T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI SEFALOSPORİN GRUBU ANTİBİYOTİKLERİN ELEKTROKİMYASAL KARAKTERİZASYONU VE VOLTAMETRİK TAYİNLERİ Seher İPEKÇİ Danışman Doç. Dr. Sabriye PERÇİN ÖZKORUCUKLU YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI ISPARTA

2 2014[Seher İPEKÇİ]

3

4 TAAHHÜTNAME Bu tezin akademik ve etik kurallara uygun olarak yazıldığını ve kullanılan tüm literatür bilgilerinin referans gösterilerek tezde yer aldığını beyan ederim. Seher İPEKÇİ

5

6

7

8 ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAZI SEFALOSPORİN GRUBU ANTİBİYOTİKLERİN ELEKTROKİMYASAL KARAKTERİZASYONU VE VOLTAMETRİK TAYİNLERİ Seher İPEKÇİ Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Sabriye PERÇİN ÖZKORUCUKLU Sefalosporinler β-laktam antibiyotiklerinin ikinci büyük grubudur ve dört kuşakta sınıflandırılırlar. Bu antibiyotikler, uygun antibakteriyel aktivite, β-laktamaz direnci ve farmakokinetik özelliklerinden dolayı ağır enfeksiyonların tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada sefalosporin grubunda bulunan sefadroksil vesefoperazonun elektrokimyasal davranışları incelenip bu etken maddelerin çeşitli ortamlarda tayini için voltametrik yöntem geliştirilmiştir. Elektrokimyasal davranışları, karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls voltametri yöntemiyle incelenmiştir. Destek elektrolit ve ph nın, bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine etkisi incelenmiştir. Gözlenebilme sınırı (S/N=3) sefadroksil ve sefoperazon için sırasıyla 5, M ve 7, M olarak bulunmuştur. Aynı şekilde alt tayin sınırı (S/N=10) sefadroksil için1, M ve sefoperazon için 2, M dır.optimize edilen yöntem ile farmasötik ve kanörneklerinde sefoperazonun tayinigerçekleştirilmiştir. Bu uygulamalarda %100 e yakın geri kazanım değerlerielde edilmiştir. Elektrot yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için pik akımları üzerine tarama hızının etkisi dönüşümlü voltametri yöntemi ile incelenmiş ve elektrokimyasal davranışın difüzyon kontrollü olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler:Sefalosporin, İlaç Analizi, Antibiyotik, Elektrokimyasal Biyosensör 2014, 100sayfa iv

9 ABSTRACT M.Sc. Thesis ELECTROCHEMİCAL CHARACTERİZATİON AND VOLTAMMETRİC DETERMİNATİON OF SOME CEPHALOSPORİN GROUP ANTİBİOTİCS Seher İPEKÇİ Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Sabriye PERÇİN ÖZKORUCUKLU Cephalosporins are the second major group of β-lactam antibiotics, they are classified into four generations. These antibiotics are widely used in clinical therapy for the treatment of severe infections, because of their convenient antibacterial activity, β-lactamases resistance and pharmacokinetic properties. In this study, the electrochemical behaviours of cefadroxil and cefoperazone that are located in the cephalosporin group were examined and voltammetric method was developed for determining those substances in the different mediums. The electrochemical behaviours of the substances in the different mediums. The electrochemical behaviours of the substances were examined at a carbon graphite electrode by using differential pulse voltammetry. Effect on electrochemical behaviour of supporting electrolyte and ph were determined. The limit of detection (S/N=3) was found to be 5, M and 7, M, respectively for cefadroxil and cefoperazone. Similarly limit of quantification (S/N=10) was 1, M for cefadroxil and 2, M for cefoperazone. The cefoperazone analysis with these optimized method was carried out in pharmaceutical and biological sample. In such applications, recovery values around 100% were reconised. To characterize the mass transfer to the electrode surface, effect of the scan rate on the peak currents was examined by the cyclic voltammetry method. It is determined that electrochemical behavior was diffusion controlled. Keywords: Cefalosporin, Drug Analysis, Antibiotic, Electrochemical Biosensors 2014, 100pages. v

10 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimine başladığım ilk günden itibaren her konuda desteğini gördüğüm, bilgi ve yaklaşımı ile örnek aldığım, çalışma azmini bana yansıtan, en önemlisi bana insani değerlerin her şeyden yüce olduğunu öğreten ve yolumu aydınlatan değerli danışman hocam Doç. Dr. Sabriye PERÇİN ÖZKORUCUKLU ya teşekkürlerimi sunmaktan onur duyarım. Düşlediğim geleceğe ulaşmam için kilometrelerce öteden maddi manevi desteklerini esirgemeyen babam Feridun İPEKÇİ ile annem Meryem İPEKÇİ ye ve ablam Şule ERBİL ile eniştem Orçun ERBİL e teşekkürü borç bilirim. Yüksek lisans öğrenimim süresince karşılaştığım zorluk ve sıkıntılarda her zaman yanımda olan ve beni yüreklendirip umut veren arkadaşlarım Gizem YILDIRIM a, Cansel ÇAKIR a ve Elif SEKMEN e değerli dostlukları için sonsuz teşekkür ederim YL2-13 no lu proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na teşekkür ederim. Seher İPEKÇİ ISPARTA, 2014 vi

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1.1. Elektroanalitik tekniklerin sınıflandırılması... 4 Şekil 1.2. Doğrusal taramalı voltamogram eğrisi... 7 Şekil 1.3. (a) 1 M HCl de 5x10-4 M Cd 2+ (b) 1 M HCl çözeltisi için pologramlar... 8 Şekil 1.4. Voltameterik hücre ve bileşenleri Şekil 1.5. Voltametride kullanılan çalışma elektrotları Şekil 1.6. Karbon grafit elektrot Şekil 1.7. Kalomel elektrotun şematik gösterimi Şekil 1.8. Ag/AgCl referans elektrotunun şematik gösterimi Şekil 1.9. Tipik bir doğrusal taramalı voltamogram Şekil Voltamogramın elde edilmesinde kullanılan dönüşümlü voltametrik uyarma sinyali Şekil Pik potansiyellerini ve akımlarını gösteren klasik bir dönüşümlü voltamogram Şekil Elektrot yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabaka Şekil Elektrokimyasal çalışmalarda pik şeklini ve pik akımını etkileyen olası dönüşümler Şekil Normal puls voltametrisinde (a) uyarma sinyali ve (b) elde edilen voltamogram Şekil Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri Şekil Kare dalga voltametrisinde uyarma sinyallerinin oluşumu Şekil Beta laktam halkası Şekil Bakteri hücre duvarındaki proteini oluşturan zincirsel yapılar ve aminoasit bağlantıları Şekil Sefalosporinlerin yapısı Şekil Gram (+) ve gram (-) bakterilerde sefalosporinlerin etki mekanizması Şekil Sefalosporinlerin sınıflandırılması Şekil Sefolasporinlerin yapısı Şekil Sefadroksilin yapısı Şekil Biyosensörlerin yapısı ve çalışma prensibi Şekil Analizlenecek madde-biyoaktif bilesen ilişkisine göre; a) Biyoafinite esaslı biyosensorler, b) Biyokatalitik esaslı biyosensörler, c) İmmobilize hücre esaslı biyosensorler, d) Transmembran esaslı biyosensörler Şekil Enzim molekülünün jel içinde veya polimer matrikste tutuklanması Şekil Enzim molekülünün film veya tabakaya çapraz bağlanması Şekil Enzim molekülünün elektrot yüzeyinde adsorpsiyonu Şekil Amperometrik esaslı bir biyosensörun şematik gösterimi Şekil Potansiyometri esaslı biyosensörler Şekil Enzim alan etki transistörü Şekil 3.1. Autolab Potentiostat/Galvanostat PGSTAT-302N cihazı Şekil 3.2. Elektrokimyasal cam hücre Şekil 3.3. Deneylerde kullanılan elektrokimyasal hücrenin görünümü Şekil 3.4. Çalışma elektrotu olarak kullanılan 0,7 mm. HB Tombo karbon bazlı kurşun kalem ucu vii

12 Şekil 3.5. Referans elektrot olarak kullanılan Ag/AgCl elektrot Şekil 3.6. Karşıt elektrot olarak kullanılan Pt tel Şekil 4.1. a) Sefadroksil bulunmayan ve b) 0,050 mm sefadroksil içeren çözeltide (0,2 M asetat ph 5 tamponu) alınan DPV voltamogramların karşılaştırılması Şekil ,05 mm sefadroksilin asetat tamponunda ph-akım grafiği Şekil ,05 mm sefadroksilin fosfat tamponunda ph-akım grafiği Şekil ,05 mm sefadroksilin Britton Robinson tamponunda ph-akım grafiği Şekil ,05 mm sefadroksilin pik akımına destek elektrolit ve ph nın etkisi Şekil 4.6. ph 5 asetat tamponunda 0,005 mm ve 0,05 mm arasında değişen sefadroksilin derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları Şekil 4.7. Sefadroksilin asetat ph 5 tamponunda 0,005 mm ile 0,05 mm arasında değişen sefadroksil derişimlerine karşı DPV ile elde edilen akım değerlerinin grafiği Şekil ,5 mm sefadroksil içeren çözelide farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramlar Şekil 4.9. a) Sefoperazon bulunmayan ve b) 0,10 mm sefoperazon içeren çözeltide (0,2 M asetat ph 5,25 tamponu) alınan DPV voltamogramlarının karşılaştırılması Şekil ,1 mm sefoperazonun asetat tamponunda ph-akım grafiği Şekil ,1 mm sefoperazonun fosfat tamponunda ph-akım grafiği Şekil ,1 mm sefoperazonun Britton Robinsom tamponunda ph-akım grafiği Şekil ,1 mm sefoperazonun pik akımına destek elektrolit ve ph etkisi.. 79 Şekil ph 5,25 asetat tamponunda 0,05 mm ve 1 mm arasında değişen sefoperazonun derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları Şekil Sefoperazonun asetat ph 5,25 asetat tamponunda 0,05 mm ile 1 mm arasında değişen sefoperazon derişimlerine karşı elde edilen akım değerinin grafiği Şekil ,1 mm sefoperazonun 0,2 M asetat tamponunda (ph 5,25), karbon grafit elektrottaki dönüşümlü voltametri voltamogramları Şekil Sabit derişimde pik akımının tarama hıının karekökü ile değişimi.. 82 Şekil Sabit sefoperazon derişiminde pik akımının logaritmasının tarama hızının logaritması ile değişimi Şekil Sefoperazon içeren sülperazon isimli farmasötik numunenin ph 5,25 asetat tamponunda 0,25 mm, 0,50 mm ve 0,75 mm derişimlerinde DPV yöntemi ile alınan voltamogramları Şekil Sefoperazon içeren kan numunesinin ph 5,25 asetat tamponunda 0,25 mm, 0,30 mm ve 0,50 mm derişimleri için alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları Şekil İdrar numunesinin ph 5,25 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları Şekil İdrar numunesinin ph 5,00 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları Şekil İdrar numunesinin ph 5,00 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları viii

13 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 3.1. Kullanılan kimyasal maddeler...65 Çizelge 3.2. Sefadroksilin özellikleri...66 Çizelge 3.3. Sefoperazonun özellikleri...66 Çizelge 5.1. Sefalosporinler için elde edilen optimum çalışma koşulları...90 Çizelge 5.2. Sefadroksil ve sefoperazon için yükseltgenme gerilimi ve yükseltgenme akım değerleri...90 Çizelge 5.3. Sefadroksil ve sefoperazon için gözlenebilme ve alt tayin sınır değerleri...91 Çizelge 5.4. Sefoperazon için çalışılan farmasötik numunenin tayin sonuçları.92 Çizelge 5.5. Sefoperazon için çalışılan kan numunesinin tayin sonuçları...93 ix

14 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ACN : Asetonitril BR : Britton Robinson tamponu CV : Dönüşümlü voltametri DC Doğru akım DPV : Diferansiyel puls voltametri DKE : Doygun kalomel elektrot GC : Camsı karbon elektrot KDV : Kare dalga voltametri N : Gürültü NPV : Normal puls voltametri PV : Puls voltametrisi PGE : Kalem ucu grafit elektrot RSD : Bağıl standart sapma S : Sinyal SHE : Referans hidrojen elektrot x

15 1. GİRİŞ Günümüzde antibiyotiklerin yaygın ve kontrolsüz kullanılması, yoğun bakım desteği, kemoterapi, transplantasyon olanakları sayesinde insan ömrünün uzaması, yaşlı popülasyonunun artması antibiyotik tüketiminde artışa neden olmuştur. Beta laktam antibiyotikler yan etkilerinin azlığı ve bakterisid olmaları nedeniyle günümüzde en sık kullanılan antibiyotik grubudur. Betal laktam antibiyotiklerden en çok tüketilen türlerinden sefalosporinler yarı sentetik antibiyotiklerdir ve antimikrobiyal etki spektrumlarına göre dört ana kuşakta sınıflandırılırlar. Genel bir kural olarak, birinci kuşak bileşikler gram (+) organizmalara karşı daha iyi aktiviteye sahipken, diğer bileşikler gram (-) aerobik organizmalara karşı daha iyileştirilmiş aktiviteye sahiptirler. İlaç analiz yöntemleri, oluşturulan ilaç formunda yer alan (tablet, kapsül vb.) etken maddenin tanımlanmasında, beyan edilen dozun nicel analizinden ve her ilaç formundaki dozun aynı olduğunu kanıtlamak amacıyla kullanılmaktadır. Etken maddelerin analizinin yanı sıra ilaç formunda bulunan koruyucuların nicel analizinin yapılmasın da ilaç raf ömrünün belirlenebilmesi açısından önemlidir. Diğer yandan ilacın saflığının ve kararlılığının sağlanabilmesi için üretim sürecinden kaynaklanabilecek safsızlıkların izlenmesi de gereklidir. Ayrıca, klinik çalışmalar sırasında plazma ve serum gibi fizyolojik sıvılarda ilaç ve olası metabolitlerin tayini içinde analiz yöntemleri kullanılmaktadır. İlaç analizleri veya biyolojik öneme sahip moleküllerin analizlerinde yöntem geliştirilirken biyolojik ortamın karmaşık yapısı ve olası girişim etkileri de göz önünde bulundurulmalıdır. Bu zorlukların üstesinden gelebilmek için birçok yöntemde; ayırma, saflaştırma, özütleme, deriştirme gibi bazı ön işlemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu ön işlemler ise hem analizin maliyetini arttırmakta hem de analiz için gerekli sürenin uzamasına sebep olmaktadır. İlaç analizlerinde kromatografik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin aynı anda çok sayıdaki molekülün tayinini mümkün kılması, kolay 1

16 uygulanabilir olması, tekrarlanabilir sonuç vermesi gibi birtakım üstünlükleri mevcuttur. Bu üstünlüklerin yanısıra karmaşık ve pahalı cihazlara gereksinim duyulması gibi dezavantajları da vardır. Ayrıca bu yöntemlerin uygulanmasında fazla miktarda kimyasala ihtiyaç duyulması da ayrı bir dezavantajdır. Son zamanlarda voltametrik yöntemlerin elektrokimyasal olarak aktif olan türlerin tayininde yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanması oldukça dikkat çekicidir. Bu yöntemler kolay uygulanabilmekte, diğer yöntemlerden daha az miktarlarda kimyasal kullanılmakta ve gerekli sistemler daha ucuza kurulabilmektedir. En önemlisi, geliştirilen elektrokimyasal yöntemlerin gözlenebilme ve alt tayin sınırları diğer yöntemlerde bulunanlara göre oldukça düşük olabilmektedir. Ayrıca numunenin ayrı bir ön işleme tabii tutulmaması bu yöntemlerin ilaç analizlerindeki kullanımını arttırmaktadır. Voltametri ve polarografi yöntemleri ilaç analizlerinde ilk kez 1954 Çekoslovak farmakopesinde kullanılmıştır. Voltametri ile saf etkin maddenin yanında çok kompleks bir karışım olsa bile (çözünmeyen ilaç katkı maddeleri, serum yada plazmada bulunan endojen maddeler v.b.) aktif maddelerin analizi duyarlılıkla ve herhangi bir girişim olmaksızın yapılabilmektedir. Polarografik veya voltametrik yöntemlere pek çok ilaç etkin maddesi ve vücutta bulunan fizyolojik aktif maddeler cevap vermektedir. İlaç analizlerinde kromatografik ve fotometrik yöntemlere alternatif yöntem olarak nitelendirilen modern voltametri bu yöntemlerle yarışmalı olmaktan çok onları tamamlayıcı niteliktedir (Wang vd., 2006). Bu tez çalışmasında sefalosporinler grubu bazı bileşiklerin (sefoperazon, sefadroksil) elektrokimyasal davranışları karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls voltametri yöntemiyle incelenmiştir. Bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine destek elektrolitin ve destek elektrolit ph sının etkileri incelenerek; pik akımı ve gerilimlerinin destek elektrolit ph sı ile değişimleri değerlendirilmiştir. Elektrot yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik akımları üzerine tarama hızının etkisi bakılmıştır. Elektrokimyasal davranışları belirlenen bileşikleri içeren farmasötik dozaj formlarında, insan idrar veserum örneklerinde bu bileşiklerin analizleri belirlenen optimum deneysel 2

17 koşullardagerçekleştirilmiştir. Sefalosporin grubu bileşikler için geliştirilen metodun doğruluğu, duyarlılığı, uygulanabilirliği ve tutarlılığını gösterebilmek için gerekli validasyon parametreleri çalışılmıştır Elektroanalitik Kimya Elektroanalitik kimya; çözeltilerin elektrokimyasal bir hücrede elektriksel özelliklerinin ölçülmesi ve ölçülen bu özelliklerinden yararlanılarak maddelerin kalitatif ve kantitatif analizine dayanan teknikleri içeren, Analitik Kimya biliminin önemli bir dalıdır. Maddelerin elektrokimyasal özelliklerini analiz amacıyla kullanılan yöntemlere de elektroanalitik yöntemler adı verilir (Skoog vd., 1996). Elektrokimyasal tepkimelerde, yükseltgenme (elektron verme) indirgenme(elektron alma) reaksiyonları söz konusudur ve elektrokimyasal hücre adı verilen bir hücrede gerçekleşir. Bir elektrokimyasal tepkimenin oluşabilmesi için, incelenecek maddeyi içeren ve elektriksel iletkenliği sağlayan bir çözelti (tampon çözelti), maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrot sistemi (genellikle üçlü elektrot sistemi) ve bu elektrotları birbirine bağlayan bir çevirim sistemi (transducer) gereklidir. Hücrede bulunan iyon ve molekül halindeki madde katot adı verilen elektrotta elektron alarak indirgenir. Bu indirgenme ile birlikte yürüyen anot adı verilen elektrotta ise iyon veya molekül halindeki madde ya da elektrot malzemesinin kendisi elektron vererek yükseltgenir. Böylece elektrotlarda tepkimeye giren her bir tür, dış devrede belli sayıda elektronun iletilmesine neden olur. Elektrik akımı elektrik yükünün akışı nedeniyle oluşur. Elektrotları birbirine bağlayan devredeki metalik kısımlarda elektrik yükü elektronlar tarafından taşınır. Metallerde bulunan değerlik elektronları, bir örgü düzeni içinde bulunan ve belli bir frekans ile titreşen metal iyonları arasında serbestçe hareket ederek yükü taşırlar. Çözeltide ise elektrik yükünün taşınması bu ortamlarda bulunan iyonlar tarafından gerçekleştirilir. Metallerdeki elektronların elektrik yükünü taşıması sonucu ise iyonik iletkenlik oluşur. Elektroanalitik yöntemlerin avantajları; Hızlı ve tekrar edilebilirlikleri yüksektir, Kullanılan cihazlar diğer yöntemlerde kullanılan cihazlara göre daha ucuzdur, 3

18 Analizi yapılacak maddenin çok düşük tayin sınırlarına kadar ulaşılabilir, Elde edilen elektrokimyasal ölçümler çoğu kez bir elementin ya da molekülün özel bir yükseltgenme basamağı için spesifiktirler (Tural vd., 2003). Elektroanalitik yöntemler, net akımın sıfır olduğu denge durumundaki statik (i=0) yöntemler ve denge durumundan uzakta net akımın gözlendiği dinamik (i 0) yöntemler olmak üzere esas olarak iki ana grupta sınıflandırılmaktadır. Dinamik yöntemler genelde ya potansiyel kontrollü ya da akım kontrollüdür. Potansiyel veya akımın kontrol edildiği yöntemlerde bu parametreler, büyük genlikli veya küçük genlikli olarak uygulanır. Elektroanalitik yöntemlerin çok çeşitli sınıflandırma yolları vardır. En yaygın olarak kullanılan, sınıflandırma şekli aşağıda verildiği gibidir (Kissinger ve Heineman, 1996). Şekil 1.1. Elektroanalitik tekniklerin sınıflandırılması 1.2. Voltametri Potansiyel kontrollü tekniklerden olan voltametri, elektroaktif türlerin bulunduğu hücrede elektrota uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesi temeline dayanan elektroanalitik yöntemlerin genel adıdır (Bond, 1980; Bard ve Rubinstein, 1999; Wang vd., 2006). Voltametride, çalışma elektrotunun potansiyeli 4

19 bir potansiyometre yardımıyla referans elektrota karşı değiştirilir ve hücreden (üç elektrotlu sistemlerde çalışma elektrotu ile yardımcı elektrot arasından, iki elektrotlu sistemlerde çalışma elektrotu ile referans elektrot arasından) geçen akım galvonometreyle ölçülür. Ölçülen akımın uygulanan potansiyele karşı grafiği çizilir. Bu akım potansiyel eğrilerine voltamogram adı verilir (Bond, 1980). Voltametrinin temelleri, Çek kimyager Jaroslav Heyrovsky tarafından 1922 yılında polarografi denen bir teknikle atılmış ve ilerleyen yıllarda bu teknik geliştirilip yaygınlaştırılmıştır. Polarografide çalışma elektrotu olarak damlayan civa elektrot kullanılmaktadır. Günümüzde ise voltametrik teknikler farmasötik, biyolojik (idrar, serum, vb.) ve çevre örneklerinin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun nedeni; düşük derişimlerde farmasötik analizlerin yapılabilmesi, numunelerin kolayca ve çok kısa bir sürede hazırlanabilmesi, analiz süresinin kısa olması, ortamda bulunan katkı maddelerinin veya safsızlıkların analiz sonucunu etkilememesi ve bu tekniklerin ürün kalite kontrolünde kullanılabilmesidir. Tablet, kapsül, süspansiyon, şurup gibi ilaç formülasyonlarının çözünmeyen kısımlarının veya katı maddelerin genelde elektroaktiviteleri bulunmadığı için herhangi bir ayırma işlemine gerek olmadan analizleri yapılabilmektedir. Ayrıca diğer bir avantajı da, daha ekonomik olması ve ilaçların analizinde çok az miktarda numuneye ihtiyaç duyulmasıdır. Çevre örneklerinde (toprak, su) ise özellikle eser miktardaki toksik ağır metal ve bunların farklı yükseltgenme basamağındaki türlerin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır Voltametride kullanılan parametreler Sınır akımı Uygulanan belirli bir potansiyelden sonra akımın sabit kaldığı bir plato bölgesine ulaşılır. Bu akıma sınır akımı adı verilir. Bu akım elektrot yüzeyinde elektroetkin türün derişiminin sıfıra gittiği andaki akım değeridir ve potansiyelden bağımsızdır. Sınır akımı, analitin kütle aktarım işlemiyle elektrot yüzeyine taşınma hızındaki 5

