA çift sarmalı arasına girip birikmesidir. Bu durumda, çift sarmal DNA (dsdna) ile etkileşimden sonra alınan madde sinyali maddenin birikmesinden dolayı tek sarmal DNA (ssdna) ile etkileşimden sonra alınan madde sinyaline göre oldukça yüksektir (3,6,22,35,36).

65 49 Şekil 19: İnterkalatör bir hibridizasyon indikatörü ile DNA dizi algılanması; (1) indikatör ile etkileşme, (2) elektrokimyasal ölçüm DNA bazları ile etkileşen bir molekül ile: Hibridizasyon indikatörü olarak kullanılan madde DNA nın bazlarından biriyle (özellikle Guanin) etkileşiyor olabilir. Bu durumda, tek sarmal DNA (ssdna) da bazlar açıkta olduğundan dolayı alınan madde sinyali, hibridizasyondan sonra oluşan çift sarmal DNA (dsdna) da bazlar kapalı

66 50 olduğundan dolayı alınan madde sinyaline oranla oldukça yüksektir (21,35-37, 70,71,81). Şekil 20: DNA bazlarından biriyle etkileşen bir hibridizasyon indikatörü ile DNA dizi algılanması; (1) indikatör ile etkileşme, (2) elektrokimyasal ölçüm İndikatörsüz DNA Dizi Algılama Yöntemleri: Elektrot yüzeyine tutturulan tek sarmal prob diziye (ssdna) ait Guaninlerin verdiği elektrokimyasal yanıt ile, probun komplementeriyle birleşmesinden sonra oluşan çift sarmal DNA ya ait guaninlerden alınan

67 51 elektrokimyasal yanıt arasında önemli bir farklılanma vardır. Bu farklılanmadan hareketle hibridizasyonun tayini gerçekleştirilir (51,67,80-82,127). ölçüm. Şekil 21: İndikatörsüz DNA dizi algılama yöntemi; (1) elektrokimyasal Son dönemlerde nanoteknolojinin ve dolayısıyla nanomalzemelerin elektrokimyasal DNA biyosensörlerinde kullanımına artan bir ilgi bulunmaktadır (42,77,109,116,130,135,136).

68 52 3. NANOTEKNOLOJİ Nanoteknoloji, maddenin nanometre ölçeğinde yani atomsal, moleküler ve supramoleküler yapılar düzeyinde denetlenmesi yoluyla yeni malzeme, cihaz ve sistemlerin tasarlanmasını ve üretilmesini konu alan bir teknoloji dalıdır. Maddeleri moleküler ya da nanometre düzeyinde ele alan bir mühendislik bilimi olan nanoteknoloji, daha güçlü ve daha hafif elektronik materyallerin kullanıldığı yeni bir süreç vaat ederek bilim insanlarının son yıllarda umutlarını arttırmaya devam etmektedir. Bilim adamları, gün geçtikçe çalışmalarında daha küçük boyutlara yönelmeye, daha az yer kaplayan, daha az enerji harcayarak daha hızlı çalışabilecek aygıtlar hazırlamaya çalışmışlardır. Bir aygıtta kullanılan malzemenin boyutu küçüldükçe, çalışma hızı da artar ve o malzemenin yeni fiziksel özellikleri ortaya çıkar. Boyutlar nanometre ölçeklerine yaklaşırken, malzemenin fiziksel özellikleri kuantum mekaniğinin kontrolüne girip, elektron durumlarının fazı ve enerji spektrumunun kesikli yapısı daha belirgin hale gelmektedir. Daha da önemlisi, malzemeyi oluşturan atom sayıları yüz civarına inince, atomsal yapının geometrisi, hatta atom sayısının kendisi bile fiziksel özelliklerin belirlenmesinde etken olmaktadır. Örneğin; yarı iletken olarak bilinen ve çağımızın en önemli malzemesi olan silisyumdan yapılan bir telin çapı nanometreye yaklaşırken tel iletken bir karakter sergilemektedir. Nanoteknolojinin uygulama amaçları: 1) Nanometre ölçekli yapıların analizi, 2) Nanometre boyutunda yapıların fiziksel özelliklerinin anlaşılması, 3) Nanometre ölçekli yapıların imalatı, 4) Nano hassasiyetli cihazların geliştirilmesi,

69 53 5) Nano ölçekli cihazların geliştirilmesi, 6) Uygun yöntemler kullanılarak nanoskopik ve makroskopik dünya arasındaki bağın kurulması Nanoteknolojinin Kullanım Alanları * Mikrosensörlerin, mikromakinaların, optoelektronik elemanların imalatı ve uygun şekilde bir araya getirilmesinde, * Lazer yapımında, * Manyetikleştirilmiş nano katmanları en ufak değişiklikleri farkedecek şekilde bir çip içine integre edilip, trafik sensörü olarak uçak ve otomobilleri tanımada ve manyetik alanlarına bakarak tiplerini de belirleyebilmede, * Medikal alanında: Mikrocerrahide (göz, beyin vb.), diagnostik kitlerde, yüzey karakterizasyonu ve modifikasyonu, mikroorganizmaların taşınmasında, kanserli hücrelerin tedavisinde, * DNA modifikasyonu gibi yüzey immobilizasyon tekniklerinde, * Kozmetik sanayisinde, * Dokumada kullanılacak olan elektronik fiberler sayesinde, istenildiğinde renk değiştirebilen, vücudumuzu zararlı ışınlardan koruyan hatta özel polimerler sayesinde terin emilip vücudumuzun kuru kalmasını sağlayan, su tutmayan giysilerin üretiminde, * Mikromakinalar sayesinde de bilgisayar teknolojisinde, * Kapasitör, transistör ve fotodiyot yapımında, * Güneş pillerinde, * İlaç endüstrisinde, * Yüksek çözünürlüğe sahip ölçü aletlerinin yapımında uygulama alanları bulunmaktadır.

70 54 Uygulamaya konulacak projeler arasında, 2012 yılında yapımı tamamlanacak olan uzay asansörü ve moleküler nanoteknoloji gibi birçok alan da bulunmaktadır. Son 10 yılda, nanopartiküller, nanotüpler ve diğer nanomalzemelere dayalı sensörlere artan bir ilgi bulunmaktadır (7,24,46,48,58,68,69,82,89,109,120). Nanoteknolojinin en güncel konularından biri karbon nanotüplerdir. Karbon nanotüpler üstün elektronik ve mekanik özelliklere sahip grafit silindirik boru veya karbon atomlarının birleşmesiyle oluşan futbol topu şeklinde yapılardır. Bu topların diğer atom veya moleküllerle yaptığı bileşiklere fulleren denir. Nanotüpler çelikten daha serttir ve plastik kadar esnektir. Elektriği şimdiye kadar keşfedilen tüm maddelere göre daha iyi iletirler. CNT ler fiziksel yapılarına göre iki şekilde sınıflandırılırlar; (a) Tek duvarlı CNT ler (SWCNT) ve (b) Çok duvarlı CNT ler (MWCNT). Şekil 22: Karbon nanotüpler (CNT); (A) tek duvarlı ve (B) çok duvarlı.

