T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOĞAL KEFİR DANESİNDEN ÜRETİLEN KEFİRİN in vivo FEKAL MİKROBİYOTA VE BAZI SAĞLIK ÜZERİNDEKİ ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ Fatih Selim ERDOĞAN Danışman Yrd. Doç. Dr. Tuğba KÖK TAŞ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ISPARTA

2 2016 [Fatih Selim ERDOĞAN]

3

4 TAAHHÜTNAME Bu tezin akademik ve etik kurallara uygun olarak yazıldığını ve kullanılan tüm literatür bilgilerinin referans gösterilerek tezde yer aldığını beyan ederim. Fatih Selim ERDOĞAN

5 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... i ÖZET... ii ABSTRACT... iv TEŞEKKÜR... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... viii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Kefir Kefir Danesi Kefir Danesinde Bulunan Probiyotik Mikroorganizmalar Kefir Üretimi Starter kültür Kefirin Sağlık Üzerine Etkileri Biyokimyasal Analizlerde Kullanılan Parametreler İnsan ve deney hayvanları gastrointestinal mikroflorası Trichoderma koningii Deney Hayvanları Çalışmaları MATERYAL VE YÖNTEM Kefir Üretimi Deney Hayvanları Deneme Deseni Kefir ve Gaita Örneklerinin Mikroflora İçerikleri PZR yöntemi ile küflerin tanımlanması Biyokimyasal Analizler Serum ve doku örneklerinin hazırlanması Total antioksidan statüsü analizi Toplam oksidan statüsü analizi Malondialdehit analizi Miyeloperoksidaz analizi ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Kefir İçeceklerinin ve Gaita Örneklerinin Mikroflora İçeriğinin Sonuçları Biyokimya Analizlerinin Sonuçları SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR EKLER EK A. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul Kararı EK B. Deney Hayvanları Kullanım Sertifikası EK C. Çalışma İzinleri ÖZGEÇMİŞ i

6 ÖZET Yüksek Lisans Tezi DOĞAL KEFİR DANESİNDEN ÜRETİLEN KEFİRİN in vivo FEKAL MİKROBİYOTA VE BAZI SAĞLIK ÜZERİNDEKİ ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ Fatih Selim ERDOĞAN Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Tuğba KÖK TAŞ Doğal kefir danesi, kendine özgü olağanüstü bir mikrofloraya sahiptir. Bu yapı polisakkarit bir matriks içinde laktik asit bakterilerini (LAB), asetik asit bakterilerini ve mayaları belli oranlarda bulundurmaktadır. Gerçek kefir, kefir daneleri kullanılarak geleneksel yöntemlerle üretilir. Gıda sektöründe çeşitli firmaların kefir içecekleri bulunmakta ve starter kültür kullanılarak (sınırlı mikroorganizma sayısı) üretilmektedir. Starter kültür kullanılarak üretilen kefir probiyotik içerik açısından gerçek kefirden oldukça farklıdır. Projenin amacı; doğal kefir danesi ve strater kültür kullanılarak üretilen kefir ile beslenmiş Balb/c farelerinden alınan gaita örneklerinde beslenme süresince oluşan mikroflora değişimi (toplam laktik asit bakterileri, toplam mezofilik aerob bakteri, Kok grubu bakteri, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp. Enterobacteriaceae, maya-küf,), kan serumlarında (toplam antioksidan statü (TAS) ve toplam oksidan statü (TOS)) ve intestinal sıvı örneklerinde biyokimyasal analizler (malondialdehit (MDA) ve miyeloperoksidaz (MPO) analizi) yapılarak bazı parametrelerin karşılaştırılmasını yapmaktır. Doğal kefir danesi kullanılarak üretilen kefir (GK grubu) ve starter kültür kullanılarak üretilen kefir (SK grubu) Balb/c farelerine (6-8 haftalık gram erkek) iki hafta gavaj yoluyla 300 µl/gün verilmiştir. Kontrol grubuna (CK) fosfat tamponlu salin (PBS) verilmiştir. Mikrobiyolojik analizler ve 15. günlerde değerlendirildi. CK, GK ve SK örnekleri 15. gün Lactobacillus spp. içeriği sırasıyla 8,87; 9,75 ve 8,27 log kob/ml olarak bulunmuştur. GK ve SK örnekleri 15. gün Lactobacillus acidophilus ve Bifidobacterium spp. içeriği sırasıyla 9,86; 8,79 log kob/ml ve 8,90; 8,01 log kob/ml olarak bulunmuştur. Maya sonuçlarına göre, CK ve SK gruplarının fekal floralarında maya gözlemlenmemiştir. GK grubunun 3. gününde 4,58 log kob/gr maya miktarı sayılmıştır. 15. gün maya 6,50 log kob/gr önemli düzeyde artmıştır. CK ve SK gruplarının fekal florasında bulunan insan patojeni Trichoderma koningii küfü tespit edilmiş, GK grubu farelerin gaita florasında bu küfün inhibe olduğu gözlemlenmiştir. Bu durum kefir dane mikroflorasında bulunan mayaların potansiyel probiyotik özelliğine sahip olduğunun kanıtıdır. ii

7 Fare serum örnekleri 15. gün sakrifikasyon sonrası -80 C de depolanmıştır. CK, GK ve SK grubunun TAS değerleri sırasıyla 2,19; 3,92 ve 1,79 mmol/l; TOS değerleri 9,52; 9,26 ve 11,90 µmol/l; bağırsak doku örnekleri MDA değerleri sırasyla 0,76; 0,83 ve 1,27 ng/ml; MPO değerleri sırasıyla 0,31; 0,38 ve 0,57 pg/ml olarak tespit edilmiştir. Bu çalışma doğal kefir danesi kefirinin mikroflora zenginliğini ve potansiyel probiyotik özelliklerinin starter kültür kullanılarak üretilen kefire göre üstünlüklerini in vivo koşullarda belirlemiştir. Araştırma bulguları literatüre katkı sağlamıştır. Ayrıca birçok in vitro, in vivo ve klinik çalışmalara öncülük yapacağı düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Kefir danesi, starter kültür, Balb/c, in vivo, probiyotik, maya, Trichoderma koningii, fekal flora, bağırsak florası 2016, 89 sayfa iii

8 ABSTRACT M.Sc. Thesis DETERMINATION OF KEFIR PRODUCED FROM NATURAL KEFIR GRAIN in vivo ON IMPACT OF SOME HEALTH AND FECAL MICROBIOTA Fatih Selim ERDOĞAN Süleyman Demirel University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Asst. Prof. Dr. Tuğba KÖK TAŞ Natural kefir grain has an extraordinary microflora peculiar to itself. This structure contains lactic acid bacteria (LAB), acetic acid bacteria and yeasts at certain ratios in a polysaccharide matrix. Real kefir is produced using kefir grains with traditional methods. In the food sector, a variety of companies have their kefir beverages present in the market and these beverages are produced using starter cultures containing with a limited number of microorganisms. The kind of kefir which is produced using starter culture is quite different from the real kefir in terms of probiotic content. The aim of this project is to feed the mice with the kefir produced using both the natural kefir grains and starter culture and to determine the microbiological content of the feces samples from the rats (total lactic acid bacteria, total mesophilic aerobic bacteria, coccus group bacteria, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp., Enterobacteriaceae, yeast-fungus), to compare some parameters by performing biochemical analyses (total antioxidant status (TAS), total oxidant status (TOS) in the blood serum samples and malondialdehyde (MDA), myeloperoxidase (MPO) analysis) in intestinal liquid samples. The kefir produced using the natural kefir grains (GK Group) and the kefir produced using the starter culture (SK Group) were administered 300µl/day for two weeks by gavage to Balb/c mice (6-8 weeks old, grams, male). Phosphate buffered saline (PBS) was administered to the control group (CK). Microbiological analyses were evaluated on the 0, 3rd, 5th, 7th, 9th, 11th, 13th and 15th days. Lactobacillus spp. content in the samples of CK,GK and SK on the 15th day were determined as 8.87; 9.75 and 8.27 log cfu/ml, respectively. Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. content in the samples of GK and SK on the 15th day were found to be 9.86; 8.79 log cfu/ml and 8.90; 8.01 log cfu/ml, respectively. The results of yeasts indicated that no yeast was observed in fecal flora of CK and SK groups. On the 3rd day of GK group, 4.58 log cfu of yeasts were counted. On the 15th day, the yeasts increased (6.50 log cfu/gr) substantially. Trichoderma koningii, which is a human pathogen, was identified in the fecal flora of CK and SK groups. This was seen to iv

9 be inhibited in the fecal flora of GK group. This situation proves that the yeasts in the kefir grain microflora have potential antifungal properties. The serum samples of mice were stored at -80 C after sacrification on the 15th day. TAS values of CK, GK and SK groups were 2.19; 3.92 and 1.79 mmol/l, respectively; TOS values were 9.52; 9.26 and mmol / L, respectively; MDA values of intestinal tissue samples were 0.76; 0.83 and 1.27 ng/ml, respectively and MPO values were 0.31; 0.38 and 0.57 pg/ml, respectively. This study established the superiority of the kefir produced using natural kefir grains compared to the kefir produced using starter cultures in terms of diversity of microflora and potential probiotic properties under in vivo conditions. Our research findings have contributed to the literature. Furthermore, we think that our study will pioneer many in vitro, in vivo and clinical studies. Keywords: Grain kefir, starter culture, Balb/c, in vivo, probiotic, yeast, Trichoderma koningii, feces flora, intestinal flora 2016, 89 pages v

10 TEŞEKKÜR Bu araştırma için beni yönlendiren, karşılaştığım zorlukları bilgi ve tecrübesi ile aşmamda yardımcı olan değerli Danışman Hocam Yrd. Doç. Dr. Tuğba KÖK TAŞ a teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarımı gerçekleştirmem için her konuda imkan sunan değerli hocalarım Prof. Dr. Zeynep Banu SEYDİM ve Prof. Dr. Atıf Can SEYDİM'e teşekkür ederim. Laboratuvar çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen doktora çalışmasını sürdüren Seda KURTULMUŞ ve Gıda Mühendisi Funda DAVRAS a teşekkür ederim. Araştırmanın yürütülmesinde yardımlarını gördüğüm Gıda Mühendisi Ayten GÜLMEZ ve Gıda Mühendisi Mustafa ALKIN a teşekkür ederim. Süleyman Demirel Üniversitesi, Deney Hayvanları Ünitesine ve tüm personeline yardımlarından dolayı teşekkür ederim YL2-14 No`lu Proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na teşekkür ederim. Araştırmanın yürütülmesinde maddi ve manevi yardımlarını esirgemeyen Danem şirketine ve tüm Danem personeline teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında beni yalnız bırakmayan aileme sonsuz sevgi ve saygılarımı sunarım. İlk emri "oku" olan Allah'a şükürler olsun. Fatih Selim ERDOĞAN ISPARTA, 2016 vi

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Trichoderma koningii den izole edilen ikincil metabolitlerin yapıları Şekil 3.1. Balb/c farelerine gavaj uygulaması Şekil 3.2. Metabolik Kafes Şekil 3.3. Gaitaların peptonlu su içerisinde çözündürülmesi Şekil 3.4. MRS-nnlp (sol), RCA (orta) ve TOS-NNLP (sağ) agarlarında gelişen koloni görünümü Şekil 3.5. Balb/c faresinin anestezi altında vena cava inferior dan kan alımı Şekil 3.6. Balb/c farelerinin ince bağırsak örneğinin alınması Şekil 4.1. Doğal dane kefiri ve starter kültür kefiri mikroflorası Şekil 4.2. CK, GK ve SK gruplarının fekal Lactobacillus spp. içeriği Şekil 4.3. CK, GK ve SK gruplarının fekal Lactococcus spp. içeriği Şekil 4.4. CK, GK ve SK gruplarının fekal Lactobabacillus acidophilus içeriği Şekil 4.5. CK, GK ve SK gruplarının fekal Bifidobacterium spp. içeriği Şekil 4.6. CK, GK ve SK gruplarının fekal maya içeriği Şekil 4.7. CK (sol, 4 petri), SK (orta, 6 petri), GK (sağ, 6 petri) petrilerde maya-küf görünümü Şekil 4.8. CK, GK ve SK gruplarının fekal toplam mezofilik aerob bakteri içeriği Şekil 4.9. CK, GK ve SK gruplarının fekal Enterobacteriaceae içeriği Şekil CK, GK ve SK gruplarının serum TAS ve TOS değerleri Şekil CK, GK ve SK gruplarının doku örneğinde MDA ve MPO değerleri Şekil A.1. Hayvan deneyleri yerel etik kurul kararı Şekil B.1. Deney hayvanları kullanım sertifikası Şekil C.1. Süleyman Demirel Üniversitesi Deney Hayvanları Üretimi ve Deneysel Araştırma Laboratuvarı Çalışma İzni Şekil C.2. Akdeniz Üniversitesi Deney Hayvanları Ünitesi Çalışma İzni vii

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Kefirin kimyasal bileşimi ve enerji içeriği (100 ml-65 kcal)... 5 Çizelge 2.2. Kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar Çizelge 2.3. Probiyotik mikroorganizma seçici besiyeri inkübasyon koşulları Çizelge 2.4. Geleneksel kefir üretimi (sol) ve endüstriyel kefir üretimi (sağ) Çizelge 2.5. Fermente ürünler için starter kültür sunan firmalar Çizelge 2.6. Kefirin sağlık üzerine etkileri ve etki mekanizması Çizelge 2.7. Gastrointestinal sistemde bulunan mikrobiyal yük ve çeşitliliği Çizelge 3.1. Gavaj dozu ve veriliş sıklığı viii

13 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ CK GK SK L Lc B S T K C Str LAB TAS TOS MDA MPO WHO FAO PZR KOB PBS PCA PDA MAC PCA MAC MRS RCA Kontrol grubu Kefir danesi kullanılarak üretilen kefir ile beslenen fare grubu Starter kültür kullanılarak üretilen kefiri ile beslenen fare grubu Lactobacillus Lactococcus Bifidobacterium Saccharomyces Trichoderma Kluyveromyces Candida Streptococcus Laktik asit bakterileri Toplam antioksidan statüsü Toplam oksidan statüsü Malondialdehit Miyeloperoksidaz Dünya Sağlık Örgütü Gıda ve Tarım Örgütü Polimeraz Zincir Reaksiyonu Koloni Oluşturma Birimi Fosfat tamponlu salin Plate Count Agar Potato Dextrose Agar MacConkey Agar Plate Count Agar MacConkey Agar De Man, Rogosa and Sharpe Reinforced Clostridial Agar ix

14 1. GİRİŞ Kefirin diğer fermente süt ürünlerinden farklılığı starter kültürünün biyokütle bir yapı aracılığıyla (kefir daneleri) üretilmesidir. Kefir danesi, polisakkarit bir matriks içinde laktik asit bakterileri, asetik asit bakterileri ve mayaları belli oranlarda bulundurmaktadır. Fermente bir süt ürünü olan kefir, kefir daneleri kullanılarak üretilmekte ve bu yapı her fermentasyonla büyümektedir. Oluşan kefir hafif asidik, mayamsı, kendine özgü ferahlatıcı bir aromaya sahip ayrandan daha kıvamlı, köpüklü ve duyusal özelikleri çok üstün olan fermente süt ürünüdür. Geleneksel kefir üretimi pastörize edilmiş ve oda sıcaklığındaki süt içerisine kefir danelerinin ilave edilmesi ile üretilmektedir. 25 C de 24 saat inkübasyon uygulanır. Kefir daneleri içerisinden aseptik koşullarda steril süzgeç ile ayrılır ve daneler steril su ile yıkanır. Kefir soğukta depolanarak tüketilir. Daneler ise tekrar kefir yapımı için 4 C de süt içinde depolanır (Güzel-Seydim, 2001). Endüstriyel üretimde pastörize edilmiş süt 30 C ye soğutulmuş sütün içerisine %2-3 starter kültür (sınırlı sayıda mikroorganizma içerikli) ilavesi yapılır. 30 C de 8-10 saat inkübasyona bırakılır ve ph 4,6 da sonlandırılır ve 4 C ye soğutulur. Kefir danesinin büyüklüğü 0,2 ile 3,0 cm arasında değişen mısır patlağı şeklinde rengi kremsi beyaz olan elastik ve sağlam bir dokuya sahiptir (Rea vd., 1996; Farnworth ve Mainville, 2008; Magalhães vd., 2011). Kefir danesi genel olarak 10 9 laktokok, Leuconostoc türleri, termofil laktobasiller, mayalar ve asetik asit bakterilerini ihtiva eder (Kurman vd., 1992). Starter kültür, standart kalitede ürün elde etmek ve ürüne özgü tat, aroma ve yapının oluşmasını sağlayan mikroorganizmalara denir (Ateş ve Patır, 2001, Kayagil, 2006; Üçüncü, 2004). kaliteyi etkileyen karakteristik tat ve aroma standardizasyonu için kullanılan starter kültürler kefir, peynir, yoğurt gibi süt ürünlerin üretiminde önemli bir role sahiptir (Tunail, 1983). Starter kültürler sıvı, liyofilize ve dondurulmuş kültürler olarak satışa sunulmaktadır (Tağhan ve Öztürk 2002, Üçüncü 2005, Akın 2006). Ulusal ve uluslararası tüm dünyada süt 1

15 ürünleri üretimi starter kültürü üretimi yapan onüç firmanın ürettikleri genetiği değiştirilmiş bakteri, maya kültürlerini kullanarak gerçekleştirmektedir. Ülkemizde de bu durum geçerlidir. Probiyotikler, yeterli miktarda konakçıya verildiği zaman sağlığa yararlı etki yapan canlı mikroorganizmalardır (Anonymous, 2001; Hill vd., 2014). Mikrobiyal kolonizasyonun asıl yeri gastrointestinal sisteminde yer alan kolonda 1,5 kg mikroorganizma yani yaklaşık olarak mikroorganizma yükü bulunmaktadır (Moore ve Holdeman, 1974; Whitman vd., 1998; Dominguez- Bello vd., 2010). Gastrointestinal sistemde canlı kalabilme özelliği probiyotik mikroorganizmalarda aranan bir özelliktir. Kefir, antikanserojenik etkisi, antidiyabetik etkisi, kolesterolü düşürücü etkisi, sindirim sistemine etkisi, bağışıklık sistemine etkisi, laktoz intoleransa etkisi, antialerjik özelliği, probiyotik ve prebiyotik özelliği, antimikrobiyal özelliği olduğu uluslararası ve ulusal düzeyde yapılan birçok araştırma makaleleri (Shiomi vd., 1982; Furukawa vd., 1992; Furukawa vd., 1996; Thoreux ve Schmucker, 2001; Rodrigues vd., 2005; Güzel-Seydim vd., 2006; 2010; Ahmed vd., 2013) ile fonksiyonel ürün niteliğindedir. Bu çalışma doğal kefir danesi kefirinin mikroflora zenginliğini ve potansiyel probiyotik özelliklerinin starter kültür kullanılarak üretilen kefirlerin in vivo koşullarda belirlemiştir. 2

16 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Kefir Fermente ürünlerinin tarihçesi uzun geçmişe sahiptir. Süt ürünleri, süt üreten hayvanların (inek, koyun, keçi, kısrak, bufalo ve deve gibi) evcilleştirilmesi ile başlar ve tarihi M.Ö lere dayanır (Moreno vd., 2013). Sütün bozulması kolay, muhafazası zordur. Orta Asya da çobanlar bağırsaktan yapılan çantalarda taşıdıkları sütün kesilmesi ve asitlenmesiyle keşfetmişler ve böylece başta yoğurt olmak üzere çeşitli fermente süt ürünleri yayılmıştır (McGee vd, 2004). M.Ö e ait uzak doğu yazıtlarında fermente süt ürünlerinin sağlığa yararları anlatılmaktadır. Orta Asya kavimlerinin batı uzantısı olan İskitlerin yoğurt yaptığı ve yoğurda benzer yiyecekler yediklerini Hipokrat (M.Ö ) da bildirmiştir lü yılların başında Kafkas halklarının uzun ve sağlıklı yaşamları bilim dünyasının da ilgisini çekmiştir. Rus bilim adamı Dr. Elie Metchnikoff un 1907 yılında yayınlanan The Prolongation of Life isimli kitabında laktik asit bakterilerinin sağlığı geliştirici özelliklerini içeren araştırma ve teoriler bulunmaktadır. LAB içeren fermente süt içeceklerinin insan sağlığını geliştirici etkisi olduğunu iddia etmiştir. Yıllar süren bilimsel araştırmalar sonucunda fermente süt ürünlerinin probiyotik özellikleri ve sağlık üzerine olumlu etkileri belirlenmiştir. Probiyotik bakteri ve maya zenginliği itibariyle kefir, sağlık yönünden yararları bilinen doğal fermente bir süt ürünü olarak dikkat çekmeye başlamıştır. Kefir içeceğinin doğduğu yer Kafkas Dağları olup, Doğu Avrupa, Rusya ve Güneybatı Asya da tüketilen geleneksel bir üründür (Tamime, 2006). Kefir geleneksel olarak inek sütünden elde edileceği gibi keçi, koyun, manda ya da soya sütünden de yapılabilir (Ismail vd., 1983; Motaghi vd., 1997; Wszolek vd., 2001; Liu vd., 2006a). Kefir tüketildikten sonra keyif verici özelliği olduğu için Türk kelimesi olan keyif kelimesinden türetilmiştir (Kurmann, 1984; Lopitz- Otsoa vd., 2006; Tamime, 2006; Güzel-Seydim, 2001). Kephir, Kiaphur, Kefyr, 3

17 Kepher, Knapon, Kepi ve Kippe gibi isimler de kullanılmaktadır (Tamime, 2006; Koroleva vd., 1988). Kefir, kefir danesi olarak isimlendirilen doğal bir yapı kullanılarak üretilir. Kefir, kefir danesinin süt içinde fermantasyonu sonucunda elde edilen fermente bir süt ürünüdür. Kefir danesi, kendine özgü olağanüstü bir mikrofloraya sahiptir. Bu yapı polisakkarit bir matriks içinde laktik asit bakterilerini (LAB), asetik asit bakterilerini ve mayaları belli oranlarda ve kararlı bir dengede bulundurmaktadır. Danelerin süt içinde fermantasyonu süresince farklı metabolik yollar ile farklı metabolitler, organik asitler, aroma bileşenleri ve parçalanan aminoasitler, yağ asitleri ve ferahlatıcı bazı maddeler oluşmaktadır (Güzel-Seydim vd., 2000; Garrote vd., 2001; Tamime, 2002; Marsh vd., 2013; Tamang vd., 2016). Kefir danesinin polisakkarit matriksine kefiran denilmektedir. Mikroorganizmaların içinde bulunan bu polisakkarit yapı kefirin reolojisi ve tekstür yapısına katkıda bulunmaktadır (La Rivière vd., 1967; Frengova vd., 2002; Rimada ve Abraham, 2006). Kefirde bulunan şeker olarak bilinen kefiran, glucogalactan içeren bir heteropolisakkarittir (Ahmed, vd., 2013). Kefiran, düşük sıcaklıklarda (Ahmed vd., 2013) ve asitli sütler (Rimada ve Abraham, 2006) tarafından üretilen jel oluşumu ile reolojisini ve viskoelastik özelliklerini geliştirir. Kefiranın sağlıkla ilgili araştırmalarda antimikrobiyal ve bağışıklık sistemine olan etkisinin olumlu olduğu belirtilmektedir (Rodrigues vd., 2005). Kefir, sütte bulunan besin maddelerinin tümünü içeriğinde bulundurmasının yanında, üretimi sırasında da bazı vitaminlerin sentezlenmesi, proteinlerin ve laktozun kısmen parçalanması kefirin besin değerini artırmaktadır. Kefirin yapısında bulunan mikroorganizmalar bu ürünün kolay sindirilmesini sağlamakta ve besin maddelerinin vücut tarafından emilimini arttırmaktadır. Kefirde yer alan mineraller kalsiyum, potasyum, fosfor, magnezyum, demir, çinko, sodyum ve klorun kefirde yer aldığı bildirilmiştir (Liut Kevicius ve Sarkinas, 2004). 4

