İnsanda Endotelyal Nitrik Oksit Sentaz E298D Genetik Polimorfizminin Damar Yan tlar ve Nitrik Oksit Sal verilmesi Üzerine Etkileri

Transkript

1 Klinik Çal şmalar/clinical Reports İnsanda Endotelyal Nitrik Oksit Sentaz E298D Genetik Polimorfizminin Damar Yan tlar ve Nitrik Oksit Sal verilmesi Üzerine Etkileri Melih Önder BABAOĞLU Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dal, ANKARA ÖZET Amaç: İnsan endotelyal nitrik oksit sentaz (enos) geni yedinci ekzonunda guanin (G) nükleotidinin timin (T) ile yer değiştirdiği 894G > T nokta mutasyonu, enzim yapısında 298 numaralı glutamatın (E) aspartata (D) dönüşmesine neden olur. Bu çalışmada, E298D polimorfik varyantının sağlıklı bireylerde enos işlevinde bir değişikliğe yol açıp açmadığını incelemek amaçlanmıştır. Yöntem: Gönüllülerde ön kol damarlarının endotele-bağımlı gevşeme yanıtları ve trombositlerde nitrik oksit (NO) salıverilmesi ölçüldü. Bulgular: Asetilkolin infüzyonuna yanıt olarak alınan maksimum kan akımı homozigot mutant grupta (TT grubu, 11.5 ± 0.5 ml/dakika), GG grubuna (27.1 ± 4.1 ml/dakika) göre anlamlı olarak düşük bulundu (p< 0.01). Sodyum nitroprussid infüzyonu ile elde edilen endotelden-bağımsız damar yanıtlarında GG (maksimum akım= 14.9 ± 1.2 ml/dakika, ED 50 = 0.61 ± 0.18 µg/dakika) ve TT (maksimum akım= 17.7 ± 1.4 ml/dakika, ED 50 = 0.64 ± 0.10 µg/dakika) grupları arasında fark yoktu. Trombositlerin in vitro koşullarda agregasyonu sırasında açığa çıkan NO miktarı (pmol/10 8 hücre), homozigot (TT, 3.1 ± 2.0, n= 6) veya heterozigot mutant bireylerde (GT, 5.6 ± 2.1, n= 17) kontrol grubuna (GG, 7.8 ± 2.2, n= 15) göre düşük bulundu. Yorum: Bu bulgular, enos geninde 894G > T nokta mutasyonunun sağlıklı bireylerde enzim işlevinde azalmaya neden olduğunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: enos, genetik polimorfizm, vazodilatasyon, agregasyon SUMMARY The Effect of Endothelial Nitric Oxide Synthase E298D Genetic Polymorphism on Vascular Responses and Nitric Oxide Release in Human Objective: A point mutation of guanine (G) to thymine (T), leading to a E298D substitution, at position 894 of the endothelial nitric oxide synthase (enos) gene has been identified. To determine the functional consequence of this variant in human, forearm blood flow responses and nitric oxide (NO) release from platelets we compared. Methods: Forearm blood flow was measured by using venous occlusion plethysmography. Isolated platelets were stimulated and platelet NO release and superoxide levels were measured using a NO-selective microelectrode and lumiaggregometer. 109

2 Babaoğlu MÖ Results: Maximal blood flows were reduced (11.5 ± 0.5 ml/minute vs ± 4.1 ml/minute) and ED 50 values were higher (13.2 ± 3.3 vs. 3.0 ± 0.6 µg/minute, p< 0.01) in response to acetylcholine in TT subjects (p< 0.01), whereas the responses to sodium nitroprusside were similar. NO levels were 7.8 ± 2.2 pmol/10 8 platelets (n= 15) in subjects who are homozygous for the wild type allele, as compared to 5.6 ± 2.1 pmol/10 8 platelets in subjects carrying the mutation in one allele (n= 17; p< 0.05 vs. wild-type), and 3.1 ± 2.0 pmol/10 8 platelets in subjects homozygous for the point mutation (n= 6; p< 0.01 vs. wild-type). Conclusion: These data suggest that E298D substitution in endothelial nitric oxide synthase (enos) gene causes attenuation of acetylcholine-mediated endothelial-dependent vasodilatation and stimulation-dependent platelet NO in healthy subjects carrying the mutation. Key Words: enos, genetic polymorphism, vasodilatation, aggregation GİRİŞ Nitrik oksit (NO) insanda iyi tan mlanm ş bir endotel-kaynakl gevşetici faktördür. Endotel tabakas n n damar düz kas