71 55 Karbon nanotüplerin üretiminde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin en önemlileri; lazer buharlaştırma yöntemi ve ark buharlaştırma yöntemidir. Bunların dışında, mekanik öğütme ve diğer yöntemler bulunmaktadır. Çeşitli tekniklerle nükleik asitlerin nanopartikül yüzeyine tutturulması ve bunların elektrokimyasal sensör teknolojisinde kullanılmaları yaygınlaşmaktadır (4,29,44,47,57,102,138, ,150,151,155). Wang ve arkadaşları tarafından DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini streptavidin kaplı altın (Au) nanopartiküller kullanılarak gerçekleştirilmiştir (150). Authier ve arkadaşları tarafından, PCR amplikonlarından human cytomegalovirus virüsün elektrokimyasal tayini, altın nanopartikül ile işaretlenmiş DNA prob kullanılarak yapılmıştır (4). Cai ve arkadaşları tarafından gümüş nanopartiküllere dayalı DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini, asit çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (57). Ayrıca, nanopartiküllere dayalı DNA analizinin etkin manyetik ayırma sayesinde gerçekleştirilebildiğine dair kayıtlar literatürde mevcuttur (138,141,142). Wang ve arkadaşları tarafından, manyetik ayırma sayesinde seçimli bir DNA analizinin kullanılan nanopartikülden gelen gümüş sinyalinin V da, perde baskılı elektrotlar ile ölçülmesiyle başarıyla gerçekleştirilebildiği gösterilmiştir (151). Wang ve arkadaşlarının diğer çalışmasında ise, DNA analizi için kadmiyum sülfür nanopartikülleri kullanılmıştır (142). Manyetik partiküllere dayalı etkin ayırma ve elektrokimyasal sensörlerinin birlikte kullanıldığı çift tabaka tekniklerinin kullanımına, son 10 yıldır artan bir ilgi bulunmaktadır (44,108,123,138,140,143,145). Bu çalışmalarda kullanılan

72 56 partiküller, paramanyetik partiküller olup, sıvı fazdan küçük bir mıknatıs yardımıyla kolayca ayrılabilmekte ve mıknatıs çözeltiden uzaklaştırıldığında, partiküller sıvı faz içinde tekrar kolayca dağılabilmektedir (44,108). Dizi seçimli DNA hibridizasyonu, enzimle işaretli (108,138) ve herhangi bir işaretlemenin olmadığı sistemlerde (46,143), ya da metal nanopartiküllerle kombine tasarımlanmış manyetik partiküllere dayalı elektrokimyasal sensörler (123,140) ile etkin manyetik ayırma sayesinde ve düşük tayin sınırları içersinde analiz edilebilmektedir. Wang ve arkadaşları tarafından, manyetik partiküllere dayalı bir yöntemle göğüs kanseri genindeki 1 no lu mutasyonun (BRCA1) elektrokimyasal tayinine yönelik bir sensör teknolojisi rapor edilmiştir (143). Wang ve arkadaşlarının bir diğer çalışmasında ise aynı genin elektrokimyasal tayini, streptavidin-alkalen fosfataz enzimine dayalı biyomanyetik yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir (138). 4. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) İnsan gözünün çok ince ayrıntıları görebilme olanağı sınırlıdır. Bu nedenle görüntü iletimini sağlayan ışık yollarının merceklerle değiştirilerek, daha küçük ayrıntıların görülebilmesine olanak sağlayan optik cihazlar geliştirilmiştir. Ancak bu cihazlar, gerek büyütme miktarlarının sınırlı oluşu gerekse elde edilen görüntü üzerinde işlem yapma imkânının olmayışı nedeniyle araştırmacıları bu temel üzerinde yeni sistemler geliştirmeye itmiştir. Elektronik ve optik sistemlerin birlikte kullanımı ile yüksek büyütmelerde üzerinde işlem ve analizler yapılabilen görüntülerin elde edildiği cihazlar geliştirilmiştir. Elektro-optik prensipler çerçevesinde tasarlanmış taramalı elektron mikroskobu (Scanning Electron Microscope-SEM), bu amaca hizmet eden cihazlardan birisidir (62). Taramalı Elektron Mikroskobu, birçok dalda araştırma-

73 57 geliştirme çalışmalarında kullanımı yanında, mikro elektronikte yonga üretiminde, sanayinin değişik kollarında hata analizlerinde, biyolojik bilimlerde, tıp ve kriminal uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Taramalı Elektron Mikroskobunda (SEM) görüntü, yüksek voltaj ile hızlandırılmış elektronların numune üzerine odaklanması, bu elektron demetinin numune yüzeyinde taratılması sırasında elektron ve numune atomları arasında oluşan çeşitli girişimler sonucunda meydana gelen etkilerin uygun algılayıcılarda toplanması ve sinyal güçlendiricilerinden geçirildikten sonra bir katot ışınları tüpünün ekranına aktarılmasıyla elde edilir. Modern sistemlerde bu algılayıcılardan gelen sinyaller dijital sinyallere çevrilip bilgisayar monitörüne verilmektedir. Gerek ayırım gücü (resolution), gerek odak derinliği (depth of focus) gerekse görüntü ve analizi birleştirebilme özelliği, taramalı elektron mikroskobunun kullanım alanını genişletmektedir. Taramalı Elektron Mikroskobu Optik Kolon, Numune Hücresi ve Görüntüleme Sistemi olmak üzere üç temel kısımdan oluşmaktadır (Şekil 23).

74 58 Şekil 23: Taramalı elektron mikroskobunun (SEM) şematik görünüşü. 5. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) Bu mikroskopta elektron ışını çok ince bir örneğe yönlendirilir (62). Elektron mikroskobunda, projeksiyon mercekleri olarak adlandırılan mercekler gerçek görüntüyü flouresans ya da fotografik film üzerine düşürmelidir, çünkü gözümüz elektron görüntüsünü doğrudan göremez. TEM için kullanılan örnekler çok ince olmalıdır nm kadar incelikte örnekler, özel yöntemlerle hazırlanabilmektedir.