18 Bazı araştırmalarda kefir fermantasyon işlemi sırasında B12 vitamini, folik asit ve biotin yüksek miktarda üretilirken, tiamin ve riboflavin gibi vitaminlerde bir düşüş meydana gelir (Kneifel ve Mayer, 1991; Liut Kevicius ve Sarkinas, 2004). Diğer araştırmalarda B12 vitamini düşüş göstermiştir (Güzel-Seydim vd., 2000). Bu düşüş, kefir danesinde bulunan mevcut mikroflora tercihine bağlı olabilir (Roczniakova vd., 1974). Ticari olarak elde edilebilen kefir daneleri fermantasyondan sonra ürünün folik asit içeriğini arttırmak eğilimindedir (Alm, 1982). B vitaminlerinin yanı sıra, kefirde K vitamini (Otles ve Cagindi, 2003) ve C vitamini (Khamnaeva vd., 2000) de bulunmaktadır. Vitamin miktarını tahmin edebilmek için başlıca iki faktör vardır; süt tipi ve ilave edilecek mikroflora tipi (Ahmed vd., 2013). Çizelge 2.1 de kefirin kimyasal bileşimi ve enerji içeceiği ayrıntılı bir şekilde gösterilmiştir (Ahmed vd., 2013). Propionibacterium pituitosum ve Propionibacterium peterssoni eklenmesi ile B12 vitamininde doğrusal bir azalma (34 37%) (Roczniakova vd., 1974), Propionibacterium freudenreichii fermantasyon prosesi sırasında eklendiği zaman folik asit (500%) miktarında ani bir artış, pantotenik asit ve B6 vitaminde az bir artış gözlemlediler (Cerna ve Hrabova, 1982). Çizelge 2.1. Kefirin kimyasal bileşimi ve enerji içeriği (100 ml-65 kcal) (Ahmed vd., 2013) Enerji (kcal) Esansiyel (g) Vitaminler (g) aminoasitler Yağ (%) 3,5 Triptofan 0,05 A 0,06 Protein (%) 3,3 Fenilalanin+ 0,35 Karoten 0,02 Tirozin Laktoz (%) 4 Lösin 0,34 B1 0,04 Su (%) 87,5 İzolösin 0,21 B2 0,17 Süt Asidi (g) 0,8 Treonin 0,17 B6 0,05 Etil Alkol (g) 0,9 Metionin+ Sistin 0,12 B12 0,5 Laktik Asit 1 Lisin 0,27 Niasin 0,09 (g) Kolesterol 13 Valin 0,22 C 1 (mg) Fosfat (mg) 40 D 0,08 E 0,11 5

19 Çizelge 2.1. Kefirin kimyasal bileşimi ve enerji içeriği (100 ml-65 kcal) (Ahmed vd., 2013) (Devam) Mineral içeriği (g) Eser elementler Aromatik Bileşenler Kalsiyum 0,12 Demir (mg) 0,05 Asetaldehit Fosfor 0,1 Bakır (μg) 12 Diasetil Magnezyum 12 Molibden 5,5 Aseton (μg) Potasyum 0,15 Manganez 5 (μg) Sodyum 0,05 Çinko (mg) 0,36 Klor 0, Kefir Danesi Kefir danesinin büyüklüğü 0,2 ile 3,0 cm arasında değişen mısır patlağı şeklinde rengi kremsi beyaz olan elastik ve sağlam bir dokuya sahiptir (Rea vd., 1996; Farnworth ve Mainville, 2008; Magalhães vd., 2011). Kefir danelerinin, % 86.3 nem, % 4.5 protein, % 1.2 kül ve % 0.03 yağ içerdiğini bildirdiler (Liutkevicius ve Sarkinas, 2004). Kefir daneleri, laktik asit bakterileri, asetik asit bakterileri ve mayaları kefiran' adı verilen polisakkarit bileşim içinde belli bir oranda bulundurur (Beshkova vd., 2002). Kefir danelerinde bakteriler ve mayalar arasındaki simbiyotik ilişki, doğada bulunan eşsiz bir ekosistemi temsil eder. Kompleks bir mikrobiyotaya sahip olan kefir daneleri maya ve bakteri türleri çeşitliği çok fazla olup aynı cinsin alt türleri yüzlerce mikroorganizmaya ulaşmaktadır (Angulo vd., 1993; Garrote vd., 2001; Jukić vd., 2001; Stepaniak ve Fetliński, 2002; Sarkar vd., 2008; Wang vd., 2008). Kefir danesi mikroflorası süt kalitesi ve bileşimine göre değişim gösterdiğinden araştırmalarda içeriklerde farklılıklar belirlenmektedir. Teknolojinin ilerlemesiyle moleküler tekniklerin gelişmesi kefir danesi ile ilgili araştırmalarda da devamlılık görülmektedir. Kefir danesinde yer alan mikrobiyota bulunduğu ortama göre değişmektedir (Koroleva vd., 1988; Tamime ve Marshall, 1997; Ferreira vd., 2010). Suda çözünebilen polisakkarit yapı olan kefiran, kefir danesinin kuru ağırlığının 6

20 %25 ini oluşturmaktadır. Kefiran kompleks ekzopolisakkarit yapısında D- glukoz ve D-Galaktozu 1:1 oranında içermekte ve kefir danesinin mikrobiyotasını bir arada tutmaktadır (La Rivière vd., 1967; Kander ve Kunath, 1983; Marshall vd., 1984; Micheli vd., 1999). Kefir danesinin merkezinde mayalar hakim iken periferal matriks parçasında bakteriler hakimdir (Bottazzi ve Bianchi, 1980; Lin vd., 1999). Kefir danesi genel olarak 10 9 laktokok, Leuconostoc türleri, termofil laktobasiller, mayalar ve asetik asit bakterilerini ihtiva eder (Kurman vd., 1992). Kefirde bulunan en yaygın bakteri cinsler Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus ve Leuconostoc tur (Simova vd., 2002; Witthuhn vd., 2004; Chen vd., 2008). Kefir danesinde ve sütte Lactococcus lactis subsp. lactis, Str. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus, L. casei subsp. pseudoplantarum, L. kefiri, L. kefir ve L. brevis cinsleri toplam mikrobiyal topluluğun %37-90 arasında hakim olduğu bildirilmiştir (Simova vd., 2002; Witthuhn vd., 2004; Miguel vd., 2010). Bu türler kefir danelerinin mikroorganizma içeriğinin çoğunluğunu oluşturmaktadır. Bazı danelerde mayalar oranı daha fazladır (Witthuhn vd., 2004). L. lactis subsp. lactis, ve Str. thermophilus düzeyleri kefir danesine göre elde edilen kefir içeceğinde daha fazla olmaktadır. Bu türlerin düzeyleri elde edilen kefir kullanılarak tekrardan kefir yapılmasında daha da artacaktır. Gözlemlenen artışı %30 olarak bulmuşlardır (Simova vd., 2002). Kefir danelerinin, genellikle Lactobacillus ya da Lactobacillus ve Acetobacter hakim bakteri türlerine sahip olduğunu bulmuşlardır (Marsh vd., 2013; Nalbantoglu vd., 2014; Garofalo vd., 2015; Korsak vd., 2015). Lactobacillus grubunda en yaygın tür L. kefiranofaciens, L. kefir ve L. parakefiri olmuştur (Dobson vd., 2011; Leite vd., 2012; Hamet vd., 2013; Vardjan vd., 2013; Nalbantoglu vd., 2014; Garofalo vd., 2015; Korsak vd., 2015). Kök Taş vd. (2011) tarafından kefir danesi kullanılarak kefir üretimi ile L. acidoplilus içeriğini 5,78 log kob/ml, Bifidobacterium spp. içeriğini 6,14 log kob/ml olarak tespit edilmiş ve ayrıca PZR yöntemi ile kefir danelerinde homoloji % olan L. acidophilus, L. helveticus, L. kefiranofaciens, 7

21 Streptococcus thermophilus ve B. bifidum türleri tespit edilmiştir. Bu daneler de bulunan diğer bakteri cinsleri toplam bakteri popülasyonun %10 undan daha azını oluşturmaktadır (Leite vd., 2012; Marsh vd., 2013; Nalbantoglu vd, 2014; Garofalo vd., 2015). Bifidobacterium türlerini yapılan çalışmalarda tespit etmişler (Dobson vd., 2011; Marsh vd., 2013). Kefir danelerinde çeşitli bakterilere ek olarak, bakteriler ile simbiyotik bir ilişki içerisinde bulunan çeşitli maya popülasyonu bulunmaktadır (Simova vd., 2002; Witthuhn vd., 2004; Marsh vd., 2013). Kefir danelerinde Saccharomyces, Kluyveromyces ve Candida 3 cins maya toplam maya nüfusun çoğunluğunu oluşturmaktadır (Angulo vd., 1993; Marquina vd., 2002; Simova vd., 2002; Diosma vd., 2014). Saccharomyces cinsinin çok çeşitli türleri kefirden izole edilmiştir, yaygın türleri S. cerevisiae ve S. unisporus tur (Angulo vd., 1993; Marquina vd., 2002; Latorre-García vd., 2007; Diosma vd., 2014). Laktozu kullanan Kluyveromyces spp. toplam maya popülasyonun çoğunluğunu ya da tamamını oluşturmakta en yaygın bilinen iki türü Kluyveromyces marxianus ve K. lactis tir (Simova vd., 2002; Latorre-García vd., 2007; Diosma vd., 2014). Candida cinsinin en çok yaygın olanı ise Candida holmii ve C. Kefyr dir (Angulo vd., 1993; Marquina vd., 2002). Bu üç maya dışında Pichia spp. de izole edilmiş ve izole edilen türü Pichia fermentans tır. (Angulo vd., 1993; Wang vd., 2008). Fermantasyon ilerledikçe maya türleri oranlarında laktozu fermente edemeyen Saccharomyces azalırken, laktozu kullanan K. marxianus ve K. lactis kefir danesi ve kefir arasında benzer bir dağılım göstermektedir (Simova vd., 2002). Kazachstania, Kluyveromyces, and Naumovozyma türlerini danelerden ve fermente sütten izole etmişlerdir (Zhou vd., 2009; Marsh vd., 2013; Vardjan vd., 2013; Garofalo vd., 2015; Korsak vd., 2015). Kazachstania unispora, Saccharomyces unisporus olarak da bilinir (Marsh vd., 2013). Dekkera anomala, Issatchenkia orientalis ve Pichia fermentans türleri de kefir danelerinde bulunduğunu belirlediler (Marsh vd., 2013; Garofalo vd., 2015). Çizelge 2.2 de kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar gösterilmiştir. 8

22 Çizelge 2.2. Kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar Lactobacillus türleri Kaynaklar Lactobacillus kefiri Unsal, 2008; Chen vd., 2008; vd., 2010; Dobson vd., 2011; Kesmen ve Kacmaz 2011; Magalhaes vd. 2011; Hamet vd., 2013; Vardjan vd., 2013; vd., 2014; Garofalo vd., 2015; Korsak vd., 2015; Zanirati vd., 2015 Lactobacillus kefiranofaciens Santos vd., 2003; Unsal, 2008; Mainville vd., 2006; Chen vd., 2008; Dobson vd., 2011; Hamet vd., 2013; Vardjan vd., 2013; Nalbantoglu vd., 2014; vd., 2015; Korsak vd., 2015; Zanirati vd., 2015; Kök Taş vd., 2011 Lactobacillus kefirgranum Leite vd., 2012; Vardjan vd., 2013 Lactobacillus parakefiri Dobson vd., 2011; Hamet vd., 2013; Vardjan vd., 2013; Nalbantoglu vd., 2014; Korsak vd., 2015 Lactobacillus brevis Simova vd., 2002; Santos vd., 2003; Witthuhn vd., 2005; Nalbantoglu vd., 2014 Lactobacillus plantarum Garrote vd., 2001; Santos vd., 2003; Miguel vd., 2010; Gao vd., 2012; Nalbantoglu vd., 2014 Lactobacillus helveticus Simova vd., 2002; Chen vd., 2008; Unsal, 2008; Sabir vd., 2010; Dobson vd., 2011; Kesmen ve Kacmaz, 2011; Nalbantoglu vd., 2014; Kök Taş vd., 2011 Lactobacillus acidophilus Santos vd., 2003; Kesmen ve Kacmaz, 2011; Dobson vd., 2011; Nalbantoglu vd., 2014 Sabir vd., 2010; Kök Taş vd., 2012 Lactobacillus delbrueckii Simova vd., 2002; Santos vd., 2003; Witthuhn vd., 2004; Witthuhn vd., 2005; Nalbantoglu vd., 2014 Lactobacillus rhamnosus Nalbantoglu vd., 2014 Lactobacillus casei Simova vd., 2002; Sabir vd. 2010; Nalbantoglu vd., 2014; Zanirati vd., 2015 Lactobacillus paracasei Santos vd., 2003; Miguel vd., 2010; Magalhaes vd., 2011; Hamet vd., 2013; Nalbantoglu vd., 2014 Lactobacillus bulgaricus Simova vd., 2002; Wang vd Lactobacillus fermentum Witthuhn vd.,

23 Çizelge 2.2. Kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar (Devam) Lactococcus Türleri Lactococcus lactis subsp. lactis Garrote vd., 2001; Simova vd., 2002; Yuksekdag vd., 2004; Kojic vd., 2007; Unsal, 2008; Magalhães vd., 2011; Korsak vd., 2015; Garofalo vd., 2015; Zanirati vd., 2015 Lactococcus lactis subsp. lactis biovar Garrote vd., 2001 diacetylactis Lactococcus lactis subsp. Cremoris Yüksekdag vd., 2004; Yang vd, 2007; Zhou vd., 2009; Korsak vd., 2015 Leuconostoc Türleri Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Witthuhn vd., 2004; Mainville vd., 2006 Leuconostoc mesenteroides subsp. Cremoris Witthuhn vd., 2005; Mainville vd., 2006 Streptococcous Türleri Streptococcous thermophilus Simova vd., 2002; Yüksekdag vd., 2004; Mainville vd., 2006; Garofalo vd., 2015; Kök Taş vd., 2011 Streptococcus durans Yüksekdağ vd., 2004 Acetobacter Acetobacter spp. Garrote vd., 2001; Marsh vd., 2013; Garofalo vd., 2015 Acetobacter fabarum Gao vd., 2012 Garofalo vd., 2015 Acetobacter lovaniensis Unsal, 2008; Magalhães vd., 2011; Korsak vd., 2015 Acetobacter aceti Koreleva, 1991; Rosi, 1978 Bifidobacterium Türleri Bifidobacterium spp. Leite vd., 2012; Marsh vd., 2013 Bifidobacterium breve, B. choerinum, B. longum, B. Pseudolongum Mayalar Candida kefir Dobson vd., 2011; Kök Taş vd., 2011 Marquina vd., 2002; Witthuhn vd., 2004 Saccharomyces cerevisiae Marquina vd., 2002; Simova vd., 2002; Witthuhn vd., 2004; Latorre-García vd., 2007; Kök Taş vd., 2011; Marsh vd., 2013; Vardjan vd., 2013; Diosma vd., 2014; Garfola vd.,

24 Çizelge 2.2. Kefir danelerinden izole edilen mikroorganizmalar (Devam) Kluyveromyces marxianus Marquina vd., 2002; Wang vd., 2008; Marsh vd., 2013; Vardjan vd., 2013; Diosma vd., 2014; Korsak vd., 2015; Kök Taş vd., 2011 Pichia fermentans Wang vd., 2008; Marsh vd., 2013 Pichia guilliermondii Gao vd., 2012 Pichia kudriavzevii Gao vd., 2012 Saccharomyces unisporus Zhou vd., 2009 Marquina vd., 2002; Latorre-García vd., 2007; Wang vd., 2008; Marsh vd., 2013; Vardjan vd., 2013; Diosma vd., 2014; Garofalo vd., 2015 Saccharomyces turicensis Wang vd., 2008 Garofalo vd., 2015 Saccharomyces martiniae Zhou vd., 2009 Saccharomyces exiguus Latorre Garcia vd., 2007 Kluyveromyces lactis, Latorre Garcia vd., 2007; Zhou vd., 2009 Torulospora delbrueckii, Angulo vd., 1993; Vardjan vd., 2013 Issatchenkia orientalis Latorre Garcia vd., 2007; Marsh vd., 2013; Diosma vd., 2014 Candida holmii Witthuhn vd., Kefir Danesinde Bulunan Probiyotik Mikroorganizmalar Probiyotik terimi yaşam için anlamına gelen Yunanca kelimeden türetilmiştir (Reid, 2003). Pasteur Enstitüsü'nde çalışan ve Nobel ödülü alan Elie Metchnikoff gıdalar içerisinde bulunan faydalı mikroplar, zararlı mikropların yerine geçerek bağırsak florasını değiştirir (Metchnikoff, 1907). Fransız çocuk doktoru olan Henry Tissier, diyare olan çocukların dışkılarında Y şeklinde morfolojiye sahip olan bakterilerin sayısının düşük olduğunu gözlemledi. Bu bifid bakteriler sağlıklı çocukların dışkılarında tam tersi yoğun miktarda bulunmaktadır (Tissier, 1906). Tissier, diyare olan hastalara bağırsak florasının düzelmesi ve sağlıklı bağırsak florasına oluşturmak için bu bakterinin alımını önermiştir. Metchnikoff ve Tissierin bu eserleri probiyotik mikroorganizmalar kullanımı konusunda bilimsel çalışmaların başlangıcı olmuştur. Fakat probiyotik kelimesi henüz literatürlerde yoktu. Lilly ve Stillwell, 1965 de ilk kez Probiyotik kelimesini diğer mikroorganizmaların gelişmesini destekleyen, 11

25 mikroorganizmalar tarafından üretilen madde olarak tanımlandılar. Fuller (1989), probiyotiklerin mikrobiyal doğasını göstermek için faydalı ve konakçı hayvanın bağırsak dengesini iyileştiren canlı mikrobiyal yem takviyesi olarak yeniden tanımladı. Havenaar ve Huis Veld (1992), hayvan ya da insana uygulandığında, yararlı bir şekilde konakçı florasını iyileştiren tek veya karışık kültür bakterileri olarak tanımlamıştır. Guarner ve Schaafsma (1998), canlı mikroorganizmalar yeterli miktarda tüketildiğinde ana konakçıda sağlığa yararlı etki yapar bilgisini yayımlamıştır. Probiyotik, yeterli miktarda konakçıya verildiği zaman sağlığa yararlı etki yapan canlı mikroorganizmalardır (Anonymous, 2001; Hill vd., 2014). Probiyotik mikroorganizmada aranan özellikler (Guarner ve Schaafsma, 1998; Harmsen vd., 2000; Ewaschuk ve Dieleman, 2006): Düşük ph ve asitlere karşı dayanıklı olmalı ve yüksek hücre canlılığına sahip olmalıdır. Gastrointestinal sistemde canlı kalabilmelidir. Bağırsak epiteline tutunabilmelidir. Antimikrobiyal bileşikler üretebilmelidir. Bağırsak immün sistem hücrelerine sinyal göndermelidir. İnsan orijinli olmalıdır. Patojenik olmamalıdır. Proses koşullarında dayanıklı olmalıdır. Eklendiği ürünün kalitesini olumsuz yönde etkilememelidir. Probiyotik mikroorganizmalar, sağlığa yararlı etkisini yeterli miktarda (5x10 9 kob/gün) en az 5 gün boyunca alındığı zaman gösterirler (Gronlund vd., 1999). Probiyotik içeceklerin terapötik amaçlı kullanımı için minimum probiyotik bakteri değeri 6-7 log kob/ml olarak önerilmektedir (Özer and Kırmacı, 2010; IDF, 1992). Kodeks Alimentarus Komisyonu tarafından spesifik mikroorganizma konsantrasyonu 7 log kob/ml olarak belirtilmiştir (Gurakan vd., 2010). Ayrıca Japonya Kurumu LAB ve fermente süt içeceklerinde minimum bakteri değerini 7 log kob/ml (Farnworth, 2008; Ishibashi ve Shimamura, 1993), FAO tarafından 12

26 önerilen minimum bakteri değeri ise 5 log kob/ml olarak belirtilmiştir (FAO, 2002). Probiyotik mikroorganizmaların sayımı için inkübasyon şartlarına bağlı olarak seçici besiyerler geliştirilmektedir. Güncel araştırmalarda seçici besiyeri ve inkübasyon şartları Çizelge 2.3. de gösterilmiştir. Projemizde spesifik tüm besiyerlerinde kefir probiyotik mikroorganizma sayımı gerçekleştirilmiştir. Koloni olarak en iyi sonuç veren besiyerler araştırmamızda kullanılmıştır. Çizelge 2.3. Probiyotik mikroorganizma seçici besiyeri inkübasyon koşulları Mikroorganizma Seçici Ortamı İnkübasyon Koşulları Bifidobacterium spp. Streptococcus thermophilus Lactobacillus acidophilus MRS-NNLP agar+ 0.05% L-cysteine TOS-NNLP 37 C; 72 saat Anaerobik inkübasyon 37 C- 2-3 gün Anaerobik inkübasyon RCA-AD 37 C 2-3 gün Anaerobik inkübasyon TOS-MUP S. thermophilus agar M17-Laktoz MRS-salicin agar MRS-sorbitol agar NA-salicin agar 37 C 72 saat Anaerobik inkübasyon 37 C 24 saat Aerobik inkübasyon 45 C 24 saat Aerobik inkübasyon 37 C 72 saat Anaerobik inkübasyon 37 C 72 saat Anaerobik inkübasyon Kaynak Dave ve Shah, 1996; Tharmaraj ve Shah, 2003; Miranda vd., 2014 Wijsman vd., 1989 Darukaradhya 2006 Miranda vd., 2014 Dave ve Shah, 1996 Tabasco vd., 2007 vd., Tharmaraj ve Shah 2003; Dave ve Shah, 1996 Lankaputhra ve Shah,

