MEMS Tabanlı Elektrokimyasal Biyosensör Tasarımı ve Üretimi

Transkript

1 MEMS Tabanlı Elektrokimyasal Biyosensör Tasarımı ve Üretimi Hatice CEYLAN a,*, Haluk KÜLAH b,c, Alpaslan ALP d, Gülşen HASÇELİK d, Canan ÖZGEN a a Kimya Mühendisliği, Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Ankara, b Elektrik ve Elektronik Mühendisliği, Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Ankara, c ODTÜ MEMS Araştırma ve Uygulama Merkezi, Ankara, d Tıbbi Mikrobiyoloji, Hacettepe Üniversitesi, Ankara, *Kimya Mühendisliği, Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Ankara, 06531, hceylan@metu.edu.tr ÖZET Bu çalışmada, DNA, toksin, enzim ve bakteri tanılarında kullanılmak üzere Mikro Elektro Mekanik Sistemler (MEMS) tabanlı elektrokimyasal sensör tasarımı ve üretimi araştırılmıştır. Elektrokimyasal biyosensörde referans elektrot olarak AgCl kullanılırken, çalışma ve yardımcı elektrotlar için kolay şekil alabilirliği, oksitlenme reaksiyonun yavaş olması ve birçok kimyasal ile tepkimeye girmemesi gibi avantajları nedeniyle, altın (Au) tercih edilmiştir. Düşük fiyatlı elektrokimyasal sensörün kısa sürede üretimi için parilen kaplama, litografi, sputter ve akımla kaplama (electroplating) teknikleri kullanılmıştır. Elektrotlar üzerine konulacak sıvıların birbirine karışmasını engellemek amacıyla silisyum pul, hidrofobik özelliğe sahip parilen ile kaplanmıştır. Elektrot kaplamalarda Au için sputter kaplama, AgCl için ise akımla kaplama teknikleri kullanılmıştır. Bu çalışmada, sensörün biyolojik çalışmalarda kullanılabilirliği Hoechst redox işaretçisi kullanılarak, DNA hibridizasyonunun tanısında incelenmiştir. Elde edilen sensör, birçok biyolojik ajanın tanısında ve daha küçük ölçeklerde üretildiğinde mikroçip uygulamalarında kullanılabilir. GİRİŞ Anahtar Kelimeler: Elektrokimyasal tanı, MEMS, DNA biyosensör. Elektrokimyasal sensörlerin hızlı, yüksek hassasiyet, düşük fiyat ve yüksek seçicilik özellikleri ile modern üretim tekniklerinin tekrarlanabilen üretim yöntemlerinin birleşimi, bu sensörlerin klinik, tanı, gıda ve su kalite kontrolü gibi alanlarda kullanımını arttırmaktadır [1, 2]. Bunlar arasında özellikle, klinik uygulamalar, biyolojik analitlerin çeşitliliği, ucuz, hızlı ve küçültülmüş sensör gereksinimleri nedeniyle elektrokimyasal sensörlerin son zamanlarda yoğun olarak kullanıldığı bir alan olmuştur [3]. Düşük fiyat, entegre devre teknolojisi ile uyum, hafif ve yüksek hassasiyet gibi avantajları olan ve biyolojik ajanların elektriksel olarak algılanmasına olanak sağlayan MEMS teknolojisi ile hücre, enzim ve DNA nın elektrokimyasal özelliklerini kullanarak geleneksel tanı yöntemlerine göre daha hassas ve kısa sürede sonuçlar almak mümkündür. Bu çalışmanın amacı, özellikle DNA hibridizasyon tanısında kullanılmak üzere MEMS tabanlı elektrokimyasal biyosensör tasarım ve üretim yöntemlerini geliştirmektir. DENEYSEL ÇALIŞMALAR Malzemeler Thiol-DNA sekansı Alpha DNA ya, hedef DNA sekansı ise Iontek e sentezlettirilmiştir. Tüm kimyasallar Sigma Aldrich ten, Hoechst (350/461) ve YOYO -1-iodide (491/509) ise