75 59 6. DNA çip teknolojisi: Moleküler tanı yöntemlerindeki ilerlemelere mikrofabrikasyon teknolojisindeki gelişmelerin eklenmesi sonucunda, mikroçip teknolojisi gündeme gelmiş ve bu teknoloji, insan genom projesinin tamamlanması ile ivme kazanmıştır. Mikroçip teknolojisi ile binlerce gen veya ürünleri (RNA ve proteinler gibi) arasındaki ilişkiyi bir çip (yonga) üzerinde, eş zamanlı olarak araştırabilmek ve genetik şifremizi taşıyan nükleik asitlerin nasıl çalıştığımızı anlamamız mümkün olacaktır. Klinikte ve hasta başında gerçekleştirilecek DNA analizlerinde kullanılacak küçük boyutlarda ve tüm sağlık ekibinin kolayca kullanabileceği yeni cihazların tasarımları, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki bazı büyük firmalar tarafından başlatılmıştır yılında S. Mikkelsen in dizi seçici DNA sensörleri ile yapmış olduğu kalıtsal hastalıkların tayini projesi Amerika Birleşik Devletleri tarafından korunmaya alınmış olup, kullandığı teknolojinin lisansını Clinical Micro Sensors Inc. (CMS) adlı Amerikan şirketi satın almış ve böylelikle DNA çiplerinin hayata geçirilmesi için ilk çalışmalar başlamıştır. Başta Amerika Birleşik Devletleri olmak üzere, dünya üzerinde birçok firma tarafından DNA çiplerine yönelik araştırmalar yürütülmekte, ve özellikle nanoteknolojinin gündeme gelmesiyle çalışmalar yoğun bir şekilde bu yönde devam etmektedir. Mikroarray teknolojisi, DNA ların çipler, küçük cam slayd veya naylon membran üzerinde hibridizasyonla, genlerin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi için kullanılan bir yöntemdir. Genel olarak üç farklı mikroarray çeşidi bulunmaktadır: naylon membran üzerine sentezlenen cdna mikrodizilimleri, cam üzerine sentezlenen cdna mikrodizilimleri ve oligonükleotide dizilimler (DNA çipleri) dir de Standford Üniversitesi tarafından geliştirilen cdna mikroarrayleri cam üzerine UV-maskelemesi veya

76 60 ışıkla aktif olan kimyasal kullanılarak direkt olarak sentezlenmiş ve sabitlenmiş kısa cdna dizilerini içermektedir. Oligonükleotit arraylar ise, Affimetrix firması tarafından geliştirildiler; bu yüzden Affimetrix veya DNA çipleri olarak da anılırlar (63). In situ olarak cam slayd veya slikon yüzeyler üzerine sentezlenmiş oligolardan (mrna ve/veya cdna) oluşurlar. DNA çipleri de cdna mikroarrayleri gibi fotolitografi tekniği kullanılarak hazırlanırlar. Şekil 24. Affimetrix firmasına ait mikroarray görünümü.

77 61 BÖLÜM II GEREÇ ve YÖNTEM 2.1. Kullanılan Cihazlar Deneyler ve ölçümler sırasında kullanılan tüm cihaz ve donanımlar: Terazi (Mettler Toledo AB204-S) Ses titreşimli temizleyici (Bandelin Sonorex) ph-metre (Orion 420A) Manyetik karıştırıcı (Biosan MS 3000) Vorteks (Biosan V1) Potansiyostat (AUTOLAB 302, GPES 4,9 yazılımlı; Eco Chemie) MCB 1200 Biyomanyetik ayırma platformu (Sigris) Ag/AgCl referans elektrot (BAS) Platin tel (Yardımcı elektrot olarak kullanıldı) 2.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler Echinomisin (Sigma) Asetik asit ( %99-100) (Merck) Hidroklorik asit (%37) Sodyum Hidroksit (Merck) (Merck) Dipotasyummonohidrojenfosfat (Riedel-de Haen) Potasyumdihidrojenfosfat (Riedel-de Haen) Tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorür (Sigma) Sodyum klorür (Sigma) EDTA disodyum tuzu (Sigma) Lityum klorür (Sigma)

78 62 N-Hidroksisüksinimit (NHS) (Sigma) Etilkarbodiimit (1-etil-3-dietil aminopropil karbodiimid hidroklorür) (EDC) (Sigma) Buzağı timus bezinden elde edilen DNA [=Calf Thymus DNA; çift sarmal DNA (ctdsdna)]. Tüm çalışmalarda ultra saf su kullanıldı. Deneysel çalışmalar oda sıcaklığında (25,0 ± 0,5 ) C de gerçekleştirildi Echinomisin (ECHI) Hakkında Genel Bilgi: Açık kimyasal formül: Kapalı Kimyasal formül: C 51 H 64 N 12 O 12 S 2 Kimyasal özellikleri: DMSO da ve etanolda iyi, suda az çözünür. Molekül ağırlığı: 1.101,27 gr/mol Diğer isimleri: Quinomisin A Farmakolojik Özellikleri: Bisiklik peptit yapısında olan ECHI, antimikrobiyal ve antitümör aktivitesi gösteren kinoksalin grubu antibiyotiklerden birisidir (131).

79 63 Çift sarmal DNA ile etkileştiği ve bis-interkalasyon ile dsdna ya bağlandığı (152) rapor edilmiştir Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı Oligonükleotit Çözeltilerinin Hazırlanışı: Çalışmalarımızda kullanılan oligonükleotit dizileri TIB Molbiol (Almanya) firmasından liyofilize toz halinde temin edildi. Stok çözeltiler Tris-EDTA (ph 7,4) tamponu ile hazırlandı Ag-NP lere dayalı deneylerde kullanılan oligonükleotit dizileri: Amino ile işaretlenmiş DNA (ODN-DNA): 5 - NH 2 (CH 2 ) 6 -gag ggt gtc TgA Agg Agg ggg Manyetik partiküllere dayalı deneylerde kullanılan oligonükleotit dizileri: Biyotin ile işaretlenmiş prob: 5 -biyotin- TTT TTT TTT CgA TCg Ag-3 Hedef: 5 - CTC gat CgA AAA AAA AA-3 Rastgele dizi (NC): 5 - TgA AAC gat TAT gat AC- 3 Bir bazı hedeften farklı dizi (MM): 5 - CTC gat CgA AgA AAA AA MWCNT-SPE sistemine dayalı deneylerde kullanılan oligonükleotit dizileri: Amino ile işaretlenmiş prob: 5 - NH 2 (CH 2 ) 6 -gag ggt gtc TgA Agg Agg ggg 3