27 Çizelge 2.3. Probiyotik mikroorganizma seçici besiyeri inkübasyon koşulları (Devam) Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Total Maya Total Lactobacilli veya starter kültür olmayan Laktik asit bakterileri (NSLAB) Starter Lactococci Laktik asit bakterileri ve tüm probiyotikler MRS agar, ph 5.2 veya RCA agar, ph 5.3 MRS-Fruktoz PDA (%10 luk laktik asit veya tartarik asit ilavesi) YGC agar Lactobacillus selective agar M17 MRS agar MRS- DeMan Rogosa Sharpe agar, NA: Nutrient agar, PDA: Potato Dextrose agar, YGC: Yeast Extract Glucose Chloramphenicol agar, NNLP- (100 mg/l neomycin sulfate, 200 mg/l paromomycin sulfate, 15 mg/l nalidixic acid and 3 g/l LiCl); TOS-MUP (Transgalactosylated oligosaccharides-mupirocin lithium salt); RCA (reinforced clostridial agar) + aniline blue (0.3 g L-1 ) + dicloxacillin (2 mg L-1), ph C 72 saat Anaerobik inkübasyon 45 C 72 saat Anaerobik inkübasyon 25 C 120 saat Anaerobik inkübasyon 30 C 5 gün Anaerobik inkübasyon 30 C 2-3 gün Aerobik inkübasyon 37 C 2-3 gün Anaerobik inkübasyon Dave ve Shah, 1996 Tabasco vd., 2007 Rose vd., 1990; Özkaya vd., 2000 Rogosa vd., 1951; Gardiner vd., 1998; Daigle vd., 1999; McBrearty vd., 2001 Terzaghi ve Sandine 1975; Gardiner vd., 1998; Daigle vd., 1999; McBrearty vd., 2001; Corbo vd., 2001 DeMan vd., 1960; Corbo vd., 2001; Tharmaraj ve Shah, 2003 Kefir dane mikroflorası çok kompleks olduğu ve bu kompleks flora içerisinde de pekçok bakteri ve mayanın probiyotik özelliklerinde sahip olduğu bilinmektedir. Tuomola vd. (2001); Shah, (2000); Heller, (2001); Kim vd.,2015 yapılan araştırmalarda L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. acidophilus, L. johnsonii, L. casei, L. brevis, S. thermophilus, B. longum ve B. bifidum türlerinin probiyotik özelliklerinin olduğu belirtilmiştir. 14

28 Kefir danelerinden izole ettikleri Lactobacillus kefir in S katmanlı preteinlerin Clostridium difficile toksinlerinin sitopatik etkisinde belirgin bir düşüşe neden olduğunu buldular (Carasi vd., 2012). Kefirden izole ettikleri Lactobacillus spp. Caco-2 hücrelerine yapışarak Salmonella typhimurium ve Escherichia coli O157:H7 nin yapışmasını inhibe ettiği belirtilmektir (Santos vd., 2003; Hugo vd., 2008; Huang vd., 2013a). Kefir danelerinden izole ettikleri K. marxianus CIDCA 8154 ve S. cerevisiae CIDCA 8112 mikroorganizmalarının asit ve safra direnci olduğunu, in vitro bağırsak epitel hücrelerine yapıştığını, Balb/c farelerinin gastrointestinal sistemi boyunca geçtiğini bulmuşlardır (Gabriela vd., 2014). Kefir danelerinden izole edilen bazı Enterococcus durans suşlarının çeşitli Grampozitif ve negatif patojenler üzerinde engelleyici bir etki yaptığını buldular (Carasi vd., 2014). Kefir danelerinden izole ettikleri L. kefiri B6, safraya dirençli olduğunu ve antipatojenik aktivite gösterdiği belirtilmiştir (Eleni vd., 2015). Leite vd. (2015), araştırmalarında kefir danesinden izole ettikleri çeşitli laktik asit bakterilerini; Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis ve Lactobacillus paracasei izole ettiler. Lc. lactis in 3 suşu ve L. paracasei nin 1 suşu bakteriyosin ürettiklerini tespit ettiler. Suşların hiçbirinin istenmeyen enzimatik veya hemolitik aktiviteler göstermediğini buldular. L. paracasei MRS59 ve Lactobacillus rhamnosus GG insan Caco-2 epitel hücrelerine yapışma seviyesi gösterdiğini bulmuştur. Kefir danelerinden izole ettikleri L. lactis subsp. lactis WH-C1 safra tuzu konsantrasyonu ve asiditesi yüksek olduğunda iyi tolerans gösterdiğini buldular. Kolesterolü düşürdüğünü ve yüksek ekzopolisakkarit üretme kabiliyetine sahip olduğunu rapor etmişlerdir (Jingrui vd., 2015). 15

29 Kefir danelerinden izole ettikleri laktobasilleri, mide suyu ve safra tuzu toleransı, patojenlere karşı antagonizma, antimikrobiyal direnç ve yüzey hidrofobikliği açısından test ettiler. L. kefiranofaciens 8U, L. diolivorans 1Z ve Lactobacillus casei 17U suşlarının potansiyel probiyotik özelliğinde sahip olduğu rapor edilmiştir (Zanirati vd., 2015). Dışkı ile fermente edilen L. plantarum C4, tek başına frukto-oligosakaritler ile görülemeyen intestinal laktik asit bakterilerinin büyümesini uyardığını bulmuşlardır (Bergillos-Meca, vd., 2015) Kefir Üretimi Kefir üretiminde inek sütü kullanıldığı gibi keçi, koyun, deve ve bufalo sütleri ayrıca hindistan cevizi, pirinç ve soya sütü de kullanılmaktadır (Ertekin, 2008). Geleneksel kefir üretimi pastörize edilmiş ve oda sıcaklığına gelen sütün içerisine kefir danelerinin ilave edilmesi ile üretilmektedir. 25 C de 24 saat inkübasyon uygulanır. Kefir daneleri içerisinden aseptik koşullarda steril süzgeç ile ayrılır ve daneler steril su ile yıkanır. Kefir soğukta depolanarak tüketilir. Daneler ise tekrar kefir yapımı için 4 C de süt içinde depolanır (Motaghi vd., 1997; Güzel-Seydim, 2001). Endüstriyel üretimde kefir daneleri kullanımı çok nadirdir. Ülkemizde kefir daneleri kullanarak üretim yapan tek firma Danem Süt ve Süt Ürünleri Ltd. Şti. dır. Projemizde ürün temini için bu firma seçilmiştir. Tüm dünyada endüstriyel kefir üretimi içerisinde sınırlı mikroorganizma içeriğine sahip ve kefire özgü mikroorganizmaları içermeyen farklı probiyotik içerikli starter kültürler kullanılarak yapılmaktadır. Aslında üretilen ürün kefir değil probiyotikli içecek olarak tanımlanabilinir. Endüstriyel üretimde pastörize edilmiş süt 30 C ye soğutulmuş sütün içerisine %2-3 kültür ilavesi yapılır. 30 C de 8-10 saat inkübasyona bırakılır ve ph 4,6 da sonlandırılır ve 4 C ye soğutulur. 16

30 Geleneksel kefir üretimi laktik asit bakterileri, asetik asit bakterileri ve mayaları barındıran kefir danelerinin süte ilave edilmesiyle gerçekleştirilir. Endüstriyel kefir üretiminde ise kefir danelerinin muhafazasında hijyenik açıdan karşılaşılan güçlüklerden ve kefirin raf ömründen dolayı mikroorganizma çeşitliliği sınırlı sayıda olan starter kültür kullanılmaktadır (Bozkurt vd., 2010). Kefir üretiminde kullanılan kültüre ve sütün besin içeriğine bağlı olarak tat, koku, kıvam gibi duyusal özellikler farklılık gösterir. Kefir danesinden üretilen kefir tadı hafif asidik, kefire özgü bakteri ve maya çeşitliliğine bağlı olarak üstün bir aromaya sahiptir. Kefirin tekstürü mayalardan kaynaklı hafif köpüklü ve kıvamı ayrandan daha koyudur. Çizelge 2.4 de geleneksel kefir üretimi ve endüstriyel kefir üretimi gösterilmiştir (Güzel-Seydim, 2001). Çizelge 2.4. Geleneksel kefir üretimi (sol) ve endüstriyel kefir üretimi (sağ) (Güzel-Seydim, 2001) İnkübasyon Sıcaklığına Soğutma (25 C) Çiğ Süt Yağ Standardizasyonu (tam yağlı, yarım ve az yağlı) Homojenizasyon Pastörizasyon (90 C; 2 Dak) İnkübasyon Sıcaklığına Soğutma (30 C) Kefir Daneleri İlavesi (%2) Starter Kültür İlavesi (%2) İnkübasyon (24 saat; 25 C) İnkübasyon (8-10 saat; 30 C) Kefir Danelerinin Aseptik Olarak Soğutma (4-6 C) Uzaklaştırılması Soğutma (4-6 C) Kefir Daneleri Olgunlaştırma Ambalajlama Soğukta Depolama (+4 C) Kefir Danelerinin Steril Su İle Yıkanması Kefir Danelerinin Tekrar İnokule Edilmesi Ambalajlama Soğukta Depolama (+4 C) 17

31 Günümüzde endüstriyel kefirlerde kefir aroması hissedilmemekte, asidik tat daha baskın olarak ifade edilmiştir (Özen vd., 2016). Özen vd. (2016) araştırmasında ülkemizde bulunan starter kültür kullanılarak üretilen kefirler ile kefir daneleri kullanılarak üretilen kefir karşılaştırılmıştır. Duyusal üstünlükleri duyusal analiz testleri ile 12 panelist tarafından belirlenmiştir Starter kültür Starter kültür, standart kalitede ürün elde etmek ve ürüne özgü tat, aroma ve yapının oluşmasını sağlayan mikroorganizmalara denir (Ateş ve Patır 2001, Kayagil 2006 Üçüncü 2004). Starter kültürler fermente ürünlerde (et ürünleri, sebze ürünleri, süt ürünleri, hububat ürünleri, alkollü içecekler gibi) kullanılmaktadır. Kefir, peynir, yoğurt ve diğer fermente süt ürünlerinde, standart kaliteyi sağlamada, karakteristik tat ve aroma elde etmede kullanılan starter kültürler önemli bir role sahiptir (Tunail 1983). Starter kültürler bazı gıdalardaki işlevi aroma geliştirme, bazılarında tekstürü iyileştirme ve proteolitik aktivite gibi belirlenen bir amaca göre uygulanır(cogan and Accolas 1990). Süt ürünleri üreten firmalar bu starter kültürlerden birini seçerek, tüketiciler için aynı tat, aroma ve tekstürde ürünler üretir (Tağhan ve Öztürk 2002). Yoğurt ve peynirle ilgili arkeolojik bulgular 6000 yıl öncesinde yapılmakta ise de süt ürünleri üreten firmalarda bilinçli olarak starter kültür kullanımı 1970 li yıllarda başlamıştır (Merilainen 1988, Koçak vd. 1994). Günümüzde laktik asit üretimi, proteolitik atkivite, faj dirençliliği ve aroma oluşturma özelliklerine göre belirlenen starter kültürler süt ürünleri üreten firmalarda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Demirci 2000). Starter kültürlerin aktivitesini olumsuz olarak etkileyen en önemli faktör bakteriyofajlardır. Bakteriyofajlar, bakterilerin hücresine girer ve orada hücreyi parçalayarak, erimesine yol açan bir virüslerdir. (Akın 2006). Bu faj enfeksiyonu ile laktik asit üretimi azalmaktadır (Tükel 2002). 18

32 Süt ürünleri üreten firmalar için üretilen ilk starter kültür sıvı kültürdür (Yaygın ve Toklu 2000). Gelişen süt endüstrileri ile starter kültür kullanımı artmış ve bunun sebebiyle de kültür üreten laboratuvar sayısı ve firmaları artarak kültür üretim tekniğinde gelişmeler olmuştur (Yaygın ve Toklu 2000). Starter kültürlerin daha uzun raf ömrüne sahip olması için çeşitli kurutma yöntemleri geliştirilmiştir (Yaygın ve Toklu 2000, Akın 2006). Yapılan bir çalışmada konsantre starter kültür bakterileri dondurularak kurutulmuş ve bu yöntemle üretilen starter kültürün kullanılmasının daha uygun olduğunu bulmuşlardır (Porubcan ve Sellars, 1975). Sıvı starter kültürlerin -30, -40 C de dondurularak veya -196 C de sıvı azot içerisinde dondurularak dondurulmuş starter kültürler elde edilmiştir (Tağhan ve Öztürk 2002, Üçüncü 2004). Böylece starter kültürler sıvı, liyofilize ve dondurulmuş kültürler olarak satışa sunulmaktadır (Tağhan ve Öztürk 2002, Üçüncü 2005, Akın 2006). Starter kültürlerde kullanılan mikroorganizmalar genel olarak Lactobacillus spp., Pediococcus spp., Streptococcus spp., Leuconostoc spp., Bifidobacterium spp., Lactococcus spp., Carnobacterium spp., Enterococcus spp., Weissella spp., Vagococcus spp., Aerococcus spp., Oenococcus spp., Atopobium spp., Dolosigranum spp., Tetragenococcus spp., Alloiococcus spp., Gemella spp., Kluyveromyces spp., Candida spp. ve Saccharomyces spp. dir (Schleifer vd. 1995, Low ve Hansen 1997). Gıda endüstrisinde starter kültür olarak laktik asit bakterilerinden Lactococcus spp. ve Lactobacillus spp. süt ürünlerinde, Streptococcus spp., Lactobacillus spp. ve Pediococcus spp. et ürünlerinde, Lactobacillus spp. ve Leuconostoc spp. sebze ürünlerinde kullanılmaktadır (Foulquie vd., 2006; Holzapfel, 2003). Fermente bir ürünün elde edilmesinde kullanılacak olan starterin seçilmesi için, öncelikle starterlerin istenilen lezzet ve koku gibi bileşenleri üretmeleri gerekir (Marshall, 1987). Faj direnci süt ürünlerinde istenilirken, hububat ürünlerinde istenilmemektedir (Ganzle, 2009). Çizelge 2.5 de fermente ürünler için starter kültür sunan firmalar gösterilmiştir (Hansen, 2002). 19

33 Çizelge 2.5. Fermente ürünler için starter kültür sunan firmalar (Hansen, 2002). Şirket Alce ASCRC Centro Sperimentale del Latte Chr. Hansen CSK Danisco Degussa DSM Gewürzmüller Lallemand NZDRI Quest International Rhodia Ülke İtalya Avustralya İtalya Danimarka Hollanda Danimarka Almanya Hollanda Almanya Kanada Yeni Zelanda Hollanda Fransa Streptokoklar, Leuconostoc cremoris ve psikrotrof mikroorganizmaları %0,5 oranında inoküle etmişler. Laktik staterlerinin antimikrobiyal aktivitesinin olduğunu bulmuşlar. Ortama katalaz ilave edilmesi sonucunda antimikrobiyal etkinliğinin azaldığını ve bu aktiviteyi H2O2 üretiminin sağladığını yorumlamışlardır(juffs ve Babel, 1975). H2O2 üretimi optimum sıcaklık koşulları 5 C ve 7 C dir (Dahiya ve Speck, 1968). Laktobasil ve streptokok türleri H2O2 üretmektedir (Reiter ve Harmulu, 1984) 10 dakika boyunca 30 C'de 400MPa basınç altında Lb.helveticus un aminopeptidaz aktivitesini incelediler. Basınç etkisi, peynir olgunlaşmasının hızlanması için önemli olan aminopeptidaz ve Xprolyl dipeptidil aminopeptidaz aktivitelerini arttırdı (Miyakawa vd., 1994). Giannoglou, Katsaros ve Taoukis (2016), Str. thermophilus ve L. lactis starter kültürlerin aminopeptidaz aktivitesine 20 C'de 200 MPa'da 20 dakika sürede aktivitenin arttığını buldular (Giannoglou vd., 2016). Yaptıkları peynir üretiminde Lc. lactis ssp. lactis, Str. salivaris ssp. thermophilus, Streptococcus durans ve Lb. delbrueckii spp. bulgaricus laktik asit üretiminde Brevibacterium linens, Propioniobacterium shemanii, Leuconostoc spp., Lc. lactis spp. diacetylactis tat ve aroma üretiminde rol oynadılar (Evrensel ve Aynalı, 1996). 20

34 Lb.plantarum, fenilaktik ve 4-hidroksi-fenilaktik asitlerin üretilmesi sonucunda, hamur mayasında antifungal aktivitesi olduğunu buldular (Lavermicocca vd., 2000). L. lactis subsp. cremoris'un bazı peptidazlarının aşırı ekspresyonu, peynirin duyusal kalitesini geliştirmiştir (Guldfeldt vd., 2001) Kefirin Sağlık Üzerine Etkileri Antikanserojenik etkisi, antidiyabetik etkisi, kolesterolü düşürücü etkisi, sindirim sistemine etkisi, bağışıklık sistemine etkisi, laktoz intoleransa etkisi, antialerjik özelliği, probiyotik ve prebiyotik özelliği, antimikrobiyal özelliği olduğu belirten uluslararası ve ulusal düzeyde yapılan birçok araştırma makaleleri (Shiomi vd., 1982; Furukawa vd., 1992; Furukawa vd., 1996; Thoreux ve Schmucker, 2001; Rodrigues vd., 2005; Güzel-Seydim vd., 2006; 2010; Ahmed vd., 2013) ile fonksiyonel ürün niteliğinde fermente bir ürün olan kefirdir. Probiyotik özellikli kefir içeceğinin bağırsak bağışıklık sistemini düzenleyerek bağışıklık sistemini etkilediği pek çok araştırmada belirtilmektedir (Vinderola, 2005; 2006; Maccaferri vd., 2011; Romanin vd., 2010; Güzel-Seydim vd., 2010). Gastrointestinal bağışıklık sistemin karakteristik özellliği zararsız diyet antijenlerine ve çocukluk çağında elde edilmiş normal intestinal floraya karşı tolerans sergilemesidir. Buna karşı potansiyel olarak patojen olan mikroorganizmalara karşı ise ciddi direnç gösterir. Bu farklı davranışların gösterilebilmesi, gastrointestinal bağışıklık sistemin luminal antijenleri değerlendirmesi, farklılıkların saptanması, zararlı olanların zararsız olanlardan ayırt etmesi ile mümkündür. Gastrointestinal bağışıklık sistemin verilecek yanıtı çok iyi düzenlemesi gerekmektedir. Mukozal bağışıklık sistemin regülasyonundaki bir bozukluk ya da yetersizlik alerji, inflamasyon, otoimmun hastalıklar gibi birçok bozukluğun ortaya çıkmasına yol açar. Gastrointestinal kanal bu fonksiyonları yerine getirebilmek için vücudumuzdaki en geniş bağışıklık sistemine sahiptir. Toplam bağışıklık sisteminin %70 den fazlası gastro-intestinal kanalda bulunmaktadır (Ozden A., 2005). 21

35 Kefir, içerdiği kimyasal bileşenleri ve probiyotik mikroorganizmalar sayesinde antibakteriyel (Zacconi vd., 1995), immunolojik (Furukawa vd., 1990), antitümöral (Furukawa vd., 1991) ve hipokolesterolemik etkisi (Tamai vd., 1996) bilinen faydalı bir süt ürünüdür. Kefir, tüberküloz, Tip 2 diyeti, kanser ve gastrointestinal gibi bazı rahatsızlıklarda destek tedavi olarak kullanılmaktadır (Çevikbaş vd., 1994). Kefir sinirsel rahatsızlıklara, iştahsızlığa ve uykusuzluğa karşı iyi gelmektedir (Hosono vd., 1990; Zacconi vd., 1995; Osada vd., 1994). Düzenli olarak günde yarım litre kefir tüketilmesi konakçı metabolizması üzerinde stabilize edici etkisi bulunmakta ayrıca karaciğer, safra, böbrek fonksiyonları ve kan dolaşımı üzerine olumlu etki gösterdiğini araştırmalarda belirtilmektedir (Hosono vd., 1990; Zacconi vd., 1995; Osada vd., 1994). Kardiyovasküler hastalık (kalp ve damar hastalığı) batı dünyasında önde gelen ölüm sebeplerinden biri olup bu hastalık için serum kolesterol seviyesinin yüksek olması risk faktörlerden biridir. Diyet uygulaması kalp ve damar hastalığı riski taşıyan kişilerde serum kolesterol düzeylerinin yönteminde önemli rol oynamaktadır (WHO, 1982). Hayvan deneyleri üzerindeki çalışmalarda süt ve özellikle fermente edilmiş süt ürünleri serum kolesterol düzeylerini düşürmektedir (Beena ve Prasad, 1997; Akalin vd., 1997). Süte ilave edilmiş kefir daneleri fermantasyon süreci boyunca süt kolesterol seviyesini azaltma yeteneğini sahip olduğunu bu değerleri %41 ile 84 arasında azalma meydana geldiğini göstermiştir (Vujicic, 1992). Kefir, Gram pozitif (Zacconi vd., 1995) ve Gram negatif bakteriler ile bazı mantar (Çevikbaş vd., 1994) çeşitlerine karşı antimikrobiyel etkiye sahiptir. Probiyotik içeren gıda ürünlerinin yararlı etkilerinden en önemlisi bağırsak mikrobiyotanın değiştirmesidir. Gastrointestinal yola yeni suşların veya türlerin alınması ile ya da var olan yararlı mikroorganizmaların gelişmesini sağlayarak yapabilirler. Yapılan in vivo çalışmalarında kefir ve kefiran konakçıya verilmesi sonucunda Clostridium perfringens gibi zararlı mikrobiyal türlerin azalttığını ve 22

36 Lactobacillus ve Bifidobacterium spp. yararlı mikroorganizmaların arttığını gözlemlediler (Liu vd., 2006b; Hamet vd., 2016). Disk difüzyon yöntemiyle yapılan çalışmalarda kefirin patojen bakteri ve mantarlara karşı oluşturdukları zon çapları ampisilin, azitromisin, seftriakson, amoksisilin ve ketokonazolun oluşturdukları zon çapları ile eşit bulmuşlar ve aynı antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu yorumlamışlardır (Cevikbas vd., 1994; Yüksekdag vd., 2004; Rodrigues vd., 2005; Huseini vd., 2012). Disk difüzyon yöntemi ile kefirin, Fusobacterium nucleatum a karşı 9,42 mm zon çapı oluşturduğunu buldular (Güzel-Seydim vd., 2016). Çizelge 2.6 da kefirin sağlık üzerine etkileri ve etki mekanizması gösterilmektedir. Çizelge 2.6. Kefirin sağlık üzerine etkileri ve etki mekanizması Sağlık Üzerine Etkisi Etki Mekanizması Kaynak ANTİKARSİNOJENİK HTLV-1 negatif malign T Maalouf vd., 2011 ETKİ lenfositler üzerinde artışını önleme Sarkom 180 hücresinde Liu vd., 2002 azalma Mutajen sodyum azid ve Güzel-Seydim vd., 2006 aflatoksin B1 karşı antimutajenik etkisi İndol, imidazol gibi mutajenik maddeleri bağlama Fekal enzim aktivitesini büyük ölçüde azaltma Tümör boyutunda azalma Hosono vd., 1990; Osada vd., 1994 Karagözlü ve Kavas, 2000 Çevikbaş vd.,

37 Çizelge 2.6. Kefirin sağlık üzerine etkileri ve etki mekanizması (Devam) BAĞIŞIKLIK SİSTEMİÜZERİNE ETKİLERİ IL 8 düzeylerinde azalma, IL 5 ve TNF-α düzeylerinde artma Bağırsak mukozal bağışıklık yanıtını arttırma ile IgA düzeyinde artma Caco-2 hücrelerinin teşviği IgE ve IgG1 seviyelerinde artış Beyaz kan hücrelerinde artış ANTİALERJİK ETKİLERİ Kanda ve dokuda Eozinofil artışı Mast hücre degranülasyonunu baskılama KOLESTEROL HMG-CoA redüktazın DÜŞÜRÜCÜ ETKİSİ aktivitesini düşürme Toplam serum kolesterol ve fosfolipit seviyelerinde azalma Trigliserit ve HDL seviyesinde azalış Böbrek üstü bezlerinde yağlanmada azalış KAN ŞEKERİ İskelet kası hücrelerinde DÜZENLEYİCİ ETKİSİ glikoz alımını arttırma ANTİMİKROBİYEL Listeria monocytogenes, ETKİLERİ Yersinia enterocolitica, Escherichia coli gelişimlerini engellediği Listeria innocua gelişimini engellediği Salmonella enteritidis gelişimini engellediği Staphylococcus aureus Bacillus cereus, S. enteritidis, L. monocytogenes, E. coli gelişimlerini engellediği Pseudomonas aeruginosa gelişimini engelledği Adiloğluve vd., 2013 Thoreux ve Schmucker, 2001 Santos vd., 2003; Liu vd., 2006 Furukawa vd., 1992 Yalçın, 2005 Furuno ve Nakanishi, De Angelis Pereira vd., 2013 Tamai vd., 1996 Vujicic vd., 1992; vd., 2006 Choi vd., 2006 Teruya vd., 2002 Liu Gülmez ve Güven, 2003 Morgan vd., 2000 Czamanski vd., 2004; Golowczyc vd., 2007 Ulusoy vd., 2007 Huseini vd.,