20 sınırlamadan kaynaklanır. Sınır akımları genellikle analitin derişimi ile doğru orantılıdır. İ1 = k.ca (1.1) Burada; CA : Analit derişimi, k : Bir sabittir. Kantitatif doğrusal taramalı voltametri bu ilişkiye dayanır. Bunun dışında, hızlı bir şekilde sınır akımları elde etmek için çözelti veya mikroelektrot sürekli ve tekrarlanabilir bir hareket halinde olmalı ya da damlayan cıva elektrot gibi bir damlayan elektrot kullanılmalıdır Yarı dalga potansiyeli Akımın, sınır akımının yarısına ( is/2) karşılık gelen potansiyel değeridir ve E1/2 ile gösterilir. Referans elektrot potansiyeline göre düzeltildikten sonra yarı dalga potansiyeli, reaksiyonun potansiyeli ile yakından ilgilidir. Yarı dalga potansiyelleri bazen bir çözeltideki bileşenlerin belirlenmesinde faydalıdır Artık akım Elektrot üzerinde henüz reaksiyon olmadığı zaman küçük de olsa bir akım gözlenir. Bu akıma artık akım denir. Artık akımın büyüklüğü yöntemin duyarlılığını belirler. Bu akım giderildiği veya en aza indirildiği oranda duyarlılık artar. Sınır akımı ileartık akım arasındaki yükseklik, dalga yüksekliğidir. Dalga yüksekliği, elektroaktif maddenin konsantrasyonu ile doğrusal olarak artar. Bu akımın sebebi, hemen hemen bütün çözeltilerde bulunan eser miktarlardaki safsızlıkların indirgenmesidir. Bu safsızlıklar içinde az miktarda çözünmüş oksijen, damıtık sudan gelen ağır metal iyonları ve destek elektrolit olarak kullanılan tuzdaki safsızlıklar sayılabilir. Şekil 1.2 de doğrusal taramalı voltamogram eğrisi üzerinde sınır akımı, yarı dalga potansiyeli ve artık akım gösterilmiştir. 6

21 Şekil 1.2. Doğrusal taramalı voltamogram eğrisi Göç akımı Eğer incelenecek olan elektroaktif madde iyonik yapıda ise bu iyonlarla elektrot arasında elektrostatik etkileşim söz konusudur. Herhangi bir elektrostatik etkinin olmadığı koşullarda ölçülen sınır ile bu koşullarda elde edilen sınır akımı arasındaki farka göç akımı denir. Polarografide elektroaktif türün göç akımı istenmediğinden ortama yüksek derişimde destek elektrolit eklenerek, incelenecek türün göç akımı önlenir. Bu durumda incelenecek türün taşıma sayısı, minimuma düşürülerek elektrostatik göç elektroinaktif olan elektrolit tarafından sağlanır Difüzyon akımı Polarografide dalga yüksekliğinin en önemli bileşeni difüzyon akımıdır. Polarografik şartlar, dalga yüksekliğinin sadece difüzyon akımından dolayı olması için ayarlanır. Yani madde aktarımının sadece difüzyonla olması istenir. Plato bölgesinde elektroaktif tür elektrot yüzeyine gelir gelmez indirgenir veya yükseltgenir. Bu durumda elektrot yüzeyinin hemen yanındaki tabakada derişim sıfır olur. Elektrot yüzeyi ile ana çözelti arasında derişim farkı olacağından difüzyon kuvveti oluşur. Polarografide elektroaktif türün sadece bu derişim farkından dolayı elektrot yüzeyine gelmesi istenir. 7

22 Polarografideki tek kütle aktarım şekli difüzyondur. İşte bu sebepten polarografik sınır akımlarına genellikle difüzyon akımları denir. Yani; akımın büyüklüğü, analitin damlayan cıva elektrot yüzeyine sadece difüzyon hızı ile sınırlandığı zaman polarografide gözlenen sınır akımıdır. Difüzyon akımı, analit derişimiyle orantılıdır. Şekil 1.3 de gösterildiği gibi difüzyon akımı, sınır akımı ile artık akımlar arasındaki farktır. Şekil 1.3. (a) 1 M HCl de 5x10-4 M Cd 2+ (b) 1 M HCl çözeltisi için pologramlar Genellikle sınır akımının şu akımlardan oluştuğu söylenebilir; (İd) difüzyon akımı, (İk) cıva damlası etrafındaki çift tabakanın yüklenme veya boşalmasından oluşan kapasitif akımı, (İf) elektrottaki önceki elektrolitik proseslere bağlı faraday akımı, (İm) elektroliz olabilen maddenin transfer sayısının yeterince büyük olması halinde ilettiği taşıma, (İa) çözelti-elektrot ortak yüzeyinde çözeltinin karıştırılmasında indirgenebilir maddelerin adsorbsiyonundan ve diğer olaylardan meydana gelen akımdır (Sakallı, 2006). Böylece şu eşitlik yazılabilir: İi = İd + İk + İf + İm + İa (1.2) 8

23 Nernst eşitliği Elektrokimyasal bir analizde elektroaktif türün elektrot yüzeyindeki konsantrasyonunu bulmak için elektrot potansiyellerinin kullanılması Nernst denklemine göre açıklanabilir. Çözelti ve elektrot arasındaki yüzeyden akımın iletimi sırasında, elektrotlardan birinde yükseltgenme reaksiyonları olurken diğerinde indirgenme reaksiyonu meydana gelir. Bu reaksiyonlarda; O + ne - R (1.3) O ve R nin, sırasıyla, redoks çiftinin, yükseltgenmiş ve indirgenmiş şeklini ifade ettiği tepkime ile gösterilmektedir. Termodinamik kurallarla kontrol edilen sistemlerde, elektrot potansiyeli, elektroaktif türün elektrot yüzeyindeki derişiminin [C 0 (0,t) ve C R (0,t)], Nernst Denklemine göre saptanmasında kullanılabilir. E = E 0 + 2,303 RT / nf log (C0/CR) (1.4) E 0 = Redoks tepkimesi için standart potansiyel R = Gaz sabiti (8,314 JK -1 mol -1 ) T = Sıcaklık (K) n = Reaksiyonda transfer edilen elektron sayısı F = Faraday sabiti (96,487 coulombs) Voltametrik kap bileşenleri Voltametrik ölçümler voltametrik hücrede yapılır. Voltametrik hücre; voltametrik kap, çalışma elektrotu, karşılaştırma (referans) elektrotu, yardımcı elektrot ve destek elektrolitten oluşur. 9

24 Şekil 1.4. Voltameterik hücre ve bileşenleri Voltametrik kap Voltametrik analizler cam, kuvars veya teflon kaplarda yürütülür. Kabın yapıldığı malzeme kirlenme ve adsorpsiyon yanılgılarının en az olduğu maddelerden seçilir (Yılmaz, 2008) Destek elektrolit Hücre içindeki çözeltilerde tayini yapılacak maddeden (analitten) başka bir madde daha bulunur. Buna destek maddesi veya destek elektrolit denir. Destek elektrolit deney şartlarında elektroaktif olmayan (elektrolizlenmeyen) maddedir. Hidrodinamik voltametride iyonların elektrik çekim etkisiyle elektrotlara göç etmelerini en aza indirmek için destek elektrolit ilave edilir. Destek elektrolitin konsantrasyonu, tayini yapılan maddenin konsantrasyonunun en az 80 katı olması gerekir. Bu şartlarda tayini yapılanın elektrik etkisiyle elektrota doğru göçü ve dolayısıyla taşıdıkları elektrik miktarı ihmal edilecek seviyeye gelir. Bu da tayini yapılacak iyonun, zıt yüklü elektrota doğru çekiminin veya göçünün elektrota uygulanan potansiyelden bağımsız hale geldiğini gösterir. Voltametride destek elektrolit, analit çözeltisine fazla miktarda ilave edilen bir tuzdur. En yaygın tuzlar, analit tayininde kullanılan potansiyelde mikroelektrotta reaksiyona girmeyen alkali metal tuzlarıdır. Bu amaçla ortama KCl, KNO3gibi bir organik tuz, bir mineral asidi veya baz katılabilir. Sitrik asit/sitrat veya asetik 10

25 asit/asetat gibi tampon sistemleri ph kontrolünün gerektiği konularda destek elektrolit olarak kullanılabilir. Çalışmalardaki destek elektrolit konsantrasyonu 0,01-1,0 M arasında değişir ve genellikle 0,1 M civarında kullanılır. Ohmik düşmelerdeki değişmelerden sakınmak için, destek elektrolit konsantrasyonu örnekten örneğe hep aynı şekilde olmalıdır. Destek elektrolit hazırlanmasında çok yüksek saflıkta reaktifler kullanılır. Belirli bir elektrokimyasal teknik için kullanılan özel bir elektrolit yoktur, ancak o tekniğin şartlarına göre seçim yapılır. Örneğin polarografi için yaygın elektrolit türleri 0,1 M KCl, LiCl, NH4Cl dür. Tampon olarak asidik bölgede asetik asit/asetat, bazik bölgede amonyum klorür/amonyak tamponu kullanılır. Bununla birlikte sitrat, malonat ve fosfat tamponları kullanılan diğer destek elektrolitlerdir (Erdoğdu, 1995) Çalışma elektrotu Elektroanalitik kimyada çalışma elektrotu, potansiyeli zamanla değişen ve üzerinde analitin yükseltgendiği veya indirgendiği mikroelektrottur. İndirgenme veya yükseltgenme bu elektrotta gerçekleşir. Bu elektrota genel olarak indikatör elektrot da denir. Voltametrik yöntemlerde kullanılan çalışma elektrotları polarlanmanın olabilmesi için küçük yüzey alanına sahip olmalıdır. Bunun için kullanılan çalışma elektrotları mikroelektrotlardır. Mikroelektrotların kullanılması sonucunda örnekteki elektroaktif türlerin çok küçük bir miktarı elektrokimyasal tepkimeye girmektedir. Böylece örneğin bileşimi hemen hemen aynı kalır. Bunun sonucunda aynı örneğin defalarca voltamogramı alınabilmektedir. Çalışma elektrotu ile referans elektrot arasında potansiyel uygulanırken, çalışma elektrotu ile karşıt elektrot arasında akım kaydedilir (Türe, 2008). Çalışma elektrotunun malzemesi, voltametrik işlemin performansını büyük ölçüde etkiler. Çalışma elektrotu, büyük sinyal/gürültü özelliğine sahip olmalı ve tekrarlanır cevaplar vermelidir. Bu yüzden elektrot seçimi öncelikle iki faktöre dayanır. Bu faktörler hedef analitin redoks davranışı ve ölçüm için gerekli olan potansiyel bölgesindeki zemin akımıdır. Diğer faktörler ise potansiyel aralığı, elektriksel 11

26 iletkenlik, yüzeyin yenilenebilmesi, mekanik özellikler, maliyet, uygunluk ve toksik etkidir. Kullanılan her malzeme kendine has avantaj ve dezavantajlara sahiptir ve mümkün olduğunca çok gereksinime cevap verecek şekilde seçilmelidir. Elektro analizler için çalışma elektrotu olarak birçok malzeme kullanılmaktadır. En sık kullanılanları cıva, karbon veya platin ve altın gibi soy metallerdir (Wang, 2001). Şekil 1.5. Voltametride kullanılan çalışma elektrotları Cıva kökenli elektrotlar Cıva elektrotlar, üzerinde hidrojenin çıkış potansiyelinin büyük olması nedeniyle oldukça geniş bir katodik çalışma potansiyel aralığına ve her damlada yenilenen elektrot yüzeyine sahiptirler. Metallerle amalgam oluşturma özelliğinden dolayı, metal iyonlarının metalik halde önderiştirilmesini sağlarlar. Bu özellikleri nedeniyle de voltametride oldukça geniş bir kullanım alanı bulurlar (Haskılıç, 2005). Damlayan cıva elektrot, asılı cıva damla elektrot ve cıva film elektrot bu amaçla kullanılan elektrotlardır. Bütün bu üstün özelliklerine karşın cıva elektrotların bazı sınırlamaları da vardır. Metalik cıvanın düşük pozitif gerilimde bile kolayca yükseltgenebilmesi ( +0.4V ), cıva elektrotun kullanılmasını sınırlayan en önemli özelliklerden birisidir. 12

27 Ayrıca kullanılan cıvanın temizlenmesi, damlama süresinin ayarlanmasının zorluğu, cıvanın damlatılmasında kullanılan kılcalların tıkanması, cıva buharlarının toksik olması ve tekniğin doğrudan doğruya uygulanamaması bu elektrotun kullanılmasındaki başlıca sorunlardır (Tural vd., 2003) Katı elektrotlar Civa kökenli elektrotların anodik çalışma bölgesi dardır. Elektrot yapılan malzemenin anodik çözünmesinin daha pozitif potansiyellerde olması, bu elektrotlara daha geniş anodik çalışma bölgesi sağlar. Bu nedenle bu özelliğe sahip platin, altın gibi soy metaller ve karbon, elektrot yapımında kullanılır. Fakat yüzeylerinin yenilenmemesi ve yüzeylerin kirlenmesi elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini azaltır. Platin elektrot, en çok kullanılan katı elektrottur. Oksit oluşumundan dolayı kirlenebilir yüzeye sahiptir. Bu nedenle düşük tekrarlanabilirlik gösterir. Altın elektrot, oksit oluşumundan az etkilendiği gibi adsorbsiyonu da platin elektrota göre daha azdır. Bizmut elektrot, hidrojenin bizmut üzerinden çıkış potansiyelinin aşırı yüksek olması, bizmutun katodik bölgede kullanılma olasılığını ortaya koymuştur. Uçucu ve zehirli olmaması cıvaya göre üstünlüğüdür. Karbon elektrot, karbon geniş bir anodik potansiyel aralığına, düşük elektriksel dirence, düşük artık akıma ve tekrarlanabilir yüzey yapısına sahip oluşu gibi birçok özellikleri yönünden ideal bir elektrot malzemesidir. Karbon elektrot çeşitleri; Grafit, Karbon pasta, Camsı karbon, Perde baskılı karbon elektrotlar olarak sıralanabilir. 13

28 Grafit elektrot;grafit ve grafit çubuklar yalnız grafit kömüründen imal edilir. Toz ve sıkı bir yapıya sahiptir. Grafit elektrot olarak genellikle karbon grafit elektrotlar kullanılmaktadır. Bunun sebebi oldukça kolay hazırlanabilmesi, ucuz olması ve tek kullanımlık olmasıdır (Erdoğdu, 1995). Elektrokimyasal çalışmalarda geniş bir kullanım alanı vardır. Analizi yapılacak maddeler, uygun elektrokimyasal teknikler kullanılarak daha düşük tayin sınırlarına ulaşılabilir. Şekil 1.6. Karbon grafit elektrot Modifiye elektrotlar Voltametride kullanılan elektrotların sınırlı olması nedeniyle elektrotların kimyasal veya elektrokimyasal özellikleri değiştirilerek çalışma şartları geliştirilmiştir. Modifiye elektrotlar, genel olarak elektrot yüzeyinde önderiştirme sağlayan kimyasal maddelerle işlem veya elektrot yüzeyinin elektron aktarma özelliğini değiştiren işlem (elektrokataliz) yapılarak hazırlanır (Yılmaz, 2008). Kompozit Elektrotlar:Modifiye edici kimyasal doğrudan iletken malzemesine katılıp, karıştırılarak elektrot hazırlanabilir. Bu tür elektrotlara kompozit elektrotlar adı verilir. Kimyasal modifiye elektrotlar: Modifiye edici kimyasal elektrot yüzeyine kimyasal bağla veya kimyasal adsorpsiyonla bağlanarak kimyasal modifiye 14

29 elektrotlar hazırlanabilir. Ayrıca modifiye edici uygun bir monomer elektrotyüzeyinde elektropolimerizasyona uğratılarak ya da elektrot yüzeyinde doğrudan polimer film oluşturularak da bu tür elektrotlar hazırlanabilir Dönen elektrotlar Dönen elektrotlar; dönen-disk ve halka-disk elektrotlar olarak ikiye ayrılır. Bu elektrotlar platin ve camsı karbondan yapılıp, bir motor sistemi ile dönme hızları kontrol edilir. Kimi zaman diğer katı elektrotlar doğrudan veya cıva ile kaplanarak da kullanılabilir. Dönen disk elektrotlarla elektrota madde taşınması konvektif difüzyonla sağlandığından durgun elektrotlardan daha büyük bir akım yoğunluğu sağlarlar. Bu nedenle, bu tür elektrotlarla yapılan ölçümlerde duyarlık daha yüksektir. Halka-disk elektrotlar, ortadaki diskten elektriksel olarak yalıtılmış ve belli bir uzaklıkta halka şeklinde ikinci bir elektrot içerirler. Bu elektrot ikilisi kullanıldığında, disk elektrotta elektrokimyasal olarak oluşan tür, elektrotun dönme hareketiyle halka elektrota doğru taşınır Referans elektrot Bu elektrotlar, bilinen ve sabit bir potansiyel değeri sağlayan ve incelenen çözeltinin bileşiminden etkilenmeyen elektrotlardır. Karşılaştırma elektrotunun bileşimi değişmez ve analiz boyunca polarlanmadan kalır. Bu amaçla Ag/AgCl veya doygun kalomel elektrot (DKE) kullanılır. Bu elektrotlardan anodik akım geçtiğinde metaller yükseltgenir ve ortamdaki aşırı klorürle çökeldiklerinden, elektrot yüzeyindeki derişimleri değişmez ve böylece potansiyelleri akımdan bağımsız olur. Bu elektrotlardan katodik akım geçtiğinde ise, çözünürlükten gelen metal iyonları indirgenir, elektrot yüzeyinde çökelek ayrışarak tekrar aynı denge düzeyinde metal iyonu oluşturur. Böylece potansiyel yine değişmeden kalır. 15

30 İyi bir referans elektrot Tersinir olmalı, Nerst eşitliğine uymalı, Zamanla bağımlı olmayan sabit bir potansiyel vermeli, Az miktarlarda akım elde edildikten sonra yine eski haline kısa sürede dönmeli, Sıcaklık değişimlerinde önemli bir değişiklik göstermemelidir Kalomel elektrot, Hg/Hg2Cl2 Elektrotta gerçekleşen; Hg2Cl2 + 2e - 2Hg + 2Cl - E 0 = 0,268 V ( 25 0 C, SHE ) bu reaksiyonun potansiyeli ortamdaki klor iyonu konsantrasyonuna bağlıdır. Kalomel elektrot, referans elektrot olarak çok kullanılan elektrotlardan bir tanesidir. Laboratuvarda kolaylıkla hazırlanabilir. Dengeye gelmesi için yapıldıktan sonra birkaç gün bekletilmelidir. Sıcaklık değişimlerinden kolay etkilenen bir elektrottur. Yarı-hücre diyagramı: Hg Hg2Cl2 (doygun), KCl (x M) Nernst eşitliği: E = E 0 0,0591 log acl - (1.5) Şekil 1.7. Kalomel elektrotun şematik gösterimi 16

31 Gümüş/gümüş klorür elektrot Elektrotta gerçekleşen; AgCl (k) +e - Ag (k) + Cl - E 0 = 0,222 V ( 25 0 C, SHE ) reaksiyonuna dayanır. Bir tüpün en alt kısmında cam veya plastikten yapılmış poröz bir tıpa, bunun üstünde çözelti sızmalarını önlemek için potasyum klorürce doymuş bir köprü, onun üstünde katı potasyum klorür ve en üstte de içine 1 2 damla gümüş nitrat damlatılmış doymuş potasyum klorür çözeltisi bulunur. Bu çözeltinin içine ucu AgCl ile kaplanmış gümüş bir tel daldırılır. Gümüş-gümüş klorür referans elektrotları da doygun kalomel elektrotlar gibi oldukça yaygın kullanılırlar. Bu elektrot doygun kalomel elektroda göre daha yüksek sıcaklıklarda kullanılabilir ve daha az analitle reaksiyona girer. Yarı-hücre diyagramı: Ag (k) AgCl (doygun), KCl (xm) Nernst eşitliği: E = E 0 0,0591 log acl - (1.6) Şekil 1.8. Ag/AgCl referans elektrotunun şematik gösterimi 17

32 Karşıt (yardımcı) elektrot İki elektrotlu sistemlerdeki polarlanmayan elektrot, üzerinden yüksek akım geçtiğinden polarlanır. Ayrıca eğer çözelti direnci yüksek ise bu direnci yenmek için gerekli potansiyel önemli düzeye çıkacağından, çalışma elektrotunun polarizasyon potansiyeli yanlış algılanabilir. Bu karışıklığın önlenmesi için üçüncü bir elektrotun yani yardımcı bir elektrotun kullanılması gerekir. Çalışma elektrotu ve yardımcı elektrottan akım geçirilip çalışma elektrotunun potansiyeli, karşılaştırma elektrotuna karşı sıfır akım altında saptanır. Akım yardımcı elektrot üzerinden geçtiği için bu elektrotların platin, grafit, tantal ve tungsten gibi soymetal olmaları gerekmektedir. Ayrıca çok küçük hacimlerle çalışıldığında yardımcı elektrottaki ürünlerin çalışma elektrotunda girişim yapmayacağı ve çalışma elektrotunun alanının en az 50 katı olan elektrotlar seçilmelidir. Helezon şeklinde sarılmış bir Pt tel, elektriğin kaynaktan gelerek çözelti içinden mikroelektrota aktarılmasını sağlayan karşıt elektrot olarak çalışır. Karşı elektrotun çalışma elektrotundaki reaksiyona etkisi olmaz, sadece onu elektronlarla besler Voltametride kullanılan uyarma sinyalleri Doğrusal taramalı voltametri Bu yöntemde uyarma sinyali, doğru akım potansiyelinin zamanla doğrusal bir şekilde arttırılmasıyla elde edilir. Uygulanan bu potansiyel sonrasında analizlenen maddeye özgü akım cevapları, potansiyelin bir fonksiyonu olarak voltamogramlarda incelenir. Doğrusal taramalı voltametride, iyi pik maksimumları elde edebilmek için yarı dalga potansiyel farkı en az 0,2 V civarında olmalıdır. 18

33 Şekil 1.9. Tipik bir doğrusal taramalı voltamogram Şekildeki 1.9 daki voltamograma göre, başlangıçta (A noktasında) akım çok düşüktür. Safsızlık ve çift tabaka yükleme (elektrot yüzeyi kondansatör gibi davrandığından) sebebiyle A ve B noktaları arasında akım yavaşça yükselir. Bu genellikle zemin akımı olarak adlandırılır. B noktasında potansiyel, yükseltgenmiş türlerin indirgenme potansiyeli değerine yaklaşır. Potansiyel artışı elektronların, elektrottan yükseltgenmiş türe doğru artan bir hızla göç etmesine sebep olur. İndirgenmedeki hız artışı hücredeki akımı da arttırır. Bu artış sürekli devam etmez görüldüğü gibi C noktasında bir pik ile sonuçlanır Dönüşümlü voltametri (CV) Dönüşümlü voltametri, durgun bir çözelti içinde bulunan çalışma elektrotuna uygulanan potansiyel polarizasyon dalgasının düzgün bir şekilde değiştirilmesisonucu oluşan akım-potansiyel davranışını inceleyen elektrokimyasal yöntemdir. Dönüşümlü voltametri nitel analiz için kullanılan en yaygın elektrokimyasal yöntemdir (Wang vd., 2006). Çalışılan potansiyel aralığı, verilen bir deney için bir veya daha fazla analitin yükseltgenme veya indirgenmenin meydana geldiği potansiyel aralığıdır ve buna çevirici potansiyeller de denir. 19

34 Şekil Voltamogramın elde edilmesinde kullanılan dönüşümlü voltametrik uyarma sinyali Şekilde gösterildiği gibi potansiyel doğrusal olarak değiştirilir daha sonra tarama yönü tersine çevrilir ve orijinal değerine geri döner. Başlangıç taramasının yönü numunenin bileşimine bağlı olarak negatif ya da pozitif olabilir. Bu yöntemde örnek çözeltisine potansiyel uygulandığında, elektrot yüzeyi uygulanan potansiyele göre pozitif ya da negatif bir karakter gösterir ve çevresindeki çözeltiden elektron alır ya da çözeltiye elektron verir bu da ölçülebilir bir akım oluşmasına neden olur. Çalışma ortamında karıştırma yapılmadığı için elektron transferi elektrot yüzeyi ve çevresinde olur. Bu nedenle elektrot çevresindeki bileşen miktarı zamanla azalır. Sonuç olarak oluşan akımda zamanla bir pik yapar ve azalmaya başlar. Bu pikler indirgenme ve yükseltgenme pikleridir. Şekil Pik potansiyellerini ve akımlarını gösteren klasik bir dönüşümlü voltamogram Dönüşümlü voltamogramın önemli parametreleri, katodik pik potansiyeli Epc, anodik pik potansiyeli Epa, katodik pik akımı ipc ve anodik pik akımı ipa dır. Tersinir bir 20