80 64 Bu çalışmada kullanılan Hepatit B virüsünü (HBV) temsil eden prob dizisi daha önce yapılan çalışmalarda (2,37,38,44,48) belirtildiği gibi HBV yi temsil eden gen haritasından seçildi ve bu dizide guanin bazının olmaması indikatörsüz hibridizasyon tayini açısından çalışmaya avantaj kazandırdı. Prob dizisinin elektrot yüzeyine daha düzgün bir şekilde bağlanması ve hibridizasyonun sterik açıdan daha verimli bir şekilde gerçekleşmesi amacıyla, çalışmamızda amino hekzan ile işaretlenmiş prob dizisi kullanıldı. Kullanılan diziler; HBV prob: 5 NH 2 (CH 2 ) 6 -AAT ACC ACA TCA TCC ATA TA 3 Hedef: 5 TAT ATg gat gat gtg gta TT 3 Tek bazı farklı hedef dizi (MM): 5 TAT ctg gat gat gtg gta TT 3 Rastgele dizi (NC): 5 AAT ACC TgT ATT CCT CgC CTg TC 3 Tüm oligonükleotit stok çözeltileri Tris-EDTA tampon çözeltisi (ph 7,4) ile 1000 µg/ml konsantrasyonunda hazırlandı ve sıfır derecenin altında saklandı Tampon Çözeltilerin Hazırlanışı: Tüm tampon çözeltilerin hazırlanışında ultra saf su kullandı. Tampon çözeltiler hazırlandıktan sonra plastik şişelerde, buzdolabında saklandı. 0,05 M fosfat tampon çözeltisinin hazırlanışı (ph 7,4; PBS): Ölçümler sırasında kullanılan 0,05 M fosfat tampon çözeltisi litresinde 1,36 g (0,01 mol) KH 2 PO 4, 6,96 g (0,04 mol) K 2 HPO 4 ve 1,168 g NaCl (0,02 mol)

81 65 içermektedir. Hazırlanan tampon çözeltisinin ph değeri yaklaşık 7,4 olmaktadır. Çözeltinin ph sı gerekliyse, 0,1 N NaOH ve / veya 0,1 N HCl ilavesiyle phmetre ile 7,4 e ayarlanır. 0,50 M asetat tampon çözeltisinin hazırlanışı (ph 4,8; ABS): Kullanılan 0,50 M asetat tampon çözeltisi litresinde 0,2722 g sodyum asetat trihidrat, 0,1154 ml asetik asit ve 1,168 g NaCl (0,02 mol) içermektedir. Çözeltinin ph'sının 4,8 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, phmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi. 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin hazırlanışı (ph 7,0; TBS): Kullanılan 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisi litresinde 3,152 g Trizma HCl ve 1,168 g NaCl (0,02 mol) içermektedir. Çözeltinin ph'sının 7,0 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve / veya 0,1 N HCl ilavesiyle, phmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi. 0,01 M Tris-HCl, 1 mm EDTA tampon çözeltisinin hazırlanışı (ph 8,0; Tris-EDTA): Kullanılan 0,01 M Tris-HCl, 1 mm EDTA tampon çözeltisi litresinde 1,576 g Trizma HCl ve 0,372 g EDTA içermektedir. Çözeltinin ph'sının 8,0 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, phmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi. NaCB): 0,075 M Sodyum sitrat tampon çözeltisinin hazırlanışı (ph 7,0 ve 8,0; Kullanılan 0,075 M sodyum sitrat tampon çözeltisinin litresinde 22,06 g trisodyum sitrat dihidrat ve 43,88 g NaCl (0,75 mol) içermektedir. Çözeltinin

82 66 ph'sının 7,0 veya 8,0 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve / veya 0,1 N HCl ilavesiyle, phmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi. 0,1 M TTL tampon çözeltisi (ph 8,0): Kullanılan 0,1 M Tris-HCl çözeltisi litresinde 15,76 g Trizma HCl, 4,239 g LiCl ve % 0,1 oranında yüzey aktif madde olan Tween 20 içermektedir. Çözeltinin ph'sının 8,0 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, phmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi. 0,25 M TT tampon çözeltisi (ph 8,0): Kullanılan 0,25 M Tris-HCl çözeltisi litresinde 39,4 g Trizma HCl ve % 0,1 oranında yüzey aktif madde olan Tween 20 içermektedir. Çözeltinin ph'sının 8,0 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, phmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi Kullanılan yöntem: Kullanılan elektrotların aktivasyonu ve elektrot yüzeyine DNA ve/veya oligonükleotitlerin tutturulması, hibridizasyon işlemlerine ilişkin basamaklarda, mevcut literatürlerde (37,43,44,101,105) rapor edilen yol izlenmiştir.

83 Kullanılan elektrotların hazırlanışı: Kalem Ucu Grafit Elektrot (PGE) Hazırlanışı: Çalışmada kullanılan kalem grafit elektrot, Tombo kalem uçlarının 3.0 cm boyutunda kesilmesiyle hazırlandı (101,143). Elektrokimyasal hücre içerisinde 1.0 cm kalacak şekilde kalem içerisine yerleştirildi CNT modifiye SPE: Perde baskılı elektrot 3,4 x 1,0 x 0,05 cm (Uzunluk x Genişlik x Yükseklik) boyutlarında olup üç kısımdan oluşmaktadır; (a) yüzeyi karboksil gruplarıyla zenginleştirilmiş çok duvarlı karbon nanotüp içeren grafit çalışma elektrodu, (b) grafit yardımcı elektrot ve (c) Ag/AgCl referans elektrot. Grafit çalışma elektrodu yüzeyi 4.0 mm çapındadır. Kullanılan çok duvarlı karbon nanotüplerin çapı 10 nm, boyları ise 1-2 µm civarındadır. Bu tek kullanımlık perde baskılı elektrotlar Dropsens (Oviedo-Asturias, İspanya) firmasından temin edildi ve elektrotların potansiyostata bağlantısı özel bir DropSens bağlayıcısı (DSC) ile sağlandı (61).

84 Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA analizine yönelik çalışma: 1,0 mm Ag-NP stok çözeltisi NaCB ile hazırlandı. Çalışma ortamı olarak ABS kullanıldı. Bu çalışmada de belirtilen oligonükleotit dizileri kullanıldı. Şema 2: Gümüş nanopartiküllerin (Ag-NPs) yüzeyine DNA nın tutturulması ve tek kullanımlık kalem grafit elektrotlar kullanılarak DNA nın elektrokimyasal algılanmasında takip edilen basamaklar; (1) amino işaretli DNA nın Ag-NP üzerine tutturulması, (2) Ag-NP ile işaretlenmiş DNA nın PGE yüzeyine pasif adsorpsiyonu (3) üçlü elektrot sistemi bağlantısı ile voltametrik olarak gümüş ve guanin sinyallerinin ölçülmesi.