38 Çizelge 2.6. Kefirin sağlık üzerine etkileri ve etki mekanizması (Devam) LAKTOZ İNTOLERANSINI AZALTICI ETKİSİ KAN BASINCI ÜZERİNE ETKİLERİ SİNDİRİM SİSTEMİ ÜZERİNE ETKİLERİ Candida albicans, Salmonella typhi, Shigella sonnei, S. aureus ve E. coli gelişimlerini engellediği Fusobacterium nucleatum gelişimini engellediği Helicobacter pylori gelişimini engellediği Β-galaktosidaz (laktaz) aktivitesini arttırma Anjiyotensin dönüştürücü enzim baskılayıcı etkisi Antagonistik etkisiyle bağırsakta patojen bakteri kolonizasyonunu engelleme Midenin ph sında korunarak, bakterilerin önemli kısmının ince ve kalın bağırsaklara geçişi Silva vd., 2009 Güzel-Seydim vd., 2016 Zubillaga vd., 2001 De Vrese vd., 1992; Zubillaga vd., 2001; Hertzler ve Clancy, 2003 Quiros vd., 2005 Zacconi vd., 2003 Gibson ve Rastall, 2003; Farnworth vd., 2003; Santos vd., 2003; Marquina vd., 2002; Quiros vd., 2005; Millette vd., 2006; Zhou vd., Biyokimyasal Analizlerde Kullanılan Parametreler Enzimatik veya enzimatik olmayan antioksidanlar tarafından uzaklaştıran, metabolik ve fizyolojik aşamalarda oluşan maddelere serbest oksijen radikaller denir. Tüm sistemde, serbest oksijen radikalleri oluşumu ile antioksidanlar arasında bir denge vardır. Oksidatif stres, oluşan serbest oksijen radikallerin antioksidanlar tarafından ortadan kaldırılması ile arasındaki dengesizlikten oluşur. Serbest oksijen radikalleri lipit, protein oksidasyonuna ve DNA hasarına yol açar (Gitto vd., 2009; Naito vd., 2010). Hücre metabolizmasında oksijen yer alan biyokimyasal reaksiyonlar sonucunda serbest oksijen radikalleri oluşur. Oluşan kimyasal reaksiyonlarda oksijen, elektron transport zincirinde suya kadar indirgenirken her basamakta serbest oksijen radikalleri meydana gelir (Naito vd., 2010; Akkuş, 1995). Hidrojen 25

39 peroksit, süperoksit radikali, hidroksil radikali ve singlet oksijeni serbest oksijen radikallerinin en önemlileri arasında yer almaktadır (Akkuş, 1995). Serbest oksijen radikallerinin en önemli etkisi lipitlerin peroksidasyonudur. Kontrol altına alınamayan lipit perosidasyonu hücre disfonksiyonuna sebep olur. Lipitlerin peroksidasyonu sonucunda oluşan hasarların geri dönüşümü yoktur (Kılınç ve Kılınç, 2002). Membranda bulunan lipitlerin peroksidasyonu hücre geçirgenliği bozar ve hücre içi organellerinin hasarına sebep olur. Serbest oksijen radikalleri çoklu doymamış yağ asidi moleküllerini oksitleyerek aldehitleri meydana getirirler. Oluşan aldehitler uzun ömürlü olduklarından dolayı hücre hasarının yayılmasına sebep olur. Malondialdehit (MDA) en iyi bilinen bir aldehittir. MDA lipit peroksidasyonu ile korelasyon gösterirler. Membran komponentlerinin çapraz bağlanmasına sebep olan MDA membranın özelliği değiştirmektedir (McCord, 1993). Bu yüzden serbest oksijen radikalleri ile oluşan ürünlerin ölçümünün yapılması daha pratiktir. Serbest oksijen radikallerinin en önemli sonucu bilindiği gibi lipit peroksidasyonudur. Yağ asitlerinin oksidasyon sonrasında aldehitler (malondialdehit gibi) oluşmaktadır (Erel, 2005; Traverse vd., 2006). Oluşan hasarları gideren veya bu hasarı önleyen, oluşan serbest oksijen radikallerini metabolize eden veya serbest oksijen radikallerinin meydana gelmesini önleyen savunma maddelerine antioksidan denir (Akkuş, 1995). Toplam antioksidan statüsü (TAS) değerinin ölçümü, antioksidanların tek tek ölçümden daha önemli bilgiler verir. Ayrıca antioksidanların tek tek ölçülmesi pahalı, zaman alıcı ve karmaşıktır. Bu yüzden TAS değerinin ölçümü daha çok kabul görmektedir (Wijnberger vd., 2003; Vlachos vd., 2006) Nötrofillerde bulunan lizozomal enzim miyeloperoksidaz (MPO), H2O2 ile halojenlerin (Cl -, Br -, I - ) hipohalojenöz asit formasyonuna oksidasyonunu katalizler ve hipoklorik asit meydana getirir. Hipohalojenöz asit reaksiyonu 26

40 sırasında serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali meydana gelir (Caramori ve Papi, 2004). Laktik asit bakterileri yararlı mikroorganizmalar olup, kültürlü süt ürünleri ve diğer fermente ürünlerde yaygın bir şekilde kullanılır. Laktik asit bakterilerinin insan sağlığı açısından en iyi bilinen faydaları bağışıklık sisteminin uyarılması ve antioksidatif özelliğidir (Lin ve Change, 2000; Hoolihan, 2001). MPO aktivitesi dokulardaki lökosit birikimi ve inflamatuvar yanıtı gösteren biyokimyasal parametrelerdendir (Ysebaert vd., 2000). TAS değeri bir organizmanın antioksidan savunma durumunu gösterir (Gariballa vd., 2002) İnsan ve deney hayvanları gastrointestinal mikroflorası Kefirin sağlık üzerine etkilerinin en başında gastrointestinal sistem gelmektedir. Bağırsak sağlığı tüm vücut sağlığını etkilemektedir. Gastrointestinal sistemde bulunan konakçı (Çizelge 2.6.) mikrofloraya fermente süt ürünleri içinde en olumlu desteği içerisinde bulunan kendine özgü doğal probiyotik içeriği ile kefir sağlamaktadır. Gastrointestinal sistem ağız, ağız boşluğu, özofagus, mide, duodenum, jejunum, ileum, çekum, kolon ve rektumdan meydana gelir (Maciariane ve Cummings, 1991). Doğum öncesinde, uterus ve bebeğin büyümesi steril bir ortam içerisinde gerçekleşir. Ancak, doğum sırasında annenin vajinal ve fekal florasında bulunan mikroorganizmalar yeni doğan bebeğin gastrointestinal sistemine inoküle olur (Mevissen-Verhage vd., 1987). Başlangıçta, Escherichia coli veya enterokok gibi fakültatif anaerobik suşların bir üstünlüğü vardır (Rotimi ve Duerden 1981; Yoshiota vd., 1991). Anne sütü veya mama ile beslenen bebeklerin dışkısında bifidobakterler, streptokoklar, laktobasiller, koliformlar ve enterobakterler gibi mikroorganizma çeşitleri ve yükleri farklı oranlarda bulunur (Stark ve Lee, 1982; Yuhara vd., 1983; Benno vd., 1984; Mevissen-Verhage vd., 1987; Yoshioka vd., 1991; Langhendries vd., 1995; Kleessen vd., 1995). 2 yaşından sonra yetişkinin florasına benzer bir flora oluşmaya başlar. Anne sütü veya mama ile 27

41 beslenmesi, annenin aldığı probiyotik ve prebiyotikli besinler, normal doğum veya sezeryan ile doğum ve gebelik yaşı gibi faktörler yeni doğan bebeğin florasını etkiler (Coskun, 2006; Mountzouris vd., 2002). Ayrıca gastrointestinal sistemde mikrobiyal yük ve çeşitlilik yaş, probiyotik veya prebiyotik alımı, antimikrobiyal bileşenler gibi faktörler ile değişmektedir (Woodmansey, 2007; Walsh vd., 2014). Mikrobiyal kolonizasyonun asıl yeri gastrointestinal sisteminde yer alan kolonda 1,5 kg mikroorganizma yani yaklaşık olarak mikroorganizma yükü bulunmaktadır (Moore ve Holdeman, 1974; Whitman vd., 1998; Dominguez- Bello vd., 2010). Kalın bağırsakta bulunan Escherichia coli, Clostridia ve Bacteriodes gibi patojen mikroorganizmalar bağırsak florasını dengede tutmaktadır (Ziemer ve Gibson 1998). Mikrobiyal yük gastrointestinal sistemi boyunca değişmektedir (Çizelge 2.7) (Ouwehand ve Vesterlund, 2003; Ley vd., 2006). Çizelge 2.7. Gastrointestinal sistemde bulunan mikrobiyal yük ve çeşitliliği (Ouwehand ve Vesterlund, 2003; Ley vd., 2006). Özofagus Mide (ph: 1,5-2) kob/ml Streptococcus Prevotella Veilonella <10 4 kob/ml Streptococcus Lactobacillus Staphylococcus Helicobacter pylori 28

42 Çizelge 2.7. Gastrointestinal sistemde bulunan mikrobiyal yük ve çeşitliliği (Devam) (Ouwehand ve Vesterlund, 2003; Ley vd., 2006). Duodenum (ph: 6-7) Jejunum (ph: 7) İleum (ph: 7,5) Kolon (ph: 6,8-7,3) kob/ml Streptococcus Lactobacillus Staphylococcus Helicobacter pylori Veilonella Mayalar kob/ml Bifidobacterium Bacteroides Veilonella Clostridium Enterobacteriacea kob/ml Bacteroides Bifidobacterium Clostridium Ruminococcus Peptostreptococcus Eubacterium Faecalibacterium Streptococcus İnsan ve hayvan sağlığı üzerinde sindirim sisteminde bulunan mikrofloranın önemli bir rolü bulunmaktadır. Bu mikrofloranın patojenlere karşı korunması ve fonksiyonunu yerine getirebilmesinde prebiyotik, probiyotik ve simbiyotik adı verilen gıda katkı maddelerinden faydalanılmaktadır Balb/c farelerin fekal florasında mayaların olmadığını tespit ettiler (Diosma vd., 2014). Balb/c farelerinin fekal florasında Lactobacillus acidophilus 5F49; 9.5 log CFU/gr, Bifidobacterium longum E194b; 9.3 log CFU/gr, Enterococcus faecalis M266TA; 10.1 log CFU/gr, Enterococcus faecium IB37; 10.0 log CFU/gr, Escherichia coli M66; 10.3 log CFU/gr olarak buldular (Akira vd., 1998). Balb/c farelerinin fekal florasından Bacteroides thetaiotaomicron, Clostridium clostridiiforme, Fusobacterium prausnitzii, Peptococcus productus, Bifidobacterium longum, L. acidophilus ve Eubacterium limosum izole ettiler (Rong-Fu vd., 1996). 29

43 Balb/c farelerin kolon florasından Enterococcus durans, Staphylococcus intermedius, Lactococcus lactis, Escherichia coli ve Bacteriodes ovatus bakteri türlerini izole ettiler (Verdua vd., 1999) Trichoderma koningii Trichoderma spp. hızla organizmaları büyüyen, kolonileri başlangıçta düzgün veya yarı saydam olan ve daha sonra konsantrik beyaz ve yeşil halkalar oluşturan, yüne benzeyen yapı oluştururlar. Trichoderma mikroskobik karakterizesi düz duvarlı, hiyalin, bölmeli ve hif dallıdır. T. longibrachiatum, T. harzianum, T. koningii, T. pseudokoningii ve T. viride Trichoderma türleri insan patojenleri arasında tespit edilmiştir (Walsh vd., 2004). Trichoderma adında bir mantar çalışmasında ilk tanımlama 1794 yılında yapıldı (Persoon, 1794) ve 1865 yılında, bir Hypocrea türlerinin seksüel durumuna bir bağlantılı olduğunu önerdiler (Tulasne ve Tulasne, 1865). Trichoderma/Hypocrea cinslerine atanan farklı türlerin morfolojik olarak ayırt etmek zordu. Hatta tek bir tür, Trichoderma viride için sınıflandırmayı azaltmak için önerilmiştir. Bu nedenle, bu tanımlama için bir metod geliştirilmesi (Rifai, 1969; Samuels, 2006) başlatıldı ve bu çalışmalar 1969 yılına kadar sürdü. Bundan sonra, Trichoderma / Hypocrea sayısız yeni türler keşfedildi ve 2006 yılında, 100'den fazla filogenetik tanımlanmış türler oluştu (Druzhinina vd., 2006). Trichoderma spp. peptaibols pironlar, virides, butenolides ve antrakinonlar gibi çeşitli ikincil metabolitler izole edilmiştir (Vinale et al. 2006; Reino et al. 2008). Trichoderma koningii T-8 ve T-11 suşlarından izole edilen ikincil metabolitlerin yapıları Şekil 2.8 de gösterilmiştir (Kapoor vd., 2002; 2006; Vivek vd., 2013). 30

44 Şekil 2.1. Trichoderma koningii den izole edilen ikincil metabolitlerin yapıları (Kapoor vd., 2002; 2006; Vivek vd., 2013). Trichoderma türleri en çok topraktan izole edilmekte ayrıca havadan da izole edilebilmektedir. Trichoderma spp. önceden insanlara patojen etkisi olmayan bir küf olarak kabul edilirdi, fakat bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ve periton diyalizi hastalarında patojen olarak ortaya çıkmıştır (Tanis vd., 1995; Fung- Tonc vd., 1998). Trichoderma enfeksiyonlarının çok sayıda olguları bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda bildirilmiştir. İlk rapor T.viride, kronik akciğer hastalığı olan bir hastada pulmoner miçetomdan izole edilmiştir. (Escudero vd., 1976) Periton diyalize giren böbrek hastalığına sahip bir hasta Trichoderma koningii tarafından peritonit atağı yaşadı ve verilen raporlar Trichoderma spp. rolünü desteklemektedir (Campos-Herrero vd., 1996). İnsan patojenleri olarak verilen bilgilere göre T. koningii tarafından kaynaklanan enfeksiyonu gösteren ilk rapordur (Campos-Herrero vd., 1996). Trichoderma türleri tarafından üretilen uçucu organik bileşikler, solunum problemlerine neden olduğunu bildirdiler (Larsen vd., 1998). 31

45 İki hasta T. pseudokoningii ve T. koningii ile enfekte olmuş ve enfekte başlarında kateterinle uzaklaştırıldıktan sonra hastalar kurtuldu. Trichoderma tarafından oluşan en yaygın enfeksiyonlar kemik iliği naklinde (T. pseudokoningii ve T. longibrachiatum) ve böbrek nakli alıcısında (T. harzianum) rapor ettiler (Guarro vd., 1999) Deney Hayvanı Çalışmaları Zheng vd. (2013), Sprague-Dawley ratlarına, 48 gün boyunca bütün gruplar yüksek kolesterol diyetle beslemişler. Ayrıca Tibet kefirlerinden izole ettikleri L. acidophilus LA15 L. plantarum B23 ve L. kefiri D17 bakterileri vermişlerdir. Ratların fekal mikroflorasında Lactobacillus sayımını yapmışlar, kontrol grup ile anlamlı derecede yüksek olduğunu bulmuşlardır. Diosma vd. (2014), Balb/c farelerine, 12 gün boyunca S. boulardii ve kefirden izole ettikleri K. marxianus CIDCA 8154, S. cerevisiae CIDCA 8112 içme su ile uygulamışlardır. Fekalde maksimum maya konsantrasyonu 7. gün sonunda 10 7 kob/g saymışlardır. Millette vd. (2008), C57B1/6 farelerine 18 gün boyunca Lactobacillus acidophilus CL1285 ve L. casei karışımı, L. rhamnosus ATCC 9595 ve L. rhamnosus RW-9595M bakterileri vermişlerdir. Fekalde başlangıçtaki LAB sayımı ile çalışma sonundaki LAB sayımında benzer sonuçları bulmuşlardır. Tavan vd. (2002), F344 ratlarına 7-8 hafta heterosiklik aromatik amin tüketimi ardından 1 hafta deney diyeti ile %20 su, %30 yağsız süt, %30 Bifidobacterium animalis DN ve %30 Str. thermophilus DN vermişler. Heterosiklik aromatik amin metabolizması, fekal mutajenitesi ve kolon DNA lezyonlarını azaldığını bulmuşlardır. in vivo çalışmasında kefirin kolesterol seviyesini düşürdüğünü bulmuşlardır (Liu et al., 2006a) in vivo çalışmasında (Hamster) karaciğerde kolesterol 32

46 konsantrasyonları azaldığını ve dışkıda safra asidinin arttığını bulmuşlardır (Xiao vd., 2003). Yüksek kolesterol diyeti erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanlarında kefirden izole ettikleri Lactobacillus plantarum MA2 hipokolesterolemik aktivite göstermiştir. Bu çalışmada toplam serum kolesterol seviyesini, LDL-kolesterol, karaciğer kolesterol ve trigliserid önemli düzeyde düşürdüğünü ve dışkıda artan kolesterol miktarı tespit etmişlerdir (Wang vd., 2009). Yüksek kolesterol diyet uygulanan benzer bir Sprague-Dawley sıçan çalışmasında Lactobacillus plantarum un Lp09 ve Lp45 suşları ile aynı etkiler bulmuşlardır (Huang vd., 2013a). Lactobacillus plantarum LP27 ile desteklenmiş diyet tüketilen ratlarda toplam serum kolesterolü, LDL-kolesterol ve trigliseridi azalttığını buldular (Huang vd., 2013b) Kefir ile beslenen CB57BL/6 fareleri, bağışıklık sistemi düzenlendiği için Giardia intestinalis enfeksiyonun şiddetini azalttığını buldular (Correa Franco vd., 2013). Caco-2 hücrelerine yapışan Lactobacillus spp. kefir ile beslenen sıçanlarda fekal mikrobiyotasında arttığını gözlemlediler (Liu vd., 2006b; Carasi vd., 2015). Balb/c fareleri intragastrik E. coli O157:H7 tehdidine maruz bırakıldı ve buna karşılık olarak L.kefiranofaciens M1 verilerek bağırsak ve böbrek hasarı ve Shiga toksin penetrasyonunu, enfeksiyon belirtilerini azalttığını buldular (Chen vd., 2013). 8 haftalık gram Kunming farelerine kob/gün L. plantarum MA2 yi gavaj yoluyla 21 gün boyunca uyguladılar. L. plantarum MA2'nin 21. günde ileum, kolon ve dışkılarda tespit ettiler ve CFU/g muhafaza edildiğini buldular. Bu sonuçları L. plantarum MA2'nin bağırsak yolunda kolonize olduğunu ve hayatta kaldığı olarak rapor ettiler (Wei vd., 2016). 33

47 Kefir danelerinden izole ettikleri Lactobacillus kefiri CIDCA 8348, 4 haftalık erkek Swiss albino farelerine gavaj yoluyla 21 gün boyunca 10 8 kob/gün verdiler. Gaitalarında 21. Gün sonunda yapılan total bakteri, Firmicutes, Bacteroidetes ve Lactobacillus spp. sayımlarında kontrol grubuna göre daha yüksek olduğunu ve Lactobacillus spp. miktarının yüksekliği istatistiksel olarak önemli olduğunu buldular (Carasi vd., 2015). 6-8 haftalık dişi C57B1/6 farelerine Lactobacillus acidophilus CL1285 ve L. casei karışımı, L. rhamnosus ATCC 9595, L. rhamnosus RW-9595M mikroorganizmalarını 21 gün boyunca 10 9 kob/gün verdiler. 1, 9 ve 18. günlerde farelerin gaitalarında mikroorganizma sayımımı gerçekleştirdiler. L. rhamnosus ATCC 9595 verilen grupta 9. günde laktik asit bakterileri miktarı ilk günkü miktardan önemli ölçüde (P 0,05) arttığını buldular. Enterobacteriaceae popülasyonu L. rhamnosus ATCC 9595 verilen grupta 18. Günde ilk gündeki miktardan önemli ölçüde (P 0,05) azaldığını buldular. Total mezofilik bakteri popülasyonu L. rhamnosus ATCC 9595, L. rhamnosus RW-9595M verilen gruplarda 18. günde ilk gündeki miktardan önemli ölçüde (P 0,05) arttığını buldular (Mathieu vd., 2008). Stres altında bulunan konakçının bağırsak florasının değiştiğini derlemeler ve çalışmalar göstermektedir (Michael vd., 2011; Dinan ve Cryan, 2012; Jane ve Karen-Anne 2013). Dişi Swiss albino farelerine CCl4, vitamein E ve kefir danelerinden yaptıkları kefir örneklerini uyguladıktan 7 hafta sonra MDA değerlerine doku örneklerinde bakmışlar (Güven vd., 2003). Reaktif oksijen, karbon tetraklorür (CCl4) gibi hepatotoksik ajanlara bağlı hücre hasarının mekanizması içinde önemli bir rol oynamaktadır (Racknagel vd., 1989). Karaciğer ve böbrek dokularında CCl4 uygulanan grupta MDA değerlerinde artış gözlemlediler. Dane kefiri ve vitamin E uygulanan gruplarda MDA değerlerini düşürdüğünü gözlemlediler Oksijensiz radikal üretimi E vitamini ve dane kefir tarafından etkili bir şekilde engellenmiş, bu yüzden karaciğer ve böbrekteki MDA değerleri 34

48 azaldığını yorumladılar. Bununla birlikte, E vitaminin antioksidan etkisi kefir kadar etkili olmadığını buldular (Güven vd., 2003). Erkek Wistar albino ratlarında yaptıkları çalışmada, karaciğer dokularında oksidan hasarın parametresi olan MDA değerlerinde iskemi reperfüzyon grubunda kontrol gruba göre arttığını ve dokuda reperfüzyon hasarının önlenemediği şeklinde yorumlamışlar. Nötrofil infiltrasyon ve aktivasyon parametresi olan MPO değerlerinde de iskemi reperfüzyon grubunda yükselmiş ve bu durumu inflamasyonun belirgin bir şekilde arttığını gösteren bir sonuç olarak yorumlamışlar (Yardımcı, 2009). Osteoartritli hastaları içeren bir çalışmada TOS ile TAS arasında istatistiksel olarak anlamlı negatif korelasyon vardı (p<0.001) (Erel, 2004; Erel, 2005). TAS ve TOS ölçümleri üzerine oksidatif/antioksidan dengenin bir göstergesi olarak farklı klinik çalışmalar da yapılmıştır (Turan vd., 2014; Eren vd., 2015). Toksik maruz kalma sonrası oksidatif stres ile nefrotoksisite arasındaki ilişkiyi araştıran deneysel çalışmalarda, oksidatif stres varlığında TOS değeri önemli derecede artarken TAS değeri önemli ölçüde azaldı (Bozkurt vd., 2012; Rifaioglu vd., 2015). Alfa-amanitin, Amanita phalloides zehirlenmesinde çok organik organlarda, özellikle karaciğer ve böbreklerde toksik etkiler gösteren önemli bir rol oynamaktadır. Çalışmalar, alfa-amalitin ile ilişkili yaralanmalar ile reaktif oksijen türleri arasında bir ilişki olduğunu göstermiştir. Balb/c erkek farelerine Alfa-amanitin in farklı doz miktarıyla (0,2 mg/kg, 0,6 mg/kg, 1mg/kg) uyguladıkları in vivo çalışmasında böbrek dokusunda TAS, TOS ve MDA değerlerini karşılaştırmışlardır. Kontrol grupları ile karşılaştırıldığı zaman; TAS değeri 0,6 mg/kg ve 1 mg/kg Alfa-amanit doz miktarlarında azaldığını, MDA değeri ve TOS değerinin doz miktarı arttıkça arttığını buldular (Ergin vd., 2015). Erkek Wistar albino ratlarında spinal kord yaralanmasından sonra nöronal hasar üzerine minosiklinin etkisini serumlarında TAS, TOS ve MDA değerlerini incelediler. MDA değeri minosiklinin3, minosiklinin30, minosiklinin90 35