35 elektrot reaksiyonu için anodik ve katodik pik akımları mutlak değer olarak yaklaşık eşittir; fakat zıt işaretlidir. Pik potansiyellerinin farkı 0,0592/n dir. Burada n, yarıreaksiyonda yer alan elektron sayısıdır. Tersinir bir elektrokimyasal tepkimede analite ait pik akımı aşağıdaki eşitlikle bulunur: İp = 0,27 n 3/2 AD 1/2 C v 1/2 (1.7) İp analite ait pik akımı, n transfer edilen elektron sayısı, A elektrot yüzey alanı (cm 2 ), D türlere ait difizyon katsayısı (cm 2 /s), C türlerin çözelti içerisindeki derişimleri (mm), v ise tarama hızıdır (V/s). Dönüşümlü voltametride analitin duyarlılık sınırı 10-5 M dır. Dönüşümlü voltametri rutin kantitatif analizlerde kullanılmadığı halde, özellikle organik ve metal organik sistemlerde yükseltgenme - indirgenme işlemlerin mekanizma ve hız çalışmaları için önemli bir araçtır. Bu yöntem, normal de elektrokimyasal olarak belirtilebilen bir sistemin araştırılması için seçilen ilk yöntemdir (Bard ve Rubinstein, 1999) Dönüşümlü voltametride akım çeşitleri ve önemli parameterler Diğer elektrokimyasal yöntemlerde olduğu gibi voltametrik çalışmalarda da kaynağına bağlı olarak isimlendirilen iki farklı akım vardır: a) Faradayik akım (if): Elektrotlardan birinde yükseltgenme reaksiyonu olurken diğerinde indirgenme reaksiyonu olur, bu sırada elektronların doğrudan aktarımı ile akım iletilir. Bu tip işlemlere, bir elektrottaki kimyasal reaksiyon miktarının geçen akımla orantılı olduğunu ifade eden Faraday yasalarına uygun olması nedeniyle Faradayik işlemler adı verilir. Bu şekilde oluşan akımlara Faradayik akımlar denir. Kısacası; bir elektrokimyasal hücrede elektrot/çözelti ara yüzeyi boyunca bir yükseltgenme/indirgenme işlemiyle taşınan akımdır. Reaksiyondan (analiz edilecek maddeden) kaynaklanan akımdır. Analizlenecek madde ve 21

36 ürünlerin konsantrasyonları yalnızca elektrot yüzeyinden uzaklığın bir fonksiyonu olarak ve Nerst tabakası içinde değişir. b) Kapasitif akım (ic): Elektrot/çözelti ara yüzeyindeki yüklü bir çift tabakada oluşan bir yükleme akımıdır. Bir elektrotun bir elektrolit çözeltisine daldırılması ve negatif yükle yüklenmesi ile çözeltideki pozitif yüklü iyonlar elektrota doğru çekilir. Böylece ara yüzeyde bir gerilim farkı oluşur. Ters işaretli yüklerin ara yüzeyin iki tarafında birikmesi ile bu bölgede bir elektriksel çift tabaka oluşur. Oluşan bu çift tabaka, bir kapasitör gibi davranır. Bu kapasitörü yüklemek için ortamda yükseltgenecek ve indirgenecek madde olmasa dahi bir akım oluşur. Bu akım reaksiyona bağlı değildir; sistemden kaynaklanır ki bu akıma kapasitif akım denir. Ne kadar düşük olursa o kadar doğru ölçüm yapılır. Şekil Elektrot yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabaka Örneğin ilk önce elektrota pozitif bir potansiyel uygulandığında, elektrota bitişik çözeltinin yapısını dikkate alalım. Potansiyel, uygulandıktan hemen sonra eğer elektrotun yüzeyinde reaksiyona girebilecek aktif bir tür yoksa hızlı bir şekilde sıfıra düşen anlık bir akım dalgası oluşacaktır. Bu akım her iki elektrotun da yüzeyinde bir negatif yük fazlalığı (veya eksikliği) yaratan bir yükleme akımıdır. Fakat iyonik hareketliliğin bir sonucu olarak elektrotlara bitişik olan çözelti tabakalarında derhal bir zıt yüklenme oluşur. Bu etkileşim şekil 1.12 de görülmektedir. Metal elektrotun yüzeyinde uygulanan pozitif potansiyelin bir sonucu olarak oluşan pozitif yük fazlalığı gösterilmektedir. Yüklü çözelti tabakası iki kısımdan oluşmaktadır: 22

37 (1) Bir yoğun iç tabaka (d0' dan d1' e), bu tabakada elektrot yüzeyinden uzaklaşıldıkça potansiyel mesafe ile doğrusal ilişkili olarak azalır, (2) Bir difüze tabaka (d1' den d2' ye), burada elektrot yüzeyinden uzaklaşıldıkça ortaya çıkan potansiyel üstel olarak azalır. Elektrot yüzeyindeki, yüzeye bitişik çözeltideki bu yük topluluğu bir elektriksel çift tabaka olarak adlandırılır (Bond, 1980). Toplam akım (i) = faradayik akım (if) + kapasitif akım (ic) olduğundan kapasitif akım azalırsa duyarlılık artar. Genellikle 10-3 M ve üstünde kapasitif akım, faradayik akımdan küçüktür ve çalışılabilir M da kısmen iyi sonuç alınır M ve üzerinde kapasitif akım faradayik akımdan çok büyük olacağı için çalışılmaz. Dönüşümlü voltametride çalışma elektrotuna uygulanan potansiyel için deneysel olarak kontrol edilebilecek değişik parametreler vardır. Bunlar; a) Başlangıç potansiyeli: Çalışma elektrotuna uygulanacak olan potansiyel taramasının başladığı potansiyel değeridir. Çalışmalarda başlangıç potansiyelinin elektron aktarımının olmadığı bir değer seçilmesi tercih edilir. b) Dönme potansiyeli: Potansiyel taramasının yönünün değiştirileceği (anodik yönden katodik yöne veya katodik yönden anodik yöne) potansiyel değeridir. c) Bitiş potansiyeli: Potansiyel taramasının sonlandırılacağı potansiyel değeridir. Bu değer incelenen özelliklere göre başlangıç potansiyeli ile aynı veya başlangıç potansiyelinden farklı bir değer olabilir. d) Anodik tarama: Başlangıç potansiyeline göre daha pozitif potansiyel değerine doğru yapılan potansiyel taramasıdır. Bu taramada olası yükseltgenme davranışları incelenir. 23

38 e) Katodik tarama: Başlangıç potansiyeline göre daha negatif potansiyel değerlerine doğru yapılan potansiyel taramasıdır. Bu taramada olası indirgenme davranışları incelenir. f) Tarama hızı: Başlangıç potansiyelinden bitiş potansiyeline kadar yapılacak olan potansiyel taramasında potansiyelin hangi hızda değişeceğini belirten parametredir. Tepkime mekanizmasının aydınlatılmasında oldukça önemlidir. g) Segment: Başlangıç potansiyelinden dönme potansiyeline kadar yapılan taramaya veya bu tarama sonucu elde edilen voltamograma segment denir. h) Döngü: Başlangıç potansiyelinden bitiş potansiyeline kadar yapılan, genelde iki segmentten oluşan taramaya veya bu tarama sonucu elde edilen voltamograma döngü denir. Bu parametreler kontrol edilerek sabit tarama hızında, uygulanan potansiyele karşı oluşturulan akım grafiğine volt-amperogram (voltamogram) denilir. Bir voltamogramın çalışmalara ışık tutabilecek farklı parametreleri şunlardır: a) Pik potansiyeli (Ep): Uygulanan potansiyelin elektron aktarımına sebep olduğu, faradayik akımın en yüksek değere ulaştığı andaki potansiyel değeridir. Elektrokimyasal çalışmalarda elde edilebilecek olası bir pikin potansiyeli; incelenen molekülün yapısal özelliklerine, çalışmaların yapıldığı çalışma elektrotuna, ph ya, kullanılan destek elektrolit ve çözücü cinsine, sıcaklığa ve tarama hızına göre değişiklik gösterebilir. Pik potansiyeli ve pik potansiyelindedeneysel koşullara göre meydana gelebilecek değişiklik, yapılan elektrokimyasal çalışmada elde edilecek termodinamik ve kinetik sonuçlar için oldukça önemlidir. b) Yarı pik potansiyeli (Eh, Eph, Ep1/2): Pik akımının en yüksek değerinin yarısına ulaştığı noktadaki potansiyel değeridir. Bazı durumlarda yarı pik potansiyelinin, pik potansiyeline göre daha spesifik ve termodinamik-kinetik sonuçlar için daha kesin sonuçlar verdiği bilinmektedir. 24

39 c) Yarı pik genişliği (ypg): Pik akımının en yüksek değerinin yarısına ulaştığı noktadaki pik genişliğidir. d) Pik akımı (ipa, ipc): Uygulanan potansiyel sonucunda meydana gelen elektron aktarımının oluşturduğu akımdır. Bu akımın büyüklüğü; elektron aktarımına katılan türlerin derişimine, bu türlerin difüzyon ve adsorpsiyon özelliklerine, kullanılan çalışma elektrotuna ve bu elektrotunun yüzey alanına, kullanılan destek elektrolit ve çözücü cinsine ve derişimine, sıcaklığa ve tarama hızına bağlıdır. Pik akımının ölçülmesinde farklı yaklaşımlar sergilenmekle birlikte faradayik akımın kapasitif akımdan farklılaşmaya başladığı noktaya çizilen teğet ile pik akımının maksimum değere ulaştığı noktaya çizilen teğet arasındaki dik uzaklığın ölçülmesi en doğru yaklaşımdır. e) Pik alanı (Ap): Yapılan çalışmalarda elde edilen pikin altında kalan alandır. Bazı yazılım programlarında birimi kulon bazılarında ise voltamper olarak verilmektedir. Dönüşümlü voltametride çalışmaların yapıldığı moleküllere ait karakteristik pikin şekli ve akımı Şekil 1.13 de şematik olarak gösterilen ve elektrot yüzeyinin çok yakınındaki difüzyon tabakasında meydana gelen dönüşümlerden etkilenmektedir. Şekil Elektrokimyasal çalışmalarda pik şeklini ve pik akımını etkileyen olası dönüşümler 25

40 Dönüşümlü voltametri yöntemi ile akım türünün belirlenmesi Voltametrik yöntemlerde akım türünü belirlemek oldukça önemli ve gereklidir. Çünkü akım türüne göre uygulanacak teknikler değişmektedir. Örneğin difüzyon kontrollü akım türlerinde normal teknikler, adsorpsiyon kontrollü akım türlerine ise sıyırma teknikleri uygulanır. Voltametride akım türü çeşitli yöntemlerle belirlenebilir. Bunlardan dönüşümlü voltametri yöntemiyle akım türünü belirlemek oldukça kolay ve yaygın bir tekniktir. Bu yöntemde akım türünü belirlemek için yüksek konsantrasyonda ( M ) CV yöntemiyle mvs -1 aralığındaki tarama hızlarında voltamogramlar alınıp tarama hızlarına bağlı olarak akım değişimi incelenir. Tarama hızı-akım verilerinden yararlanarak tarama hızının kareköküne karşılık pik akımı değerleri grafiği ve tarama hızının logaritmasına karşılık pik akımının logaritması grafiği çizilir. Logv-logip grafiğinin eğiminin 0,5 civarında olması akımın difüzyon kontrollü olduğunu gösterir. Ayrıca ν 1/2 -ip grafiğinin korelasyon katsayısının 1 e yakın olması yine akımın difüzyon kontrollü olduğunun diğer bir göstergesidir. Logν-logip grafiğinin eğiminin 0,75-1 aralığında olması ve ν 1/2 -ip grafiğinin korelasyon katsayısının 1 den uzaklaşması akımın adsorpsiyon kontrollü olduğunu gösterir(yılmaz, 2008) Normal puls voltametrisi (NPV) Normal puls voltametrisi yönteminde şiddeti giderek artan bir seri puls istenen zaman aralıklarında çalışma elektrotuna uygulanmaktadır. Uygulanan pulsların şiddetleri her seferinde lineer olarak arttırılırken elektrot, pulslar arasında analitin reaksiyonuna neden olmayacak sabit bir gerilimde tutulmaktadır. Akım puls uygulamasının sonuna doğru, yani yükleme akımının yaklaşık sıfır olduğu durumda ölçülmektedir. Ölçülen akım değerleri gerilime karşı grafiğe geçirildiğinde, sigmoidal şeklinde voltamogram elde edilmektedir (Perçin, 2008). Şekil 1.14 de normal puls voltametri yönteminde elektroda uygulanan potansiyel programı ve elde edilen akım-potansiyel eğrisi verilmiştir. 26

41 Voltametrinin duyarlığı artık akıma bağlı olduğundan duyarlılığı arttırmak için artık akımın giderilmesi gerekir. Gerilimlerin puls şeklinde uygulanması artık akımın giderilmesine dolayısıyla duyarlığın artmasına neden olur. Çalışma elektrotuna puls şeklinde gerilim uygulandığında artık akımın kapasitif bileşeni neredeyse sıfır gibidir. Böylece pulsun sonundaki artık akım, faradaik akımdan kaynaklanmakta ve duyarlık M düzeyine çıkmaktadır. Şekil Normal puls voltametrisinde (a) uyarma sinyali ve (b) elde edilen voltamogram Diferansiyel puls voltametrisi Diferansiyel puls teknikleri birçok sıvı ve dokulardaki elektroaktif türlerin iz miktarlarının tayininde geniş olarak kullanılmaktadır. Puls tekniklerisabit veya değişen DC (doğru akım) sinyali üzerine bir kare dalganın biniştirilmesi ile oluşan bir uyarıcı sinyalin uygulandığı tekniklerdir. En yaygın olarak kullanılan puls tekniği diferansiyel puls polarografisi veya voltametrisi olup, yavaşça yükselen bir DC sinyali üzerine yükseklikleri sabit pulslarının biniştirilmesi ile oluşan uyarıcı sinyal kullanılmaktadır. Akım, pulstan hemen önce ve pulsun sonuna doğru iki kere ölçülerek bunların farkı, çıktı olarak kaydedilmektedir. Her bir analite ait pik potansiyeli (Ep), yarı-dalga potansiyeline (E1/2) bağlı olarak, Ep = E1/2 ΔE / 2 (1.8) Eşitliğinden hesaplanabilir. Burada; ΔE, puls genliğidir. Puls genliğinin ve potansiyelin iyi seçilmesiyle duyarlılık artırılabilir. Birçok durumda 50 mv luk bir 27

42 potansiyel farkı ile pikleri birbirinden ayırt edilebilir. Tersinmez redoks sistemlerinde daha düşük ve daha geniş akımlar (duyarlılık daha zayıf) elde edilmektedir. Diferansiyel puls polarogramın bir üstünlüğü, yarı dalga potansiyelleri 0,04-0,05V kadar farklı olan maddeler için bile pik maksimumları elde edilmesidir, oysa klasik ve normal puls polarografisinde yarı dalga potansiyel farkı en az yaklaşık 0,2 Volmalıdır. Aksi takdirde dalgalarda iyi bir çözüm elde edilemez. Daha da önemlisi, diferansiyel puls polarografisi, polarografik metodun duyarlığını artırır. Normal puls voltametrisinde puls sonundaki artık akım az da olsa kapasitif akım içerir. Kapasitif akımın artık akım içindeki payını azaltmak, duyarlığı arttırmak amacıyla pulsun başlangıcında ve sonunda ölçülen akımların farkları alınmış ve diferansiyel puls voltametrisi adında yeni bir teknik elde edilmiştir. Bu teknik normal puls voltametrisinden daha duyar olup duyarlığı M düzeyindedir. Şekil Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri Kare dalga voltametri Kare dalga voltametrisi(kdv), en çok kullanılan elektroanalitik yöntemlerden biri olup, bu yöntemde çalışma elektrotuna simetrik kare dalgalar şeklinde potansiyel uygulanır. Her bir kare dalga döngüsü boyunca, akım iki kez ölçülür. Bu iki akım arasındaki fark, uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak grafiğe geçirildiğinde kare dalga voltamogramı elde edilir. 28

43 Kare dalga voltmetrisi diferansiyel pulstan daha çok tercih edilen elektroanalitik bir yöntemdir ve bu yöntemin en büyük üstünlüğü oldukça hızlı bir teknik olmasıdır. Etkin tarama hızı, kare dalganın frekansı (f) ve basamak yüksekliği (ΔEs) değiştirilerek belirlenir. Böylece, birkaç saniye içinde voltamogramlar kaydedilebilmektedir. Bu, ortalama 2-3 dakikayı bulan diferansiyel pulsvoltamogramının tamamlanması ile karşılaştırıldığında, kare dalga voltametrisi analiz süresini oldukça kısaltmaktadır (Wang, 2001). Kare dalga voltametri yönteminin diğer bir üstünlüğü ise, kare dalga yoluyla toplam akıma kapasitif katkıların etkisinin en aza indirilmiş olmasıdır. Böylece, tarama hızı çarpıcı bir şekilde arttırılabilir ve 1 V/s lik tarama hızına kolaylıkla ulaşılabilir. Kare dalga voltametride, net akım (ΔI) hem ileri hem de geri puls akımlarından daha büyüktür. Bu nedenle voltametrik pik akımları genellikle daha kolay okunmaktadır. Bu da, yöntemin doğruluğunu arttırmakta ve diferansiyel puls voltametriden daha yüksek duyarlılığın elde edilmesini sağlamaktadır (Monk, 2001). Böylece, 1, M a yakın çok düşük gözlenebilme sınırlarına inilebilmektedir. Kare dalga ve diferansiyel puls voltametri karşılaştırıldığında kare dalga akımlarının, benzer diferansiyel puls cevaplarından tersinir ve tersinmez sistemler için sırasıyla 4,0 ve 3,3 kat daha yüksek olduğu söylenebilir (Borman vd., 1982). Şekil Kare dalga voltametrisinde uyarma sinyallerinin oluşumu 29

44 1.3. Antibiyotikler Antibiyotikler; bakteri, mantar ve aminoasitler gibi canlı mikroorganizmalar tarafından meydana getirilen veya sentezle hazırlanan, düşük yoğunlukta bile bakterilerin gelişmesini etkileyen ya da onları öldüren maddelerdir. Bütün bakterilerde yavaş gelişme, hızlı gelişme ve dinlenme dönemlerinden oluşan üç çoğalma devresi vardır. Antibiyotikler bakterilerin hızlı ve yavaş gelişme dönemlerinde etki gösterirler. Bu etkileşim ya bakterilerin öldürülmesi (bakterisid etki) ya da bakterilerin gelişiminin ve üremesinin durdurulması (bakteriostatik etki) şeklinde olur. Örneğin penisilinler, aminoglikozidler, sefalosporinler, vankomisin, florokinolonlar ve basitrasin bakterisid etkiye; tetrasiklinler, makrolidler ve sülfonamidler ise bakteriostatik etkiye sahiptirler (Schugerl, 2001) Antibiyotiklerin sınıflandırılması Antibiyotikleri çeşitli kıstaslara göre sınıflandırmak mümkündür. Antibiyotikler, mikroorganizmalar üzerindeki etki derecelerine, etki mekanizmalarına, kimyasal yapılarına ve farmakokinetik özelliklerine göre çeşitli şekillerde sınıflandırılabilirler. Vücut sıvılarında oluşturdukları konsantrasyonlarda, mikroorganizmalar üzerindeki etki derecelerine göre de bakteriyostatikler ve bakterisidler olmak üzere iki şekilde sınıflandırılırlar (Koç-Türkoğlu, 2008). Bakteriyostatikler: Bunlar bakteri hücrelerinin gelişmesini veya üremesini önlerler. Gelişmesi ve üremesi duran bakteriler, vücudun savunma mekanizmaları tarafından kolaylıkla yok edilirler. Bakteriyostatik etki gücünün göstergesi Minimum İnhibitör Konsantrasyonu = MİK dur. Makrolitler Tetrasiklinler Sülfonamidler Amfenikoller Linkozamidler Metronidazol Mikonazol 30

45 Bakterisidler: Bunlar bakteri hücresini dolaysız olarak yok ederler. Bakterisid etki gücünün göstergesi Minimum Bakterisid Konsantrasyon = MBK dur (Akkan, 1997). Beta-Laktamlar Penisilinler Sefalosporinler Monobaktamlar Karbapenemler Beta-laktamaz İnhibitörleri: Tazobaktam Sulbaktam Klavulanik Asid Polipeptidler Florokinolonlar Vankomisin Rifamisin Teikoplanin Beta laktam antibiyotikler Beta laktam grubu antibiyotikler, günümüzde en yaygın kullanılan ve "betalaktam" halkası olarak adlandırılan ortak kimyasal molekülleri ile diğer antibiyotiklerdenayırt edilen antibiyotik grubudur. İlk olarak 1928 yılında besiyerine tesadüfen düşen Penicillium notatum türü mantarın çevresinde stafilokok türü bakterilerin üreyememesi nedeniyle dikkat çekmiştir. Yapılan çalışmalar sonucu 1949 yılında penisilin G geliştirilerek klinik kullanıma sunulmuştur. Sonraki yıllarda geliştirilen yeni beta-laktam grubu antibiyotiklerin tümü, ortak molekül olan beta laktam halkasına bağlı aminoasitler üzerinde yapılan çeşitli modifikasyonlar sonucunda şekillendirilmiştir (Öncül, 2002). β-laktam halkası; biri azot, üçü karbon olan 4 üyeli doymuş heterosiklik bir halkadır (Şekil 1.17). Şekil Beta laktam halkası 31

46 Beta laktam antibiyotiklerin etki mekanizması Beta-laktam antibiyotikler bakterilerin peptidoglikan tabakasının sentezini bozarak etki ederler. Bakterileri hücre duvarında yer alan peptidoglikan (mürein) tabakası mikroorganizmanın yapısını ve bütünlüğünü sağlar. Bu tabaka çapraz bağlanan kısa peptid zincirleri ile sağlamlaşır. Bu çapraz bağlantı, N-asetil muramik asitinyapısında yer alan D-alanin D alanin moleküllerinin transpeptidasyon reaksiyonu ilebirleşmeleri sonucu oluşur. Transpeptidaz reaksiyonu oluşturan enzimlere penisilin bağlayan proteinlere PBP adı verilir. Beta-laktam antibiyotiklerin temel hedefi işte bu penisilin bağlayıcı proteinlerdir. Şekil Bakteri hücre duvarındaki proteini oluşturan zincirsel yapılar ve aminoasit bağlantıları Beta-laktam antibiyotiklerin yapısı ve uzaydaki konfigürasyonları D-alanin D-alanin molekülüne çok benzemektedir. Bu benzerlik beta-laktam antibiyotiklerin PBP ile reaksiyona girmelerini ve D-alanin D-alanin molekülünün yerini alarak transpeptidasyonu engellemelerini sağlar (Gür, 2002). Hücre duvar yapısı bozulan bakteride ozmotik direnç kaybı ve ölüm meydana gelmektedir (Sarı, 2005). Beta laktam antibiyotiklerin hedeflerine bağlanmaları ve etkinlik göstermeleri için GN bakterilerde porin (Outer Membran Protein, OMP) adı verilen içi su dolu protein kanalcıklarından geçmeleri, sitoplazmik membranla dış membran arasındaki periplazmik boşlukta yer alan beta-laktamazlardan etkilenmemeleri gerekmektedir (Kfoury, 2003). Gram (+) bakterilerde dış membran tabakası bulunmayıp, sitoplazmik kalın bir peptidoglikan tabakası uzanmaktadır. Beta-laktamazlar bu tabakaya yapışık veya bakteri hücresi etrafında serbest olarak yer almaktadır (Opal ve Medeiros, 2005). 32