85 Gümüş nanopartiküllerin (Ag-NP) sentezi ve mikroskobik karaterizasyonu: Çalışmada kullanılan gümüş nanopartiküller (Ag-NP) Porto Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümünde, kolloidal altın ve gümüş partikül (128) sentezi için Turkevich tarafından geliştirilen yönteme göre yapılmış ve tarafımıza temin edilmiştir. 5 mg gümüş (gümüş nitrat olarak) içeren sulu çözelti devamlı karıştırılarak kaynama noktasına kadar ısıtıldı. Bu noktada % 1 lik (a/a) sodyum sitrat çözeltisinden 5 ml ilave edildi. Yaklaşık 45 dakika sonra açık yeşil bir çözelti elde edildi. Hazırlanan bu nanopartiküller, karanlıkta saklanmak suretiyle birkaç ay süreyle kullanılabilir. Ag-NP lerin karakterizasyonu, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) (JEOL 200M OS-1, Agar Scientific, İngiltere) ile Porto üniversitesinde yapıldı. Nanopartiküllerin partikül büyüklüğü tayini ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) (JEOL JSM 6301F, Agar Scientific, İngiltere) ile karekterizasyonu, Porto Üniversitesi Fen Fakültesi nde yapılmıştır. TEM ve SEM görüntüleri, nanopartiküller hazırlandıktan sonra izlendi ve 3 ile 5 ay süresince partikül büyüklüğünde herhangi bir değişim gözlenmedi. Ayrıca, gümüş nanopartiküllerin stabilitesi, UV-Vis spektrofotometre tekniği kullanılarak ölçüldü (50,51) ve herhangi bir farklılık gözlenmedi Ag-NP lerin elektrokimyasal davranışının incelenmesi: Ag-NP lerin elektrokimyasal davranışlarını göstermek amacıyla, dönüşümlü voltametri (CV) ve diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemleri kullanıldı.

86 Ag-NP lerin elektrokimyasal davranışının dönüşümlü voltametri (CV) tekniği ile incelenmesi: PGE nin aktivasyonu: PGE, 0,05 M ABS içersinde +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan ortamda aktive edildi. PGE yüzeyine Ag-NP immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, NaCB içinde hazırlanmış 1,0 mm NP stok çözeltisi içine daldırıldı. Ölçüm: -0,1 V ile +1,0 V arasında 100 mv/s tarama hızıyla, 50 mv luk puls genliğinde tarama yapılarak, ABS içersinde ölçüm gerçekleştirildi ve gümüşe ait yükseltgenme sinyali incelendi Ag-NP lerin elektrokimyasal davranışının diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği ile incelenmesi: PGE nin aktivasyonu: PGE, 0,05 M ABS içersinde +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan ortamda aktive edildi. PGE yüzeyine Ag-NP immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, NaCB içinde hazırlanmış 1,0 mm NP stok çözeltisi içine daldırıldı ve potansiyel uygulanmadan 5 dakika boyunca karıştırıldı. Daha sonra immobilize edilmiş PGE, NaCB ile 10 saniye süreyle yıkandı. Ölçüm: -0,2 V ile +1,4 V arasında, 30 mv/s tarama hızıyla, 50 mv luk puls genliğinde tarama yapılarak ABS içersinde ölçüm gerçekleştirildi ve gümüşe ait yükseltgenme sinyali incelendi.

87 AgNP üzerine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA nın elektrokimyasal tayini: 1,0 mm Ag-NP stok çözeltisi içersinde 50 µg/ml amino ile işaretlenmiş ODN-DNA hazırlandı ve bu karışım 5 dakika boyunca vortekste 500 rpm hızı ile karıştırıldı. NP üzerine DNA immobilizasyonu için, ODN-DNA ve NP karışımı içeren viyaller, 1 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bekletildi. Aktive edilmiş PGE ler, ODN-DNA ve NP karışım çözeltisinden 110 µl içeren viyallere daldırıldı ve pasif adsorbsiyon prosedürüne (72,99) göre, elektrotlar bu viyaller içinde 60 dakika süreyle bekletildi. Daha sonra PGE ler 10 saniye boyunca NaCB ile yıkandı. Ölçüm: -0,2 V ile +1,4 V arasında, 30 mv/s tarama hızıyla, 50 mv luk puls genliğinde tarama yapılarak ABS içersinde ölçüm yapılarak, gümüş ve guaninin yükseltgenme sinyalleri incelendi. Gümüş nanopartikül yüzeyine tutturulacak kısa DNA dizisinin ne tür bir işaretleme içermesi konusunda bilgi edinmek amacıyla, işaretsiz DNA dizisi veya tiyol grubu ile işaretlenmiş farklı türdeki kısa DNA dizileri ile aynı çalışma tekrarlandı DNA konsantrasyonundaki değişimin Ag-NP ve guanin yükseltgenme sinyaline olan etkisinin incelenmesi: Bu çalışmada yüzeyi aktive edilmiş PGE kullanıldı. Yöntem deki koşullarda gerçekleştirildi µg/ml aralığındaki DNA konsantrasyonlarında elde edilen sinyal farklılıkları incelendi.

88 Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesi: Bu çalışmada yüzeyi aktive edilmiş PGE kullanıldı. Yöntem deki koşullarda gerçekleştirildi. Ölçüm tamponu olarak ABS veya NaCB kullanıldı ve farklı ph lara sahip tampon değişiminin yanıta olan etkisi incelendi AgNP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin incelenmesi: Bu çalışmada yüzeyi aktive edilmiş PGE kullanıldı. Yöntem deki koşullarda gerçekleştirildi. Çalışmada AgNP stok çözeltisi ile birlikte 1:2 ile 1:50 oranları arasında seyreltilmiş, değişen konsantrasyonlarda AgNP kullanıldı ve nanopartikül konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisi incelendi Manyetik partiküllere (MB) dayalı DNA hibridizasyonunun indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine yönelik çalışmalar: ECHI nin elektrokimyasal davranışının incelenmesi: ECHI stok çözeltisi, mm konsantrasyonunda olacak şekilde metanol ile hazırlandı. ECHI nin elektrokimyasal davranışı, dönüşümlü voltametri (CV) ve diferansiyel puls voltametri (DPV) teknikleri ile PGE kullanılarak incelendi ECHI nin elektrokimyasal davranışının dönüşümlü voltametri (CV) tekniği ile incelenmesi: PGE nin aktivasyonu: PGE, 0,05 M PBS içersinde +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan ortamda aktive edildi. PGE yüzeyine ECHI immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, TBS içinde hazırlanmış 5 µm ECHI çözeltisi içine daldırıldı ve 5 dakika süreyle

89 73 potansiyel uygulanmadan karıştırıldı. Daha sonra yüzeyine ECHI tutturulmuş PGE, 10 saniye süre ile TBS ile yıkandı. Ölçüm: -0,25 V ile -1,2 V arasında 100 mv/s tarama hızı tarama yapılarak PBS içersinde ölçüm gerçekleştirildi ve ECHI ye ait yükseltgenme sinyali incelendi ECHI nin elektrokimyasal davranışının diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği ile incelenmesi: PGE nin aktivasyonu: PGE, 0,05 M PBS içersinde +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karıştırılmayan ortamda aktive edildi. PGE yüzeyine ECHI immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, TBS içinde hazırlanmış 0,1-10 µm arasında değişen farklı konsantrasyonlardaki ECHI çözeltisi içine daldırıldı ve 5 dakika süreyle potansiyel uygulanmadan karıştırıldı. Daha sonra yüzeyine ECHI tutturulmuş PGE, 10 saniye süre ile TBS ile yıkandı. Ölçüm: -0,8 V ile -0,2 V arasında 100 mv/s tarama hızıyla ölçüm gerçekleştirildi ve ECHI ye ait yükseltgenme sinyali incelendi.