49 uygulamalarında azalma, TAS değeri minosiklinin90 uygulamasında artış ve TOS değeri Minosiklinin3 uygulamasında azalma buldular. Minosiklinin doza bağımlı antioksidan aktivitesi göstermiştir. Minosiklinin uygulaması ile antioksidan enzim düzeylerini arttırdığı ve toplam antioksidan durumunu iyileştirdiğini rapor ettiler (Aras vd., 2015). 36

50 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Kefir Üretimi Pastörize süt Süleyman Demirel Üniversitesi Ünsüt Süt İşletmesi (Isparta, Türkiye) nden temin edilmiştir. Kefir danesi Danem Süt ve Süt Ürünl. Gıda Amb. Eğt. Dan. Tic. ve San. Ltd. Şti (Isparta, Türkiye) den, exact KEFIR 2 (kod: ;710295) starter kefir kültürü (Debaryomyces hansenii, Leuconostoc, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus lactis, L.diacetlylactis, L.cremoris) CHR Hansen (İstanbul, Türkiye) dan temin edilmiştir. Kefir üretiminde pastörize süt 25 C ye soğutulmuş, %2 oranında kefir danesi inokülasyonu ile 25 C de inkübatörde fermantasyon işlemi uygulanmıştır. Kefirler ph 4.6 da fermantasyonda sonlandırılarak, aseptik koşullarda kefir daneleri ayırılmıştır. mikroorganizmalarından oluşmaktadır. Starter kültür ile kefir üretiminde ise kültür inokülasyonu %2 oranında yapılarak, üretim ph 4.6 da sonlandırılmıştır. Üretilen kefir örnekleri 4 C de depolanmıştır. Gavaj uygulamasında kullanılan kefir örnekleri gün aşırı hazırlanmış ve kefir mikroorganizma içerikleri kaydedilmiştir Deney Hayvanları Deneme Deseni Projenin deney hayvanları çalışması için Süleyman Demirel Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma biriminden tarafından Etik Kurul onayı alınmıştır. Balb/c fareleri Akdeniz Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma biriminden alınmıştır. Doğal kefir mayasından ve ticari kefir mayasından üretilen kefir örnekleri deney hayvanlarına verilmiştir. Fare kullanılmasının sebebi metabolizmalarının hızlı olmasından, dolayısıyla kısa süre içerisinde değişimleri gözlemleyebilmektir. Balb/c fareleri bağırsak florası çalışmalarında sıkça kullanılan fare türüdür (Rong-Fu vd., 1996; Akira vd., 1998; Verdua vd., 1999; Diosma vd., 2014). Deney hayvanlarının günlük normal yem ve su ihtiyaçları karşılanmıştır. 12 saat karanlık ve 12 saat aydınlık koşullarda gelişimi izlenmiştir (Vinderola vd., 2005). Gavaj veriminden 1 saat önce yemler önlerinden alınmıştır. Deneme 37

51 deseni 3 grup ve her grupta erkek 6-8 haftalık / gr 10 Balb/c fareleri yer almaktadır. 1. Grup; kontrol grubu olarak PBS (fosfat tamponlu salin), 300 µl/gün olarak, 2. Grup; doğal kefir danesinden üretilen kefir örneği 300 µl/gün olarak, 3. Grup; ticari kefir kültürden üretilen kefir örneği 300 µl/gün olarak uygulanmıştır (Şekil 3.1). Çizelge 3.1. de ayrıntılı olarak değerler verilmiştir. Şekil 3.1. Balb/c farelerine gavaj uygulaması Çizelge 3.1. Gavaj dozu ve veriliş sıklığı Adı Dozu (µl/gün) Veriliş Yolu Veriliş Sıklığı Etki Süresi (Hafta) (kez/gün) Kontrol (PBS) (CK) 300 Oral 1 2 Doğal kefir danesinden üretilen kefir (GK) 300 Oral 1 2 Starter kefir kültürden üretilen kefir (SK) 300 Oral

52 3.3. Kefir İçeceklerinin ve Gaita Örneklerinin Mikrobiyolojik Analizlerinin Yapılması Projenin mikrobiyolojik analizleri için fare gaitalarının tek tek toplanması gerektiğinden metabolik kafesler kullanılmıştır. Şekil 3.2 de görünen metabolik kafeslerden her gün gaita örnekleri alınmıştır. Mikrobiyolojik analizler 0, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15. gün gaitaları kullanılmıştır. Gaita örnekleri alınıp -20 C de depolanmıştır. Farelerin gaita örnekleri 0,5 gr alındı, steril havan ve tokmak yardımıyla toz hale getirilmiştir. Toz hale gelen 0,5 gr gaita 4,5 ml peptonlu su içerisinde vortex yardımıyla çözündürülmüştür (Şekil 3.3). Kefir içeceklerinden 1 ml alınarak 9 ml peptonlu su içerisinde dilüsyonları yapılmıştır. Art arda dilüsyonlar hazırlanmıştır. Ön çalışmalar ile belirlenmiş dilüsyonlardan steril petrilere 1 ml örnekler aktarılmıştır. Şekil 3.2. Metabolik Kafes 39

53 Şekil 3.3. Gaitaların peptonlu su içerisinde çözündürülmesi Lactobacillus spp. içeriği: Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek steril petri kutularına pipetlendikten sonra, 45 C ye kadar soğutulmuş 15 ml Rogosa Agar (Merck) petri kutusuna ilave edilmiş, inkübasyon 37 C de 3 gün %6 lik CO2 inkübatörde (CO-150, New Brunswick Scientific, ABD) inkübe edilmiş, koloni bulunduran petrilerde sayımlar yapılmıştır. Kok grubu içeriği: Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek petri kutularına pipetlendikten sonra, 45 C ye kadar soğutulmuş 15 ml M17 Agar (Merck) petri kutusuna ilave edilmiş, inkübasyon 37 C de 3 gün %6 lik CO2 inkübatörde gerçekleştirilmiş koloni bulunduran petrilerde sayımlar yapılmıştır. L. acidophilus içeriği: Kefir örneklerinde L. acidophilus kolonilerini saymak amacıyla MRS-sorbitol (Sigma) agar kullanılmıştır. %10 luk hazırlanan sorbitol 0,43 µm olan steril filtreden geçirilerek ve 50 C ye kadar soğutularak MRS agar içerisine ilave edilip karıştırılmıştır. Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek steril petri kutularına alınarak üzerine 15 ml MRS-sorbitol agar petri kutusuna ilave edilmiş, inkübasyon 37 C de 3 gün %6 lık CO2 inkübatörde gerçekleştirilmiş, koloni bulunduran petrilerde sayımlar yapılmıştır. Bifidobacterium spp. içeriği: Kefir örneklerinde Bifidobacterium spp. kolonilerini saymak amacıyla MRS- NNLP, TOS-MUP, TOS-NNLP, RCA agar 40

54 besiyerleri karşılaştırılmıştır. MRS-NNLP ve RCA agar ile yapılan sayımlar daha net ve doğru olmuştur. NNLP karışımı, Neomisin sülfat (Merck) (100 mg/l), nalidisik asit (Merck) (50 mg/l), lityum klorit (Merck) (3000 mg/l), paronomisin sülfat (Merck) (200 mg/l) tartılarak, üzerine 100 ml saf su ilave edilmiş ve 35 C karıştırıcıda çözündürülecek, steril filtereden 0,43 µm geçirilerek, %20 oranında MRS agar içerisine ilave edilmiştir. Hazırlanan örnek dilüsyonlarından 1 ml steril petri kutularına alınarak ve 45 C ye kadar soğutularak, 15 ml MRS-NNLP agar inoküle edilmiştir. İnokülasyon 37 C de 3 gün %6 lık CO2 inkübatörde gerçekleştirilerek koloni bulunduran petrilerde sayımlar yapılmıştır (Tharmaraj ve Shah, 2003). MRS-NNLP ve RCA agarda gelişen koloni görünümü Şekil 3.4 te gösterilmiştir. Şekil 3.4. MRS-nnlp (sol), RCA (orta) ve TOS-NNLP (sağ) agarlarında gelişen koloni görünümü Maya içeriği: Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek petri kutularına alınarak, 45 C ye kadar soğutulmuş PDA (Potato Dextrose Agar, Merck) dan 15 ml petri kutusuna ilave edilecek; 25 C de 5 gün inkübe edilerek, koloni bulunduran petrilerde sayımlar yapılmıştır. Farklı katkı maddeleri ilaveleri ile (cycloheximide, Sigma) koloni gelişimleri karşılaştırılmıştır. Toplam mezofilik aerob bakteri içeriği: Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek petri kutularına alınarak, 45 C ye kadar soğutulmuş PCA (Plate Count Agar, Merck) dan 15 ml petri kutusuna ilave edilecek; 35 C de 2 gün inkübe edilerek, koloni bulunduran petrilerde sayımlar yapılmıştır. 41

55 Enterobacteriaceae içeriği: Hazırlanan dilüsyonlardan 1 ml örnek petri kutularına alınarak, 45 C ye kadar soğutulmuş MAC (MacConkey Agar, Merck) dan 15 ml petri kutusuna ilave edilerek; 37 C de 1 gün inkübe edilerek, koloni bulunduran petrilerde sayımlar yapılmıştır (Millette vd., 2008) PZR yöntemi ile küflerin tanımlanması Küflerin moleküler yöntemle tanımlanması 18Sr RNA FR1-FF2 gen bölgesinin Polimeraz zincirleme reaksiyonu (PZR) yapılmıştır. 18S rrna dizisini PZR yöntemiyle çoğaltabilmek için öncelikle kullanılacak primerlerin belirlenmesi gerekmektedir. Belirlenen Primerler FF2 (5'-GGTTCTATTTTGTTGGTTTCTA-3'), FR1 (5'- CTCTCAATCTGTCAATCCTTATT-3'). DNA ayrılması için 0,1 ml örnek 0,5 ml lik mikro tüplere alınarak 3 dakika homojenize edildikten sonra serbest nükleazların inaktive etmek için su banyosunda dakika bekletilerek oda sıcaklığında soğutulduktan sonra 2 ile 5 dakika santrifüj yapıldı ve DNA izolasyonu yapıldı. Kullanılan PZR Master Mix (Promega, ABD) kiti içinde 1,25 U Taq DNA polimeraz (ph 8,5),,2mM datp, dgtp, dctp, dttp, 1,25 mm MgCl2 içermektedir. Örnekler protokolde verilen miktarlar ile hazırlanmıştır. PZR Master mix 12,5 μl, 0,4 pmol primer A ve B, 1 μl DNA ve son miktar 50μl olacak şekilde nükleaz içermeyen su (Merck) ile tamamlanmıştır. Karışım hazırlandıktan hemen sonra PZR tüplerine alınarak ısısal döngü cihazına (Bio- Rad, Hercules, CA) yerleştirilmiştir. 95ºC de 3 dakika denatürasyon ile başlayıp 94ºC de 1 dk ve 52ºC de 2 dk 35 tekrar yapılıp, 72ºC de 10 dakika şeklinde reaksiyon döngüsü programlanmıştır. PZR ürünlerinin elektroforezi %2 agaroz içeren jellerde yapılmıştır. Jeller 10 dakika etidyum bromür, (0.5 ug / ml) ile lekelendirilerek Eagle Eye II görüntü kullanılarak UV ışığı altında görselleştirilmiştir. Örnekler %1,8 Agarose (AppliChem) içeren jelde 1 x TBE tampon içerisinde yürültülmüştür. Her bir kuyucuk, 3 µl yükleme boyası (orange loading dye- Promega, ABD), 5 µl yükleme tamponu (Loading tampon-promega, ABD) karıştırılarak mikropipet ile yerleştirilmiştir. 100 bp lik marker (Promega, USA) kullanılmıştır. Sonra numuneler sırasıyla yine aynı oranda boya ve numune 42

56 karıştırılarak mikropipetle yükleme yapılmıştır. Elektroforez 100 V da çalıştırılmıştır. TBE de yaklaşık 3-5 cm yürüyünceye kadar elektroforeze devam edilmiştir. Jel dikkatlice alınıp, görüntüleme cihazında (Bio-Rad, Hercules, CA) Quantity One 4,0 programı kullanılarak, görüntü boyutları ayarlandıktan sonra kaydedilmiştir. In vitro ortamda uygun primer ile çoğaltılmış PZR ürünleri mikrolitrede her 100 baz için 10 ng olarak hesaplanmıştır ve 25 μl dizi analizi için REFGEN (Ankara) firmasına gönderilmiştir. Dizi analizi sonrası sonuçlar, internet adresi kullanılarak BLAST programında değerlendirilmiştir Biyokimyasal Analizler Serum ve doku örneklerinin hazırlanması Balb/c fareleri anestezi altında vena cava inferior dan kan örnekleri alınmıştır (Şekil 3.5) xg de 4 ºC de 10 dakika santrfüj edilmiştir. Üst kısımda yer alan serumlar steril eppendorflara paylaştırılmıştır. Serumlar -80 C de depolanmıştır. Serum örneklerinde TAS (Total Antioksidan Status) ve TOS (Total Oksidan Status) değerleri Rel Assay Diagnostics Assay ticari kitleri ile spektrofotometrik yöntemle bakılmıştır. İntestinal sıvı elde edilme işlemi; çalışma için oluşturulan Balb/c farelerinden alınan ince bağırsak örnekleri (Şekil 3.6) PBS ile işleme tabi tutulmuştur. Bağırsak örnekleri marka doku parçalayıcı (Janke & Kunkel Ultraturrax T-25 (Almanya)) ile parçalanmıştır. MDA ve MPO sevieleri elisa kit ile ölçülmüştür xg de 4 C de 10 dakika santrfüj edilmiş ve üst sıvı alınarak -80 C de depolanmıştır. 43

57 Şekil 3.5. Balb/c faresinin anestezi altında vena cava inferior dan kan alımı Şekil 3.6. Balb/c farelerinin ince bağırsak örneğinin alınması 44

58 Total antioksidan statüsü analizi Standart, kör ve örnekler hücrelerin içine 30 µl eklendi ve üzerine 500 µl fosfat asetat tamponu eklenmiştir ve iyice karışıtırılmıştır. 30 saniye 37 C inkübasyon sonrasında A1 okunmuştur (660nm). Okuma işleminden sonra her kuyucuğun üzerine 75 µl Prochromogen çözeltisi eklenmiş ve iyice karıştırılmıştır. 5 dk 37 C inkübasyon sonrasında A2 okunmuştur (660 nm). Sonuçlar mmol/l olarak verilmiştir (Erel, 2004). A2-A1=Delta Abs (Standart yada örnekteki değişim) Sonuç= (delta su delta örnek) / (delta su delta standart) Birim= mmol / L Toplam oksidan statüsü analizi Standart, kör ve örnekler her hücreye 75 µl eklendi ve üzerine 500 µl H2SO4 (25mM, ph1.75) tampon çözeltisi eklenmiştir. 30 saniye 37 C inkübasyon sonrasında A1 okunmuştur (530 nm). Okuma işleminden sonra her kuyucuğun üzerine 25 µl Prochromogen çözeltisi eklenmiş ve iyice karıştırılmıştır. 5 dk 37 C inkübasyon sonrasında A2 okunmuştur (530 nm). Sonuçlar µmol/l olarak verilmiştir (Erel, 2005). A2-A1=Delta Abs (Standart yada örnekteki değişim) Sonuç = (delta örnek) / (delta standart) * 10 µmol/l Birim= µmol/l Malondialdehit analizi 30 ml konsantre yıkama tamponuna 750 ml distile suda çözündürülmüştür. Standart g de 1 dakika santrifüj edilmiştir. Üzerine 1 ml referans standart ve örnek dilüsyonu eklenmiştir. 10 dakika boyunca çalkalandı ve pipetle karışım karıştırılmıştır. Hazırlanan stok çözeltiden 0,5 ml alınır ve 45

59 referans standart ve örnek dilüsyonu 0,5 ml aktarılmıştır ve bu şekilde dilüsyonlar devam ettirilmiştir. Standart, kör, örnekler ve referans standart ve örnek dilüsyonu kuyucuklara 50 µl eklenmiştir. Kuyucukların üzerine 50 µl Biotinylated Detection Ab eklenmiştir ve kapatıldıktan sonra hafifçe sallanmıştır. 45 dakika 37 ºC de inkübe edilmiştir. Tüm hücreler havalandırılmıştır ve 350 µl yıkma tamponu ile 3 kez yıkanmıştır. Her yıkama arası 1 dakika beklenmiştir. Yıkamadan sonra her bir hücreye 100 µl HRP ilave edilmiş ve üzeri kapatılmıştır. 30 dakika 37 ºC de inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile 5 kez yıkanmıştır. Yıkama işleminden sonra her bir hücreye 90 µl substrat ilave edilmiş ve üzeri kapatılmıştır. 15 dakika 37 ºC inkübe edilmiştir. Hücrelere 50 µl durdurucu solüsyon ilave edilmiştir ve 450 nm de okuma yapılmıştır. Birimi ng/ml dir Miyeloperoksidaz analizi 30 ml konsantre yıkama tamponuna 750 ml distile suda çözündürülmüştür. Standart g de 1 dakika santrifüj edilmiştir. Üzerine 1 ml referans standart ve örnek dilüsyonu eklenmiştir. 10 dakika boyunca çalkalandı ve pipetle karışım karıştırılmıştır. Hazırlanan stok çözeltiden 0,5 ml alınır ve referans standart ve örnek dilüsyonu 0,5 ml aktarılmıştır ve bu şekilde dilüsyonlar devam ettirilmiştir. Standart, kör, örnekler ve referans standart ve örnek dilüsyonu kuyucuklara 100 µl eklenmiştir. Kuyucukların üzerine 100 µl Biotinylated Detection Ab eklenmiştir ve kapatıldıktan sonra hafifçe sallanmıştır. 90 dakika 37 ºC de inkübe edilmiştir. Tüm hücreler havalandırılmıştır ve 350 µl yıkma tamponu ile 3 kez yıkanmıştır. Her yıkama arası 1 dakika beklenmiştir. Yıkamadan sonra her bir hücreye 100 µl HRP ilave edilmiş ve üzeri kapatılmıştır. 30 dakika 37 ºC de inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile 5 kez yıkanmıştır. Yıkama işleminden sonra her bir hücreye 90 µl substrat ilave edilmiş ve üzeri kapatılmıştır. 15 dakika 37 ºC inkübe edilmiştir. Hücrelere 50 µl durdurucu solüsyon ilave edilmiştir ve 450 nm de okuma yapılmıştır. Birimi pg/ml dir. 46

60 log kob/ml 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Kefir ve Gaita Örneklerinin Mikroflora İçerikleri Fareler her iki kefir ile beslenmeden önce, kefirlerde bulunan mikroflora öncelikle belirlenmiş ve doğal kefir danesinden yapılan kefirin ve starter kefir kültüründen yapılan kefirin mikroorganizma içeriği Şekil 4.1 de gösterilmiştir. Kefir danesi ile yapılan kefir Starter kültür ile yapılan kefir 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 A B C D E F Kefir danesi ile yapılan kefir 10,54 10,62 5,69 9,71 9,37 10,27 Starter kültür ile yapılan kefir 8,40 8,76 2,50 8,25 7,78 9,20 Şekil 4.1. Doğal dane kefiri ve starter kültür kefiri mikroflorası A:Lactobacillus spp., B:Kok grubu, C:Toplam Maya., D:Lactobacillus acidophilus, E:Bifidobacterium spp., F: Toplam mezofilik aerob bakterileri Kefir danesi ile yapılan kefirin mikroorganizma içeriği starter kültür ile yapılan kefirden mikroorganizma içeriğinden (P<0,05) önemli düzeyde yüksek bulunmuştur. Doğal kefir danesi kullanılarak üretilen kefirin Lactobacillus spp. içeriği 10,54 log kob/ml, starter kültür kullanılarak üretilen kefirin ise 8,40 log kob/ml olarak bulunmuştur. Diğer mikroorganizma içerikleride paralellik göstermektedir. Doğal kefir danesinden üretilen kefirin toplam maya içeriği (5,69 log kob/ml) dikkat çekici şekilde diğer kefirden üstünlük göstermektedir. Kefir danesinden elde edilen kefirin mikroorganizmalarının özellikle mayaların yüksek miktarda olmasının sebebi içerisinde bulunan kompleks floranın simbiyotik bir ilişki içerisinde yaşamasından düşünülmektedir. 47

61 Lactobacillus spp. log kob/gr Kefir danelerinde çeşitli bakterilere ek olarak, bakteriler ile simbiyotik bir ilişki içerisinde bulunan çeşitli maya popülasyonu bulunmaktadır (Simova vd., 2002; Witthuhn vd., 2004; Marsh vd., 2013). Doğal kefir danesinde yer alan mayaların son yıllarda potansiyel probiyotik özellikleri ile ilgili çalışmalar yapılmaktadır (Liu vd., 2012; Zhuang vd., 2012; Diosma vd. 2014). Kefir danesi ve starter kültür kullanılarak üretilen kefirlerin L. acidophilus ve Bifidobacterium spp. içerikleri sırasıyla 9,71; 8,25 ve 9,37; 7,78 olarak tespit edilmiştir. Daha önce yapılan çalışmalarda da belirtildiği üzere memeli hayvanların bağırsak sisteminde kompleks bakteri ekosistemi barındırmaktadır (Moore ve Holdeman, 1974; Akira vd., 1998; Verdua vd., 1999). 2 hafta süreyle her iki kefirle beslnen GK, CK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin fekal mikroflorasında yer alan Lactobacillus spp. log kob/gr içeriği Şekil 4.2 de gösterilmiştir ,5 10 9,5 9 8,5 CK GK SK CK 9,10 9,45 9,01 8,96 8,98 9,19 8,86 8,87 GK 9,12 9,53 9,40 9,81 10,45 9,65 9,85 9,75 SK 9,15 8,93 9,15 8,97 8,99 9,28 8,71 8,27 Gün Şekil 4.2. CK, GK ve SK gruplarının fekal Lactobacillus spp. içeriği CK grubunda bulunan fare gaitalarında Lactobacillus spp. içeriği 0., 7. ve 15. günlerde sırasyıyla 9,10; 8,96; 8,87 log kob/gr olarak belirlenmiştir. Günler arası değişim istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0,05). 48