2 Invitrogen den alınmıştır. Tampon çözeltilerin ve biyolojik örneklerin hazırlanmasında ultra saf su kullanılmıştır. SAM (Self Assembled Monolayer) Oluşturma ve Hibridizasyon DNA hibridizasyonu için Au çalışma elektrot üzerinde, Şekil 1 de belirtilen değişiklikler yapılmıştır [4]. Kısaca, Au yüzey üzerinde ssdna nın kovalent bağ kurarak tutunması, thiol ile modifiye edilmiş DNA problar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yüzeye tutunan ssdna nın yüzeyle arasındaki düzensiz yapıyı en aza indirgemek için 6-mercaptohexanol (MCH) kullanılmıştır. Daha sonra hedef DNA ile hibridizasyonu yapılmış ve YOYO-1 iodide dsdna boyası kullanılarak hibridizasyon flöresan mikroskopide gözlemlenmiştir. Hibridizasyon aşamasından sonra Hoechst boyası ile işaretleme yapılmıştır [7]. Şekil 1. Çalışma elektrodu üzerinde yapılan modifikasyonun şematik görünümü. Elektrokimyasal Sensör Üretimi Tasarlanan biyosensör üzerinde dört ayrı tanı bölgesi (dört çalışma elektrot) yer almaktadır ve her bir tanı bölgesi AgCl referans elektrodu ve Au çalışma ve yardımcı elektrodundan oluşmaktadır. Biyosensör ve bu sensörün üretim akış şeması Şekil 2 de verilmiştir. Elektrokimyasal sensör ve litografi aşamasında kullanılan maskeler ODTÜ MEMS Araştırma ve Uygulama Merkezi nde üretilmiştir. Elektrotlar üzerine konulan sıvıların diğer elektrotlar üzerine yayılmasını engellemek amacıyla, hidrofobik (temas açısı ~98 o ) ve biyouyumlu özellikleri ile biyosensörlerde sıklıkla kullanılan parilen 4 silisyum pullar üzerine kaplanmıştır (Şekil 2a). Daha sonra, çalışma ve yardımcı elektrotları oluşturmak amacıyla, DC sputter kaplama tekniği kullanılarak Ti ve Au kaplanmıştır (Şekil 2b ve 2c). Photoresist (ışığa duyarlı) ile kaplama yapılmış, AgCl oluşturulacak bölümler UV ile açılmıştır (Şekil 2d ve 2e). Ag referans elektrot oluşturmak için akımla kaplama yöntemi özel olarak hazırlanan çözelti ile sağlanmıştır. Akımla kaplama için üç elektrotlu elektrokimyasal hücre (AgCl referans elektrot, Au kaplı silisyum pul çalışma elektrot, platin yardımcı elektrot olarak) kullanılmıştır. Kaplama oda sıcaklığında, galvanostat yardımıyla gerçekleştirilmiştir [5] (Şekil 2f). AgCl tabaka oluşturmak için KCl kullanılmıştır. Au tabakasını aşındırmak için yüzey tekrar ışığa duyarlı ile kaplanmış ve aqua regia ile aşındırma yapılmıştır (Şekil 2g ve 2h).

3 SONUÇLAR VE TARTIŞMA Şekil 2. Elektrokimyasal sensör ve üretim akış şeması. Biyosensörün üretim aşamalarında en kritik proses Ag akımla kaplamadır. Bu aşama için hazırlanan çözeltinin ışığa duyarlı malzeme ile ve aqua regia nın aşındırma sürecinde Ag tabaka ile reaksiyona girmesi referans elektrodun boyutlarını değiştirmektedir. Bu nedenle, tasarlanan biyosensördeki elektrotların boyutlarının optimizasyonu gerekir. Bu amaçla, pul üzerinde 50µmx50µm ile 3cmx3cm arasında farklı boyutta elektrotların üretimi ile deneyler yapılmıştır (Şekil 3). Boyutların optimizasyonu ile ilgili çalışmalar devam etmektedir. Şekil 3. Litografi uygulanan test pulu.. Elektrokimyasal sensörün DNA hibridizasyonu ile ilgili deneylerde, çift sarmal üzerinden daha fazla sinyal alabilmek için Hoechst redoks işaretçisi kullanılmaktadır. Hoechst [2 - (4-hydroxyphenyl)-5-[5-(4-methylpiperazine-1-yl)-benzimidazo-2-yl-benzimidazole] flöresan mikroskopide çift sarmal DNA ya yüksek bağlanma özelliği olan DNA boyasıdır (Şekil 4a ve 4b)[8].