47 Sefalosporinler Sefalosporinlerin yapısı Sefalosporinlerde penisilinlerinkine benzer, iki halka sisteminden oluşan bir çekirdek yapı vardır. Beta-laktam halkası yanında penisilindeki 5 üyeli tiazolidin halkası yerine sefalosporinlerde 6 üyeli bir dihidrotiazin halkası bulunur (Şekil 1.19). Dihidrotiazin halkasında fazladan bulunan karbon atomu 3. pozisyonda da yeni yandalların ilavesi ile daha değişik ve çok sayıda sefalosporinler elde edilmesine olanak sağlamıştır (Sarı, 2005). Şekil Sefalosporinlerin yapısı Sefalosporin çekirdeğinde yan zincir-2 daha çok beta laktamazlara stabiliteyi etkiler. Buraya eklenen açil yan dalında yapılan diğer değişiklikler antibakteriyel aktivite ve farmakolojik özelliklerde değişimlere neden olur. Yan zicir-1 de yapılan değişiklikler ise antibakteriyel aktiviteden çok farmakolojik özellikleri etkiler (Willet, 1984) Sefalosporinlerin etki mekanizmaları Sefalosporinler, diğer bütün β-laktam antibiyotikler gibi bakteri hücre duvarı yapımını bozarak etki göstermektedir. Tüm beta-laktam antibiyotiklerin hedefi hücre duvar sentezinin transpeptidasyon evresinde rol alan penisilin bağlayan proteinleri (PBP) inhibe etmektir. Gram (-) bakterilerde içi su dolu porinleri geçerek, gram (+) bakterilerde ise direkt olarak bu hedefe bağlanırlar. Transpeptidasyonaşamasının gerçekleşmemesi sonucu bakteri duvar tam olarak sentezlenemez ve iç basınçtan 33

48 dolayı bakteri lizisine uğrar (Şekil 1.20). Sefalosporinler bakterisidal ajanlardır (Montesissa vd.,2003). Şekil Gram (+) ve gram (-) bakterilerde sefalosporinlerin etki mekanizması Sefalosporinlerin sınıflandırılması Sefalosporinler, antimikrobiyal etki spektrumlarına göre dört ana grupta veya kuşakta sınıflandırılabilir (Şekil 1.21). Genel bir kural olarak birinci kuşak bileşikler gram (+) organizmalara karşı daha iyi aktiviteye sahipken, diğer bileşikler gram (-) aerobik organizmalara karşı daha iyileştirilmiş aktiviteye sahiptir. Şekil Sefalosporinlerin sınıflandırılması 34

49 1. kuşak sefalosporinler: Gram (+) bakterilere en etkili sefalosporin grubudur. Gram (-) etkinlikleri E.coli, Proteus mirabilis ve K.pneumoniae gibi bakterilerle kısıtlıdır. Bu özellikler göz önüne alındığında, yumuşak doku infeksiyonları gibi stafilokoksik infeksiyonlarda ilk seçilecek ilaçlar arasındadır. Ayrıca, idrar yolu infeksiyonları ve safra yolu infeksiyonlarında da kullanılabilirler. Sefazolin, cerrahi profilaksinin seçkin ilacıdır. 2. kuşak sefalosporinler: İkinci kuşak sefalosporinler birinci kuşaklara yakın veya eşit bir gram (+) etkinliğe sahiptir. Bunun yanında gram (-) etkinlikleri biraz daha fazladır. Asıl çarpıcı özellikleri H.influenzae, S.pneumoniae ve M. catarrhalis gibi solunum yolu patojenlerine olan çok iyi etkinlikleridir. Etki alanları göz önüne alındığında başlıca kullanım alanları solunum sistemi infeksiyonlarıdır. Akut tonsillofarenjitler, akut otits media ve akut sinüzit gibi üst solunum yolu infeksiyonları,pnömoni vekoah alevlenmeleri gibi alt solunum yolu infeksiyonlarının tedavisinde ilk tercih edilen ilaçlar arasında yer alırlar. Ayrıca, komplike olmayan üriner sistem infeksiyonları, deri ve yumuşak doku infeksiyonlarında da oldukça iyi etkinlik gösterirler. 3. kuşak sefalosporinler: Bu grup sefalosporinlerin en etkili olduğu bakteriler gram (-) çomaklardır. Ayrıca, P aeruginosa ya sadece seftazidim etkili olup diğerlerinin etkinlikleri yoktur. Gram (+) bakterilere karşı etkinlikleri 1. kuşaklara oranla oldukça azdır. Sefotaksim gram (+) etkinliği en iyi olan 3. kuşak sefalosporindir. En az etkili olan ise seftazidimdir. Hiçbirinin iyi bir anti-anaerop etkinliği yoktur. 3. kuşak sefalosporinler gram (-) sepsis gibi ciddi infeksiyonlarda, gram (-) bakterilerle oluşan hastane kökenli infeksiyonlarda (nozokomiyal pnömoni, nosokomiyal üriner sistem infeksiyonu gibi) genellikle aminoglikozitlerle kombine olarak, beyin-omurilik sıvısına iyi geçtiklerinden ve başlıca menenjit etkenlerinin tümüne etkili olduklarından akut bakteriyel menenjitlerde (gram (-) basil menenjitleri dahil) kullanılırlar. 4. kuşak sefaloporinler: Bu grupta sefepim bulunmaktadır. Sefepimin gram (-) bakterilere etkinliği mükemmeldir. 3. kuşaklardan farklı olarak Enterobactertürlerine etkinliği de çok iyidir. Sefepimin P.aeruginosa ya etkinliği en az seftazidim 35

50 kadardır. 3. kuşaklardan bir diğer farklı yönlü gram (+) bakterilere onlardan daha etkili olmalarıdır. Yani 4. kuşak sefalosporinler, daha geniş ve dengeli bir etki alanına sahiptirler. Ancak, antianaerop etkinlikleri iyi değildir. Sadece parenteral kullanılır. Kullanım alanları 3.kuşak sefalosporinler gibidir Sefoperazon Sefoperazon, sefalosporinlerin 3. kuşaktan yeni bir semisentetik antibiyotiktir. Paranteral uygulamada sodyum tuzu olarak kullanılır (Kim, 1981). Aerobik ve anaerobik gram (-) ve gram (+) bakterilere etkilidir. Etkisi, bakteri hücre duvar sentezini inhibe etme şeklindedir. Nefrotoksik değildir ve eliminasyonu büyük ölçüde böbrek dışı yoldan gerçekleştiği için böbrek yetersizliği olan hastalarda doz indirimine gerek göstermez ( Bailey vd., 1981). Şekil Sefolasporinlerin yapısı Sefoperazon, diğer sefalosporinlerden farklı olarak verilen dozun %70 i karaciğerden safra ile atılır, enterokepatik siklusa girer. Yarılanma ömrü diğer sefalosporinlerden daha uzundur. Böbrek yetmezliğinde dozun ayarlanması gerekmez. Kaynağı belli olmayan sepsisler, obstrüktif safra yolu enfeksiyonları, Pseudomonasca bağlı pnömonilerde 12 saatte bir intramüsküler (kas içine) veya intravenöz (damar içine) yoldan alınır. 36

51 Sefadroksil Sefadroksil geniş spektrumlu, bakterisit etkili ve yarı-sentetik bir antibiyotiktir. Sefadroksil, gram (+) ve gram (-) çoğu mikroorganizmaya karşı bakterisid etki gösteren bir antibiyotiktir. Sefadroksile duyarlı olan gram (+) mikroorganizmalar ise şunlardır: Penisilinaz üreten ve üretmeyen stafilokoklar, beta-hemolitik streptokoklar, Streptococcus pneumoniae (diplokoklar), Streptococcus pyogenes. Sefadroksile duyarlı olan gram (-) mikroorganizmalar şunlardır: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Salmonella ve Shigella'nın bazı türleridir. Şekil Sefadroksilin yapısı Sefadroksil mide asitlerine dayanıklı bir antibiyotik olduğundan, oral yoldan alındıktan sonra kolayca emilerek, 1 saat içinde kanda en yüksek antibiyotik düzeylerine ulaşır. Kandaki antibiyotik 12 saat süreyle ölçülebilir düzeylerde kalır. Serum yarılanma süresi 1,4 saattir. Ortalama %20 oranında gevşek olarak serum proteinlerine bağlanır. Bileşiğin değişikliğe uğramamış bölümü, 24 saat boyunca yavaş ve sürekli bir biçimde idrarla dışarı atılır. İlk dozun alınmasından sonra saat boyunca idrardaki antibiyotik konsantrasyonları, idrar yollarındaki bütün patojenler için minimum inhibisyon konsantrasyonunun (MIC) üzerinde bulunur Biyosensörler Biyosensörler; biyoloji, kimya, biyokimya, mühendislik gibi pek çok bilim alanının bilgi birikiminden yararlanılarak biyolojik moleküllerin veya sistemlerin seçicilik 37

52 özellikleri ile modern elektronik tekniklerin işlem yeteneğinin birleştirilmesi sonucu geliştirilen biyoanalitik cihazlar olarak tanımlanabilir (Spichiger-Keller, 1998). Biyosensör teknolojisinin tarihsel geçmişine bakıldığında bu alandaki ilk çalışmaların enzim sensörleriyle başladığı görülmektedir. Biyosensörlerin tarihi, 1950 li yılların ortalarında L.C. Clark ın Cincinnati Hastanesinde ameliyat sırasında kanın O2 miktarını bir elektrot ile izlemesiyle başlar yılında Clark ve Lyons ile 1967 de Updike ve Hick tarafından yayınlanan glukoz tayinine yönelik glukoz oksidaz enzim elektrotları bu konudaki ilk örnekleri oluşturmuştur (Clark ve Lyons, 1962). Böylece Clark ve Lyons, glukoz oksidaz enzimini O2 elektrotu ile birleştirerek kanın glukoz düzeyini ölçmeyi başarmışlardır. Bu sistem bir yandan biyolojik sistemin yüksek spesifikligini (enzim) diğer taraftan ise fiziksel sistemin (elektrot) tayin duyarlığını birleştirmiş ve geniş bir uygulama alanı bulmuştur Biyosensörlerin yapısı ve fonksiyonu Biyosensörler biyokomponentler (reseptör) ile fiziksel komponentlerden (transduser) oluşurlar. Biyosensörler, genel olarak analizlenecek madde ile seçimli bir şekilde etkileşime giren biyoaktif bir bileşenin, bu etkileşim sonucu ortaya çıkan sinyali ileten bir iletici sistemle birleştirilmesi ve bunların bir ölçüm sistemiyle kombinasyonuyla oluşturulurlar. Biyosensörlerde biyoaktif bileşenin tayin edilecek madde ile etkileştiğinde oluşan sinyalin iletim ve ölçümünde, genel olarak elektrokimyasal, optik, piezoelektrik ve kalorimetrik esaslı sistemler kullanılır. Şekil 1.24 de bir biyosensörün çalışma prensibi şematize edilmiştir. Şekil Biyosensörlerin yapısı ve çalışma prensibi 38

53 Algılama kısmı (Biyomolekül) Ana elamanların en önemlisi analite karşı son derece seçimli ve tersinir etkileşmeye sahip biyoajanlardır. Biyoajanlar, biyoafinite ve biyokatalitik olmak üzere iki grupta toplanabilir. Biyoafinite ajanları (örneğin antikorlar) analitlerle kompleks oluşturarak analitin moleküler tanımlanmasında kullanılırlar. Bu kompleks oluşumu tabaka kalınlığı, kırılma indisi ve elektriksel yük gibi fizikokimyasal parametrelerin değişimine neden olur. Biyokatalitik ajanlar ise analitin molekül yapısında değişime neden olur ve bu dönüşüm sonucunda ortamda artan veya azalan madde miktarı takip edilerek değerlendirilir. Biyokatalitik ajan olarak enzimler, mikroorganizmalar, organlar, tüm hücreler, bitki veya hayvansal doku parçaları kullanılmaktadır (Piletsky ve Turner 2002). Çevirici kısım (Transduserler) Biyosensörün ikinci önemli elamanı çevirici kısmıdır. Çeviriciler biyoajan-analit etkileşimi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyallerin elektrik sinyallerine dönüştürüldüğü biyosensör elemanlıdır. Biyokimyasal reaksiyona göre çeviriciler seçilir. Elektrotlar amperometrik ve potansiyometrik ölçümlerde kullanılır ve burada hedef; analitdir (O2 - elektrodunda çözünmüş O2, ph elektrotunda H+ iyonu gibi). Optik sensörlerde hedef; ışık, piezoelektrik sensörlerde ise kristalin salınım rezonansının kütle yüklenimi sebebiyle değişmesidir (Piletsky ve Turner 2002). Elektronik kısım Çevirici kısmın elektrik sinyali üretmesi için gerekli osilatör, fark devresi, işlemsel yükselteç devresi, besleme devresi, anolog-digital dönüştürücü vb. elektronik kısımdan oluşmaktadır Biyosensörlerde kullanılan biyoaktif yapılar Analizlenecek madde-biyoaktif bileşen ilişkisine göre biyosensörler aşağıdaki gibi sınıflandırılabilirler (Spichiger-Keller,1998); 39

54 Biyoaffinite Esaslı Biyosensörler; örneğin; iletici sistem üzerinde antikor immobilizasyonuyla antijenlerin tayini (a), Biyokatalitik Esaslı Biyosensörler; örneğin, iletici sistem üzerinde enzim immobilizasyonuyla enzimin substratı, inhibitörü, aktivatörü veya koenzimi olan çeşitli kimyasal maddelerin tayini (b), İmmobilize Hücre Esaslı Biyosensörler; örneğin, iletici sistem üzerinde hücrelerin immobilizasyonuyla o hücreler tarafından metabolize edilen çeşitli maddelerin tayini (c), Transmembran Esaslı Biyosensörler; örneğin, çeşitli moleküllere spesifik reseptör veya farklı membran proteinlerini içeren hücre membranlarının iletici sistem üzerinde immobilizasyonuyla söz konusu moleküllerin seçimli bir şekilde tayinleri (d). Şekil Analizlenecek madde-biyoaktif bilesen ilişkisine göre; a) Biyoafinite esaslı biyosensorler, b) Biyokatalitik esaslı biyosensörler, c) İmmobilize hücre esaslı biyosensorler, d) Transmembran esaslı biyosensörler 40

55 Biyosensörlerde biyoaktif bileşen immobilizasyon yöntemleri Enzimlerin çeşit ve sayısının fazla olması, çok farklı kullanım alanı ve amaçlarına sahip olmaları biyoaktif bileşen olarak enzim esaslı biyosensörlerin yaygın olarak kullanılmalarına neden olmuştur. Enzimlerin endüstriyel alanda kullanımını arttırmak için, özellikle son otuz yılda enzim immobilizasyonu üzerine araştırmalar yoğunlaşmıştır. Bu alanda yapılan yayınların sayısı da yıldan yıla artmaktadır (Schugerl, 2001). Kelime anlamı olarak immobilizasyon, hareketi sınırlandırma demektir. İmmobilize edilmiş enzimlerin de gerçekten hareketleri sınırlandırılmış olmaktadır. Enzimler, suda çözünmeyen bir taşıyıcıya fiziksel veya kimyasal olarak bağlanarak immobilize edilebilirler. Suda çözünmeyen ürün veren bir kopolimerizasyon reaksiyonuna enzim molekülünün monomer olarak katılması ve suda çözünmeyen bir matriks veya mikro kapsüllerde tutuklanmasıyla immobilizasyon gerçekleştirilir. İmmobilize enzimlerin doğal (serbest) enzimlere göre üstünlükleri aşağıdaki gibi sıralanabilir (Fagain, 2003); Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir (süzme, santrifujleme vb.) ve ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem oluşturmaz. Çevre koşullarına (ph, sıcaklık vb.) karşı daha dayanıklıdır. Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir. Sürekli işlemlere uygulanabilir. Doğal enzime kıyasla daha kararlıdır. Ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir. Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur. Bazı durumlarda serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterebilir. Enzimin kendi kendini parçalaması (autolysis, self-digestion) olasılığı azalır. Bir biyosensör, farklı özellikteki iki elemanın (iletici sistem (sensör) ve biyoaktif bileşen) birleştirilmesiyle ile oluşturulur. Uygun biyoaktif materyal ve sensör seçildikten sonra bunların birbirine bağlanması, aşılması gereken en önemli sorundur. Bu bağlama işlemi biyosensörlerin immobilizasyonu olarak tanımlanmaktadır. Bağlama işleminde çok değişik yöntemler kullanılabilir. Hangi immobilizasyon yönteminin kullanılacağı seçilen sensöre, biyoaktif bileşenin 41

56 kimyasal yapısına ve fiziksel durumuna göre belirlenir. Enzimler protein yapısında bileşikler oldukları için enzimlere uygulanan tüm immobilizasyon yöntemleri protein yapısındaki diğer biyoaktif bileşenlere de uygulanabilir. Hayvan ve bitki dokularımembran yapısında olduklarından farklı immobilizasyon yöntemleri uygulamak gerekir (Merkoci vd., 1999.,Reddy ve Vadgama, 2002) Kovalent bağlanma Kovalent bağlı enzim sistemleri ile ilgili ilk çalışmalar Gruphofer ve Schleith tarafından 1953 yılında diazoaktiflenmiş poliamino stirene; α-amilaz, pepsin ve ribonükleazın immobilizasyonu ile başlamıştır. Kovalent bağlanma genellikle enzimin yapısının ve fonksiyonel gruplarının bilindiği durumlarda kullanılır (Dumitriv ve Papu,1988.,Reddy ve Vadgama, 2002). Kovalent bağlama ile immobilizasyon, destek yüzeylerde uygun bir yöntemle etkin bölgeler oluşturarak enzim molekülleri ile destek yüzeyler arasında kovalent bağ oluşturur. Kovalent bağlanma yönteminin en büyük avantajı, bağların çok kuvvetli olması böylece her türlü akış ortamında kullanılabilirliğidir. Enzim destek materyali üzerinde yer aldığından substrat ile teması kolaydır. Ayrıca enzim molekülü ve destek materyali birlikte genellikle ısıl kararlılık gösterirler. Yöntemin dezavantajı, destek materyali ile enzim arasındaki sıkı etkileşim enzimin doğal konformasyonunu bozabilmesidir (Dumitriv ve Papu, 1988., Reddy ve Vadgama, 2002) Tutuklama Tutuklama, biyoreseptörün bir membran veya tabaka içerisinde hapsedilmesidir. Enzimler makromoleküler yapılı proteinler olup polimer jel tabakalarda ve daha basit olarak diyaliz membranlarında tutuklanabilirler. Bu yöntem enzimler yanında organeller, hücreler ve antikorlar için de uygulanabilir. Elektrokimyasal polimerleşme diğer bir tutuklama yöntemidir (Telefoncu, 1997). 42

57 Şekil Enzim molekülünün jel içinde veya polimer matrikste tutuklanması Çapraz bağlama Bu yöntem biyosensör hazırlanmasında daha çok tutuklama ve kovalent bağlama yöntemlerinin kombinasyonu şeklinde uygulanır. Çapraz bağlayıcı reaktif olarak gluteraldehit, heksametilen diizosiyanat, diflorodinitrobenzen, bismaleimidoheksan, disüksinilsuberat sık kullanılır. İki fonksiyonlu reaktifler enzimler yanında organeller, hücreler ve antijenlerin immobilizasyonunda da uygulanır (Telefoncu, 1997). Şekil Enzim molekülünün film veya tabakaya çapraz bağlanması Adsorpsiyon Bu yöntemde biyobileşenin film veya tabakaya adsorbe olması sağlanır. Biyobileşenlerin kimyasal yapısı ve fiziksel durumuna göre immobilizasyon yöntemi belirlenir. Enzimler için uygulanan tüm immobilizasyon yöntemleri protein yapısındaki diğer biyoreseptörler için de uygulanabilir. Örneğin; hayvan ve bitki 43

58 dokuları zar yapısında olduklarından farklı immobilizasyon yöntemleri uygulamak gerekir (Telefoncu, 1997). Şekil Enzim molekülünün elektrot yüzeyinde adsorpsiyonu İletim ve ölçüm sistemlerine göre biyosensörlerin sınıflandırılması Biyosensörlerin sınıflandırılması başta biyoaktif bileşenlere ve tayin yöntemlerine göre olmak üzere birçok şekilde yapılmaktadır. Biyosensörler de, biyoaktif bileşenin tayin edilecek madde ile etkileşmesiyle oluşan sinyalin belirlenme ilkesine göre Tablo 1 de belirtildiği şekilde sınıflandırılmaktadır. Tablo 1.1. Biyosensörlerin biyoaktif bileşenlere göre sınıflandırılması Elektrokimyasal Esaslı Amperometri Esaslı Sensörler Optik Esaslı Fotometri Esaslı Optik Lifler Potansiyometri Esaslı Sensörler Fluorometri Esaslı Optik Lifler Yarı İletken Esaslı Transistörler Biyolüminesans Esaslı Optik Lifler Kalorimetrik Esaslı Piezoelektrik Esaslı Termistörler Piezoelektrik Kristaller Kuru Reaktif Kimyası Esaslı 44

59 Elektrokimyasal esaslı biyosensörler Amperometri esaslı biyosensörler Amperometri genel anlamda belli bir potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümünü esas alır. Söz konusu akım yoğunluğu, çalışma elektrotunta yükseltgenen ya da indirgenen elektro aktif türlerin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak tanımlanır. İkinci elektrot, referans elektrot olarak iş görür. Kalibrasyondan sonra akım yoğunluklarından ilgili türlerin konsantrasyonlarının belirlenmesinde yararlanılır (Şekil 1.29). A: Çalışma Elektrotu (Pt) B: Referans Elektrot (Ag/AgCl) C: Elektrolit Çözelti (KCl) D: İç gaz geçirgen membran (teflon) E: İmmobilize enzimi içeren biyoaktif tabaka F: Dış koruyucu membran (selüloz asetat v.b.) G: O-ring Şekil Amperometrik esaslı bir biyosensörun şematik gösterimi İletici sistem olarak bir amperometrik sensörün kullanılması durumunda potansiyometrik sensörlerden en büyük fark, ürünlerden sinyal oluşturan türün elektrot yüzeyinde tüketilmesidir. Oksijen tüketimine ilişkin reaksiyonlar aşağıda verilmiştir. Katodik reaksiyon; O2 + 2H2O + 2e - H2O2 + 2HO - H2O2 + 2e - 2HO - Anodik reaksiyon; Ag - + Cl - AgCl + e - Toplam reaksiyon; 4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl - 4AgCl + 4HO - 45

60 Amperometri esaslı ve biyoaktif bileşen olarak enzimlerin kullanıldığı bazı biyosensörlere ilişkin örnekler aşağıda verilmiştir (Telefoncu, 1997; Christie vd., 1992). Glukoz Oksidaz Glukoz + O2 + H2O Glukonik asit + H2O2 Laktat Oksidaz L-Laltat + O2 Piruvat + H2O2 İnvertaz Sakkaroz + H2O α-d-glukoz + D-Fruktoz Potansiyometri esaslı biyosensörler Potansiyometri bilindiği gibi en genel anlamda bir çalışma ve referans elektrot arasındaki potansiyel farkının ölçümünü esas alır. Elektrot potansiyelinin belirlenmesi doğrudan analit konsantrasyonunu tanımlar. Potansiyometrik biyosensörlerde kullanılan temel sensörler; ph ya da tek değerlikli iyonlara duyar cam elektrotlar, anyon ya da katyonlara duyarlı iyon seçimli elektrotlar ve karbondioksit ya da amonyağa yönelik gaz duyar elektrotlardır. Şeki1.30 de genel olarak potansiyometrik esaslı bir biyosensör şematize edilmiştir. A: Elektrot dış ceketi B: İç doldurma çözeltisi C: Cam ph elektrot D: O-ring E: İmmobilize enzimi içeren biyoaktif tabaka F: Dış koruyucu membran Şekil Potansiyometri esaslı biyosensörler Potansiyometri esaslı ve biyoaktif bileşen olarak enzimlerin kullanıldığı biyosensörlere ilişkin örnek aşağıda verilmiştir (Elmosallamy, 2006). 46