62 Kefir danesi kullanılarak üretilen kefir ile beslenen grubun Lactobacillus spp. içeriği gavaj uygulama öncesi 8,86 log kob/gr iken 15. gün sonunda 9,75 log kob/gr belirlenmiştir. GK grubunun fekal Lactobacillus spp. içeriği 9. günde 10,45 log kob/gr (maksimum) sayılmıştır (P<0,05). GK grubunun fekal Lactobacillus spp. miktarındaki artış dane kefir ile yapılan kefirin florasında yer alan Lactobacillus spp. miktarının yüksek olması (10,54 log kob/gr) ve çok çeşitli olmasının kanıtıdır. Fekal floradaki bu artış dane kefirinde bulunan Lactobacillus spp. potansiyel probiyotik özelliği taşıdığı düşünülmektedir. SK grubunda son günde gavaj öncesi miktardan düşük olmasının sebebi kontrol gurubundaki azalışı da göz önünde bulundurarak, starter kültür kefiri içerisinde bulunan Lactobacillus spp. içeriğinin az ve çeşitliliğinin kısıtlı olduğu düşünülebilir. Benzer bir çalışmada kefir danelerinden izole ettikleri Lactobasillus kefiri CIDCA 8348, farelere gavaj yolu ile verilmiş ve fekal Lactobacillus spp. miktarını 1log kob/gr arttırmıştır (P<0,05) (Carasi vd., 2015). GK, CK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin fekal mikroflorasında yer alan kok grubu log kob/gr içeriği Şekil 4.3 te gösterilmiştir. 49

63 Kok grubu log kob/gr 11 10,5 CK GK SK 10 9,5 9 8,5 8 7, CK 8,90 8,60 8,50 8,97 8,94 8,61 8,95 8,99 GK 8,87 9,57 9,23 9,80 10,14 9,41 9,94 10,04 SK 8,98 8,67 8,68 8,57 8,77 7,89 8,11 8,18 Gün Şekil 4.3. CK, GK ve SK gruplarının fekal kok grubu içeriği CK örneklerinde kok grubunda mikroorganizma içeriği 0., 7. ve 15. günlerde sırasıyla 8,90; 8,97; 8,99 olarak tespit edilmiştir. Şekil 4,3 te görüldüğü gibi GK grubunun gavaj uygulama öncesi fekal florası en düşük kok grubu sayılmıştır. Fakat son gün GK grubunun fekal kok grubu içeriği en yüksek 10,04 log kob/gr olarak sayılmıştır. GK grubu fekal kok grubu içeriği 9. günde 10,14 log kob/gr (maksimum) sayılmıştır. GK grubunda fekal florasının kok grubu miktarındaki artış dane kefiri florasında bulunan kok grubu potansiyel probiyotik olduğunu gastrointestinal sistemde canlı kaldıklarını kanıtlamaktadır. SK grubu farelerin gavaj uygulama öncesi fekal florasına kok grubunda 8,98 log kob/gr iken son gün 8,18 log kob/gr sayılmıştır. Bu düşüş kontrol grubunu da göz önünde bulundurularak kok grubu içeriği starter kefirde 8,76 log kob/gr bulunmakta ve miktarının düşük olması fekal florayı olumlu yönde etkilemediği düşünülebilir. Laktobasil ve kok grubunda kontrol grubunda güne bağlı olarak görülen azalma stress faktörü olarak yorumlanabilir. Stres altında konakçı bağırsak florasının 50

64 Lactobabacillus acidophilus log kob/gr değiştiği çalışmalarda belirtilmektedir (Michael vd., 2011; Dinan ve Cryan, 2012; Jane ve Karen-Anne, 2013). GK, CK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin fekal mikroflorasında yer alan Lactobacillus acidophilus log kob/gr içeriği Şekil 4.4 te gösterilmiştir. 10,5 10,0 CK GK SK 9,5 9,0 8,5 8, CK 8,85 8,80 9,07 9,20 8,93 8,85 9,00 9,00 GK 8,82 9,37 9,31 9,45 10,00 9,33 9,46 9,86 SK 8,83 8,39 9,28 9,09 9,08 8,78 8,69 8,79 Gün Şekil 4.4. CK, GK ve SK gruplarının fekal Lactobabacillus acidophilus içeriği CK grubunda bulunan fare gaitalarında Lactobacillus acidophilus içeriği 0., 7. ve 15. günlerde sırasıyla 8,85; 9,20; 9,00 log kob/gr olarak belirlenmiştir. Son gün, ilk günkü mikroorganizma içeriğinden önemli düzeyde artmamıştır (p>0,05). Balb/c farelerinin fekal florasında Lactobacillus acidophilus içeriği 9.5 log kob/gr olarak bulmuşlardır. 15. günde fekal florasında Lactobacillus acidophilus içeriği karşılaştırıldığı zaman GK grubunda 9,86 log kob/gr SK grubunda 8,79 log kob/gr belirlenmiştir. GK grubu farelerin fekal maksimum L. acidophilus içeriği 9. günde 10 log kob/gr olarak belirlenmiştir. GK grubu farelerin gavaj uygulama öncesi fekal L. acidophilus içeriği ile son gün karşılaştırıldığı zaman; bu artış istatistiksel olarak anlamlı bir artma tespit edilmiştir (P<0,05). GK grubunda bulunan L. 51

65 Bifidobacterium spp. log kob/gr acidophilus un fekal florasındaki artışı potansiyel probiyotik olduğu düşünülmektedir. SK grubu farelerinin fekal florasında bulunan L. acidophilus içeriği gavaj uygulama öncesi ve son gün karşılaştırıldığı zaman gözlemlenen artış istatistiksel olarak önemli düzeyde değildir (P>0,05). Bunun sebebi olarak doğal mikroorganizma yapısı olmamasından kaynaklandığı olabilir. GK, CK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin fekal mikroflorasında yer alan Bifidobacterium spp. log kob/gr içeriği Şekil 4.5 te gösterilmiştir. Tez çalışmamızda MRS-NNLP ve RCA agar olmak üzere iki farklı besiyer kullanılmıştır. Sonuçlar birbiriyle paralellik göstermektedir. Araştırma bulgularımızda RCA agar besiyerinde elde ettiğimiz veriler sunulmuştur. 10,0 9,5 CK GK SK 9,0 8,5 8,0 7,5 7, CK 8,20 8,15 8,22 8,68 7,87 7,69 8,26 8,26 GK 8,08 8,24 8,89 9,12 9,31 9,34 8,83 8,90 SK 8,10 7,49 8,43 8,08 7,88 7,45 8,01 8,01 Gün Şekil 4.5. CK, GK ve SK gruplarının fekal Bifidobacterium spp. içeriği Araştırmamızda probiyotik özellikli mikroorganizmaların fekal floradaki değişimi gastrointestinal sistemde canlı kaldıklarını gösterdikleri için çok önemlidir. Balb/c farelerinde fekal florasında Bifidobacterium spp. içeriğini 9,3 log kob/gr olarak tespit etmişlerdir (Akira vd., 1998). CK, GK ve SK gruplarında 0. gün Bifidobacterium spp. içeriği 8,20; 8,08; 8,10 log kob/gr arasında değiştiği 52

66 Maya log kob/gr 7. günde GK ve SK örneklerinde sırasıyla 9,12; 8,08 log kob/gr olarak belirlenmiştir. Şekil 4.5 te görüldüğü gibi CK ve SK gruplarında gavaj uygulama öncesi (0. gün) ve 3. gün de ki fekal florada bulunan Bifidobacterium spp. içeriği azalmış. Fakat GK grubunda bulunan farelerin fekal Bifidobacterium spp. içeriğinde artış gözlemlenmiştir. Bunun sebebinin kefir danesinden elde edilen kefiri Bifidobacterium spp. fekal florada artış etkisini diğer mikroorganizmalarda olduğu gibi kendini göstermiştir. GK grubunda gavaj uygulama öncesi 8,08 log kob/gr olan Bifidobacterium spp. içeriği son gün 8,90 log kob/gr olmuştur (P<0,05). GK grubunda fekal Bifidobacterium spp. içeriği 9. günde 9,31 log kob/gr (maksimum) olarak sayılmıştır. Bu veriler gösteriyor ki dane kefiri florasında bulunan Bifidobacterium spp. gastrintestinal sistemde canlı kalarak fekale kadar ulaşmıştır. SK grubunda son gündeki gavaj uygulama öncesi fekal Bifidobacterium spp. içeriğindeki artış gözlemlenmemiştir. Bunun sebebinin starter kültür kefiri mikroflorasında yer alan Bifidobacterium spp. içeriğinin yeteri kadar yüksek olmadığını gösteriyor. GK, CK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin fekal mikroflorasında yer alan maya içeriği log kob/gr Şekil 4.6 da gösterilmiştir. 8,0 6,0 CK GK SK 4,0 2,0 0, CK 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 GK 0,00 4,58 4,23 5,09 4,98 4,96 6,64 6,50 SK 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Gün Şekil 4.6. CK, GK ve SK gruplarının fekal maya içeriği 53

67 Diosma vd. (2014), araştırmalarında Balb/c farelerinin fekal florasında mayaların olmadığını tespit etmişler. Kefirden izole ettikleri K. marxianus CIDCA 8154 gavaj yoluyla verdikleri Balb/c farelerinde maksimum fekal maya miktarının 7. günde 10 7 kob/gr olarak tespit etmişlerdir. Tüm gruplarda gavaj verimi öncesi fekal maya içeriği tespit edilmemiştir. CK ve SK gruplarında maya içeriği 15 gün boyunca aynı devam etmiştir. Starter kültürden elde edilen kefirde bulunan 2,50 log kob/ml maya fekalde tespit edilmemiştir. Bunun sebebi maya miktarının kısıtlı olması veya probiyotik özelliğini taşımadığı düşünülmektedir. Probiyotik mikroorganizmaların özelliklerinden biri gastrointestinal sistemde canlı kalma yeteneğidir (Guarner ve Schaafsma, 1998; Harmsen vd., 2000; Ewaschuk ve Dieleman, 2006). GK grubu 3. gün 4,58 log kob/gr, 7. gün 5,09 log kob/gr ve 15. gün 6,50 log kob/gr olarak önemli düzeyde artış tespit edilmiştir (P<0,05). Kefir danesinden elde edilen kefirde bulunan 5,69 log kob/ml maya fekale kadar ulaşmış, gastrointestinal sistemde canlı kalmıştır. Yapılan çalışmalarda kefir danelerinde, Saccharomyces spp., Kluyveromyces spp. ve Candida spp. gibi mayalar belirtilmektedir (Angulo vd., 1993; Marquina vd., 2002; Simova vd., 2002; Diosma vd., 2014). Projemizde çok dikkat çekici GK grubu fekal maya içeriği ilk günden itibaren bağırsak mikroflorasına yerleştiği ve 15. güne kadar maya içeriğinde P<0,05 önemli düzeyde artma tespit edilmiştir. Araştırmamızda maya içeriğini belirleme aşamasında Şekil 4.7 de görülen CK ve SK örneklerinde küf gözlemlenmiş, GK örneğinde ise kefir danelerinden üretilen kefirde bulunan mayalar gözlemlenmiştir. Maya-Küf besiyeri petrilerinde görülen küfler spesifik primer yardımıyla PZR metodu ile çoğaltılarak Refgen Biyoteknoloji Enstitüsünde yapılmıştır. Petri kaplarında görülen küf Trichoderma koningi olarak tanımlanmıştır. Starter kültür kullanılarak üretilen 54

68 kefir ile beslenen farelerin bağırsak florasında Trichoderma koningii yi inhibe etmediği tespit edilmiştir. GK grubunun fekal florasında Trichoderma koningii inhibe edilmiştir. Şekil 4.7 de CK, SK ve GK gruplarının fekal maya-küf petri görüntüleri gösterilmitir. Doğal kefir danesinde yer alan mayaların potansiyel probiyotik özelliğe sahip olduğu bu çalışma ile yorumlanmıştır. Doğal kefir danesi mikroorganizma içeriği ve çeşitliliğinin önemi bir kez daha vurgulanmıştır. Şekil 4.7. CK (sol, 4 petri), SK (orta, 6 petri), GK (sağ, 6 petri) petrilerde mayaküf görünümü GK, CK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin fekal mikroflorasında yer alan toplam mezofilik aerob bakteri log kob/gr içeriği Şekil 4.8 te gösterilmiştir. 55

69 Toplam mezofilik bakteri log kob/gr 10,50 10,00 9,50 9,00 8,50 8,00 7, CK 9,35 9,26 8,54 9,17 8,68 8,35 8,45 8,45 GK 9,25 9,60 9,19 9,50 10,03 9,32 9,67 9,77 SK 9,28 8,87 9,67 8,98 8,54 7,97 8,59 8,59 Gün CK GK SK Şekil 4.8. CK, GK ve SK gruplarının fekal toplam mezofilik aerob bakteri içeriği Fekal toplam mezofilik aerob bakteri içeriği diğer mikroorganizmalar (Lactobacillus spp., Lactococcus spp., bazı mayalar gibi) ile paralel sonuç göstermektedir. CK ve SK gruplarında bulunan farelerin fekal toplam mezofilik aerob bakteri içeriği değerlenirildiğinde 0. ve 15. günlerde sırasıyla 9,35; 9,28 ve 8,45; 8,59 log kob/g olarak belirlenmiştir. GK grubunun fekal florası toplam mezofilik aerob bakteri içeriği 9. günde 10,03 log kob/g belirlenmiştir. GK örneklerinde 0. ve 15. günlerde toplam mezofilik aerob bakteri içeriği 9,25 ve 9,77 log kob/gr olarak belirlenmiştir. GK, CK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin fekal mikroflorasında yer alan Enterobacteriaceae log kob/gr içeriği Şekil 4.9 da gösterilmiştir. 56

70 Enterobacteriaceae log kob/g 9,00 8,50 8,00 7,50 CK GK SK 7, CK 8,34 8,29 7,53 8,17 7,67 7,69 8,03 8,23 GK 8,38 8,22 8,28 8,31 8,53 7,75 8,35 8,56 SK 8,42 7,90 8,70 7,68 8,11 7,58 8,17 8,47 Gün Şekil 4.9. CK, GK ve SK gruplarının fekal Enterobacteriaceae içeriği Tüm örneklerde 0. ve 15. günlerde Enterobacteriaceae içeriği değerlendirmesinde önemli bir artış tespit edilmemiştir (P>0,05). Bizim yaptığımız çalışmada Enterobacteriaceae içeriğinin anlamlı bir şekilde azalma veya artış meydana geldiği gözlemlenmemiştir. Kalın bağırsakta bulunan Escherichia coli, Clostridia ve Bacteriodes gibi patojen mikroorganizmalar bağırsak florasını dengede tutmaktadır (Ziemer ve Gibson 1998). Denge floranın bozulmaması için Enterobacteriaceae populasyonunun azalmadığı düşünülebilir. Enterobacteriaceae populasyonu yapılan çalışmada L. rhamnosus ATCC 9595 verilen farelerde fekal florada azaldığını bulmuşlardır (Millette, 2008). 57

71 4.2. Biyokimya Analizlerinin Sonuçları GK, CK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin serum TAS ve TOS değerleri Şekil 4.10 da gösterilmiştir. 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 TAS (toplam antioksidan statüsü) (mmol / L) TOS (toplam oksidan statüsü) (µmol/l) CK 2,19 9,52 GK 3,92 9,26 SK 1,79 11,90 CK GK SK Şekil CK, GK ve SK gruplarının serum TAS ve TOS değerleri Şekil 4.10 da GK grubu farelerin serum örneklerinde TAS değerleri CK ve SK grubu farelerden yüksek olduğu tespit edilmiştir (P<0,05). Bunun sebebi kefir danesi ile üretilen kefirin antioksidan etkisinin yüksek olmasıdır. Kök Taş vd., (2013), oksijen radikal absorbans kapasite analizine göre kefir danesinden elde edilen kefirin 7,01 mmol/ml TE olarak tespit etmişlerdir. TOS değerlerinin toksik madde girmediğinden dolayı düşük çıktığı yorumlanabilir. SK grubunda bulunan farelerde antioksidan kapasitesini arttırmadığı tespit edilmiştir. Starter kefirde bulunan mikroorganizmaların antioksidan etki oluşturmadığı tespit edilmiştir. Tüm örneklerde TAS sonuçlarına göre önemli düzeyde farklılık olduğu belirlenmiştir (P<0,05). 58

72 Toksik maruz kalma sonrası oksidatif stres ile nefrotoksisite arasındaki ilişkiyi araştıran deneysel çalışmalarda, oksidatif stres varlığında TOS değeri önemli derecede artarken TAS değeri önemli ölçüde azaldı (Bozkurt vd., 2012; Rifaioglu vd., 2015). TAS ve TOS değerlerinde diğer çalışmalarda gösterildiği gibi bir denge olduğu bulunmuştur (Turan vd., 2014; Eren vd., 2015). Bizim bulduğumuz bulgular yapılan çalışmalar ile paralellik göstermektedir. CK, GK ve SK örneklerinde sırasyıla TOS değerleri 9,52; 9,26 ve 11,90 µmol/l olarak tepit edilmiştir. CK, GK ve SK gruplarındaki Balb/c farelerinin ince bağırsak doku örneğinde MDA ve MPO değerleri Şekil 4.11 de gösterilmiştir. İnce bağırsak dokularının starter kültür kullanılarak üretilen kefir ile beslenen fare bağırsaklarının yıkma sırasında PBS nin şırınga ile verilirken bağırsakların patladığı gözlemlenmiştir. Fakat basınç testi uygulanmamıştır. 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 MDA (Malondialdehit) (ng/ml) MPO (Miyeloperoksidaz) (pg/ml) CK 0,76 0,31 GK 0,83 0,38 SK 1,27 0,57 CK GK SK Şekil CK, GK ve SK gruplarının doku örneğinde MDA ve MPO değerleri CK, GK ve SK bağırsak doku örneklerinde MDA değerleri sırasyla 0,76; 0,83 ve 1,27 ng/ml olarak tespit edilmiştir. SK örneğinin MDA değeri istatiksel olarak anlamlı seviyede yüksek bulunmuştur (P<0,05) 59

73 Şekil 4.11 de görüldüğü gibi SK grubu MDA ve MPO değerleri diğer gruplardan yüksek seviyededir. SK grubunun MPO değerlerinin yüksek olması sonucunda oluşan hidroksil radikali ile MDA değerinin yüksek çıkmasına sebep olmuş ve lipit peroksidasyonu olduğunu göstermektedir. MDA değeri GK grubunda düşük çıkmasının sebebi kefir danesinden elde edilen kefirin antioksidan etkisinden kaynaklanmaktadır. in vivo çalışmalarında kefir danesinden elde edilen kefirin MDA değerini düşürdüğünü ve bu düşüşün antioksidan özelliğinden kaynaklandığı belirtilmiştir (Güven vd., 2003). CK, GK ve SK bağırsak doku örneklerinin MPO değerleri sırasıyla 0,31; 0,38 ve 0,57 pg/ml olarak tespit edilmiştir. SK örneği istatistiksel olarak anlamlı seviyede yüksek bulunmuştur (P<0,05). SK grubunun MPO değerinin yüksek olması ince bağırsakta inflamasyon sonucu olduğu şeklinde yorumlanmuştır. Karaciğer dokularında oksidan hasarın parametresi olan MDA değerlerinde iskemi reperfüzyon grubunda kontrol gruba göre arttığını ve dokuda reperfüzyon hasarının önlenemediği şeklinde yorumlamışlar. Nötrofil infiltrasyon ve aktivasyon parametresi olan MPO değerlerinde de iskemi reperfüzyon grubunda yükselmiş ve bu durumu inflamasyonun belirgin bir şekilde arttığını gösteren bir sonuç olarak yorumlamışlar (Yardımcı, 2009). 60

74 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Araştırmamızda farklı mikroorganizma grupları değerlerilmiştir. 3. günde CK grubundaki fekal florasındaki azalış farelerin stres altında olduğunu göstermektedir. Fakat 3. günden sonra fareler stres olmayıp, flora dengeye ulaşmaktadır. 3. günde SK grubunda kontrol grubundaki fare fekal florası gibi azalış gözlemlenmiştir. Starter kültür kullanılarak üretilen kefir ile beslenen farelerin fekal florasını olumlu bir yönde arttırmadığı, içeriğinde bulunan mikroorganizmaların yeterli miktarda bulunmadığı veya potansiyel probiyotik özelliği göstermediği şeklinde yorumlanabilir. GK grubunun gavaj uygulamasının 3. gününde fekal florasında artış gözlemlenmiştir. Bunun sebebi, dane kefirinin içerisinde bulunan mikrofloranın çok çeşitli ve miktarının yüksek olmasıdır. Ayrıca mikroflorada yer alan mikroorganizmalar gastrointestinal sistemde canlı kalarak fekale kadar ulaştığı içerik açısından tespit edilmiştir. Kefir danesi kullanılarak üretilen kefirin mikroorganizmaları probiyotik özelliğe sahip olduğunun kanıtı olduğu düşünülmektedir. Fekalde bulunan mikroorganizmaların daha net anlaşılabilmesi için denatüre edilmiş gradyan jel elektroforezi, floresan in situ hibridizasyonun ve gerçek zamanlı PZR'nin bütünleşik kullanımı gibi kültürden bağımsız teknikler kullanılarak çalışılması önerilir. Probiyotik mikroorganizma içeriği araştırmasında rutin maya-küf sayımı sonuçlarının değerlendirilirken çok dikkat çekici bir sonuçla karşılanmıştır. CK ve SK gruplarında maya miktarının sayılamaması, starter kefirde yer alan mayaların yeterli miktarda bulunmaması veya potansiyel probiyotik özelliği taşımamasının göstergesi olduğu sonucu ile yorumlanmıştır. 3. günden itibaren GK grubunun fekal florasındaki mayaların gözlemlenmesi kefir danesinden üretilen kefirin maya içeriğinin gastrointestinal sistemi boyunca canlı kaldığını göstermekte ve bu mayaların potansiyel probiyotik özelliğine sahip olduğu düşünülmektedir. CK ve SK gruplarının fekal florasında bulunan insan patojeni Trichoderma koningii küfü GK grubu farelerin fekal florasında inhibe olmuştur. 61

75 Biyokimyasal analizlerde kefir danesi kullanılarak üretilen kefirin serum TAS değeri en yüksek edilmiş, MDA değerinin düşük olması antioksidan etkisinin olduğunu ve mikrofloranın potansiyel probiyotik özelliiği olduğunu göstermektedir. Starter kültür kullanılarak üretilen kefir ile beslenen farelerin ince bağırsak MPO değeri CK dan yüksek olması inflamasyon olduğu yorumlanmıştır. Buradaki değişimlerin daha net anlaşılabilmesi için ince bağırsak dokularının histopatolojik görüntüleri, immün sistem gibi çalışmaların yapılması önerilir. Bu çalışma doğal kefir danesi kefirinin mikroflora zenginliğini ve potansiyel probiyotik özelliklerinin starter kültür kullanılarak üretilen kefire göre üstünlüklerini in vivo koşullarda belirlemiştir. Araştırma bulguları literatüre katkı sağlamıştır. Ayrıca birçok in vitro, in vivo ve klinik çalışmalara öncülük yapacağı düşünülmektedir. 62