90 Manyetik partiküllere (MB) dayalı indikatörlü ve indikatörsüz elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayini: Bu çalışmada de belirtilen oligonükleotit dizileri ve çalışma ortamı olarak çeşitli tampon çözeltileri kullanıldı. Piyasada mevcut streptavidin ile kaplı ve büyüklüğü 2,8 µm olan manyetik partiküller (Dynal Biotech ASA, Norveç) ile deneyler gerçekleştirildi. Şema 3. Manyetik partiküllere dayalı indikatörlü ve indikatörsüz elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayini: (1) streptavidin kaplı manyetik partiküllerin yüzeyine biyotin ile işaretli DNA probun immobilizasyonu; (2) hedef/nc/mm varlığında hibridizasyon; (3) ECHI akümülasyonu; (4) manyetik partikül yüzeyinde oluşan DNA hibritlerini partiküllerden ayırmak için alkali ile muamele edilmesi; (5) pasif adsorbsiyon ile örneklerin elektrot yüzeyine tutturulması; (6) ECHI ve DNA nın elektroaktif bazları; guanine ve adenin in yükseltgenme sinyallerinin tek kullanımlık sensör; kalem grafit elektrot (PGE) ile elektrokimyasal ölçümü.

91 75 Prob kaplı manyetik partiküllerin hazılanması ve manyetik partikül yüzeyinde DNA hibridizasyonu: Prob kaplı manyetik partiküllerin hazırlanması, MCB 1200 Biyomanyetik ayırma platformu (Sigris, ABD) manyetik ayıracı kullanılarak aşağıdaki prosedür izlenerek yapıldı (44,143); 5 µl streptavidin ile kaplı manyetik parküller 1,5 ml lik santrifüj tüpüne transfer edildi. Manyetik partiküller (MB), 90 µl TTL tampon çözeltisi ile yıkandı ve 25 µl TTL tampon çözeltisinde dağıtıldı. 25 µl biyotinli prob ilave edildi ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırılarak inkübe edildi. İmmobilize edilmiş prob ayrıldı ve iki defa 90 µl TT tampon çözeltisi ile yıkandı ve hesaplı miktarda hedef/mm/nc dizileri içeren 40 µl hibridizasyon çözeltisi (sodyum sitrat tamponu (NaCB) (ph 7,00) içinde dağıtıldı. Hibridizasyon basamağı 20 dakika boyunca oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Manyetik partikülleri içeren örnekler daha sonra 90 µl NCB ile yıkandı. İndikatör bağlanması: Hibridize edilmiş manyetik partiküller 5 µm ECHI içeren 50 µl TBS içinde dağıtıldı ve indikatör oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırılarak hibridize edilmiş manyetik partiküllere akümüle edildi ve 90 µl PBS ile yıkandı. Alkali ile muamelesi için örnek, 25 µl 0,05 M NaOH çözeltisi ile 5 dakika boyunca karıştırıldı. Alkali muamelesi basamağından sonra, 25 µl örnek 85 µl PBS içeren viyal içine transfer edildi. Daha sonra PGE ler pasif adsorpsiyon basamağı için 15 dakika boyunca bu viyallere daldırıldı. Elektrotlar daha sonra 5 saniye boyunca TBS ile yıkandı. DPV ölçümü için, PGE ler PBS içeren elektrokimyasal hücredeki üçlü elektrot sistemine yerleştirildi.

92 76 Ölçüm: ECHI ve DNA bazları, guanine ve adenin in yükseltgenme sinyalleri, -0,80 to +1,40 V arasında, 30 mv/s tarama hızıyla, 50 mv luk puls genliğinde DPV tekniğiyle tarama yapılarak ölçüldü ECHI nin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini: Yöntem de anlatıldığı koşullarda gerçekleştirildi. Hibridizasyon tayini için -0,65 V civarında gözlenen ECHI ye ait yükseltgenme sinyali incelendi Guanin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini: Yöntem de anlatıldığı koşullarda gerçekleştirildi. Hibridizasyon tayini için +1,0 V civarında gözlenen guanine ait yükseltgenme sinyali incelendi Adenin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini: Yöntem de anlatıldığı koşullarda gerçekleştirildi. Hibridizasyon tayini için +1,2 V civarında gözlenen adenine ait yükseltgenme sinyali incelendi.

93 Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrot (MWCNT-SPE) kullanılarak DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine yönelik çalışma: MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonu: MWCNT-SPE yüzeyinin mikroskobik karakterizasyonu alan emisyonu taramalı elektron mikroskobu (hızlandırma potansiyel aralığı KV) (FE- SEM; Quanta 400 FEI, Japan) ile Orta Doğu Teknik Üniversitesi (ODTU) Merkezi Laboratuvarında uzman personel tarafından gerçekleştirildi. Benzer şekilde yüzeyine 1 saat süreyle 100 µg/ml konsantrasyonda dsdna tutturulmuş MWCNT-SPE yüzeyinin mikroskobik karakterizasyonu, yukarıda belirtilen aynı koşullarda gerçekleştirildi MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA nın elektrokimyasal tayini: Karboksil gruplarınca zengin MWCNT-SPE yüzeyine amino işaretli kısa DNA dizisinin doğrudan ya da kovalent bağlayıcı ajan kullanılarak bağlanmasını belirlemek amacıyla, MWCNT-SPE yüzeyine taze hazırlanmış kovalent bağlanma çözeltisinden (8 mm NHS ve 5mM EDC olacak şekilde litresinde 0,921 g NHS ve 0,959 g EDC içeren ve PBS ile hazırlanan çözelti; EDC-NHS), 40 µl damlatılarak 1 saat bekletildi. Daha sonra elektrot PBS çözeltisi ile 5 saniye boyunca yıkandı. MWCNT-SPE yüzeyine 40 µl ABS damlatılarak, DPV yöntemi ile, +0,4 V ile +1,3 V arasında, 30 mv/s tarama hızıyla, 50 mv luk puls genliğinde DPV tekniği ile tarama yapılarak ölçüm yapıldı.

94 78 Şema 4: MWCNT-SPE yüzeyinde DNA immobilizasyonun elektrokimyasal tayini: (1) MWCNT-SPE yüzeyine amino işaretli DNA immobilizasyonu (a: referans elektrot; b: çalışma elektrodu; c: yardımcı elektrot); (2) yıkama basamağı; (3) MWCNT-SPE nin potansiyostata bağlanması; ve (4) DPV tekniği ile guanin yükseltgenme sinyaline bağlı elektrokimyasal ölçüm.