61 Penisilinaz Penisilin Penisiloat + H + (ph duyarlı biyosensör) Yarı iletken esaslı biyosensörler Temel sensör olarak metal oksit yarı iletken alan etki transistörlerini (MOSFET) ya da iyon duyarlı alan etki transistörlerini (ISFET) esas alan bu tür enzim sensörleri, enzim ile alan etki transistorlerinin birleştirilmesini ifade edecek Şekil 1.31 da enzim alan etki transistorleri (ENFET) olarak adlandırılırlar. MOSFET lerin, gazların ölçümüne uygun hale getirilmesiyle oluşan gaz duyar sensörler de (GASFET) adsorblanan gaz moleküllerinin disosiyasyonu ve oluşan yükün oksit tabakasına transferi temel ilkeyi oluşturur. Bu durum tabakanın dielektrik sabitini değiştirir ve geçen akımda bir değişime yol açarak ölçüme imkân verir (Eggins,1996.) A: Referans eletrot B: Koruyucu tabaka C: İmmobilize enzin tabakası D: İyon seçimli membran Şekil Enzim alan etki transistörü İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler Elektrokimyasal, optik veya diğer biyosensör türlerini en uygun bir şekilde tasarlayabilmek için ölçüm sisteminin sahip olması gereken bazı temel fiziksel özelliklerin olması gerekmektedir. İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken bazı önemli karakteristik ve özellikler şöyle sıralanabilir (Buerk, 1993). Seçicilik: İdeal bir biyosensörde en önemli parametrelerden birisi olan seçicilik özelliğidir. Bu da biyosensörlerdeki biyomolekül kısmı ile ilgili bir durumdur. Bir 47

62 biyosensörün seçimliliği üzerinde başlıca, sensörle girişimler, biyokatalizörlegirişimler ve ph etkili olmaktadır. Sensör de meydana gelebilecek girişimleriengellemenin en iyi yolu örnekteki diğer maddelere cevap vermeyen ve yalnızcailgilenilen biyokatalitik tepkimeyi izleyebilecek bir sensör kullanmaktır. Örneğin; kandaüre tayinine yönelik bir biyosensör de temel sensör olarak NH4 + a duyarlı bir iyonseçimli elektrotun kullanılması ortamda bulunan Na + ve K + iyonlarının girişimineneden olur. Buna karşılık temel sensör olarak NH3 e duyarlı bir sensör kullanılması buistenmeyen durumu ortadan kaldırır (Dinçkaya vd., 1994). Biyomolekülün spesifik olması girişim yapabilecek türleri içeren karmaşık içerikli ölçüm ortamlarında ön işlem yapılmaksızın analize imkan verir. Kararlılık: Kararlılık kullanılan biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığına bağlıdır. Biyolojik molekülün kararlı olması ise çok sayıda analize imkan vereceği için biyosensörün ekonomik olmasına zemin hazırlar. Ayrıca biyosensörün ph, ısı, nem, ortam O2konsantrasyonu gibi fiziksel parametrelerden olabildiğince az etkilenmesi istenir. Bu özellik fiziksel koşulların değişebildiği laboratuvar dışı koşul ve ortamlarda dagüvenilir analizlerin yapılabilmesine imkân verir. Duyarlılık: Biyosensöre immobilize edilmiş biyolojik materyalin yalnız belirli maddelere karşı duyarlı olması, ideal biyosensörlerin özelliklerindendir. Duyarlılık, biyolojik sistemlerden gelen unsurlar kullanıldığı için genelde çoğu klasik yöntemden daha iyidir. Tekrarlanabilirlik: İdeal bir biyosensör için, biyosensör cevaplarının doğru ve tekrarlanabilir olması büyük önem taşır. Tekrarlanabilirlik ne kadar iyi olursa, biyosensörün uygulamalarının o denli iyi olduğundan söz edilebilir. Kullanım ömrü: Biyosensörün kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktör, biyolojik çeviricinin aktivitesindeki azalmadır. Bir biyosensörde kullanılan biyolojik elementler çoğu zaman sistemin en az kararlı olan bileşeni olmaktadır. Bir biyosensörün önemli bir özelliği normal işlem koşulları altında hassasiyetinikoruyabildiği kadar uzun bir kullanım ömrüne sahip olmasıdır. Bu kullanım ömrü, yapılan toplam ölçüm sayısına veya ölçülen analitin derişiminin 48

63 büyüklüğüne bağlı olabilir. Daha yüksek derişimler hassasiyetin daha hızlı bir şekilde düşmesine neden olabilir. Ayrıca analit derişimine bağlı olmaksızın analiz ortamında aktivasyonu engelleyecek diğer kimyasal türler bulunabilir. Bir diğer önemli özellik ise biyosensörün saklanması ve kullanılması arasında geçen zamanın uzunluğudur. Biyosensörün bir buzdolabı ortamında muhafaza edilmesi gerektiği gibi biyolojik bileşenin biyoaktivitesini koruyabilmesi için özel bir kimyasal ortamda saklanması da gerekebilmektedir. Basitlik ve ucuzluk: Tasarımı basit ve ucuz, kullanımı rahat biyosensörler ideal biyosensörlerdir. Bu nedenle ilk biyosensörlerdeki karmaşık ve de pahalı olan yapılar, daha sonra basitleştirilmiş ve mümkün olduğunca da ucuzlaştırılmıştır. Ayrıca ölçüm ünitesinin ucuz ve taşınabilir olması değişik alanlarda yaygın kullanımına imkân verir. Kalibrasyon gereksinmesi: İdeal bir biyosensör, bilinen derişimlerdeki analiti içeren standart çözeltiler yardımıyla kolayca kalibre edilebilmelidir. Kalibrasyon eğrileri hassasiyeti belirlemek için çok sayıda veriye ihtiyaç duymamalıdır. İstenilen aralığın dışında kalan güvenilir olmayan ekstrapolasyonlardan kaçınmak için kalibrasyonda elde edilecek veri aralığı, ölçüm yapılacak değerleri içermelidir. İdeal olarak, artarda yapılacak ölçümler için biyosensör hassasiyetinin belirlenmesinde bir kez kalibrasyon yapılması yeterli olmalıdır. Bununla beraber, uygulamada zamanla hassasiyette meydana gelebilecek değişimleri belirlemek amacıyla düzenli aralıklarla kalibrasyon yapmak gerekebilmektedir. Yeterli düzeyde tayin sınırı: Tasarlanan bir biyosensörün tayin sınırının belirli bir konsantrasyon değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu sınır elektrot yüzeyinin büyüklüğü, biyolojik materyalin tayin edilecek maddeye afinitesi, immobilize edilen madde miktarı gibi faktörlerden etkilenir. İdeal olarak, bir biyosensör tarafından tayin edilebilen en düşük analit derişimi sadece ölçüm için kullanılan elektronik cihazın çözünürlüğü tarafından sınırlandırılmalıdır. Uygulamada ise, diğer etkenlerde tayin sınırını etkiler. Örneğin, potansiyometrikölçümlerde kullanılan elektrokimyasal dönüştürücülere, diğer iyonlar ve ölçümü sınırlayan yüzey reaksiyonları girişim yapabilir. 49

64 Taban sinyali: Genellikle, bir biyosensörün sinyali göz önünde bulundurulması gereken bazı taban gürültülerine sahiptir. Akım kaçakları, elektronik cihazdaki veya biyosensör de farklı metallerin temasından kaynaklanan küçük gerilim farklılıkları veya pek çok elektrokimyasal etken taban gürültüsüne neden olabilir. Taban sinyali elektriksel bir gürültü değildir. Bu nedenle doğrusal bir sistem için doğru sinyal (S) basitçe şöyle ifade edilir. S = Sölçülen Staban sinyali (1.8) Cevap süresi: Bir biyosensörün cevap süresi 3 ana aşamada meydana gelen olaylar tarafından etkilenir. Bunlar; Substratın analiz ortamından zar yüzeyine ne kadar hızlı difüzlendiği, Substratın zar içine ne kadar hızlı difüzlendiği ve biyokatalizörün aktif merkezi ile ne kadar çabuk tepkime verdiği, Oluşan ürünün ölçüldüğü yer olan sensör yüzeyine ne kadar hızlı difüzlendiğidir. Bu üç olayı etkileyen başlıca unsurlar da çözeltinin karıştırma hızı, substrat derişimi, optimum ph, sıcaklık ve sensör yüzeyinde veya biyoaktif tabaka yüzeyinde herhangi bir zarın kullanılıp kullanılmadığı ve kullanılıyorsa niteliğidir. Bu unsurlardan karıştırma hızının artışı cevap süresini kısaltırken, substrat derişimindeki artış uzamasına yol açar. Optimum ph ya yakınlaşma, cevap süresini kısaltır. Küçültülebilirlik ve sterilize edilebilirlik: Elektrotlarının sterilize edilebilmesi ve boyutlarının küçültülmesi biyosensör tasarımında önemlidir. Buna karşın, biyosensör yapısına giren biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığı, sterilizasyonu kısıtlayan en önemli parametredir. Küçük ve biyouyumlu sistemlerin özellikle in vivo ölçümlere uyarlamada önemli üstünlükleri vardır (Hall,1990). Doğrusallık: Doğrusallık bir biyosensör de aranan önemli özelliklerden biridir. Ölçülecek maddenin ortamdaki derişimi ile alınan cevap (voltaj, akım miktarı, kütle,optik yoğunluk, renk vb. değişimleri) arasındaki ilişkinin doğrusal olarak değişmesi gerekir. Başka bir ifadeyle biyosensörler doğrusal oldukları değişim 50

65 aralığında kalibre edildiklerinden ancak bu bölgeye sonuç verirler. Doğrusallık biyoajan türü, çevirici ve elektronik bölümlerin yapısı ve tüm elemanların uyumu ile ilgilidir Biyosensörlerin kullanım alanları Biyosensörler tıp, tarım, gıda, eczacılık, çevre kirliliği, savunma ve endüstride çok önemli rol oynarlar. Biyosensörler için mümkün uygulama alanları şunlardır: Tıp: Biyosensörlerin ve kimyasal sensörlerin temel uygulama alanı sağlık ile ilgili teşhislerdir. Kandaki bileşenlerin, gazların, iyonların ve vücut metabolitlerinin ölçümü bir hastanede hastaların metabolik durumları hakkında önemli bilgiler verir ki özellikle yoğun bakım hastalarında bunların tayini daha da önem kazanmaktadır. Bu türlerin çoğu, tıbbi teşhis laboratuvarlarında kan ve idrardan ayrıştırılarak uzun zaman alan klasik analizler yardımıyla belirlenmektedir. Bu yüzden alınan örneğin doğrudan ve yerinde analizleri yapılabilirse dakikalarla veya saniyelerle ifade edilebilecek sürelerde sonuca ulaşılabilecektir. Gıda üretim ve analizi:başta glikoz olmak üzere birçok monosakkarid, amino asit, organik asit (laktik asit), üre ve alkol tayinlerinde enzim sensörleri kullanılmaktadır. Ayrıca gıdalardaki yabancı maddeler (pestisidler, toksinler ve yabancı maddeler) için de biyosensörler hazırlanabilir. Tarla tarımı, bağ-bahçe tarımı ve veterinerlik:organofosfatların tayin ve tespitinde, patojen tayinlerinde biyosensörlerin kullanımı mevcuttur. Çevre koruma ve kirlilik kontrolü:hava ve su bileşen analizleri, toprak, hava ve sudaki pestisit ve mikotoksin gibi toksiklerin tayinlerinde biyosensörlerden yararlanılmaktadır (Chiti vd., 2001). Toprak, hava ve su kirliliğinin kontrolünde mikrobiyal sensörler ve enzim sensörleri kullanılmaktadır. Ayrıca; maden işletmelerinde toksik gaz analizi, askeri uygulamalar ve savunma sanayi, proses kontrolü, biyoreaktör kontrol ve analitiği, ilaç analizi ve ilaç etki 51

66 mekanizmalarının aydınlatılması gibi birçok alanda biyosensörlerden yararlanılmaktadır (Lucarelli vd., 2002). Bazı ilaç molekülleriyle DNA nın etkileşmesi (özellikle antikanser özellik taşıyan ilaç molekülleri ile etkileşim) ve bu etkileşimin geliştirilen yeni yöntemlerle tayin edilmesi; yeni ilaç tasarımları için büyük önem taşımaktadır. İlaçların kötü amaçla kullanımı ve uyuşturucu ile mücadelede biyosensörler kullanılabilecektir. Uyuşturucu arayan köpeklerin yerini biyosensörler alabilir. Böylece özellikle gümrüklerde, karakollarda zaman kazanılacaktır İlaç analiz yöntemleri Geniş çeşitlilikteki numunelerin değerlendirilmesinde genellikle farklı kromotografik yöntemler kullanılmakla birlikte genellikle sıvı kromotografi yöntemi tercih edilmektedir. Bu yöntem kullanılarak elde edilen hassas, özgün, kararlı ve hızlı sonuçların düşük dozlar içinde elde edilebilmesi ve tekniğin çoklu karışımlara uygulanabilmesi önemli avantajıdır. Ancak, cihaz maliyetlerinin yanı sıra kullanılan kimyasalların miktarı ve maliyeti oldukça fazladır. Sıvı kromotografi yönteminin yanı sıra, pek çok ilaç etkin maddesinin kromofor gruplara sahip olmasından dolayı spektrofotometrik tekniklerde sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak kromatografik çalışmalarda kullanılan yöntemin gözlenebilme ve alt tayin sınırı değerleri sistemde kullanılan detektöre bağlı olduğundan sıradan dedektörler kullanıldığında plazma, idrar ve serumda çoğu zaman eser miktarda bulunan türlerin tayini için daha gelişmiş dedektör sisteminin kullanılması gerekmektedir ki bu gereksinim analiz yöntemini daha karmaşık hale getirirken yöntemin ekomonik maliyetini de arttırmaktadır. Spektrofotometrik yöntemlerde gözlenebilme ve alt tayin sınırı değerlerinin diğer yöntemlere göre göreceli olarak daha yüksek olmasının yanında kan ve plazma sıvılarında uygulama alanlarının oldukça kısıtlı olması yöntemin geçerliliğini sınırlamaktadır (Taşdemir, 2011). Voltametri, inorganik, analitik ve biyokimyacılarca çeşitli ortamlarda meydana gelen yükseltgenme ve indirgenme işlemlerinin incelenmesi, yüzeydeki adsorpsiyon işlemlerinin araştırılması ve kimyasal olarak modifiye edilmiş elektrot yüzeylerinde 52

67 cereyan eden elektron aktarım mekanizmalarının aydınlatılması gibi analitik olmayan amaçlar için oldukça yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Voltametri özellikle farmasötik açıdan önemli olan çok sayıda türün tayininde kullanılması bu metoda olan ilgiyi artırmıştır lı yılların ortalarında klasik voltametrik tekniklerde yapılan pek çok değişiklik, yöntemin duyarlılığını ve seçiciliğini büyük ölçüde arttırmış ve özellikle tıp, eczacılık, biyokimya ve çevre çalışmalarında yönteme geniş ve giderek artan bir uygulama alanı sağlanmıştır. (Patriarche, 1979; Özkan vd., 1997; Şentürk vd., 1996). Voltametrik ve polarografik yöntemlerin, eczacılık alanında ve klinik çalışmalarda dönüşümlü kullanılmasının nedeni düşük derişimlerde farmasötik analizlerin yapılabilmesi, numunelerin kolayca ve çok kısa bir sürede hazırlanabilmesi, analiz süresinin kısa olması, ortamda bulunan katkı maddelerinin veya safsızlıkların analiz sonucunu etkilememesi, bu tekniklerin ürün kalite kontrolünde kullanılabilmesine olanak sağlamaktadır (Doğan vd., 2005). Tablet, kapsül, süspansiyon, şurup vb. ilaç formülasyonlarının çözünmeyen kısımlarının veya katkı maddelerinin genelde elektroaktiviteleri bulunmadığı için herhangi bir ayırma işlemine gerek olmadan analizleri yapılabilmektedir. Ayrıca bu yöntemlerin diğer bir üstünlüğü de pahalı ve az miktardaki ilaçların analizinde de çok az miktarda numuneyle çalışma imkanı verdiği için kullanılabilmesidir (Brezina ve Zuman, 1958; Zuman, 1962). 53

68 2. KAYNAK ÖZETLERİ Subba-Reddy vd. (1996), sefalosporinlerin tayini için 2,0-12,0 ph aralığındaki üniversal tamponlarda ilaçlardaki azometin grubunun elektrokimyasını temel alan diferansiyel puls polarografi metodunu geliştirmişlerdir. Kantitatif ölçümler, sefalosporinlerin ile 2, mm derişim aralığında başarılı olmuştur. Geliştirilen bu yöntem ile düşük tayin limitleri elde edilmiştir. Bu metot farmasötik numuneler ve idrar örneklerindeki sefalosporinlerin hem ayrı ayrı hem de eş zamanlı tayinlerine uygulanmıştır. Yılmaz vd. (1998), çalışmalarında sefotaksimin elektroksidasyonu, farklı destek elektrolit çözeltilerinde ve farklı ph larda spesifik olarak camsı karbon (GC), platin ve karbon pasta (CP) elektrotları kullanarak araştırmışlardır. Voltamogram şekillerinin ve oksidasyon basamağı sayılarının elektrotun yapısına bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir. Destek elektrolitin yapısı da elektrotun cevabı için oldukça önemlidir. Aktive edilen GC elektrot ile 0,2 M H3PO4 çözeltisinde M ve M konsantrasyon aralıklarında eğimleri farklı iki kalibrasyon grafiği elde edilmiştir. Geri kazanım testlerinin sonuçları ve istatistik analiz verileri bu voltametrik metodun sefotaksimin tayininde kullanılabileceğini göstermiştir. Analitik açıdan bakıldığında, aktif GC elektrotun uygun olduğu bulunmuştur. El-Maali vd. (2000), yaptıkları çalışmada seftazidimin (CFZ) elektrokimyasal davranışını dört faklı elektrot (statik damlayan cıva elektrotu (SMOE), büyüme kontrollü cıva elektrotu (CGME), camsı karbon elektrot (GCE) ve karbon pasta elektrot (CPE) ) kullanarak incelemişlerdir. Sulu ortamda ilacın zenginleştirilmesi ve tayini için optimum koşullar belirlenmiştir. Karbon pasta elektrotun polivinil alkol ile modifikasyonu, ilaç birikiminde hem seçiciliği hem de hassasiyeti artmıştır. Böylece çok düşük seviyelerde CFZ nin tayini yapılmıştır. CGME ile CFZ için M ın altında tayin limiti tespit edilmiştir. İlaç birikimi için; polivinil alkol ile CPE modifikasyonu (PVA) sonucunda duyarlılığıve seçiciliğiarttırdığı ve bu nedenle bu elektrotun çok düşük seviyelerde kararlı olduğu bulunmuştur. Geliştirilen yöntem ile idrar ilave edilen veya metabolizma sonrası alınan örneklerde CFZ analizi kolaylıkla 54

69 gerçekleştirilmiştir M konsantrasyonun altındaki CFZ içeren örneklerde de kolayca tayin yapılmıştır. Lin vd. (2000), sefalosporin grubunda yer alan 12 antibiyotiğin ayrımını ve çalışılan tampon türünün, derişiminin ve ph sının migrasyon davranışı üzerine etkisini, kapiler bölge elektroforez kullanılarak fosfat, sitrat ve 2-(N-morfin)etansülfonat (MES) tamponlarında incelemişlerdir. Sonuçlar özellikle aynı anda analit olarak sefuroksim-sefazolin, sefaleksin-sefaklor veya sefotaksim-sefapirin bulunduğu durumlardaki sefalosporinlerin ayırımında tampon ph sının yanında tamponu derişimininde önemli rol oynadığını göstermiştir. Sitrat tamponunda optimum tampon derişimi (35-40 mm) küçük bir aralık ile sınırlıyken, MES tamponu 300 mm ın üzerindeki derişimlerde kullanılabilmişlerdir. Bu üç tampon kullanılarak çeşitli optimum koşullar altında on iki sefalosporin ayırımı gerçekleştirilmiş ve ayırımın, fosfat tamponuna kıyasla MES ve sitrat tamponlarında daha iyi olduğu görülmüştür. ph sı 5 den düşük olan sitrat tamponunda sefalosporinlerin elektroforetik mobilitelerinin, elektroosmotik mobiliteden daha büyük olması nedeniyle bazı sefalosporinler gözlenememiştir. Sefradin, sefaleksin, sefapirinin pka değerlerinin ya amino yada pridinyum grubunun deprotonasyonundan kaynaklandığı belirlenmiştir. Ayrıca sefalosporinlerin migrasyon davranışları, çalışılan ph aralığında kantitatif olarak tanımlanmıştır. Pajchel vd. (2000), sefazolin, sefuroksim sodyum, sefoperazon sodyum ve seftazidimin migrasyon davranışlarını incelemişlerdir. ph 5-8 aralığında sodyum dodesilsülfat (SDS) ilaveli ve ilavesiz fosfat-borat tamponu kullanılmıştır. Tüm bileşiklerin kapiler elektroforez ile ayrımı gerçekleştirilememiştir. SDS eklenen ph 6,5 fosfat-borat tamponunda sefalosporinlerin ayırımının iyileştiği gözlenmiştir. ph 6,5 deki fosfat-borat tamponuna pentansülfonik asidin (17,4 g/l) ilavesi, herbir sefalosporinin ayırımını sağlamıştır. Bu koşulda hem migrasyon zamanın hemde pik alanın tekrarlanabilirliğinin iyi olduğu tespit edilmiştir. Billova vd. (2003), kare dalga voltametrik yöntemi ile çeşitli tamponlarda, bakteri kültürlerinde, süt ve idrarda sefoperazonun tayinini gerçekleştirmişlerdir. Sefoperazonun voltametrik pikinin, ph ve çözelti bileşenlerinden etkilendiği 55

70 gözlenmiştir. Sefoperazon için Britton Robinson tamponunda (ph=4,4) düşük dedeksiyon limiti ( yaklaşık 0,5 nmoll -1 ) elde edilmiştir. Kompleks bir ortam içinde ise (bakteriyel 2YT ortamı ph 7,2) dedeksiyon limiti yaklaşık olarak 1,5 mmoll - 1 olarak bulunmuştur. Çalışmacılar, biyokütle ayırımı olmadan yaşayan bakteri kültüründe sefoperazon tayini için kare dalga voltametri tekniğinin uygun ve hızlı bir metot olduğunu kanıtlamışlardır. Sefoperazon bulunan kültür içindeki metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve metisiline duyarlı Staphylococcus aureus (MSSA) arasında zamana bağlı olarak büyük farklılıkların olduğu görülmüştür. Sefoperazon penisilinaz tarafından yarıldığında, oldukça pozitif gerilimlerde yeni bir kare dalga voltametri piki gözlenmiştir. Orjinal sefoperazonun piki eşzamanlı azalırken gözlenen bu yeni pik, yarılma zamanı ve enzim konsantrasyonunun artmasıyla yükselmektedir. Sefoperazonun Pathozene isimli ilaç içindeki derişimi standart ekleme metodu ile tespit edilmiştir ve bulunan sonuç ilaç içindeki bilinen sefoperazon değeri ile örtüşmektedir. Sefoperazonun sütteki tayininin basit bir ön deriştirme işlemi ile gerçekleştirildiği bunun yanı sıra idrardaki tayini için ön deriştirmenin gerekli olmadığı belirtilmiştir. Kare dalga voltametri yöntemi kullanılarak, inek sütünde ve insan idrarında 500 nmol/l gibi düşük derişimdeki sefoperazonun tayininin yapıldığı bildirilmiştir. Becker vd. (2004), yaptıkları bu çalışmada, 2377/90 Konsey tüzüğünde AB Maksimum kalıntı limitleri verilen penisilin ve sefolasporinlerin birçoğu için duyarlı ve spesifik sıvı kromotografi-tandom kütle spektrometri (LC-MS-MS) yöntemi geliştirilmiş ve bu yöntem sığır kası, böbrek ve sütte valide edilmiştir. Analitler, asetonitril/su ile ekstrakte edilmiş ve tek ters-faz/katı-faz ektraksiyon adımı ile temizlenmiştir. Amoksisilin, ampisilin, safaleksin, sefapirin, sefalonyum, sefkuinom ve sefazolin pozitif elektrosprey iyonizasyon modunda; sefoperazon, benzilpenisilin, fenoksimetilpenisilin, oksasilin, kloksalin ve nafsalin ise negatif elektrosprey iyonizasyon modunda ölçüldüğünde analitler için en yüksek duyarlılık elde edilmiştir. Kromotografi çalışması formik asit/metanol ile gerçekleştirilmiştir. Argon ile çarpışma kaynaklı ayrışma (CID), gereken spesifikliği elde etmek için pseudomomelekül iyonların çarpışması için kullanılmıştır. Yöntem yeni AB direktiflerine göre valide edilmiş ve gıda örneklerindeki beta laktam kalıntılarının tanımlanması ve miktar tayinine uygulanmıştır. 56