76 KAYNAKLAR Ahmed, Z., Wang, Y.P., Ahmad, A., Khan, S.T., Nısa, M., Ahmad, H., Afreen, A., Kefir and Health A Contemporary Perspective. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 53, Akın, N., Starter kültür teknolojisi. Modern Yoğurt Bilimi ve Teknolojisi, Uğurer Tarım Yayınları, Damla Ofset, s , Konya. Akira, O., Yokshiyuki, M., Tsutomu, O., Sin-ichi, I., Takeo, M., Inhibition of polyposis in the small intestine of BALB/c mice by intestinal bacteria Cancer Letters, 131, Akkuş, I., Serbest radikaller ve fizyopatolojik etkileri. 1. Baskı, Mimoza Yayınları, Konya. Alm, L., Effect of fermentation on L(+) and D( ) lactic acid in milk. Journal of Dairy Research, 65, Angulo, L., Lopez, E., Lema, C., Mikroflora present in kefir grains of the galician region (North-West of Spain). Journal of Dairy Research, 60, Anonymous, Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. FAO/WHO, 1-4 October, 34p, Córdoba, Argentina. Aras, M., Altas, M., Motor, S., Dokuyucu, R., Yilmaz, A., Ozgiray, E., Seraslan, Y., Yılmaz, N., Protective effects of minocycline on experimental spinal cord injury in rats. Injury International Journal Care Incured, 46, Assadi, M.M., Pourahmad, R., Moazami, N., Use of isolated kefir starter cultures in kefir production. World Journal Microbiology and Biotechnology, 16, Ateş, G., Patır, B., Starter kültürlü tulum peynirinin olgunlaşması sırasında duyusal, kimyasal ve mikrobiyolojik niteliklerinde meydana gelen değişimler üzerine araştırmalar. Fırat Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Dergisi, 15(1), Beena, A., Prasad, V., Effect of yoğurt and bifidus yoğurt forti fied with skim milk powder condensed whey and lactose-hydrolysed condensed whey on serum cholesterol and triacyl glycerol levels in rats. Journal of Dairy Research, 64, Benno, Y., Sawada, K., Mitsuoka, T., The intestinal microflora of infants: composition of faecal flora in breast-fed and bottle-fed infants. Microbiology and Immunology, 28,

77 Bergillos-Meca, T., Costabile, A., Walton, G., Moreno-Montoro, M., Ruiz-Bravo, A., Dolores Ruiz-Lopez, M., In vitro evaluation of the fermentation properties and potential probiotic activity of Lactobacillus plantarum C4 in batch culture systems. LWT Food and Sciences Technology, 60, Beshkova, D.M., Sımova, E.D., Sımov, Z.I., Frengova, G.I., Spasov, Z.N., Pure Cultures For Making Kefir. Food Microbiology, 19(5), Bottazzi, M.S., Bianchi, F., A note on scanning electron microscopy of microorganisms associated with the kefir granule. Journal of Applied Bacteriology, 48, Bozkurt, P., Kök Taş, T., Güzel-Seydim, Z., Geleneksel ve ticari olarak üretilen kefirlerin mikrobiyal içeriklerinin belirlenmesi. 1.Uluslar arası Adryatik ten Kafkaslar a Geleneksel Gıdalar Sempozyumu, Nisan, Tekirdağ, 330. Bozkurt, Y., Bozkurt, M., Turkcu, G., Sancaktutar, A.A., Soylemez, H., Penbegul, N., Caffeic acid phenethyl ester protects kidneys against acetylsalicylic acid toxicity in rats. Renal Failure, 34(9), Campos-Herrero, M.I., Bordes, A., Perera, A., Ruiz, M.C., Fernandez, A., Trichoderma koningii peritonitis in a patient undergoing peritoneal dialysis. Clinical Microbiology Newsletter, 18, Caramori, G., Papi A Oxidants and asthma. Thorax, 59, Carasi, P., Jacquot, C., Romanin, D.E., Elie, A.M., De Antoni, G.L., Urdaci, M.C., Serradell, M.A., Safety and potential beneficial properties of Enterococcus strains isolated from kefir. International Dairy of Journal, 39, Carasi, P., Racedo, S.M., Jacquot, C., Romanin, D.E., Serradell, M.A., Urdaci, M.C., Impact of Kefir Derived Lactobacillus kefiri on the Mucosal Immune Response and Gut Microbiota. Hindawi Publishing Corporation Journal of Immunology Research, 12. Carasi, P., Trejo, F.M., Pérez, P.F., De Antoni, G.L., Serradell, M.D.L., Surface proteins from Lactobacillus kefir antagonize in vitro cytotoxic effect of Clostridium difficile toxins. Anaerobe, 18(1), Cerna, J., Hrabova, H., Possibilities of biological enrichment of fermented milk beverage with vitamins. XXI International Dairy Congress, 1, Cevikbas, A., Yemni, E., Ezzedenn, F.W., Yardimici, T., Cevikbas, U., Stohs, S., Antitumoural antibacterial and antifungal activities of kefir and kefir grain. Phytotherapy Research, 8,

78 Chen, H.C., Wang, S.Y., Chen, M.J., Microbiological study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent methods. Food Microbiology, 25, Chen, Y., Lee, T., Hong, W., Hsieh, H., Chen, M., Effects of Lactobacillus kefiranofaciens M1 isolated from kefir grains on enterohemorrhagic Escherichia coli infection using mouse and intestinal cell models. Journal of Dairy Research, 96, Cogan, T.M., Accolas, J.P., Dairy Microbiology- The microbiology of milk, vol 1., 2nd Edition, Robinson, R. K. (ed), Elsevier Applied Science, pp , London. Corbo, M.R., Albenzio, M., De Angelis, M., Sevi, A., Gobbetti, M., Microbiological and biochemical properties of Canestrato pugliese hard cheese supplemented with Bifidobacteria. Journal of Dairy Science, 84, Correa Franco, M., Golowczyc, M.A., DeAntoni, G.L., Pérez, P.F., Humen, M., Serradell, M., Administration of kefir-fermented milk protects mice against Giardiaintestinalis infection. Journal of Medicinal Microbiology, 62, Coşkun, T., Pro-, Pre- ve Sinbiyotikler, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 49(2), Çevikbaş, A., Yemni, E., Ezzedenn, F. W., Yardmcı, T., Çevikbas, U., Stohs, S.J., Antitumoural, antibacterial and antifungal activities of kefir and kefir grain. Phytotherapy Research, 8, Dahiya, RS., Speck, M.L., Hydrogen peroxide formation by Lactobacilli and its effect on Staphylococcus aureus. Journal of Dairy Science, 51, Daigle, A., Roy, D., Belanger, G., Vuillemard, J.C., Production of probiotic cheese (Cheddar-like cheese) using enriched cream fermented by Bifidobacterium infantis. Journal of Dairy Science, 82, Darukaradhya, J., Phillips, M., Kailasapathy, K., Selective enumeration of Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp., starter lactic acid bacteria and non-starter lactic acid bacteria from Cheddar cheese. International Journal of Dairy, 16(5), Darukaradhya, M., Phillips, K., Kailasapathy, J., Selective enumeration of Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp., starter lactic acid bacteria and non-starter lactic acid bacteria from Cheddar cheese. International Journal of Dairy, 16(5), Dave, R.I., Shah, N.P., Evaluation of media for selective enumeration of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus, 65

79 Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Journal of Dairy Science, 79, DeMan, J.C., Rogosa, M., Sharpe, M.E., A Medıum For The Cultıvatıon Of Lactobacıllı. Applied Bacteriology, 23, Demirci, M., Süt mikrobiyolojisi ve katkı maddeleri. VI. Süt ve Süt Ürünleri Sempozyumu Tebliğler Kitabı, Rebel Yayıncılık, s , Tekirdağ. Diosma, G., Romanin, D.E., Rey-Burusco, M.F., Londero, A., Garrote, G.L., Yeasts from kefir grains: isolation, identification, and probiotic characterization. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 30, Dobson, A., O Sullivan, O., Cotter, P.D., Ross, P., Hill, C., High-throughput sequence-based analysis of the bacterial composition of kefir and an associated kefir grain. Federation of European Microbiologial Societies Microbiology Letters, 320, Dominguez-Bello, M.G., Costello, E.K., Contreras, M., Magris, M., Hidalgo, G., Fierer, N., Knight, R., Delivery mode shapes the acquisition and structure of the initial microbiota across multiple body habitats in newborns. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 107, Druzhinina, I.S., Kopchinskiy, A.G., Kubicek, C.P., The first 100 Trichoderma species characterized by molecular data. Mycoscience, 47, Eleni, L., Paraskevi, V., Anagnostis, A., Jonathan, R., In vitro evaluation of potential antimicrobial synbiotics using Lactobacillus kefiri isolated from kefir grains. International Journal of Dairy, 45, Erel, O.A., novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical cation. Clinical Biochemistry, 37(4), Erel, O. A., new automated colorimetric method for measuring total oxidant status. Clinical Biochemistry, 38, Eren, Y., Dirik, E., Neselioglu, S., Erel, O., Oxidative stress and decreased thiol level in patients with migraine cross-sectional study. Acta Neurolagica Belgica, 115, Ergin, M., Dundar, Z.D., Kılınc, İ., Colak, T., Oltulu, P., Girisgin, A.S., Alpha- Amanitin Poisoning, Nephrotoxicity and Oxidative Stress An Experimental Mouse Model. Iranian Red Crescent Medical Journal, 17(8),

80 Ertekin, B., Yağ ikame maddeleri kullanımının kefir kalite kriterleri üzerine etkisi. Yüksek Lisans Tezi, Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Isparta, 102. Escudero Gil, M.R., Pino Corral, E., Munoz, R., Pulmonary mycetoma cause by Trichoderma viride. Actas Dermosifiliogr, 67, Evrensel, S.S., Aynalı, N., Süt endüstrisinde starter kültür kullanımı. Gıda Sanayi, 47, Ewaschuk, J.B., Dieleman, L.A., Probiotics and prebiotics in choronic inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology, 12, FAO/WHO, Working Group. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. London, Ontario. Farnworth, E.R., Mainville, I., Kefir-AFermentedMilkProduct. In: Farnworth, E. R. (2th ed.), Handbook of Fermented Functional Foods (2 ed). CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton, London, New York, p Ferreira, I.M., Pinho, O., Monteiro, D., Faria, S., Cruz, S., Perreira, A., Roque, A.C., Tavares, P., Effect of kefir grains on protolysis of major milk protins. Journal of Dairy Science, 93, Foulquie- Moreno, M.R., Sarantinopoulos, P., Tsakalidou, E., De Vuyst, L., The role and application of enterococci in food and health. International Journal of Food Microbiology, Frengova, G.I., Simova, E.D., Beshkova, D.M., Simov, Z.I., Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria of kefir grains. Zeitschrift für Naturforschung, 57, Fuller, R., Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, 66, Fung- Tonc, J.C., Huczko, E., Minassian, B., Bonner, D.P., in vitro activity of a new oral triazole. Antimicrobial Agents Chemotherapy, 42, Furukawa, N., Iyama, R., Takahashi, T., Yamanaka, Y., Effect of oral administration of water soluble fraction from kefir grain on antibody production in mice. Animal Science Technology (Japan), 63, Furukawa, N., Matsuoka, A., Takahashi, T., Yamanaka, Y., Effects of fermented milk on the delayed type hypersensitivity response and survival day in mice bearing meth-a. Animal Science and Technology, 62,

81 Furukawa, N., Matsuoka, A., Yamanaka, Y., Effects of orally administered yogurt and kefir on tumor growth in mice. Journal of Japanese Society of Nutrition and Food Science, 43(6), Furukawa, N., Takahashi, T., Yamanaka, Y., Effects of supernatant of Peyer s Patch cell culture with kefir grain components on the mitogenic response of thymocyte and splenocyte in mice. Animal Science Technology (Japan), 67, Gabriela, D., Romanin, D.E., Rey Brusco, M.F., Londero, A., Garrote, G.L., Yeasts from kefir grains: isolation, identification, and probiotic characterization. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 30, Ganzle, G.M., From gene to function, Metabolic traits of starter cultures for improved quality of cereal foods. International Journal of Food Microbiology, 134, Gao, J., Gu, F., Abdealla, N.H., Ruan, H., He, J., Investigation on Culturable icroflora in Tibetan Kefir Grains from Different Areas of China. Journal of Food Science, 77 (8), Gardiner, G., Ross, R.P., Collins, J. K., Fitzgerald, G., Stanton, C., Development of a probiotic Cheddar cheese containing human-derived Lactobacillus paracasei strains. Applied Environmental Microbiology, 64, Garofalo, C., Osimani, A., Milanovic, V., Aquilanti, L., De Filippis, F., Stellato, G., Bacteria and yeast microbiota in milk kefir grains from different Italian regions. Food Microbiology, 49, Garrote, G.L., Abraham, A.G., DeAntoni, G.L., Chemicaland microbiological characterisation of kefir grains. Journal of Dairy Research, 68, Giannoglou, M., Katsaros, G., Taoukis, P., Selective activation/inactivation of aminopeptidases of starter cultures of brine cheeses by high pressure and temperature. Food and Bioprocess Technology, 9(12), Gitto, E., Pellegroni, S., Gitto, P., Barberi, I., Reiter, RJ., Oxidative stress of the newborn in the pre- and postnatal period and the clinical utility of melatonin. Journal of Pineal Research, 46, Gronlund, M.M., Lehtonen, O.P., Eerola, E., Kero, P., Faecal microflora in healthy infants born by different methods of delivery Permanent changes in intestinal flora after cesarean delivery. Journal of Pediatric Gastroenterology Nutrition, 28,

82 Guarner, F., Schaafsma, G.J., Probiotics. International Journal of Food Microbiology, 39, Guarro, J,. Antolin-Ayala, M.I., Gene, J., Fatal case of Trichoderma harzianum infection in a renal transplant recipient. Journal of Clinical Microbiology, 37, Guldfeldt, L. U., Sørensen, K. I., Stroman, P., Behrndt, H., Williams, D., Johansen, E., Effect of starter cultures with a genetically modified peptidolytic or lytic system on Cheddar cheese ripening. International Dairy Journal, 11, Gurakan, G.C., Cebeci, A. Ozer H.B., Probiotic Dairy Beverages: Microbiology and Technology. In:"Development and Manufacture of Yogurt and Other Functional Dairy Products" Güven, A., Güven, A., Gülmez, M., The Effect of Kefir on the Activities of GSH-Px, GST, CAT, GSH and LPO Levels in Carbon Tetrachloride-Induced Mice Tissues. Journal of Veterinary Medicine, B 50, Güzel-Seydim, Z., Kök-Tas, T., Greene, A.K., Review: functional properties of kefir. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 51, Güzel-Seydim, Z.B., Dibekci, M., Cagdas, E., Seydim, A.C., Effect of kefir on Fusobacterium nucleatum in potentially preventing intestinal cancer. Functional Foods in Health and Disease, 6(7), Güzel-Seydim, Z.B., Seydim, A.C., Greene, A.K., Organic acids and volatile flavour components evolved during refrigerated storage of kefir. Journal of Dairy Science, 83, Güzel-Seydim, Z.B., Seydim, A.C., Grenee, A.K., Tas, T., Determination of antimutagenic properties of some fermented milks ıncluding changes in the total fatty acid profiles including CLA. Internatinal Journal of Dairy Technology, 59 (3), Güzel-Seydim, Z., Seydim, A., Greene, A., Bodine, A., Determination of organic acids and volatile flavor substances in kefir during fermentation. Journal of Food Composition Analysi, 13, Güzel-Seydim, Z.B., Studies on fermentative, microbiological and biochemical properties of kefir and kefir grains. Ph.D. Dissertation, Clemson University, Clemson, SC. Hamet, M.F., Londero, A., Medrano, M., Vercammen, E., Van Hoorde, K., Garrote, G.L., Application of culture-dependent and culture-independent methods for the identification of Lactobacillus kefiranofaciens in microbial consortia present in kefir grains. Food Microbiology, 36,

83 Hamet, M.F., Medrano, M., Pérez, P.F., Abraham, A.G., Oral administration of kefiran exertsa bifido geniceffecton BALB/c mice intestinal microbiota. Benefical Microbes, 7, Hansen, E.B., Commercial bacterial starter cultures for fermented foods of the future. International Journal of Food Microbiology, 78, 119, 131. Harmsen, H.J., Wildeboer-Veloo, A.C., Raangs G.C., Wagendorp, A.A., Klijn, N, Bindels, J.G., Welling, G.W., Analysis of intestinal flora development in breast -fed and formula -fed infants by using molecular identification and detection methods. Journal of Pediatric Gastroenterology Nutrition, 30, Havenaar, R., Huis Veld, J.H.J., The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease. Probiotics A general view, 1, Hill, C., Guarner, F., Reid, G., Gibson, G.R., Merenstein, D.J., Pot, B., Expert consensus document, the international scientific association for probiotics and prebiotics consensus statement on the scope and appropriate. Holzapfel, W.H., Enterococci in foods. Functional and safety aspects. International Journal of Food Microbiology, 88, Hoolihan, L.K., Prophylactic and therapeutic use of probiotics a review. Journal of the American Dietetic Association, 101, Hosono, A., Tanabe, T., Otani, H., Binding properties of lactic asid bacteria ısolated from kefir milk with mutagenic amino asid pyrolyzates. Milchwissenschaft, 45, Huang, Y., Wang, X., Wang, J., Wu, F., Sui, Y., Yang, L., 2013a. Lactobacillus plantarum strains as potential probiotic cultures with cholesterollowering activity. Journal of Dairy Science, 96, Huang, Y., Wu, F., Wang, X., Sui, Y., Yang, L., Wang, J., 2013b. Characterization of Lactobacillus plantarum Lp27 isolated from tibetan kefir grains: a potential probiotic bacterium with cholesterol-loweringeffects. Journal of Dairy Science, 96, Hugo, A., Kakisu, E., DeAntoni, G., Perez, P., Lactobacilli antagonize biological effect so fenterohaemorrhagic Escherichia coli in vitro. Letters Applied Microbiology, 46, Huseini, H.F., Rahimzadeh, G., Fazeli, M.R., Mehrazma, M., Salehi, M., Evaluation of wound healing activities of kefir products. Burns 38,

84 IDF, General Standard of Identity for Fermented Milks, Brussels: International Dairy Federation, 163. Ishibashi, N., Shimamura, S., Bifidobacteria: research and development in Japan. Food Technology, 47, Ismail, A.A., El-Nockrashy, S.A., Khorshid, M., Abeveragefrom separated buffalo milk fermented with kefir grains. International Journal of Dairy Technology, 36, Jane, A.F., Karen-Anne, M.N., Gut brain axis how the microbiome influences anxiety and depression. Trends in Neurosciences, 36(5), Jingrui, W., Zhuqing, X., Wei, T., Yongna, Z., Yanping, W., Isolation, Identification, and Potential Probiotic Characterization of One Lactococcus from Kefir Grain. Biotechnology, 24(5), Juffs, H.S., Babel, F.J., Inhibition of psychrotrophic bacteria by lactic cultures in milk stored at low Temperatuer. Journal of Dairy Science, 58, Jukic, M., Gregurek, L.J., Tratnik, L.J., Istrazivanje mikroflore radne kulture proizvedene od kefirnih zrnaca različitog podrijetla. Mljekarstvo, 51(2), Kander, O., Kunath, P., Lactobacillus kefir sp.nov, a component of the microflora of Kefir. Systematic and Applied Microbiology, 4, Kapoor, A.S., Kumar, P., Sharma, R., Mass multiplication and viability of Trichoderma harzianum vis-à-vis management of white rot of pea. Indian Phytopathology, 55, 374. Kapoor, A.S., Paul, Y.S., Singh, A., Integrated management of white rot and root rot-wilt disease complex of wheat. Indian Phytopathology, 59, Kayagil, F., Effect of traditional starter cultures on quality of cheese. Middle East Technical University, A Thesis of Master, pp. 9-41, Ankara. Kesmen, Z., Kacmaz, N., Determination of lactic microflora of kefir grains and kefir beverage by using culture-dependent and culture-independent methods. Journal of Food Science, 76, Khamnaeva, N.I., Tsyrenov, V.Z., Gongorova, V.S., Shalygina, A.M., Biosynthesis of biologically active substances in Kefir grains. Molochnaya Promyshlennost, 4,

85 Kılınç K, Kılınç A., Oksijen toksisitesinin aracı molekülleri olarak oksijen radikalleri. Hacettepe Tıp Dergisi, 33(2), Kleessen, B., Bunke, H., Tovar, K., Noack, J., Sawatzki, G., Influence of two infant formulas and human milk on the development of the faecal flora in newborn infants. Acta Paediatrica, 84, Kneifel, W., Mayer, H.K., Vitamin profiles of kefirsmade frommilks of different species. International Journal of Food Science Technology, 26, Koçak, C., Yetişmeyen, A., Atamer, M., Süt Endüstrisinde Starter Kültürler. Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Yayınları No:1362, Derleme: 62, Ankara. Kojic, M., Lozo, J., Begovic, J., Jovcic, B., Topisirovic, L.: Characterisation of lactoccoci isolated from homemade kefir. Archives of Biologial Science, 59, Koroleva, N.S., Starters for fermented milks, section 4: Kefir and kumys starters. Bulletin of the International Dairy Federation, 227, Koroleva, N.S., Technology of kefir and kumys. International Dairy Federation Bulletin, 22, Koroleva, N.S., Products prepared with lactic acid bacteria and yeasts. Page 159 in Therapeutic Properties of Fermented Milks. R. IC Robinson, ed. Elsevier Science Publications, New, York, NY. Korsak, N., Taminiau, B., Leclercq, M., Nezer, C., Crevecoeur, S., Ferauche, C., Short communication: evaluation of the microbiota of kefir samples using metagenetic analysis targeting the 16S and 26S ribosomal DNA fragments. Journal of Dairy Science, 98, Kök-Taş, T., Ekinci, Y., Guzel-Seydim, Z.B., Identification of Microbial Flora in Kefır Grains Produced in Turkey Using PCR. International Journal of Dairy Technology, 64, 1-6. Kurman, J.A., Fermented milks. Bulletin International Dairy Federation, 179, Kurman, J.A., Rašić, J.L.J., Kroger, M., Encyclopedia of Fermented Fresh Milk Products, An APV Book, New York. La Rivière, J.W., Kooiman, P., Schmidt, K., Kefiran, a novel polysaccharide produced in the kefir grains by Lactobacillus brevis. Archives für Mikrobiologie, 59,

86 Langhendries, J.P., Detry, J., Van Hees, J., Lamboray, J.M., Darimont, J., Mozin, M.J., Secretin, M.C., Senterre, J., Effect of a fermented infant formula containing viable bifidobacteria on the fecal flora composition and ph of healthy full-term infants. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 21, Larsen, F.O., Clementsen, P., Hansen, M., Maltbaek, N., Ostenfeldt-Larsen, T., Nielsen, K.F., Gravesen, S., Skov, P.S., Norn, S., Volatile organic compounds from the indoor mould Trichoderma viride cause histamine release from human bronchoalveolar cells. Inflammation Research 47, 5-6. Latorre-García, L., del Castillo-Agudo, L., Polaina, J Taxonomical classification of yeasts isolated from kefir based on the sequence of their ribosomal RNA genes. World Journal of Microbiology Biotechnology, 23, Lavermicocca, P., Valerio, F., Evidente, A., Lazzaroni, S., Corsetti, A., Gobbetti, M., Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B. Applied and Environmental Microbiology, 66, Leite, A. M. O., Mayoa, B., Rachid, C. T., Peixoto, R. S., Silva, J. T., Paschoalin, V. M., Assessment of the microbial diversity of Brazilian kefir grains by PCR-DGGE and pyrosequencing analysis. Food Microbiology, 31, Leite, A.M.O., Miguel, M.A.L., Peixoto, R.S., Ruas-Madiedo, P., Pascholoalin, V.M.F., Mayo, B., Delgado, S., Probiotic potential of selected lactic acid bacteria strains isolated from Brazilian kefir grains. Journal of Dairy Science, 98, Ley, R. E., Peterson D. A., Gordon J. I., Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell 124, Lilly, D.M., Stillwell, R.H., Probiotics: Growth promoting factors produced by microorganisms. Science, 147, Lin, C., Chen, H., Lin, J., Identification and characterization of lactic acid bacteria and yeast isolated from kefir grains in Taiwan. Australian Journal of Dairy Technology, 54, Lin, M. Y., Change, F. J., Antioxidative effect of ıntestinal bacteria Bifidobacterium longum ATCC and Lactobacillus acidophilus ATCC Digestive Diseases and Sciences, 45, Liu, H., Xie, Y.H., Xiong, L.X., Dong, R.T., Pan, C.L., Teng, G.X., Effect and (mechanism) of cholesterol-lowering by kluyveromyces from tibetan kefir. Advanced. Materials Research, ,