95 MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA prob konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisinin incelenmesi: Bu çalışmada MWCNT-SPE kullanıldı. MWCNT-SPE yüzeyine değişen konsantrasyonlarda amino ile işaretli DNA probu içeren 40 µl örnek damlatılarak 20 dakika bekletildi. Daha sonra elektrot ABS ile 5 saniye boyunca yıkandı ve elektrokimyasal ölçüm gerçekleştirildi. Ortamdaki DNA miktarı 5 µg/ml den 40 µg/ml ye arttırıldı ve bu konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisi incelendi MWCNT-SPE yüzeyinde HBV DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine yönelik çalışma: Bu çalışmada de belirtilen oligonükleotit dizileri kullanıldı. Çalışma ortamı olarak ABS kullanıldı. CNT-SPE yüzeyine HBV DNA prob immobilizasyonu: MWCNT-SPE yüzeyine 20 µg/ml HBV DNA probu içeren 40 µl örnek damlatılarak 20 dakika bekletildi. Daha sonra elektrot ABS ile 5 saniye boyunca yıkandı. Prob immobilize edilmiş CNT-SPE yüzeyinde DNA hibridizasyonu: 40 µg/ml hedef/nc/mm dizi içeren 40 µl örnek MWCNT-SPE yüzeyine damlatılarak hibridizasyon basamağı için 30 dakika süreyle bekletildi. Daha sonra elektrot ABS ile 5 saniye boyunca yıkandı. Ölçüm: MWCNT-SPE yüzeyine 40 µl ABS damlatılarak guanine yükseltgenme sinyali, DPV yöntemi ile, +0,4 V ile +1,3 V arasında, 30 mv/s tarama hızıyla, 50 mv luk puls genliğinde DPV tekniği ile tarama yapılarak ölçüldü.

96 HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalar: Yöntem deki gibi aynı koşullarda gerçekleştirildi. Hedef ile rastgele (NC) dizilerin 1:1 karışımını, veya hedef ile çift sarmal DNA (dsdna) nın 1:1 karışımlarını içeren örnekler, karışım çözeltileri olarak kullanıldı. Hibridizasyon tayini için guanine ait yükseltgenme sinyali incelendi Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon yanıtına olan etkisinin incelenmesi: Yöntem deki gibi aynı koşullarda gerçekleştirildi. Ortamdaki hedef dizi miktarı 5 µg/ml den 80 µg/ml ye arttırıldı ve bu konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisi incelendi.

97 81 BÖLÜM III BULGULAR 3.1. Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA analizine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular: bulgular: Ag-NP lerin mikroskobik karaterizasyonunda elde edilen Yöntem de anlatıldığı gibi yapıldı. Ag-NP lerin mikroskobik karaterizasyonu, TEM ve SEM cihazları kullanılarak gerçekleştirildi. Elde edilen görüntüler şekil 25 ve şekil 26 da gösterildi. Şekil 25: Nanopartiküllerin TEM görüntüsü ( x büyütme).

98 82 büyütme). Şekil 26: Çözeltideki gümüş nanopartiküllerin SEM görüntüsü (x TEM görüntüsünden hareketle partikül büyüklüğü tayini yapıldı ve elde edilen histogram şekil 27 de gösterildi.

99 83 Şekil 27: Ag-NP lerin partikül büyüklüğü dağılımı Ag-NP lerin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde elde edilen bulgular: Yöntem, ve de anlatıldığı gibi yapıldı. Ag-NP lerin elektrokimyasal davranışı, dönüşümlü voltametri (CV) ve diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemleri ile incelediğimizde elde edilen voltamogramlar sırasıyla, şekil 28A ve şekil 28B de gösterildi.

100 84 Şekil 28: (A) Dönüşümlü voltametri (CV) ve (B) diferansiyel puls voltametrisi (DPV) tekniği kullanılarak, Ag-NP lerin elektrokimyasal davranışlarını gösteren voltamogramlar.

101 AgNP üzerine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA nın elektrokimyasal tayininde elde edilen bulgular: Yöntem, de anlatıldığı gibi yapıldı. AgNP üzerine amino işaretli kısa DNA dizisinin tutturulması ve elektrokimyasal tayininde elde edilen gümüş ve guanin yükseltgenme sinyalleri, şekil 29 da gösterildi. Şekil 29: Amino ile işaretlenmiş DNA varlığında elde edilen, (NP) gümüş ve (G) guanin oksidasyon sinyallerini ve (K) sadece ABS tamponu içinde ölçülen sinyali gösteren voltamogram (kontrol).

102 86 Gümüş nanopartikül yüzeyine tutturulacak DNA dizisinin ne tür bir işaretleme içermesi konusunda bilgi edinmek amacıyla, işaretsiz DNA dizisi veya tiyol grubu ile işaretlenmiş farklı türdeki kısa DNA dizileri ile aynı çalışma tekrarlandı DNA konsantrasyonundaki değişimin Ag-NP ve guanin yükseltgenme sinyaline olan etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular: Yöntem, de anlatıldığı gibi yapıldı. Ag-NP konsantrasyonu sabit tutularak yüzeyine tutturulan amino işaretli DNA prob dizisinin konsantrasyonu 0-60 µg/ml konsantrasyon aralığında arttırıldığı zaman elde edilen histogram ve grafikler sırasıyla, şekil 30A ve şekil 30B de gösterildi.

103 87 Şekil 30: Amino işaretli DNA oligonükleotidlerinin farklı konsantrasyonlarında gözlenen gümüş ve guanin sinyalleri: (A) Histogramda nanopartiküllerin yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda metalik gümüşün (a) guaninin (b) yükseltgenme sinyalleri gösterilmektedir. (B) Grafikte nanopartiküllerin yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda, gümüşün (NP) ve guaninin (G) yükseltgenme sinyalleri gösterilmektedir Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular: Yöntem, de anlatıldığı gibi yapıldı. Ölçüm tamponu olarak, ABS veya NaCB kullanıldığı zaman elde edilen gümüş ve guanin yükseltgenme sinyallerindeki değişimi gösteren histogram, şekil 31 de gösterildi.

104 88 Şekil 31: Farklı tampon çözeltilerinin yanıt üzerine olan etkisini gösteren histogram. Nanopartiküllerin yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda gümüşün ve guaninin yükseltgenme sinyalleri: (a) Ag-NP yükseltgenme sinyali, (b) 50 µg/ml DNA varlığında Ag-NP yükseltgenme sinyali, (c) guanin yükseltgenme sinyali Ag-NP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular: Yöntem de anlatıldığı gibi yapıldı. Nanopartiküllerin yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda hem gümüşün hem de guaninin yükseltgenme sinyalleri, ABS tamponunda elde edildi. DNA konsantrasyonu sabit tutularak AgNP konsantrasyonu, stok çözeltisi ile birlikte 1:2 ile 1:50 oranları arasında seyreltilerek kullanıldığında elde edilen gümüş ve guanin sinyallerindeki değişimi gösteren histogram, şekil 32 de gösterildi.