4 a b Şekil 4. (a) Hoechst in kimyasal yapısı (b) Hoechst in dsdna nın küçük oluklarına bağlanmasının şematik gösterimi [6]. Hoechst 33258, dsdna nın küçük oluklarına (minor groove) ve özellikle A-T bakımından zengin olan bölgelere bağlanarak 5(±1) baz çiftini kaplar [6]. Bu boya ile redoks işaretlemede her bir molekül için transfer edilen elektron sayısı Faraday kanununu kullanarak hesaplanabilir. Sufen ve ark. [6] her bir Hoechst molekülü başına transfer edilen elektron sayısının yaklaşık iki olduğunu göstermişlerdir. Elektrot yüzey üzerindeki elektroaktif maddelerin reaksiyon mekanizmaları Cyclic Voltametri, Diferensiyel Puls Voltametri gibi tekniklerle belirlenebilir. Tersinmez (irreversible) bir reaksiyon için peak akımı (i pa ) ile tarama oranı (v 1/2 ) arasındaki ilişki Denklem 1 ile elde edilebilir [6]. (1) Peak akımı (i pa ) ile nükleotit fosfat konsantrasyon un toplam Hoechst konsantrasyonuna oranının (R) lineer olmayan analizi Hoechst ve Hoechst DNA nın difüzyon katsayılarını (D f, D b ), tutunma katsayısını (K) ve tutunan bölüm ölçülsünü(s) bulmak için kullanılacaktır. D f ve D b chronocoulometrik analizi ve Cottrell denklemini (Denklem 2) kullanılarak da bulunabilir. (2) Bu konu ile ilgili çalışmalar devam etmektedir. ÖNERİLER Bu çalışma ile elde edilen elektrokimyasal sensör birçok biyomedikal uygulamada ve daha küçük boyutlarda üretimi yapıldığında, mikroçip uygulamalarında kullanılabilir.

5 KAYNAKLAR 1. M. Mahalanabis, H.A. Muayad, M.D.Kuliniski, D. Altman, C.Klapperich, Cell lysis and DNA extraction of gram-positive and gram negative bacteria from whole blood in a disposable microfluidic chip, Lab Chip, 9, , J. Schotter, A. Shoshi, H. Brueckl, Development of a magnetic lab-on-a-chip for pointof-care sepsis diagnosis, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 321, , Wang, J., D.Xu, A. N.Kawde and R. Polsky, Metal nanoparticle based electrochemical stripping potentiometric detection of DNA hybridization, Anal. Chem., 73, , H. Ceylan, H. Külah, C. Özgen, A. Alp, G. Hasçelik, MEMS Tabanlı DNA Biyosensör ile Bakteriyel DNA Saptaması, TOK 2009 Bildiri Kitapçığı, B.J. Polk, A. Stelzenmuller, G. Mijares, W. MacCrehan, M. Gaitan, Ag/AgCl microelectrodes with improved stability for microfluidics, Sensors and Actuators B, 114, , W.Sufen, P.Tuzhi, F.Yang, Electrochemical Studies for the Interaction of DNA with an irreversible redox compound Hoechst 33258, Electroanalysis, 14, 23, , G.D. McEwen, F. Chen, A.Zhou, Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy, Analytica Chimica Acta, 643, 26-37, D. Banerjee, S.K. Pal, Ultrafast charge transfer and salvation of DNA minor groove binder: Hoechst in restricted environments, Chemical Physics Letters, 432, , 2006.