87 Liu, J.R., Wang, S. Y., Chen, M. J., Yueh, P. Y., Lin, C. W., 2006b. The anti-allergenic properties of milk kefir and soy milk kefir and their beneficial effects on the intestinal microflora. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86, Liu, J.R., Wang, S.Y., Chen, M.J., Chen, H.L., Yueh, P.Y., Lin, C.W., 2006a. Hypocholesterolaemic effect sof milk kefir and soya milk kefirin cholesterol fed hamsters. British Journal of Nutrition, 95, Liutkevicius, A., Sarkinas, A., Studies on the growth condi-tions and composition of kefir grains as a food and forage biomass. Veterinarija ir Zootechnika, 25, Lopitz-Otsoa, F., Rementeria, A., Elguezabal, N., Garaizar, J., Kefir: a symbiotic yeasts-bacteria community with alleged healthy capabilities. Review Iberoam Micologia, 23, Low, B.A., Hansen, E.B., Microbiology and Biochemistry of cheese and fermented milk, Low, B.A. eds. Blackie Academic and Professional, 337 p, London. Maccaferri, S., Klinder, A., Brigidi, P., Cavina, P., Costabile, A., Potential Probiotic Kluyveromyces marxianus B0399 Modulates the Immune Response in Caco-2 Cells and Peripheral Blood Mononuclear Cells and Impacts the Human Gut Microbiota in an in vitro Colonic Model System. Applied and Environmental Microbiology, 78, Macfarlane, G.T., Cummings, J.H., The colonie flora, fermentation and large bowel digestive function. In: The Large Intestine: Physiology, Pathophysiology and Disease (Phillips, S. F., Pemberton, J. H. & Shorter, R. G., eds.), pp Raven Press, New York, NY. Magalhaes, K.T., Pereira, G.V.M., Campos, C.R., Dragone, G., Schwan, R.F., Brazilian Kefir: Structure, Microbial Communities and Chemical Composition. Brazilian Journal of Microbiology, 42, Mainville, I., Robert, N., Lee, B., Farnworth, E.R., Polyphasic characterization of the lactic acid bacteria in kefir. Systematic Applied Microbiology, 29, Marquina, D., Santos, A., Corpas, I., Munoz, J., Zazo, J., Pienado, J.M., Dietary influence of kefir on microbial activities in the mouse bowel. Letters in Applied Microbiology, 35, Marsh, A.J., O Sullivan, O., Hill, C., Ross, R.P., Cotter, P.D., Sequencing-based analysis of the bacterial and fungal composition of kefir grains and milks from multiple sources. Plos One, 8(7),

88 Marshall, V.M., Lactic acid bacteria, starters for flavour. Federation European Microbiology Societies Microbiology Letters, 46, Marshall, V.M., Cole, W.M., Brooker, B.E., Observation on the structure of kefir grains and the distribution of the microflora. Journal of Applied Bacteriology, 57, Mathieu, M., François-Marie, L., Marcia Teresa, R., Monique L., Characterization of probiotic properties of Lactobacillus strains. Dairy Science Technology, 88, McBrearty, S., Ross, R.P., Fitzgerald, G.F., Collins, J.K., Wallace, J.M., Stanton, C., Influence of two commercially available Bifidobacteria cultures on Cheddar cheese quality. International Journal of Dairy, 11, McCord, J.M., Human disease, free radicals, and the oxidant/antioxidant balance. Clinical Biochemistry, 26, Merilainen, V.I IDF Bulletin, 227. Preperation of starter cultures. Fermented Milk Science and Technology, Brüksel. Metchnikoff, E., Lactic acid as inhibiting intestinal putrefaction. In the prolongation of life Optimistic studies. William Heinemann, London, Mevissen-Verhage, E.A.E., Marcelis, J.H., De Vos M.N., Harmsen-Van Amerongen, W.C.M., Verhoef, J., Bifidobacterium, Bacteroides, and Clostridium spp. in fecal samples from breastfed and bottle-fed infants with and without iron supplement. Journal of Clinical Microbiology, 25, Micheli, L., Uccelletti, D., Palleschi, C., Crescenzi, V., Isolation and characterisation of a ropy Lactobacillus strain producing the exopolysaccharide kefiran. Applied Microbiology and Biotechnology, 53, Miguel, M.G.D.C.P., Cardoso, P.G., de Assis Lago, L., Schwan, R.F., Diversity of bacteria present in milk kefir grains using culture-dependent and culture-independent methods. Food Research International, 43, Millette, M., Luquet, F.M., Lacroix, M., In vitro growth control of selected pathogens by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei fermented milk. Letters in Applied Microbiology, 44(3), Miranda, R.O., Carvalho, A.F., Nero, L.A., Development of a selective culture medium for bifidobacteria, Raffinose-Propionate Lithium Mupirocin (RP-MUP) and assessment of its usage with Petrifilm TM Aerobic Count plates. Food Microbiology, 39,

89 Miyakawa, H., Anjitsu, K., Ishibashi, N., Shimamura, S., Effects of pressure on enzyme activities of Lactobacillus helveticus LHE-511. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 58(3), Moore, W.E.C., Holdeman, L.V., Human fecal flora: The normal flora of 20 Japanese Hawaiians. Applied Microbiology, 27(5), Motaghi, M., Mazaheri, M., Moazami, N., Farkhondeh, A., Fooladi, M., Goltapeh, E., Kefir production in Iran. World Journal of Microbiology Biotechnology, 13, Mountzouris, K.C., McCartney, A.L., Gibson, G.R., Intestinal microflora of human infants and current trends for its nutritional modulation. British Journal of Nutrition, 87, Naito, Y., Lee, MC., Kato, Y., Nagai, R., Yonei, Y., Oxidative stress markers. Anti-Aging Medicine; 7(5), Nalbantoglu, U., Cakar, A., Dogan, H., Abaci, N., Ustek, D., Sayood, K., Metagenomic analysis of the microbial community in kefir grains. Food Microbiology, 41, Osada, K., Nagira, K., Teruya, K., Tachibana, H., Shirahata, S., Murakami, H., Enhancement of interferon-b production with sphingomyelin from fermented milk. Biotherapy, 7(2), Otles, S., Cagindi, O., Kefir: A probiotic dairy composition, nutritional and therapeutic aspects. Pakistan Journal of Nutrition, 2, Ouwehand, A., Vesterlund, S., Health aspects of probiotics. IDrugs, 6(6), Ozden, A., Gastro-intestinal Sistem ve Probiyotik-Prebiyotik Synbiyotik. Güncel Gastroenteroloji, Ozer, B.H., Kırmacı, A.H., Functional milks and dairy beverages. International Journal of Dairy Technology, 63 (1), Özkaya, D.F., Kuleasan, H., Maya ve Küf. Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları. Sim Matbaacılık Ltd. Sti. 522 s, Ankara. Persoon, C.H., Disposita methodica fungorum. Römer's Neues Mag Bot 1, Porubcan, R.S., Sellars, R.L., US Patent No Quiro s, A., Herna ndez-ledesma, B., Ramos M., Amigo L., Recio, I., angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of peptides derived from caprine kefir. Journal of Dairy Science, 88,

90 Racknagel, R. O., E. J. R. Glende, J. A. Dolak, Waller, R.I., Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacology Therapeutics, 43, Rea, M.C., Lennartsson, T., Dillon, P., Drina, F.D., Reville, W.J., Heapes, M., Cogan, T.M., Irish kefir-like grains : their structure, microbial composition and fermentation kinetics. Journal of Applied Microbiology, 8, Reid, G., Jass, J., Sebulsky M.T., McCormick J.K., Potential use of probiotics in clinical practice. Clinical Microbiology Reviews, 16, Reino, J.L., Guerrero, R.F., Hernandez-Galan, R., Collado, I.G., Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma. Phytochemistry Reviwes, 7, Reiter, B., Harmulu, G., Lactoperoksidase antibacterial system, Narutal occurance, biological functions and practical applications. Food Protection, 47, 724. Rifai, M.A., A revision of the genus Trichoderma. Mycological Papers, 116, Rimada, P.S., Abraham, A.G., Kefiran improves rheological properties of glucono-d-lactone in duced skim milk gels. International Journal of Dairy l, 16, Roczniakova, B., Kornacka, D., Bielecka, M., Stimulatory effect of the microflora of kefir grains on the biochemical activity of propionic acid bacteria. XIX International Dairy Congress, 1, Rodrigues K., Caputo L., Carvalho J., Evangelista J., Schneedorf J., Antimicrobial and healing activity of kefir and kefiran extract. International Journal of Antimicrobial Agents, 25, Rodrigues, K.L., Caputo, L.R., Carvalho, J.C., Evangelista, J., Schneedorf, J.M., Antimicrobial and healing activity of kefir and kefiran extract. International Journal of Antimicrobial Agents, 25, Roginski, H., Fuquaq, J.W., Fox, P.F. (Ed.), Academic Press, p, London. Rogosa, M., Mitchell, J.A., Wiseman, R.T., A selective medium for the isolation and enumeration of oral and fecal lactobacilli. Journal of Bacteriology, 62, Romanin, D., Serradell, M., González Maciel, D., Lausada, N., Garrote, G.L., Rumbo, M., Down-regulation of intestinal epithelial innate response by probiotic yeasts isolated from kefir. International Journal of Food Microbiology, 140,

91 Rong-Fu, W., Wei-Wei, C., Carl, E.C., Detection and Quantitation of Predominant Anaerobic Bacteria in Human and Animal Fecal Samples Applied and Environmental Microbiology, 62(4), Rose, M.D., Winston, F., Hieter, P., Methods in Yeast Genetics. A laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, p Rosi, J., I Microrganismi del kefir: gli acetobatteri. Scienza Tecnica Lattiero-Casearia, 29, Sabir, F., Beyatli, Y., Cokmus, C., Onal-Darilmaz, D., Assessment of potential probiotic properties of Lactobacillus spp., Lactococcus spp., and Pediococcus spp. strains isolated from kefir. Journal of Food Science, 75, Samuels, G.J., Trichoderma: systematics, the sexual state, and ecology. Phytopathology, 96, Santos, A., San Mauro, M., Sanchez, A., Torres, J.M., Marquina, D., The antimicrobial properties of different strains of Lactobacillus spp. isolated from kefir. Systematic and Applied Microbiology, 26, Sarkar, S., Biotechnological innovations in kefir production: a review. British Food Journal, 110, Schleifer, K.H., Ehrmann, M., Beimfohr, C., Brockmann, E., Ludwig, W., Amann, R Application of molecular methods for the classification and identification of lactic acid bacteria, International Journal of Dairy, 5, Shiomi, M., Sasaki K., Murofushi, M., Aibara, K., Antitumor activitiy in mice of orally administered pollysaccharide from Kefir grain. Japon Journal of Medicine Science Biology, 35 (2), Shiomi, M., Sasaki, K., Murofushi, M., Aibara, K., Antitumor activity in mice of orally administered polysaccharide from kefir grain. Japanese Journal of Medical Science and Biology, 35(2), Sibel Akalin, A., Gönç, S., Düzel, S., Influence of yoğurt and acidophilus yogurt on serum cholesterol levels in mice. Journal of Dairy Science, 80, Simova, E., Beshkova, D., Angelov, A., Hristozova, T., Frengova, G., Spasov, Z., Lactic acid bacteria and yeasts in kefir grains and kefir made from them. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 28,

92 Stark, P.L., Lee, A., The microbial ecology of the large bowel of breast-fed and formula-fed infants during the first year of life. Journal of Medical Microbiology, 15, Stepaniak, L., Fetlinski, A Kefir, Encyclopedia of Dairy Science, Academic Press, London. Tabasco, R., Paarup, T., Janer, C., Peláez, C., Requena, T., Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk. International Journal of Dairy, 17, Tağhan, N., Öztürk, Ş., Yoğurt. Sütaş Uzmanlık Eğitim Programı, s , Bursa. Tamai, Y., Yoshimitsu, N., Watanabe, Y., Kuwabara, Y., Nagai, S., Effect of milk fermented by culturing with various lactic acid bacteria and a yeast on serum cholesterol level in rats. Journal of Fermentation Bioengineering, 81, Tamang, J.P., Holzapfel, W.H., Watabane, K., Review: diversityof microorganisms in global fermented food sand beverages. Frontiers Microbiology, 7, 377. Tamime, A.Y., Fermented milks: a historical food with modern applications a review. European Journal of Clinical Nutrition, 56(4), Tamime, A.Y., Production of Kefir, Koumiss and Other Related Products. Tamime, A.Y. (Ed.), Fermented Milk Blackwell Science Ltd, ( ). Oxford, UK. Tamime, A.Y., Marshall, V.M.E., Microbiology and technology of fermented milks. U Miccrobiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk. Law, B.A. (Ed.), 2nd, Blackie Academic and Professional, , London. Tanis, B.C., van der Piji, H., van Ogtrop, M.L., Fatal fungal peritonitis by Trichoderma longibrachiatum complicating peritoneal dialysis. Nephrol Dial Transplant, 10, Terzaghi, B.E., Sandine, W.E., Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Applied Microbiology, 29(6), Tharmaraj, N., Shah, N.P., Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp., Bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and Propionibacteria. Journal of Dairy Science, 86,

93 Thoreux, K., Schmucker, D.L., Kefir milk enhances intestinal immunity in young but not old rats. Journal of Nutrition, 131, Tissier, H., Traitement des infections intestinales par la méthode de la flöre bactérienne de l'intestin. CR. Society Biology, 60, Traverse, J.H., Nesmelov, Y.E., Crampton, M., Linstrom, P., Thomas, D.D., Bache, R.J., Measurement of myocardial free radical production during exercise using EPR spectroscopy. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology, 290(6), Tulasne, L.R., Tulasne, C., Selecta fungorum carpologia. Jussu, Paris Tunail, N Beyaz peynir yapımında saf kültür kullanımı ve yararları. Beyaz peynir sempozyumu. Korunca Matbaacılık, s , İzmir Turan, T., Mentese, U., Agac, M.T., Akyuz, A.R., Kul, S., Aykan, A.C., The relation between intensity and complexity of coronary artery lesion and oxidative stress in patients with acute coronary syndrome. Anadolu Kardiyoloji Dergisi, 15(10), 795. Tükel, Ç., Tuncer, Y., Akçelik, M., Laktokok fajlarının moleküler genetik doğası. Gıda Dergisi, 27(1), Unsal, B., Phylogenetic analysis of bacterial com-munities in kefir by metagenomics. Master thesis. Grad-uate School of Engineering and Sciences. İzmir Institute of Technology. Üçüncü, M., Süt ve Mamülleri Teknolojisi. Meta Basım Matbaacılık Hizmetleri, s , , Bornova, İzmir. Vardjan, T., Lorbeg, P.M., Rogelj, I., Majhenic, A.C., Characterization and stability of Lactobacilli and yeast microbiota in kefir grains. Journal of Dairy Science, 96, Verdua, E.F., Bercik, P., Cukrowska, B., Farre-Castany, M.A., Bouzoyrene, H., Saraga, E., Blum, A.L., Corthea, I., Tlaskalova, H., Michetti, P., Oral administration of antigens from intestinal flora anaerobic bacteria reduces the severity of experimental acute colitis in BALB/c mice. Clinical Experimental Immunology, 120, 46, 50. Vinale, F., Marra R., Scala, F., Ghisalberti, E.L., Lorito, M., Sivasithamparam, K., Major secondary metabolites produced by two commercial Trichoderma strains active against different phytopathogens. Letters in Applied Microbiology, 43, Vinderola, C.G., Farnworth, E., Matar, C., Perdigon, G., Duarte, J., Thangavel, D., Immunomodulating capacity of kefir. Journal of Dairy Research, 72(2),

94 Vinderola, G., Perdigón, G., Duarte, J., Farnworth, E., Matar, C., Effects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity. Cytokine, 36, Vivek, A., Suresh, W., Sati, O.P., Jitendra, K., Aditi, K., Jay, S., Paul, Y.S., Isolation, characterisation of major secondary metabolites of the Himalayan Trichoderma koningii and their antifungal activity. Archives of Phytopathology and Plant Protection, 47, Vlachos, G.D., Bartzeliotou, A., Schulpis, K.H., Partsinevelos, G.A., Lazaropoulou, C., Papadima, C., Maternal-neonatal serum paraoxonase 1 activity in relation to the mode of delivery. Clinical Biochemistry, 39, Vujicic, I., Vulic, M., Könyves,T., As similation of cholesterol in milk by kefir cultures. Biotechnology Letters, 14, Walsh, C.J., Guinane, C.M., O Toole, P.W., Cotter, P.D., Beneficial modulation of the gut microbiota. Federation of European Biochemical Societies Letters, 588, Walsh, T.J., Groll, A., Hiemenz, J., Fleming, R., Roilides, E., Anaissie E. Infections due to emerging and uncommon medically important fungal pathogens. Clinical Microbiology and Infection, 10, Wang, S.Y., Chen, H.C., Liu, J.R., Lin, Y.C., Chen, M.J., Identification of Yeasts and Evaluation of their Distribution in Taiwanese Kefir and Viili Starters. Journal of Dairy Science, 91, Wang, Y., Xu, N., Xi, A., Ahmed, Z., Zhang, B., Bai, X., Effects of Lactobacillus plantarum MA2 isolated from Tibet kefir on lipid metabolism and intestinal microflora of rats fedonhigh-cholesteroldiet. Applied Microbiology and Biotechnology, 84, Wang, Y.F., Huo, G.C. Liu., L.B., Isolation and identification of the lactic acid bacteria from kefir grains. China Dairy Industry, 32, Wei., T, Xing, Z., Wei, H., Chao, L., Jingu, W., Yanping, W., Antioxidative effects in vivo and colonization of Lactobacillus plantarum MA2 in the murine intestinal tract. Applied Microbiology and Biotechnology, 100, Whitman, W.B., Coleman, D.C., Wiebe, W.J., Prokaryotes: the unseen majority. Proceedings of the National Academy Sciences, USA 95, Wijnberger, L.D.E., Krediet, T.G., Visser, G.H.A., Van, Bel F., Egberts J. Early neonatal antioxidant capacity after preexisting impaired placental function. Early Human Development, 71,

95 Wijsman, M.R., Hereijgers, J.L.P., de Groote, J.M.F.H., Selective enumeration of bifidobacteria in fermented dairy products. Netherlands Milk and Dairy Journal, 43, Witthuhn, R.C., Schoeman, T., Britz, T.J., Isolation and characterization of the microbial population of different South African kefir grains. International Journal of Dairy Technology, 57, Witthuhn, R., Schoeman, T., Britz, T., Characterisation of the microbial population at different stages of Kefir production and Kefir grain mass cultivation. International Journal of Dairy Technology, 15, Woodmansey, E.J., Intestinal bacteria and ageing. Journal of Applied Microbiology, 102, Wszolek, M., Tamime, A., Muir, D., Barclay, M., Propertiesof kefir made in Scotland and Poland using bovine, caprine and ovine milk with different starter cultures. LWT-Food Science and Technology, 34, Xiao, J., Kondo, S., Takahashi, N., Miyaji, K., Oshida,K., Hiramatsu, A., Effects of milk products fermented by Bifidobacterium longum on blood lipids in rats and healthy adult malevol unteers. Journal of Dairy Science. 86, Yang, X.J., Fan, M.T., Shi, J.L., Dang, B., Isolation and identification of preponderant flora in Tibetan kefir. China Brewing, 171, Yardımcı, S., Kısa Dönem Montelukast Tedavisinin Deneysel Olarak Oluşturulmuş Hepatik İskemi Reperfüzyon Modeline Etkiler. Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Uzmanlık Tezi, 38. Yaygın, H., Toklu, G.Ş., Süt ürünleri üretiminde starter kültürler. Süt Mikrobiyolojisi ve Katkı Maddeleri, IV. Süt ve Süt Ürünleri Sempozyumu Tebliğler Kitabı. M. Demirci (ed), Rebel Yayıncılık, s , Tekirdağ. Yoshioka, H., Fujita, K., Sakata, H., Murono, K., Iseki, K., Development of the normal intestinal flora and its clinical significance in infants and children. Bifidobacteria Microflora, 10, Ysebaert, D.K., Greef, K.E., Vercauteren, S.R., Ghielli, M., Verpooten, G.A., Eyskens, E.J., De Broe, M.E., Identification and kinetics of leukocytes after severe ischaemia/reperfusion renal injury. Nephrology Dialysis Transplantation, 15, Yuhara, T., Isojima S., Tsuchiya, F., Mitsuoka, T., On the intestinal flora of bottle-fed infants. Bifidobacteria Microflora, 2,

96 Yüksekdag, Z., Beyatli, Y., Aslim, B., Determination of some characteristics coccoid forms of lactic acid bacteria isolated from Turkish kefirs with natural probiotic. J. WT-Food Science and Technology, 37, Zacconi, C., Parisi, M.G., Sarra, P.G., Dallavalle, P., Bottazzi, V., Competitive exclusion of Salmonella Kedougou in kefir fed chicks. Microbiologie, Aliments, Nutrition, 12, Zanirati, D.F., Abatemarco, M., de Cicco Sandes, S.H., Nicoli, J.R., Nunes, Á.C., Neumann, E., Selection of lactic acid bacteria from Brazilian kefir grains for potential use as starter or probiotic cultures. Anaerobe, 32, Zhou, J., Liu, X., Jiang, H., Dong, M., Analysis of the microflora in Tİbetan kefir grains using denaturing gradient gel electrophoresis. Food Microbiology, 26(8), Zhuang, G., Liu, X.M., Zhang, Q.X., Tian, F.W., Zhang, H., Zhang, H.P., Research advances with regards to clinical outcome and potential mechanisms of the cholesterol. Ziemer, C.J., Gibson, G.R., An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in the functional food concept perspectives and future strategies. International Dairy of Journal, 8(5-6),

97 EKLER EK A. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul Kararı EK B. Deney Hayvanları Kullanım Sertifikası EK C. Çalışma İzinleri 84

98 EK A. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul Kararı Şekil A.1. Hayvan deneyleri yerel etik kurul kararı 85

99 EK B. Deney Hayvanları Kullanım Sertifikası Şekil B.1. Deney hayvanları kullanım serifikası 86

100 EK C. Çalışma İzinleri Şekil C.1. Süleyman Demirel Üniversitesi Deney Hayvanları Üretimi ve Deneysel Araştırma Laboratuvarı Çalışma İzni 87

101 Şekil C.2. Akdeniz Üniversitesi Deney Hayvanları Ünitesi Çalışma İzni 88