gevşemesindeki rolünün taraf ndan gösterilmesinden sonra NO nun, L-arjininden nitrik oksit sentaz (NOS) arac l ğ ile üretildiği ve insanda birçok dokuda sinyal aş r m ndan sorumlu olduğu bulunmuştur (1-3). NOS un nöronal (nnos veya NOS 1), sitokinle-indüklenen (inos veya NOS 2) ve endotelyal (enos veya NOS 3) olmak üzere üç ayr izotipi tan mlanm şt r (4). Bunlardan nnos ve enos izotipleri hücrede yap sal olarak aktif halde iken, inos düzeyi ve aktivitesindeki art ş ortamda sitokinlerin bulunmas na bağl d r. Endotel hücrelerinde enos aktivitesi sonucu üretilen NO, endotel tabakas alt ndaki düz kas dokusuna difüzyon ile ulaş r ve gevşemeye yol açarak vasküler tonusun ve kardiyovasküler homeostaz n düzenlenmesinde önemli rol oynar (5). Endotelden NO sal verilmesini sağlayan başl ca fizyolojik faktörler s yr lma bask s (shear stress), asetilkolin (ACh), bradikinin, endotelin, P maddesi, histamin ve vazopressindir (6-18). enos ayr ca trombositlerde ve megakaryoblastik hücrelerde de gösterilmiştir (19). Trombosit agregasyonu s - ras nda sal verilen NO, agregasyonu önleyici etki gösterir (20). Son y llarda, insan enos geni klonlanm ş, nükleotid dizimi çözümlenmiş ve insanlar aras nda genetik dizimindeki genetik polimorfizmler ortaya konmuştur (21, 22). Tan mlanan bu polimorfizmlerden birisi yedinci ekzonda 894 numaral guanin (G) baz n n timin (T) ile yer değiştirdiği (894G > T) tek nokta mutasyonudur (22,23). Baz dizimindeki bu değişme protein yap s nda 298 numaral glutamat n (E) aspartat (D) ile yer değiştirmesine yol açmaktad r (E298D). Baz etnik gruplarda yap lan araşt rmalarda, bu mutasyonun toplumda görülme s kl ğ n n, hipertansiyon ve miyokard infarktüsü gibi kardiyovasküler hastal - ğ olan bireylerde sağl kl popülasyona göre anlaml derecede yüksek bulunduğu bildirilmiştir (22,24,25). Bu bulgular, E298D polimorfik varyant n n enos enzim fonksiyonunda bir değişikliğe yol açabileceğini akla getirmektedir. Bu çal şmada, insanda E298D genetik polimorfizminin enzim işlevinde bir bozukluğa yol aç p açmad ğ s nanm ş ve sağl kl mutant bireylerde in vivo koşullarda endotele-bağ ml damar gevşeme yan tlar nda bir değişikliğin olup olmad ğ n n saptanmas amaçlanm şt r. Bu amaçla, homozigot mutant gönüllülerde endotele-bağ ml ve bağ ms z ön kol kan ak mlar ölçülmüş ve mutasyonsuz kontrol bireyler ile aralar nda bir fark olup olmad ğ araşt r lm şt r. Ayr ca, enos işlevi sonucu üretilen NO düzeyinde bir azalma olup olmad ğ n n belirlenmesi amac yla doğrudan NO ölçümüne olanak sağlayan in vitro bir deney modeli kullan lm ş ve agregasyon s ras nda insan trombositlerinden aç ğa ç kan NO miktar ölçülmüştür. HASTALAR ve YÖNTEM Öznelerin Seçilmesi Her iki cinsiyetten ve çeşitli rklardan sağl kl, normotansif (sistolik kan bas nc < 130 mmhg ve diyastolik kan bas nc < 85 mmhg) ve sigara içmeyen, devaml ilaç kullanmayan 92 gönüllünün enos 894G > T mutasyonu için genotipleri belirlendi. Deneklerin ilk gelişinde sağl k durumlar n ve demografik yap lar n belirlemek için özgeçmişleri al nd, fiziksel muayeneleri yap ld ve bilgilendirilmiş olurlar al nd. Çal şma, Georgetown Üniversitesi Etik Kurulu taraf ndan onayland. Genotipi taranan bireyler aras ndan GG (kontrol) genotipinde sekiz, TT (homozigot mutant) genotipinde dört birey ön kol kan ak m çal şmas na dahil edildi. Kan ve idrar biyokimyasal testleri normal referans aral ğ n n d ş nda kalan denekler ça- 110