71 El-Desoky vd. (2005), yaptıkları çalışmada antibiyotik ilaçlardan sefazolin sodyumun (CFZ) Britton Robinson tamponları (ph 2-11) içinde cıva elektrot kullanılarak elektrokimyasal davranışını DC polarografi, dönüşümlü voltametri, kontrollü-potansiyel, kulometri ve kare dalga adsorptif sıyırma voltametri yöntemleri ile incelemişlerdir. Kara dalga adsorptif katodik sıyırma voltametri yöntemi ile sefazolinin dedeksiyon ve kantitatif tayin sınırları sırasıyla M ve 8, M olarak bulunmuştur. Bu yöntem zaman alıcı ekstraksiyon, evaporasyon gibi numune hazırlama işlemlerine gerek duymadan farmasötik numunedeki sefazolinin tayini için kullanılmıştır. El-Maali vd. (2005), sefalosporin grubu antibiyotik türevlerinden olan seftriakson ve sefoperazonu doğru akım, diferansiyel puls ve dönüşümlü voltametri teknikleri ile incelemişlerdir. Her iki antibiyotik için iki-elektron indirgenme basamağına ait iki tersinmez pik gözlemişlerdir. Her iki ilaç etken maddesinin elektroksidasyonu karbon pasta elektrot ile incelenmiş ve her iki bileşik için doygun kalomel elektrota karşı yaklaşık +1,05 V da (ph 1,6 fosfat tampon çözeltisi) yükseltgenme piki gözlenmiştir. Bu bileşiklerin karbon pasta elektrotla tayini için optimum ph aralığı verilmiştir. Seftriakson ve sefoperazon için lineer kalibrasyon grafikleri, sırasıyla 0,49 ile 0,99 μg/ml ve 0, μg/ml derişim aralığında elde edilmiştir. Tayin limiti ise seftriakson için 2,5 μg/ml, sefoperazon için 0,13 μg/ml olarak bulunmuştur. Hammam vd. (2006), yaptıkları çalışmada sefoperazonun kantitatif tayini için kare dalga sıyırma voltametri yöntemini kullanmışlardır. Prosedür, damlayan cıva elektrotuna adsorbe edilen ilacın indirgenmesini temel almaktadır. Dedeksiyon limiti 4, M ve kantitatif tayin sınırı 1, M olan sefoperazonun 150 saniyede damlayan cıva damla elektrot üzerinde ön deriştirilmesi gerçekleştirilmiştir. İnsan serum ve plazmasındaki eser miktardaki sefoperazonun tayini için kare dalga adsorptif katodik sıyırma voltametri yöntemi başarı ile uygulanmıştır. İlacın dedeksiyon kantitasyon sınırları sırası ile M ve M olarak bulunmuştur. Hastanede yatan gönüllülerin plazması içinde sefoperazonun farmokinetik parametreleri başarılı bir şekilde bulunmuştur. 57

72 Jamasbi vd. (2006), bu çalışmada sefaleksin ve sefazolin elektrokatalitik oksidasyonunu, kobalt salopen CoSal ile modifiye edilmiş karbon pasta elektrotun kullanıldığı dönüşümlü voltametri yöntemi ile incelemişlerdir. Sefaleksin ve sefazolinin tayininde CaSol ile modifiye edilen karbon pasta elektrotun seçiciliği araştırılmıştır. Sefazolinin elektro-oksidasyonunda bir elektrokatalitik mekanizmaönermek içn beta-laktam halkası dışında tiyol gruplarına sahip seftriaksonun elektrokimyasal davranışı incelenmişitr. CoSal modifiye karbon elektrotta bu antibiyotiklerin elektrokatalitik oksidasyonunun tersinmez olduğu gözlenmiştir. Kükürt içeren sefazolinin tarama hızına bağımlılığı araştırılmış ve sonuçlar bileşiklerin elektrokatalitik oksidasyonunun difüzyon kontrollü olduğunu göstermiştir. Modifiye edilmiş elektrot ile modifiye edilmemiş elektrotların cevapları karşılaştırılmış ve sefazolin tayininde modifiye elektrotun daha hassas olduğu gözlenmiştir. Sefazolinin kronoamperometri tarafından oksidasyonuna, bütün elektrotların katkısı olduğu belirlenmiştir. Hız kısıtlayıcı basamağa dahil olan elektron sayısı birdir. Yüksek hassasiyetli modifiye elektrotun kullanıldığı diferansiyel puls voltametri sonuçları, insan kanı örneklerindeki sefazolinin tayinine uygulanmıştır. Tampon çözelti içerisinde (ph=3) sefazolinin DPV ile tayininde ile mm derişim aralığında doğrusallık elde edilmiştir. Puig vd. (2007), plazma içindeki sefoperazon ve seftidurun tayini için online katı-faz ekstraksiyon-kapiler elektroforez yöntemlerinin kullanıldığı bir yöntem geliştirmişlerdir. Katı-faz ekstraksiyon C18 mikro ön kolon kullanılarak gerçekleştirilmiş ve sefalosporinler için 1 ml nin üstündeki hacimlerde oldukça iyi alıkonma özellikleri elde edilmiştir. Desorpsiyon için 426 nl kullanıldığında geri kazanım sefoperazon için %75, seftidur %90 olarak bulunmuştur. Elüsyon hacmi yaklaşık olarak 1,8 μl dir. Plazma örneklerindeki analizlerde katı-faz ekstraksiyonundan önce deproteinizasyon adımı uygulanmıştır ve sefoperazon ve seftidur için geri kazanım sırasıyla %90 ve %57 olarak elde edilmiştir. 250 nm dalga boyundaki UV ölçümlerinde derişim ve pik alanları arasında standartlar için 10-50ngmL -1, plazma örnekleri için ise ngml -1 aralığında lineer illişki saptanmıştır. Gün içinde (n=5) ve farklı günlerde (n=5) pik alanının tekrarlanabilirliliği %12 RSD den daha düşüktür. Plazma için elde edilen dedeksiyon 58

73 limitinin (100ngmL -1 sefoperazon ve seftidur) farmokinetik çalışmalara uygulanan metotlar için yeterli olduğu belirtilmiştir. Doğan vd. (2009), çeşitli tampon sistemlerinde ve farklı ph değerlerinde dönüşümlü, doğrusal taramalı, diferansiyel puls ve kare dalga voltametri tekniklerini kullanarak camsı karbon elektrot yüzeyinde sefoperazon sodyumun tersinmez olarak yükseltgenmesini çalışmışlardır. Sefoperazon sodyumun yükseltgenmesinin tersinmez ve ph değerine bağlı olarak difüzyon kontrollü olduğu saptanmıştır. Detaylı bir yükseltgenme mekanizması önerilmiş ve tartışılmıştır. Pik akımının vepotansiyelinin ph, derişim, tarama hızı ve tampon çözeltisine bağımlılığı araştırılmıştır. Pik akımı ile derişim arasındaki lineer ilişkiye göre farmasötik dozaj formlarında ve biyolojik sıvılarda sefoperazon sodyum tayini için diferansiyel pulsve kare dalga voltametri metotları geliştirilmiştir. Sefoperazon sodyumun, diferansiyel puls voltametri tekniği ile M, kare dalga voltametri tekniği ile M aralıklarında sodyum ph 2 fosfat tamponunda kantitatif tayini gerçekleştirilmiş ve serum örneklerine M derişim aralıklarında ilave edilen sefoperazonun tayini her iki yöntemle yapılmıştır. Metodun tekrarlanabilirliği, duyarlılığı, kesinliği ve doğruluğu bütün ortamlarda incelenmiştir. Geliştirilen metodun kesinliği ve doğruluğu geri kazanım çalışmaları için kullanılmıştır. Geri kazanım çalışmaları, standart ekleme metodu ile yapılmıştır. Farmasötik formlardaki katkı maddelerinin ve biyolojik sıvılardaki endonojen maddelerin elektroaktif girişimlerine rastlanmamıştır. Ojani vd. (2010), yaptıkları çalışmalarında bazı sefalosporinlerin (sefiksim, seftriakson, seftizoksim) elektrokatalitik oksidasyonlarını poli(o-anisidin)/sds/ni modifiye karbon elektrot ile dönüşümlü voltametri, kroamperometri ve kronoklometri metotlarını kullanarak gerçekleştirmişlerdir. İlk olarak poli(oanisidin), karbon elektrot yüzeyinde sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren monomer çözeltisinde dönüşümlü voltametri yöntemi ile oluşturulmuştur. Daha sonra, amin grubuna sahip polimerik modifiye elektrotun 0.1 mol/l Ni(II) çözeltisine daldırılması ile Ni(II) iyonları elektrota katılmıştır. Bu elektrot yüzeyinde Ni(OH)2/NiOH çifti için iyi bir redoks davranışı gözlenmiştir. Sefalosporinler nikel iyonlarının bulunduğu poli(o-anisidin) modifiye karbon elektrot yüzeyinde başarılı 59

74 bir şekilde yükseltgenmişlerdir. Sefalosporinlerin elektrokatalitik yükseltgenme pik akımları ve konsantrasyonları arasında lineer bir ilişki bulunmuştur. Elektrot, farmasötik preparatlardaki sefalosporinlerin tayini için başarıyla kullanılmıştır. Ali Ahmed vd. (2011) sefiksim, sefaleksin ve sefotaksimin farmasötik numunelerden tayini için doğru ve kesin spektrofotometrik bir metot önermişlerdir. Önerilen metot, sefalosporinlerin1,2naftakinon-4-sülfonik (NQS) ile türevlendirilmesini temel almaktadır. Optimum deneysel koşullar çalışılmıştır. Sefiksim, sefaleksin ve sefotaksim için sırasıyla 0,5-3, 0,8-2,8 ve 0,2-1,2 μg/ml derişim aralıklarında Beer yasası geçerlidir. Sefiksim, sefaleksin ve sefotaksimin dedeksiyon limitleri ve lineer regresyon korelasyon katsayıları sırasıyla 0,12 (0,9993), 0,168 (0,9993) ve 0,0465 (0,9994) μg/ml olarak bulunmuştur. Geri kazanım değerleri ise sefiksim için 96,5-102,3, sefaleksin için 96,04-102,22 ve sefotaksim için 97,09-99,3 aralığındadır. Sefiksim, sefaleksin ve sefotaksimin tayininde ph, sıcaklık, reaksiyon zamanı ve NQS derişiminin etkisi incelenmiştir. Bu yöntemin kalite kontrol laboratuvarlarında farmasötik numunelerden sefiksim, sefaleksin ve sefotaksimin tayini için basit ve uygulanabilir olduğu belirtilmiştir. Hoang vd. (2013), sefoperazonun elektro indirgenme davranışını ve tayinini, damlayan asılı cıva elektrot ile incelemişlerdir. ph 3-6 aralığındaki Britton Robinson tamponlarında kaydedilen sefoperazonun dönüşümlü voltamogramlarında tek tersinmez katodik pik gözlenmiştir. Yöntemin adsorpsiyon kontrollü olduğu belirtilmiştir. Diferansiyel puls ve kare dalga adsorplayıcı katodik sıyırma voltametrisi ile sefoperazonun tayininde 0,04 mm ph 4 Britton Robinson tamponu destek elektrolit olarak seçilmiştir. Deneysel voltametrik koşullar Central Composite Face ile optimize edilmiştir. İndirgenme piki -0,7 V ile -0,8 V arasında görülmüştür. Bu voltametrik teknikler ICH kurallarına göre valide edilmiş ve sefoperazonun tek başına ve sülbaktam ile tayini için uygulanmıştır. Sonuçlar USP-HPLC yöntemi ile istatiksel olarakkarşılaştırılmıştır. Sefoperazonun insan kanındaki tayini matriks etkisi olmadan gerçekleştirilmiştir. Quesada-Molina vd. (2013), 1:2 oranında aseton-su çözücüsüne amonyum sülfat eklenmesiyle sulu çözeltiden aseton içerisine sefalosporinlerin iyon-çifti 60

75 ekstraksiyonu ters-faz kapiler sıvı kromotografi yöntemini kullanarak bu bileşiklerin tayinini gerçekleştirmişlerdir. Analit olarak sefoperazon, sefaleksin, sefopirin, sefolanin, sefamandol, sefazolin ve sefadroksil kullanılmıştır. İyon çifti oluşturmak için sulu çözeltide optimum koşul olarak 10 mm fosfat (ph 8) tamponunun kullanıldığı 0,9 mm derişim de katyonik iyon-çifti reaktifi hekzadesiltrimetiamonyum bromür (CTAB) seçilmiştir. Sefolasporinlerin ayırımı Luno C18 (150 mm 0,3 mm 5 μm 100 A) kolonu kullanılarak aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilmiştir. A (suda % 0,1 formik asit, ph 4) ve B (asetonitril-su (50:50, v/v)) çözücülerinin birleşimi gradient program, 20 μlmin -1 akış hızı, 35 0 C kolon sıcaklığı, 7 μl enjeksiyon hacmi ve 250 nm dalga boyu aralığındadır. Sığır örnekleri için elde edilen kantitatif tayin limiti, Avrupa Birliği tarafından müsade edilen maksimum kalıntı limitlerinden daha düşüktür. Geliştirilen metodun yüksek duyarlılık, kesinlik ve tatmin edici geri kazanım ile sığır ve domuz kası içeren et ve su örneklerinde yaygın olarak kullanılan antibiyotiklerin analizleri için uygun olduğu gösterilmiştir. 61

76 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu bölümde, bazı sefolasporinler grubu bileşiklerin elektrokimyasal karakterizasyonu ve voltametrik tayinlerinde kullanılan cihazlar, kimyasallar ve yöntemler hakkında bilgi verilmiştir Kullanılan Cihazlar Potentiostat/Galvonostat cihazı Sefolasporin grubu antibiyotiklerden sefoperazon ve sefadroksilin elektrokimyasal davranışları, karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls voltametri yöntemi ile incelenmiştir. Ayrıca dönüşümlü voltametri yöntemi kullanılarak tarama hızının pik akımları üzerine etkisine bakılmıştır. Bu çalışmalarda GPES 4.9 versiyon yazılım programlı Autolab Potentiostat/Galvonostat PGSTAT-302N cihazı kullanılmıştır. Şekil 3.1 de Potantiostat/Galvonostat cihazı görülmektedir. Şekil 3.1. Autolab Potentiostat/Galvanostat PGSTAT-302N cihazı Ultrasonik karıştırıcı Tüm çözeltilerin hazırlanmasında Elmasonic S51 model ultrasonik karıştırıcı kullanılmıştır. 62

77 Hücreler Elektrokimyasal deneyler; beş girişli, rodajlı, aşağıdan yukarıya doğru genişleyen ve kirlenme ile adsorpsiyon yanılgılarının en az olduğu cam hücrelerde yapılmıştır. Şekil 3.2 de kullanılan hücrenin resmi verilmiştir. Şekil 3.2. Elektrokimyasal cam hücre Rodajlı girişlerden birine çalışma elektrotu, birine referans elektrot diğerine de karşıt elektrot yerleştirilmiştir. Şekil 3.3 de deney hücresinin resmi verilmiştir. Şekil 3.3. Deneylerde kullanılan elektrokimyasal hücrenin görünümü Elektrotlar Deneylerde referans elektrot olarak Ag/AgCl elektrot; karşıt elektrot olarak Pt tel ve çalışma elektrodu olarak 0,7 mm. HB Tombo karbon bazlı kalem ucundan oluşan üçlü elektrot sistemi kullanılmıştır. Kullanılan elektrotlar Şekil 3.4, 3.5 ve 3.6 de verilmiştir. 63

78 Şekil 3.4. Çalışma elektrotu olarak kullanılan 0,7 mm. HB Tombo karbon bazlı kurşun kalem ucu Şekil 3.5. Referans elektrot olarak kullanılan Ag/AgCl elektrot Şekil 3.6. Karşıt elektrot olarak kullanılan Pt tel ph /İyon metre Elektrokimyasal çalışmalarda kullanılan tampon çözeltilerin ph ayarlamalarında Mettler Toledo S220 Seven Compact ph/iyon metre ve Mettler Toledo InLab 416 Ag/AgCl kombine elektrot kullanılmıştır. 64

79 3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler Deneylerde kullanılan kimyasal maddeler analitik veya HPLC saflıktadır ve ticari olarak temin edilmiştir. Çözeltiler ultra-saf deiyonize su kullanılarak hazırlanmıştır. Kullanılan kimyasal maddeler ve özellikleri Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1. Kullanılan kimyasal maddeler Kimyasalın Adı Kullanım Amacı Formül ve Özellikleri Asetik asit Britton Robinson ve Asetat tamponlarının hazırlanmasında CH3COOH MA=60,05 g/mol, Merck (analitik saflıkta) O-Fosforik asit Britton Robinson ve Fosfat tamponlarının hazırlanmasında H3PO4 MA=98,00 g/mol, Merck (analitik saflıkta) Borik asit Britton Robinson tamponlarının hazırlanmasında H3BO3 MA=61,83 g/mol, Merck (analitik saflıkta) Sodyum hidroksit Tamponların ph sının ayarlanmasında NaOH MA=40,00 g/mol, Merck (analitik saflıkta) Elektrokimyasal karakterizasyonu ve voltametrik tayinleri yapılan sefolasporin grubu antibiyotiklerin isimleri, kapalı formülleri ve molekül ağırlıkları Çizelge 3.2 ve 3.3 de verilmiştir. 65

80 Çizelge 3.2. Sefadroksilin özellikleri Kapalı formülü Sefadroksil Açık formülü Molekül Ağırlığı [C16H17N3O5S] 363,39 g/mol Çizelge 3.3. Sefoperazonun özellikleri Kapalı formülü Sefoperazon Açık formülü Molekül Ağırlığı [C25H27N9O8S2] 645,6 g/mol 66

81 3.3. Kullanılan Çözeltiler Britton-Robinson tamponu (BR) (ph 2,0-12,0) BR tampon çözeltisi, analitik derişimleri 0,04 M olacak şekilde asetik asit, borik asit ve fosforik asitten gerekli miktarlarda alınıp 0,50 L hacimde suda hazırlanmıştır. Bu stok çözeltiden alınarak ph lar, 3 M NaOH ve derişik H3PO4 çözeltileri kullanılarak 2-12 aralığında ayarlanmıştır Asetat tamponu (ph 3,5-5,5) Asetat tamponu, derişim 0,2 M olacak şekilde asetik asittengerekli miktarda alınıp 0,250 L hacimde suda çözülerek hazırlanmıştır. Bu stok çözeltiden alınarak ph lar, 3 M NaOH ve derişik asetik asit çözeltileri kullanılarak 3,5-5,5 aralığında ayarlanmıştır Fosfat tamponu (ph 2-8) Fosfat tamponu, derişim 0,2 M olacak şekilde fosforik asitten gerekli miktarda alınıp 0,250 L hacimde suda çözülerek hazırlanmıştır. Bu stok çözeltiden alınarak ph lar, 3 M NaOH ve derişik fosforik asit çözeltileri kullanılarak 2-8 değer aralığında ayarlanmıştır Sülfürik asit çözeltisi 0,1 M sülfürik asit çözeltisi, derişik sülfürik asitten gerekli miktarda alınıp hacmin 0,10 L ye saf su tamamlanması ile hazırlanmıştır. Hazırlanan çözeltinin ph sı ölçülerek kaydedilmiştir Sodyum hidroksit çözeltisi NaOH çözeltisi, katı sodyum hidroksitten 3 M olacak şekilde gerekli miktarda tartılıp hacim 0,10 L olacak şekilde suda çözülerek hazırlanmıştır. 67

82 Stok sefadroksil çözeltisi 0,227 gram sefadroksil alınıp % 20 metanol-su içerisinde çözülmüş ve hacmi balon jojede 25 ml ye tamamlanarak 25 mm sefadroksil çözeltisi elde edilmiştir. DPV ve CV çalışmaları yapılırken bu stok çözeltiden gerekli seyreltmeler yapılmıştır Stok sefoperazon çözeltisi 0,417 gram sefoperazon alınıp su içerisinde çözülmüş ve hacmi balon jojede 25 ml ye tamamlanarak 25 mm sefoperazon çözeltisi elde edilmiştir. DPV ve CV çalışmaları yapılırken bu stok çözeltiden gerekli seyreltmeler yapılmıştır İlaç örneğinin hazırlanması Sefoperazon tayini için kullanılacak bir flakon içindeki sülperazonun tamamı tartılarak kütlesi belirlenmiştir. Bir flakonda 1,1074 g sefoperazon olduğu bilindiğinden tartılması gereken madde miktarı hesaplanmış ve bu miktarda alınan ilaç balon jojede su ile 10 ml ye tamamlanmıştır. İlaç örneğinde sefoperazon derişimi 3, M dır. Çözünmeyen destek ve katkı maddelerinin çökmesi için, oda sıcaklığında 2 saat bekletilmiştir. Çökme işlemi tamamlandıktan sonra çözeltinin berrak kısmından belirli hacimlerde alınarak deneylerde kullanılmıştır Serum örneğinin hazırlanması Serum numunesi sağlıklı ve söz konusu ilacı kullanmayan insanlardan temin edilmiştir. Belirli miktar serum 2000 devir/dakika hızla 15 dakika santrifüjlenerek proteinlerin çökmesi sağlanmıştır. Proteinleri çöktürülüp ayrılan serum, filtreden geçirilmiştir. Serumdan 2,5 ml alınıp, içerisinde 7,5 ml çalışma tamponu bulunan elektrokimyasal hücreye eklenerek serum çözeltisi hazırlanmıştır İdrar örneğinin hazırlanması İdrar numuneleri de söz konusu ilacı kullanmayan sağlıklı bireylerden alınmıştır. Belirli miktar idrar 2000 devir/dakika hızla 15 dakika santrifüjlenerek proteinlerin çökmesi 68

83 sağlanmış ve süpernatant kısım alınarak filtreden geçirilmiştir. Her bir çalışma için idrardan 2,5 ml alınıp, içerisinde 7,5 ml çalışma tamponu bulunan elektrokimyasal hücreye eklenerek idrar çözeltisi hazırlanmıştır Yöntem Bu çalışmada sefalosporin grubu bazı bileşiklerin (sefoperazon ve sefadroksil) elektrokimyasal davranışları,karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls voltametri yöntemiyle incelenmiştir. Bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine destek elektrolitin ve destek elektrolit ph sının etkileri incelenerek; pik akımı ve gerilimlerinin destek elektrolit ph sı ile değişimleri değerlendirilmiştir. Elektrot yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik akımları üzerine tarama hızının etkisi bakılmıştır. Elektrokimyasal davranışları belirlenen bileşikleri içeren farmasötik dozaj formlarında ve insan idrar ve serum örneklerinde bu bileşiklerin analizleri belirlenen optimum deneysel koşullarda gerçekleştirilmiştir Sefolasporin grubu bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine destek elektrolit ve ph etkisinin incelenmesi Yapılan çalışmada sefolasporinlerin elektrokimyasal davranışları, destek elektrolit olarak 0,1 M H2SO4 (ph=1,26), ph 2,00-12,00 aralığındaki Britton-Robinson tamponları, ph 2,00-8,00 aralığındaki fosfat tamponları ve ph 3,5-5,5 aralığında asetat tamponları kullanılarak incelenmiştir. Analize başlamadan önce karbon grafit elektrotunun kendi elektroaktivitesini azaltmak amacıyla tüm tampon çözeltiler içerisinde 0 V ile +1,5 V arasında 5 er kez diferansiyel puls voltamogramları alınmıştır. İkinci aşamada tampon çözelti içerisine sefadroksil ve sefoperazon stok çözeltisinden 0, mm aralığındaki derişimlerde seyreltme yaparak farklı sefadroksil ve sefoperazon derişimleri için 3 er kez alınan diferansiyel puls voltamogramlarından akım ve gerilim değerleri belirlenmiştir. Bileşiklere ait pik akım ve gerilimlerinin 69