105 89 Şekil 32: Çeşitli oranlarda seyreltilmiş gümüş nanopartiküllerin yanıta olan etkisi: (a) DNA yokluğunda, (b) 50 µg/ml DNA varlığında Ag-NP lerin yükseltgenme sinyali ve (c) guanin yükseltgenme sinyali.

106 Manyetik partiküllere (MB) dayalı DNA hibridizasyonunun indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular: ECHI nin elektrokimyasal davranışının incelenmesine ilişkin bulgular: Yöntem, ve de anlatıldığı gibi yapıldı. Hibridizasyon indikatörü ECHI nin elektrokimyasal davranışı, dönüşümlü voltametri (CV) tekniği ile PGE kullanılarak incelendiğinde, elde edilen voltamogram, şekil 33A da gösterildi. Farklı ECHI konsantrasyonlarında diferansiyel puls voltametri (DPV) tekniği ile PGE kullanılarak ölçülen ECHI sinyallerine ait konsantrasyon-akım eğrisi, şekil 33B de gösterildi.

107 91 Şekil 33. (A) ECHI nin dönüşümlü voltametri tekniği ile elde edilen voltamogramı; (a) ECHI sinyali (b) ECHI içermeyen PBS tamponundan gelen sinyal (kontrol); (B) Farklı ECHI konsantrasyonlarında diferansiyel puls voltametri tekniği ile ölçülen ECHI yükseltgenme sinyallerine ait konsantrasyonakım eğrisi Manyetik partiküllere (MB) dayalı indikatörlü ve indikatörsüz elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayinine ilişkin bulgular: Yöntem, de anlatıldığı gibi yapıldı. DNA hibridizasyonunun MB lere dayalı indikatörlü ve indikatörsüz elektrokimyasal tayininde elde edilen ECHI, guanin ve adenine ait yükseltgenme sinyallerinin aynı ölçüm skalasında gösterildiği voltamogram şekil 34 de gösterildi.

108 92 Şekil 34. Hibridizasyon varlığında ölçülen (E) ECHI, (G) guanin ve (A) adenin sinyallerini gösteren voltamogram; (1) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu varlığında elde edilen sinyaller, (2) sadece prob varlığında elde edilen sinyaller ECHI nin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular: Yöntem, de anlatıldığı gibi yapıldı. Streptavidin ile kaplı MB yüzeyine tutturulmuş biyotin ile işaretlenmiş prob ile hedef/mm/nc arasında gerçekleşen hibridizasyonun tayini için, -0,65 V civarında gözlenen ECHI ye ait yükseltgenme sinyali incelendiği zaman, elde edilen voltamogram ve histogram sırasıyla şekil 35 A ve şekil 35 B de gösterildi.

109 93 Şekil 35: (A) Hibridizasyon varlığında ölçülen ECHI sinyallerini gösteren DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) % akım oranını gösteren histogram: (a) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu, (b) prob ile bir bazı hedeften farklı dizinin (MM) hibridizasyonu, (c) prob ile rastgele dizinin (NC) hibridizasyonu, (d) sadece prob, (e) ortamda DNA yokken elde edilen ECHI sinyali ve (f) ECHI ve DNA içermeyen, sadece PBS tamponu içeren örnek (kontrol).

110 Guanin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular: Yöntem, de anlatıldığı gibi yapıldı. Streptavidin ile kaplı MB yüzeyine tutturulmuş biyotin ile işaretlenmiş prob ile hedef/mm/nc arasında gerçekleşen hibridizasyonun tayini için, +1,0 V civarında gözlenen guanine ait yükseltgenme sinyali incelendiği zaman elde edilen voltamogram ve histogram sırasıyla şekil 36A ve şekil 36B de gösterildi.

111 95 Şekil 36: (A) Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar: (a) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu, (b) prob ile bir bazı hedeften farklı dizinin (MM) hibridizasyonu, (c) prob ile rastgele dizinin (NC) hibridizasyonu, (d) sadece prob, (e) ECHI ve DNA içermeyen, sadece PBS tamponu içeren örnek (kontrol); (B) Hibridizasyon varlığında % akım oranını gösteren histogram; (a) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu, (b) sadece prob Adenin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular: Yöntem, de anlatıldığı gibi yapıldı. Streptavidin ile kaplı MB yüzeyine tutturulmuş biyotin ile işaretlenmiş prob ile hedef/mm/nc arasında gerçekleşen hibridizasyonun tayini için, +1,2 V civarında gözlenen adenin bazına ait yükseltgenme sinyali incelendiği zaman elde edilen voltamogram ve histogram sırasıyla şekil 37A ve şekil 37B de gösterildi.

112 96 Şekil 37: (A) Hibridizasyon varlığında ölçülen adenin sinyallerini gösteren DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar: (a) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu, (b) prob ile bir bazı hedeften farklı dizinin (MM) hibridizasyonu, (c) prob ile rastgele dizinin (NC) hibridizasyonu, (d) sadece prob, (e) ECHI ve DNA içermeyen, sadece PBS tamponu içeren örnek (kontrol). (B) Hibridizasyon varlığında % akım oranını gösteren histogram; (a) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu, (b) sadece prob.

113 Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrotlar (MWCNT-SPE) ile DNA hibridizayonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular: MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonuna ilişkin bulgular: Yöntem, de anlatıldığı gibi yapıldı. MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin SEM ile karakterizasyonunda elde edilen görüntüler, şekil 38 de gösterildi.

114 98 Şekil 38: SEM görüntüleri; MWCNT-SPE, (a) hızlandırma potansiyeli 20,0 KV, çözünürlük 200 µm; (b) hızlandırma potansiyeli 30,0 KV, çözünürlük 500 nm; yüzeyine 100 µg/ml dsdna modifiye edilmiş MWCNT-SPE, (c) hızlandırma potansiyeli 10,0 KV, çözünürlük 100 µm; (d) hızlandırma potansiyeli 10,0 KV, çözünürlük 10 µm MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması ve DNA nın elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular: Amino işaretli kısa DNA dizisinin karboksil gruplarla zenginleştirilmiş MWCNT-SPE yüzeyine doğrudan ya da kovalent bağlanma çözeltisi yardımıyla tutturulmasına karar vermek amacıyla, yöntem de anlatıldığı gibi yapıldı ve kovalent bağlanma çözeltisi varlığında elde edilen voltamogram şekil 39 da gösterildi.