84 farklı ph larda hazırlanan Britton Robinson, asetat ve fosfat tamponlarındaki değişimleri incelenmiştir Kalibrasyon grafiklerinin hazırlanması Elektrokimyasal davranışının incelenmesi sonucunda yükseltgenme pik akımının maksimum olduğu destek elektrolit çözeltisi ve ph sı belirlenmiştir. Bu çözeltide karbon grafit elektrot kullanılarak sefadroksil için 0,005-0,05 mm ve sefoperazon için 0,05-1 mm derişim aralığında DPV yöntemi ile ölçülen yükseltgenme pik akımları grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafikleri elde edilmiştir İlaç örneğinde sefoperazonun elektrokimyasal tayini Destek elektrolit çözeltisine kalibrasyon doğrusu aralığında bulunan derişimlerde ilaç örnekleri ilave edilmiş ve numunedeki sefoperazon, karbon grafit elektrot kullanılarak DPV yöntemi ile tayin edilmiştir Kan ve idrar örneğinde sefoperazonun eletrokimyasal tayini Destek elektrolit çözeltisine, serum veya idrar numunelerinden 0,1-0,75 mm derişim aralığında ilaveler yapmış ve karbon grafit elektrot kullanılarak diferansiyel puls voltametri yöntemiyle voltamogramları kaydedilip pik akımları ölçülmüştür. Sonra, bu çözeltiye artan derişimlerde standart ilaç etken madde katılmış ve her bir ilave sonrası voltamogramlar alınmış ve pik akımları kaydedilmiştir. Katılan standart etken madde derişimlerine karşı pik akımları grafiğe geçirilerek elde edilen denklemden yararlanarak etken madde derişimleri hesaplanmıştır Dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik akımları üzerine tarama hızının etkisinin incelenmesi Analizin yapılacağı sınır potansiyel değerlerinin belirlenmesi için bir takım ön denemeler yapılmış ve çalışma potansiyel aralığı belirlenmiştir. Potansiyel sınır değerleri belirlendikten sonra sabit sefadroksil ve sefoperazon derişimlerinde elektrot 70

85 yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için karbon grafit elektrot kullanılarak dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik akımları üzerine tarama hızının etkisine bakılmış ve elde edilen CV sonuçlarına göre, pik akımı ile tarama hızının karekökü (ip-υ 1/2 ) ve pik akımının logaritması ile potansiyelin logaritmasının (logip-logυ) grafikleri çizilerek bu grafiklerin eğimlerinden akım türü belirlenmiştir. 71

86 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Sefalosporinlerin Elektrokimyasal Davranışı Bu çalışmada, sefalosporin grubu antibiyotiklerden; sefadroksil ve sefoperazonun farklı destek çözeltiler içinde (Britton-Robinson, asetat ve fosfat tamponu) ve çeşitli ph larda diferansiyel puls voltametri yöntemi kullanılarak, karbon grafit elektrot yüzeyindeki elektrokimyasal davranışları incelenmiştir. Ayrıca elektrot yüzeyine kütle transferini karakterize etmek için dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik akımları üzerine tarama hızının etkisine bakılmıştır. Söz konusu ilaç etken maddelerinin nicel analizi için voltametrik tayin yöntemleri geliştirilerek ticari tabletlerden, kan ve idrar numunelerinden geri kazanım çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalardan elde edilen bulgular ve yorumlar aşağıda ayrıntılı bir şekilde verilmiştir Sefadroksilin elektrokimyasal davranışı Sefadroksilin elektrokimyasal davranışını diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemiyle inceleyebilmek için öncelikle yükseltgenme geriliminin belirlenmesi gerekmektedir. Bu amaçla çalışan tamponların sefadroksil ilave edilmeden önce ve edildikten sonra alınan voltamogramları karşılaştırılmış ve Şekil 4.1 de görüldüğü gibi, yaklaşık +0,90 V gerilimde sefadroksile ait bir yükseltgenme piki gözlenmiştir. Şekil 4.1. a) Sefadroksil bulunmayan ve b) 0,05 mm sefadroksil içeren çözeltide (0,2 M asetat ph 5 tamponu) alınan DPV voltamogramların karşılaştırılması 72

87 Sefadroksilin karbon grafit elektrotu ile yükseltgenme geriliminin belirlenmesinden sonra bileşiğin elektrokimyasal davranışı farklı ph larda hazırlanan Britton- Robinson (ph 2-12), asetat (ph 3,5-5,5) ve fosfat (ph 2-8) tampon çözeltilerinde diferansiyel puls voltametri yöntemi ile incelenmiştir. Her bir tampon için ph ya karşı sefadroksilin yükseltgenme pik akımları grafiğe geçirilerek bileşiğin elektroaktivitesinin en yüksek olduğu destek elektrolit ve ph belirlenmiştir. Şekil 4.2, 4.3 ve 4.4 de sırasıyla asetat, fosfat ve Britton-Robinson tamponlarında 0,05 mm sefadroksil için ph-akım grafikleri verilmiştir. 1,60E-05 Akım (A) 1,20E-05 8,00E-06 4,00E-06 0,00E ,5 4 4,5 5 5,5 6 ph 0,2 mm Asetat Tamponu Şekil ,05 mm sefadroksilin asetat tamponunda ph-akım grafiği 2,00E-05 1,80E-05 Akım (A) 1,60E-05 1,40E-05 1,20E-05 1,00E ph 0,2 M Fosfat Tamponu Şekil ,05 mm sefadroksilin fosfat tamponunda ph-akım grafiği 73

88 9,40E-06 8,50E-06 Akım (A) 7,60E-06 6,70E-06 5,80E-06 4,90E-06 4,00E ph 0,04 M Britton Robinson Tamponu Şekil ,05 mm sefadroksilin Britton-Robinson tamponunda ph-akım grafiği Asetat, fosfat ve Britton-Robinson tamponları için elde edilen ph-yükseltgenme akımı grafikleri değerlendirildiğinde (Şekil 4.5) sefadroksilin elektroaktivitesinin en yüksek olduğu destek elektrolitin ph 8 fosfat tamponu olduğu gözlenmiştir ancak voltamogramlar incelendiğinde asetat ph 5 tamponunda daha belirgin ve keskin pikler elde edilmesinden dolayı bu tamponun sefadroksilin kantitatif tayini için daha uygun olduğuna karar verilmiştir. 2,00E-05 Akım (A) 1,50E-05 1,00E-05 5,00E-06 0,00E ph 0,2 M Fosfat tamponu 0,04 M Britton Robinson tamponu 0,2 M Asetat tamponu Şekil ,05 mm sefadroksilin pik akımına destek elektrolit ve ph nın etkisi 74

89 Çalışma ortamı ph 5 asetat tamponu olarak belirlenen sefadroksilin, analitik tayin aralığını belirlemek için 0,2 M asetat ortamında 0,005 mm ve 0,05 mm konsantrasyon aralığında DPV yöntemiyle voltamogramları alınmıştır (Şekil 4.6). Şekil 4.6. ph 5 asetat tamponunda 0,005 mm ve 0,05 mm arasında değişen sefadroksilin derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları Sefadroksil derişimi ile yükseltgenme pik akım değeri arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi için çizilen grafik (Şekil 4.7) incelendiğinde; 0,005 mm ile 0,05 mm aralığındaki sefadroksil derişimleri ile akım arasında lineer bir ilişkinin olduğu tespit edilmiştir. i/a 3,5E-05 2,8E-05 2,1E-05 1,4E-05 7,0E-06 y = 6,462E-04x + 5,443E-07 R² = 9,999E-01 0,0E+00 0,0E+00 1,0E-02 2,0E-02 3,0E-02 4,0E-02 5,0E-02 Derişim (mm) Şekil 4.7. Sefadroksilin asetat ph 5 tamponunda 0,005 mm ile 0,05 mm arasında değişen sefadroksil derişimlerine karşı DPV ile elde edilen akım değerlerinin grafiği 75

90 Sefadroksilin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde, destek elektrolit ve ph değişkenlerinden sonra pik potansiyeli ve pik akımına tarama hızının etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla ph sı 5 e ayarlanmış 0,2 M asetat tamponunda 0,5 mm sefadroksil için mvs -1 arasındaki çeşitli tarama hızlarında voltamogramlar alınmış ve bu voltamogramlar Şekil 4.8 de verilmiştir. Diferansiyel puls voltamogramında +0,90 V civarında gözlenen pike dönüşümlü voltamogramında rastlanmamıştır. Şekil ,5 mm sefadroksil içeren çözelide farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramlar Sefoperazonun elektrokimyasal davranışı Sefoperazonun elektrokimyasal davranışını diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemiyle inceleyebilmek için öncelikle yükseltgenme geriliminin belirlenmesi gerekmektedir. Bu amaçla çalışan tamponların sefoperazon ilave edilmeden önce ve edildikten sonra alınan voltamogramları karşılaştırılmıştır ve Şekil 4.9 de görüldüğü gibi yaklaşık +1,00 V geriliminde sefoperazona ait bir yükseltgenme piki gözlenmiştir. 76

91 Şekil 4.9. a) Sefoperazon bulunmayan ve b) 0,1 mm sefoperazon içeren çözeltide (0,2 M asetat ph 5,25 tamponu) alınan DPV voltamogramlarının karşılaştırılması Sefoperazonun karbon grafit elektrotu ile yükseltgenme geriliminin belirlenmesinden sonra çalışma ortamını belirlemek amacıyla Britton-Robinson (ph 2-12), asetat (ph 3,5-5,5) ve fosfat (ph 2-8) tampon çözeltilerinde 0 V ile +1,5 V arasında DPV yöntemiyle voltamogramları alınmıştır. Şekil 4.10, 4.11 ve 4.12 de sırasıyla asetat, Britton Robinson ve fosfat tamponlarında0,1 mm sefoperazon için ph-akım grafikleri verilmiştir. 3,40E-06 2,90E-06 Akım (A) 2,40E-06 1,90E-06 1,40E-06 9,00E ,5 5 5,5 6 ph 0,2 M Asetat tamponu Şekil ,1 mm sefoperazonun asetat tamponunda ph-akım grafiği 77

92 2,40E-06 2,20E-06 Akım (A) 2,00E-06 1,80E-06 1,60E-06 1,40E ph 0,2 M Fosfat tamponu Şekil ,1 mm sefoperazonun fosfat tamponunda ph-akım grafiği 1,50E-06 1,20E-06 Akım (A) 9,00E-07 6,00E-07 3,00E-07 0,00E ,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 ph 0,04 M Britton Robinson tamponu Şekil ,1 mm sefoperazonun Britton Robinsom tamponunda ph-akım grafiği Her bir tampon için ph ya karşı yükseltgenme pik akımları grafiğe geçirildiğinde (Şekil 4.13) sefaperazonun en yüksek elektroaktivite gösterdiği elektrolitin ph 5,25 olan asetat tamponu olduğuna karar verilmiştir. 78

93 3,00E-06 2,50E-06 Akım (A) 2,00E-06 1,50E-06 1,00E-06 5,00E-07 0,00E+00 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 ph 0,2 M Asetat tamponu 0,2 M Fosfat tamponu 0,04 M Britton Robinson tamponu Şekil ,1 mm sefoperazonun pik akımına destek elektrolit ve ph etkisi Bu çözeltide 0,05 mm ile 1 mm aralığındaki sefoperazon derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları Şekil 4.14 de verilmiştir. Şekil ph 5,25 asetat tamponunda 0,05 mm ve 1 mm arasında değişen sefoperazonun derişimleri için alınan diferansiyel puls voltamogramları Şekil 4.15 deki grafik incelendiğinde 0,05 mm ile 1 mm aralığındaki sefoperazon derişimleri ile akım değerleri arasındaki ilişkinin lineer olduğu görülmüştür ve regresyon katsayısı 0,9989 olarak bulunmuştur. 79

94 7,00E-06 6,00E-06 5,00E-06 Akım (A) 4,00E-06 3,00E-06 2,00E-06 1,00E-06 0,00E+00 y = 4,467E-06x + 1,974E-06 R² = 9,989E ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Derişim (mm) Şekil Sefoperazonun asetat ph 5,25 asetat tamponunda 0,05 mm ile 1 mm arasında değişen sefoperazon derişimlerine karşı elde edilen akım değerinin grafiği Optimum destek elektrolit ve ph belirlendikten sonra dönüşümlü voltametri yöntemi ile pik potansiyeli ve pik akımına tarama hızının etkisi araştırılmıştır. 0,1 mm sefoperazonun CV yöntemi ile mvs -1 aralığındaki çeşitli tarama hızlarında voltamogramları alınmış ve bu voltamogramlar Şekil 4.16 da verilmiştir. Şekil ,1 mm sefoperazonun 0,2 M asetat tamponunda (ph 5,25), karbon grafit elektrottaki dönüşümlü voltametri voltamogramları 80

95 Tablo ,1 mm sefoperazonun tarama hızıyla akım ve potansiyel değişimi Tarama Hızı υ(mvs -1 ) Tarama Hızının Karekökü, υ 1/2 Tarama Hızının Logaritması, logυ Pik Akımı, Ip(μA) Pik Akımının Logaritması, logip Pik Gerilimi (V) 5 2,23 0,69 6,0 0,77 1, ,00 1,39 11,0 1,04 1, ,07 1,69 14,2 1,15 1, ,00 2,00 19,1 1,28 1, ,81 2,39 32,0 1,53 1, ,36 2,69 54,0 1,73 1, ,38 2,87 72,0 1,83 1,110 Tablo 4.1 incelendiğinde tarama hızı arttıkça yükseltgenme pik potansiyelinin daha anodik değerlere kaydığı görülmüştür. Pik potansiyelinin artan tarama hızı ile daha anodik değerlere kayması, herhangi bir indirgenme pikinin gözlenmemesi ile birlikte değerlendirildiğinde sefoperazonun karbon grafit elektrot yüzeyindeki yükseltgenmesinin tersinmez olduğu sonucu çıkartılabilir. Tarama hızının pik potansiyeline etkisinin yanında, pik akımına etkisi de incelenmiştir. Bu amaçla ip-υ 1/2 (Şekil 4.17) ve logip-logυ (Şekil 4.18) grafikleri çizilmiştir. 81

96 7,00E+01 6,00E+01 Pik akımı (μa) 5,00E+01 4,00E+01 3,00E+01 2,00E+01 1,00E+01 0,00E+00 y = 2,453E+00x - 1,485E+00 R² = 9,975E Karekök tarama hızı (mvs -1 ) Şekil Sabit derişimde pik akımının tarama hıının karekökü ile değişimi 2,10E+00 1,80E+00 1,50E+00 Log pik akımı 1,20E+00 9,00E-01 6,00E-01 3,00E-01 0,00E+00 y = 4,942E-01x + 3,783E-01 R² = 9,897E ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Log tarama hızı Şekil Sabit sefoperazon derişiminde pik akımının logaritmasının tarama hızının logaritması ile değişimi Pik akımının tarama hızının karekökü ile doğrusal olarak değişmesi (R 2 = 0,997) ve pik akımının logaritmasının tarama hızının logaritmasına karşı grafiğe geçirildiğinde elde edilen grafiğin eğiminin 0,4942 olması sefoperazonun karbon grafit elektrot yüzeyindeki yükseltgenmesinin difüzyon kontrollü olduğunu göstermektedir. 82

97 4.2. Sefolasporin Grubu Antibiyotiklerin Farmasötik ve Biyolojik Numunelerde Tayini Bu tez kapsamında incelenen sefadroksil ve sefoperazonun elektrokimyasal davranışlarıyla ilgili veriler, söz konusu ilaç etken maddelerin nicel tayini için voltametrik yöntem geliştirilebileceğini göstermiştir. İlaç etken maddelerinin kan, idrar ve farmasötik numunelerde miktarını belirlemek ve geliştirdiğimiz yöntemin doğruluğunu kontrol etmek için ilaç etken maddelerinin analizi ve geri kazanım çalışmaları yapılmıştır Sefoperazonun farmasötik numunelerden elektrokimyasal tayini Farmasötik numunelerde sefoperazon tayini için öncelikle optimum ortam olduğuna karar verilen asetat ph 5,25 tamponunda ölçülen, yükseltgenme pik akımları grafiğe geçirilerek kalibrasyon doğrusu oluşturulmuştur. Oluşturulan kalibrasyon doğrusu aralığına giren derişimler de hazırlanan farmasötik numunenin karbon grafit elektrot ile voltamogramları alınmış ve numunedeki sefoperazon miktarı tayin edilmiştir. Şekil 4.19 de farmasötik numunenin DPV ile alınan voltamogramları gösterilmiştir. Şekil Sefoperazon içeren sülperazon isimli farmasötik numunenin ph 5,25 asetat tamponunda 0,50 mm ve 0,75 mm derişimlerinde DPV yöntemi ile alınan voltamogramları 83

98 Sefoperazon içeren farmasötik numunede (sülperazon) sefoperazonun yükseltgenmesine ait pikin belirgin olduğu ve pik akımının sefoperazonun artan derişimi ile arttığı gözlenmiştir Sefoperazonun biyolojik numunelerden elektrokimyasal tayini Kan numunesinde sefoperazon tayini için öncelikle optimum ortam olarak seçilen asetat ph 5,25 tamponunda sefoperazonun 0,05 mm 1mM derişim aralığında elde edilen yükseltgenme pik akımları grafiğe geçirilerek kalibrasyon doğrusu oluşturulmuştur. Kan numunesinin analizi kalibrasyon doğrusu derişim aralığında standart ekleme metodu ile gerçekleştirilmiştir. Şekil 4.20 de sefoperazon içeren kan numunesinin DPV ile alınan voltamogramları gösterilmiştir. Şekil Sefoperazon içeren kan numunesinin ph 5,25 asetat tamponunda 0,30 mm, 0,50 mm ve 0,75 mm derişimleri için alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları Kan numunesinde sefoperazonun yükseltgenmesine ait pikin belirgin olduğu ve pik akımının sefoperazonun artan derişimi ile arttığı gözlenmiştir. Gerekli hesaplamalar yapılarak geri kazanım değerleri hesaplanmıştır. İdrar numunesinde sefoperazonun tayini çalışmasında sefoperazonun yükseltgenme geriliminde herhangi bir pik gözlenmemiştir (Şekil 4.21). 84

99 Şekil Kan numunesinin ph 5,25 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları Sefadroksilin farmasötik ve biyolojik numunelerden elektrokimyasal tayini Piyasada sefadroksil içeren ilaç formülasyonu bulunmadığından, bu bileşiğin farmasötik numuneden tayini gerçekleştirilememiştir. Sefadroksil tayini için yapılan idrar ve kan numunelerinde sefadroksilin yükseltgenme geriliminde (+0,90 V) herhangi bir pike rastlanmamıştır (Şekil 4.22, Şekil 4.23). Şekil Kan numunesinin ph 5,00 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları 85

100 Şekil İdrar numunesinin ph 5,00 asetat tamponunda alınan DPV yöntemi ile alınan voltamogramları 86

101 5. SONUÇ Antibiyotiklerle yapılan tedavilerin etkinliği, antibiyotiklerin organizmalar tarafından algılanmasına, doku ve organdaki derişimine ve organizmalardaki bozulma zamanına bağlıdır. Ayrıca tedavinin başarısı için seçilen ilacın etki alanı, canlı bünyede etkilediği organ/organlar, etki gücü, tedavi edici dozu, kullanım süresi, yan etkileri, diğer ilaçlarla etkileşimi, canlı bünyeden atılma şekli ve toksik etkileri iyi araştırılmalıdır. İlaç geliştirme ve uygulama çalışmalarında geliştirilen ilaçların bazı kimyasal/biyokimyasal, farmakolojik ve toksikolojik özelliklerinin belirlenmesi için bu ilaçların; Hedef doku ve organlarının, Varsa metabolit(ler)inin, Canlı bünyeden uzaklaştırma şekli ve yolunun belirlenmesioldukça önemlidir. Bu parametrelerin belirlenmesinde ilaç etken maddelerinin ve/veya ilaçlar ile etkileşen maddelerin canlı bünyede veya bünye dışında ilacın alınmasını takip eden farklı zamanlarda yüksek doğruluk ve kesinlikte tayin edilebilmeleri gereklidir. Bunun için validasyonu yapılmış, düşük maliyetli ve hızlı ilaç analiz yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Araştırma, geliştirme ve kalite kontrol çalışmalarında kullanılmak üzere bilinen pek çok etken madde ve ilaç için geliştirilmiş analiz yöntemleri, Amerikan Farmakopesi (USP) ile Avrupa Farmakopesi (EP) ve İngiliz Farmakopesi (BP) de yayınlanmaktadır. Analiz yöntemleri, oluşturulan ilaç formunda yer alan (tablet,kapsül vb.) etken maddenin tanımlanmasında, beyan edilen dozun nicel analizinde ve her ilaç formundaki dozun eşit olduğunu kanıtlamak amacıyla kullanılmaktadır. Elde edilen in-vitro değerler klinik çalışmalarda katı doz formlarındaki in-vivo bioyararlanım ile bağdaştırılabilir. 87

102 Geliştirilen yeni etken maddeler için mevcut analiz yöntemlerinin daha güvenilir, duyarlı ve uygun maliyetli hale getirilebilmesi önem taşımaktadır. Gelişen teknoloji ile kullanımı kolay, hızlı cevap verebilen, otomasyona elverişli ve yüksek hassasiyete sahip yeni cihaz ve teknikler kullanılarak yeni analiz yöntemleri geliştirme çalışmaları artan bir hızla devam etmektedir. Yeni analitik yöntemlerin geliştirilmesi, mevcut analitik yöntemlerin iyileştirilmesi ve yöntemlerin validasyonu; maliyetinin yanında zaman ve deneyimde gerektiren bir süreci kapsamaktadır ların ortalarına kadar biyolojik sıvılardaki ve dokulardaki antibiyotiklerin içeriği sıklıkla mikrobiyolojik yöntemlerle tayin edilmekteydi. Bu yöntemin en büyük dezavantajı numune içeriğinin bilinmemesiydi. Bu durum aynı anda birden fazla antibiyotiğin kullanılması ve organizma içinde antibiyotiğin çok fazla sayıda metabolitinin oluşmasıyla ilişkilidir. Diğer zorluğu ise analizlerin uzun zamanda gerçekleşmesidir. Günümüzde ilaç analizlerinde çeşitli analitik yöntemler kullanılmaktadır. Bunlar arasında en yaygın olarak kullanılanları kromatografik yöntemlerdir. Biyolojik ortamlarda bulunması muhtemel hücre ve doku bileşenleri ile ilaç ve ilaç ile ilgili bazı moleküllerin tayini için genelde kromatografik yöntemler ve bu yöntemler ile uyum sağlayabilen bazı sistemler kombine halde kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin aynı anda çok sayıdaki molekülün tayinini mümkün kılması, kolay uygulanabilir olması, tekrarlanabilir sonuçlar vermesi gibi bir takım üstünlükleri vardır. Ancak bu üstünlüklerin yanı sıra karmaşık ve pahalı cihazlara gereksinim duyulması gibi dezavantajlarıda mevcuttur. Ayrıca bu yöntemlerin uygulanmasında fazla miktarlarda kimyasala ihtiyaç duyulması da ayrı bir dezavantajdır. Son zamanlarda voltametrik yöntemlerin elektrokimyasal olarak aktif olan türlerin tayininde yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanması oldukça dikkat çekicidir. Bu yöntemler kolay uygulanabilmekte, diğer yöntemlerden daha az miktarlarda kimyasal kullanılmakta ve gerekli sistemler daha ucuza kurulabilmektedir. En önemlisi, geliştirilen elektrokimyasal yöntemlerin gözlenebilme ve alt tayin sınırları diğer 88

103 yöntemlerde bulunanlara göre oldukça düşük olabilmektedir. Ayrıca numunenin ayrı bir ön işleme tabii tutulmaması bu yöntemlerin ilaç analizlerindeki kullanımını arttırmaktadır. Beta laktam grubunda yer alan ve antibakteriyel tedavide yaygın olarak kullanılan sefalasporinlerin tayini için geliştirilen spektrometri, kromatografi ve elektrokimyasal yöntemler mevcuttur. Yapılan literatür taramalarında sefadroksil ve sefoperazonun elektrokimyasal davranışlarının incelenmesi ve voltametrik tayini için çalışma elektrotu olarak karbon grafit elektrotun kullanıldığı çalışmaya rastlanmamıştır. Karbon grafit elektrot, Ucuz olması, Kolay bulunabilmesi, Elektrokimyasal olarak inaktif özellik taşıması, Tek ve çok kullanımlık olması gibi özellikleriyle analizler için uygun bir çalışma elektrotudur. Çalışmanın ilk aşamasında sefalosporin grubunda yer alan sefadroksil ve sefoperazonun elektrokimyasal davranışları üzerine destek elektrolit ve ph nın etkisi (Britton Robinson, asetat ve fosfat) karbon grafit elektrot kullanılarak DPV tekniğiyle incelenmiştir. Daha sonra bu iki ilaç etken maddesinin çeşitli ortamlardaki nicel tayini için voltametrik yöntem geliştirilmesi planlanmıştır Sefolasporinlerin Elektrokimyasal Davranışlarının İncelenmesi Bileşiklerin elektrokimyasal tayinlerinin yapılabilmesi için öncelikle elektrokimyasal davranışlarının bilinmesi gerekmektedir. Sefadroksil ve sefoperazonun elektrokimyasal davranışları farklı destek elektrolitlerde (sülfürik asit, fosfat, asetat ve Britton Robinson) incelenmiştir. Bu amaçla bileşiklerin 0,0 V ile +1,5 V gerilim aralığında diferansiyel puls voltametri yöntemi ile 3 er kez voltamogramları alınarak bileşiklere ait en yüksek yükseltgenme akımlarının elde edildiği destek elektrolit ve 89

104 ph belirlenmiştir. Pik akımları-ph grafikleri (Şekil 4.5, Şekil 4.13) incelendiğide en yüksek akım değerleri sefoperazon için ph 5,25 asetat tamponunda, sefadroksil için asetat ph 5,00 tamponunda elde edilmiştir. Sefadroksil ve sefoperazon için belirlenen maksimum yükseltgenme akımlarının gözlendiği tampon ve ph koşulları çizelge 5.1 de verilmiştir. Çizelge 5.1. Sefalosporinler için elde edilen optimum çalışma koşulları Bileşik Tampon Optimum ph Sefadroksil Asetat 5,00 Sefoperazon Asetat 5,25 Sefadroksilin ve sefoperazonun belirlenen optimum ortamlardaki yükseltgenme pik gerilimleri ile akımları ve N=3 için hesaplanan standart sapma değerleri Çizelge 5.2 de verilmiştir. Çizelge 5.2. Sefadroksil ve sefoperazon için yükseltgenme gerilimi ve yükseltgenme akım değerleri Bileşik Yükseltgenme Gerilimi Yükseltgenme Akımı Sefadroksil Sefoperazon 1,02 V (±0,01) 1,12 V (±0,01) 7,19 μa (±0,20) 2,28 μa (±0,34) Optimum koşullarda sefadroksil ve sefoperazon için hazırlanan kalibrasyon grafikleri en küçük kareler yöntemiyle değerlendirilmiş ve aşağıdaki formüller kullanılarak gözlenebilme sınırı (LOD) ve alt tayin sınırı (LOQ) hesaplanmıştır. LOD = (3 Sb)/m(5.1) LOQ= (10 Sb)/m(5.2) Burasa Sb, kalibrasyondoğrusunda başlangıç ordinatının standart sapması ve m, kalibrasyon doğrusunun eğimidir. 90

105 Çizelge 5.3. Sefadroksilve sefoperazon için gözlenebilme ve alt tayin sınır değerleri Bileşik LOD LOQ Sefadroksil Sefoperazon 5, , , , Bileşiklerin elektrokimyasal davranışları üzerine destek elektrolit ve ph etkisinin incelenmesinden sonra pik potansiyeli ve pik akımına tarama hızının etkisi araştırılmıştır. Sabit derişimde dönüşümlü voltametri yöntemi mvs -1 aralığındaki tarama hızlarında alınan voltamogramlar incelendiğinde tarama hızı arttıkça pik potansiyelinin daha yüksek potansiyellere kayması ve herhangi bir indirgenme pikinin gözlenmemesi, bileşiklerin karbon grafit elektrot yüzeyindeki yükseltgenmesinin tersinmez olduğunu göstermektedir. Voltametrik yöntemlerde akım türünü belirlemek oldukça önemlidir. Akım türünü belirlemek amacıyla pik akımı-tarama hızının karekökü (ip-υ 1/2 ) ve pik akımının logaritması-tarama hızının logaritması (logip-logυ) grafikleri çizilmiştir. Pik akımının, tarama hızının karekökü ile doğrusal değişmesi (Şekil 4.17, R 2 =0,997) bileşiğin karbon grafit yüzeyindeki yükseltgenmesinin difüzyon kontrollü olduğunu düşündürmüştür. Pik akımının logaritmasının tarama hızının logaritması ile değişimi incelendiğinde ise elde edilen doğrusal grafiğin eğimi 0,49 olarak hesaplanmıştır (Şekil 4.18). Bu değer difüzyon kontrollü mekanizmalar için önerilen 0,50 değerine oldukça yakındır. Yükseltgenme absorbsiyon kontrollü olsaydı, eğimin 0,50 değil 1,0 değerine çok daha yakın olması beklenirdi. Sonuç olarak çalışma elektrotu ile bileşik arasında gerçekleşen elektron aktarımının elektrot/çözelti arayüzeyinde gerçekleştiği söylenebilir Farmasötik Numunelerden Sefalosporinlerin Tayini Elektrokimyasal davranışı incelenen bileşiklerden sefadroksili içeren ilaç formülasyonu piyasada bulunamadığından, bu bileşiğin farmasötik numunelerde tayini yapılamamıştır. 91

106 Sefoperazonun farmasötik numunelerdeki miktarını belirlemek ve geliştirdiğimiz yöntemin doğruluğunu kontrol etmek için Sülperazon isimli flakon formundan sefoperazonun analizi ve geri kazanım deneyleri yapılmıştır. Numune analizi sefaperazon için optimum ortam olan asetat ph 5,25 tamponunda gerçekleştirilmiştir. Bu çözeltide çizilen kalibrasyon grafiği kullanılmıştır (Şekil 4.15). Farmasötik numuneden hazırlanan çözelti, kalibrasyon aralığına giren sefoperazon derişimlerinde seyreltilmiştir. İlaç numunesinde verilen ve elektrokimyasal olarak tayin edilen sefoperazon miktarı Çizelge 5.4 de verilmiştir. Geri kazanım değerinin %100 e yakın olması geliştirilen yöntemin doğruluğunu göstermektedir Çizelge 5.4. Sefoperazon için çalışılan farmasötik numunenin tayin sonuçları Nunune Tablet derişimi Tayin edilen derişim %BSS RF Sülperazon M 2, M 0,13 %101, Biyolojik Numunelerden Sefalasporinlerin Tayini Sefadroksil ve sefoperazonun serum ve idrar numunelerinde tayin edilip edilemeyeceği de araştırılmıştır. Bu amaçla serum ve idrar numunelerine, standart sefadroksil ve sefoperazon çözeltileri eklenmiş ve DPV voltamogramları alınmıştır. Aynı miktarda sefadroksil, destek elektrolite katıldığında elde edilen voltamogramlarda bir yükseltgenme pikine rastlanmasına rağmen; serum ve idrar içeren numunelerde herhangi bir pik gözlenmemiştir. Kan ve idrar numunelerine kalibrasyon doğrusu aralığında sefoperazon katılmış ve DPV voltamogramları kaydedilmiştir. Sefoperazon içermeyen serum numunelerinde ilgili potansiyel bölgesinde herhangi bir pik rastlanmamakla birlikte sefoperazon ilavesiyle pik oluşumu gözlenmiştir. İdrar numunesinde ise etken maddeye ait herhangi bir pike rastlanmamıştır. 92

107 Çizelge 5.5. Sefoperazon için çalışılan kan numunesinin tayin sonuçları Nunune Kan derişimi Tayin edilen derişim %BSS RF Kan 2, M 2, M 0,70 %102,3 Yapılan literatür taramasında sefalosporin grubu bileşiklerin elektrokimyasal davranışlarının incelendiği ve voltametrik tayinlerin yapıldığı az sayıda çalışmaya rastlanmıştır. Bu çalışmalarda damlayan civa elektrot kullanılmıştır (Hammam vd., 2006). Bu elektrot çok kolay oksitlenir ve bu yüzden civanın anot elektrot olarak kullanılmasını büyük ölçüde sınırlar. Ayrıca damlayan civa elektrotun istenmeyen diğer bir yanıda faradayik olmayan artık akım ve yükleme akımı vermesidir (Hoang vd., 2013). Böyle bir akım, metotun konsantrasyon hassaslığını düşürür. Bu sebeple karbon grafit elektrotun hem indirgenme hem yükseltgenme bölgesinde geniş çalışma aralığına sahip olması önemli avantajlar sağlamıştır. Sonuç olarak sefoperazon ve sefadroksilin hiçbir ön işleme tabi tutulmaksızın analiz edilmesi, az miktarda analitle çalışılması deneyler sırasında gözlenen avantajlar olup yöntemin kolaylığını göstermektedir. Ayrıca yapılan çalışmalar sırasında uygulanan yöntemin hızlı, ayırt edici ve ekonomik bir yöntem olduğu belirlenmiştir. 93

108 KAYNAKLAR Ali Ahmed, M.S., Elbashir A.A., Aboul-Enein, H.S., New SpectrophotometricMethod for Determination of Cephalosporinsin Pharmaceutical Formulations. Arabian Journal of Chemistry, 11, 20. Akkan, G., Pratikte Antibiyotik Kullanımı Sempozyumu. İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri, 2-3 Mayıs, İstanbul, Bard, A.J., Rubinstein, L.F., Electrochemical Methods Fundamantels and Applications, John Wiley & Sons INC., 833p, New York. Bailey, R.R., Peddie, B., Blake, E., Serum and Urine Levels of Cefoperazone in Severe Chronic Renal Failure: Single and Multible Dose. Apıs INC. 41p, New York. Battilotti, M., Colapicchioni, C., Giannini, I., Porcelli, F., Campanella, L., Cordatore, M., Mazzei, F., Tomassetti, M., Characterization of Biosensors Based on Membranes Containing a Conducting Polymer, Anal. Chim. Acta, 221, Becker, M., Zittlau, E., Petz, M., Resudie Analysis of 15 Penicillins and Cephalosporins in Bovine Muscle, Kidney and Milk by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Analytica Chimica Acta, 520, Billova, S., Kizek, R., Jelen, F., Square-Wawe Voltammetric Determination of Cefoperazone in A Bacterial Culter, Pharmaceutical Drug, Milk and Urine. Anal Bional Chem, 377, Bond, A.M Modern Polarografic Methods in Analytical Chemistry, Marcel Dekker INC., 523p, New York Borman, S.A., Osteryoung, R.A., Osteryoung J.G., O'Dea, J.J Anal. Chemistry Pulse Voltammetry-Today and Tomorrow, Pittsburgh Conference, 54, 698A. Brezina, M., Zuman, P., Polarography in Medicine, Biochemistryand Pharmacy. Interscience Pyblishers, 862p, New York. Buerk, D.G., Biosensors: Theory and Applications,Technomic Publishing Company INC., 213p, USA. Chiti, G., Marrazza, G., Macsini, M., Electrochemical DNA Biosensor for Environmental Monitoring. Analytica Chimica Acta, 427,

109 Christie, I.M., Treloar, P.H., Vadgama, P., Plasticized Poly(Vinyl Chloride) as A Permselective Barrier Membrane for High-Selective. Analytica Chimica Acta, 269, Clark, L. C., Lyons, C., Electrode System for Continuous Monitoring in Cardiovascular Surgery. Ann. NY Acad. Sci., 102, Dinçkaya, E., Çağin, M., Telefoncu, A., Enzymatic Method for The Spectrophotometric Determination of Aspartame. Food Chemistry, 50, Doğan B., Uslu B., Özkan S.A., Electrochemical Studies of Ganciclovir At Glassy Carbon Electrodes and İts Direct Determination in Serum and Pharmaceutics by Square Wave and Differential Pulse Voltammetry. Doğan, B., Gölcü, A., Dolaz, M., Özkan, S.A., Electrochemical Behaviour of The Bactericidal Cefoperazone and İts Selective Voltametric Determination in Pharmaaceunitical Dosage Forms and Human Serum. Current Pharmaceutical Analysis, 5, Dumitriv, S., Papu, M., Polymeric Biomaterials As Enzyme and Drup Carriers. J. Bioact. Compat. Pol., 3, Eggins, B.R Biosensors: an Introduction, John Wiley and Sons Ltd. and B.G. Teubner, West Sussex, 210 s. El-Desoky, H.S., Ghoneim, E.M., Ghoneim, M.M., Voltammetric Behavior and Assay of The Antibiotic Drug Cefazolin Sodium in Bulk Form and Pharmaceutical Formulation at A Mercury Electrode. Journal Of Pharmaceutical And Biomedical Analysis, 39, El-Maali, N., Voltammetric Analysis of Ceftazidime After Preconcentration at Various Mercury and Carbon Electrodes: Application to Sub-ppb Level Determination in Urine Samples. Talanta, 51, El-Maali, N., Ali, A.M.M., Ghandour, M.A., Electrochemical Reducton and Oxidation of 2 Cephalosporin Antibiotics-Ceftriaxone (Rocephin) And Cefoperazone (Cefobid). Electroanalysis, 5, Elmosallamy, M.A.F., New Potentiometric Sensors for Creatinine, Analytica Chimica Acta, 564, Erdem, A., Özsöz, M., Electrochemical DNA Biosensors Based on DNA Drug İnteractions. Electroanalysis, 14, Erdoğdu G., Bazı Biyokimyasal Moleküllerin İletken Polimer Elektrotlardaki Voltametrik Davranışlarının İncelenmesi. İnönü Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora tezi, 122s, Malatya. Fagain, C.O., Enzyme Stabilization-Recent Experimental Progress. Enzyme and Microbial Technology, 33,

110 Gür, D., Bakterilerde Antibiyotiklere Karşı Direnç. Nobel Tıp Kitabevleri, 182s, İstanbul. Hall, E.A.H., Biosensors,Open University Press, 47s, England. Hammam, E., El-Attar M.A., Beltagi, A.M., Voltammetric studies on the antibiotic drug cefoperazone Quantification and pharmacokinetic studies, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 42, Haskılıç, G., Asiklovirin Elektrokimyasal Davranışı ve İlaçlarda Voltametrik Yöntemler İle Miktarının Belirlenmesi. Çanakkale On Sekiz Mart Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 66s, Çanakkale. Hoang, V.D., Huyen, D.T., Phuc, P.H Adsorptive Cathodic Strippting Voltametric Determination of Cefoperazone in Bulk Powder, Pharmaceutical Dosage Forms and Human Urine. Analitical Methods in Chemistry, 2013, Jamasbi, E.S., Rouhollahi, A., Shahrokhian, S., Haghgooc, S., Aghajani, S., The Electrocatalytic Examination of Cephalosporins at Carbon Paste Electrode Modified with Cosalophen. Talanta, 71, Kfoury, J.N.S, Araj, G.F., Recent Development in B-Lactamases and Extended Spektrum Blactamases. British Journal Medicine, 327, Kim, J.P., Kim, S.P., Clinical Studies With Cefoperazone in The Treatment of Bacterial İnfections in Surgial Practice. Drugs, 22, 87. Kissinger, P.T., Heineman, W.R., Laboratory Techniques in Electroanalytical Chemistry, Marcel Dekker INC, 989p, New York. Koç Türkoğlu, F., Pediatri Kliniğine Başvuran Annelerin Çocuklarda Antibiyotik Kullanımı Konusundaki Bilgi ve Tutumlarının Araştırılması. Göztepe Eğitim Ve Araştırma Hastanesi Aile Hekimliği, Uzmanlık Tezi, 14s, İstanbul. Labuda, J., Bubnicova, K., Kovalova, L., Vanickova, M., Mattusch, J., Wennrich R., Voltammetric Detection of Damage to DNA by Arsenic Compounds at a DNA Biosensor, Sensors, 5, Laux, G., Baumann, P., Hiemke, C Therapeutic Drug Monitoring of Antidepressants Clinical Aspects. Journal of Neural Transmission, 72, Lin, C., Chen, H., Lin., E. C., Lin., K., Huang., H., Optimization of Separation and Migration Behavior of Cephalosporins in Capillary Zone Electrophoresis. Journal of Chromatography A, 879, Lin, T.Y., Hu, C.H., Chou, T.C., Determination of Albumin Concentration by MIP-QCM Sensor. Biosensors and Bioelectronics, 20,

111 Lucarelli, F., Marazza, G., Palchetti, I., Cesaretti, S., Mascici, M., Coupling of An İndicator-Free Electrochemical DNA Biosensor with Polymerase Chain Reaction for The Detection of DNA Sequences Related to The Apolipoprotein E. Analytica Chimica Acta, 469, Lucarelli, F., Palchetti, I., Marazza, G., Mascini, M., Electrochemical DNA Biosensor As A Screening Tool for The Detection of Toxicants in Water and Waste Water Samples. Talanta, 56, Marazza, G., Chianella, I., Macsini, M., Anichini, M., Detection of Human Apolipoprotein E Genotypes with DNA Electrochemical Biosensor Coupled with PCR. Clinica Chimica Acta, 46, Merkoci, A., Fabregas, E., Alegret, S., Consolidated Biocomposite Membrane Technology for Production of Potentiometric Biosensors. Sensors and Actuators B, 60, Monk, P.S.M., Fundamentals of Electroanalytical Chemistry. John Wiley & Sons INC., Wiley VHC., 362p, New York. Montesissa, C., Villa, R., Anfossi, P., Zanoni, R., And Carli, S Pharmacodynamics and Pharmacokinetcs of Cefoperazone and Cefamandole in Dods Following Single Dose İntravenous and İntramuscular Administration. The Veterinary Journal, 166, Ojani, R., Raoof, J., Zamani, S., A Novel Sensor for Cephalosporins Based on Electrocatalytic Oxidation by Poly(O-Anisidine)/SDS/Ni Modified Carbon Paste Electrode. Talanta, 81, Opal, S.M., Medeiros, AA., Molecular Mechanisms of Antibiotic Resistance in Bacteria. Elsevier Churchill Livingstone INC, 260p, Pennsylvania. Öncül, O., Akılcı Antibiyotik Kullanımı Ve Erişkinde Toplumdan Edinilmiş Enfeksiyonlar. İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri, Kasım 2002, İstanbul, Quesada-Molina, C., Garcia-Campana, A.M., Olmo-Iruela, M., Ion-paired Extraction of Cephalosporins in Acetone Prior to Their Analysis by Capillary Liquid Chromatography in Environmental Water and Meat Samples. Talanta, 115, Pajchel, G., Tyski, S., Adaptation of Capillary Electrophoresis to The Determination of Selected Cephalosporins for İnjection. Journal of Chromatography A, 895, Patriarche, Applications of Polarography and Voltametry in Analysis for Drugs. Analytica Chimica Acta, 196,

112 Perçin, S., Bazı Sülfonamitlerin Elektrokimyasal ve Kromatografik Davranışlarının İncelenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 170, Isparta. Piletsky, S.A., Turner, A.P.F., Electrochemical Sensors Based on Molecularly İmprinting Polymers. Electroanalysis,14, Puig, P., Tempels, A., Borrull, F., Calull, M., Aguilar, C., Somsen, G.W., J. de Jong, G., On-Line Coupling of Solid-Phase Extraction and Capillary Electrophoresis for The Determination of Cefoperazone and Ceftiofur in Plasma, Journal of Chromatography B, 856, Reddy, S.M., Vadgama, P., Entrapment of Glucose in Non-Porous Poly(Vinyl Chloride). Analytica Chimica Acta, 461, Sakallı, D., Diferansiyel Puls Voltametrisi ile İlaç Analizleri. Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 97s, Ankara. Sarı H.,2005. Karbapenemlere dirençli Gram-negatif Basil İzolatlarinda İmipenem- EDTA / Meropenem-EDTA Disk Yöntemi ve Modifiye Hodge Testi ile Metallo-Beta- Laktamaz Varlığının Araştırılması. Uzmanlık tezi, İstanbul. Schugerl, K., Progress in Monitoring, Modeling and Control of Bioprocesses During the Last 20 Years. J. of Biotechnology, 85, Skoog, Douglas A., West, Donald A., Holler, F. James, Fundamentals of Analytical Chemistry. Sounders College Publishing. Skoog, M., Kronkvist, K., Johansson, G., Blocking of Chemically Modified Graphite Electrodes by Surfactants. Analytica Chimica Acta, 269, Spichiger-Keller, U.E., Chemical Sensors and Biosensors for Medical and Biological Applications. Verlag Chemie, Weinheim, 455. Subba Reddy, G.V., Estimation of Cephalosporin Antibiotics by Differantial Pulse Polarography. Talanta, 44; Şentürk, Z., Birol, İ., Özkan, S.A., Determination of Ornidazole in Pharmaceutical Dosage Forms Based on Reduction at An Activated Glassy Carbon Electrode. İnternational Journal of Pharmaceutics, 157, Taşdemir, İ.H., Hipertansiyon Tedavisinde Kullanılan Bazı İlaçlardaki Etken Maddelerin Tayini İçin Elektrokimyasal Yöntemlerin Geliştirilmesi ve Analitik Uygulamaları. Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 243s, Ankara. Telefoncu, A., Biyosensörler. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Baskı Atölyesi, 280s. İzmir. 98

113 Telefoncu, A., Enzimoloji, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Baskı Atölyesi, 380s. İzmir. Tural H., Ertan, N., Gökçel, İ., Enstrümental Analiz I Elektroanalitik Yöntemler. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları, 339s, İzmir. Türe, M., Fenilefrin Hidroklorür ün Elektrokimyasal Özelliklerinin İncelenmesi ve Ticari İlaç Formlarından Miktarının Belirlenmesi. Çanakkale On Sekiz Mart Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 99s, Çanakkale. Wang, J., Analytical Electrochemistry, John Wiley & Sons INC., Wiley VHC., 209p, New York. Wang, L., Zhang, Z., Baoxian Ye, B., Study on The Electrochemical Behaviour of The Anticancer Herbal Drug Emodin. Electrochimica Acta, 51, Willet, H.P, Antibacterial Agents. Appleton-Century-Crofts, 191p, Norwalk. Yılmaz, S., Uslu, B., Özkan, S.A., Anodic Oxidation of Etodolac and İts Square Wave and Differential Pulse Voltametric Determination in Pharmaceuticals and Human Serum. Talanta, 54, Yılmaz, S., Analitik Voltametri. 1.Basım, Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Yayınları, Çanakkale, 8. Yılmaz, N., Biryol, İ., Anodic Voltammetry of Cefotaxime. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 17, Zuman, P., Application of Polarography to Organic Chemistry. Journal of Electroanalytical Chemistry, 3,

114 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Seher İPEKÇİ Doğum Yeri ve Yılı : Ceyhan, 1988 Medeni Hali Yabancı Dili E-posta : Bekar : İngilizce : shripkci@hotmail.com Eğitim Durumu Lise : Cemile Hamdi Ongum Süper Lisesi, 2006 Lisans : SDÜ, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya, 2012 Yüksek Lisans: SDÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya, 2014 Yayınları Yıldırım, G., İpekçi, S., Özkorucuklu, S.P., Investigation of Electrochemical Behaviors of Sulfamethoxazole and Trimethoprime Using Pencil Graphite Electrode. I.Internationally Participated Electrochemistry Workshop, June 2013, Muğla, 83. İpekçi, S., Yıldırım, G., Özkorucuklu, S.P., Electrochemical Behavior and Voltametric Determination of Diclofenac. I.Internationally Participated Electrochemistry Workshop, June 2013, Muğla, 43. İpekçi, S., Yıldırım, G., Özkorucuklu, S.P., Method Development for Voltammetric Determination of Some Cephalosporin Group Antibiotics in Pharmaceutical Formulation. I.Internationally Participated Electrochemistry Workshop, June 2013, Muğla, 45. Özkorucuklu, S.P., Çimenkaya, A., Yıldırım, G., Sarı, M., İpekçi, S., Şahin, Y., Sülfonamitlerin Elektrokimyasal Katı-Faz Ekstraksiyonu ve Amperometrik Tayini. VI. Ulusal Analitik Kimya Kongresi, Eylül 2012, Hatay,