3 l şmaya dahil edilmedi. Siyah rkta vazodilatör yan tlarda önemli bir azalma bildirildiği için GG genotipine sahip sekiz kontrol birey siyah rk d ş ndaki gönüllülerden seçildi (26,27). enos Genotipi Saptanmas Gönüllülerin DNA örnekleri, kandaki beyaz küre hücrelerinden haz r bir kit (QIAamp blood kit, QI- AGEN Inc., CA, A.B.D.) yard m yla elde edildi. NOS un bilinen gen yap s kullan larak (NCBI-Gen- Bank erişim numaralar : X76307 ve D26607), mutasyonun bulunduğu noktay içine alan 248 baz-çifti (bç) uzunluğundaki gen bölgesi 100 ng DNA kullan larak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile amplifiye edildi (21,22). PCR ürünleri, BanII (5 ünite) endonükleaz enzimi eklenerek 37 C de dört saat inkübe edildi. Kesilmiş PCR ürünleri, %1 derişimli Tris-borat-EDTA tamponu içerisindeki %3 lük agaroz jelde elektroforez ile yürütülerek birbirinden ayr ld. Jeller etidyum bromür ile boyand ve bantlar mor ötesi ş k alt nda görünür hale getirildi. Ön Kol Kan Ak m n n Ölçümü Ön kol damar yan tlar n n ölçümü ven oklüzyon pletismografisi yöntemi ile yap ld. Antekübital fossa üzerinde lidokain ile cilt alt lokal anestezi uygulamas sonras nda brakiyel arter bir 22-g kanül ile kateterize edildi. Otuz dakikal k bir al şma zaman sonras nda bazal ön kol ak m ölçüldü ve artan dozlarda asetilkolin (ACh, µg/dakika) ve sodyum nitroprussid (SNP, µg/dakika) infüze edildi. Ön kol ak m, ven oklüzyon pletismografisi ile ölçüldü (28,29). Ön kol çap ndaki art ş ve kalp at m h z kaydedildi. Ön kol damar direnci değeri, ortalama kan bas nc n n o andaki ak m değerine bölünmesi ile hesapland. Trombositlerde Agregasyon, NO ve Süperoksit Sal verilmesi Ölçümü Gönüllülerin deney gününden 10 gün öncesine kadar asetilsalisilik asit ve diğer trombosit inhibitörleri kullanmamalar sağland. Gönüllülerden al nan trombosit süspansiyonu fizyolojik HEPES tamponlu çözelti (140 mm NaCl, 6 mm HEPES, 2 mm Na 2 HPO 4, 2 mm MgSO 4, %0.1 dekstroz, %0.4 s ğ r serum albumini, ph 7.4) içerisinde y kand (30). Agonistle (5 µm ADP) indüklenen trombosit agregasyonu s ras nda saydam küvetlerin içerisinden geçen ş k transmisyonundaki değişiklikler standart bir agregometre (Model 300B, Payton Assoc., Buffalo, New York) ile kaydedildi. Küvetler içine adapte edilen bir NO elektrodu (Pt/Ir alaş m, 0.2 mm çap, Inter Medical Co., Ltd., Nagoya, Japonya) ile NO ve süperoksit (SO) sal verilmesi agregasyon ile paralel olarak ölçüldü. İstatistiksel Analiz Tüm parametreler aritmetik ortalama ± standart sapma (ort ± SS) olarak verildi ve p değerinin 0.05 ten küçük olmas halinde gözlenen farklar anlaml olarak kabul edildi. Ven oklüzyon pletismografisi ile yap lan deneylerde her gönüllü için damar direncinin değişmesi üzerinden ED 50 değerleri (değişmenin %50 sini oluşturan doz) ve her iki grup (GG ve TT) için aritmetik ortalamalar hesapland. İki grubun ED 50 değerleri ve diğer parametrelerinin karş laşt r lmas nda istatistiksel analiz için Mann-Whitney U testi kullan l rken, ayn grup içinde deney başlang c ve sonundaki bazal kan ak m değerlerinin karş laşt r lmas için eşleştirilmiş t-testi ve Wilcoxon eşleştirilmiş iki örnek testi uyguland. Trombosit agregasyonu deneylerindeki üç grupta NO ve SO düzeyleri aras ndaki fark tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testi ile analiz edildi ve Bonferroni düzeltmesi uyguland. BULGULAR Deneklerin Dağ l m ve Mutasyon S kl ğ enos için genotipleri taranan toplam 92 gönüllünün 28 i kad n, 64 ü erkekti. Doksaniki birey içerisinde toplam yedi bireyin (%7.6, TT grubu), enos genindeki 894G > T nokta mutasyonu için homozigot olduğu saptand. Toplam 45 (%48.9) birey guanin nükleotidi için homozigot iken (GG), 40 (%43.5) bireyin mutasyon aç s ndan heterozigot olduğu belirlendi. Doksaniki bireydeki genotip dağ l m ve alel s kl ğ Tablo 1 de sunulmuştur. Ön Kol Kan Ak m Deneyleri Genotipleri TT olarak belirlenen yedi kişiden dört sağl kl erkek ön kol kan ak m deneyleri için çal şmaya dahil edildi. Ön kol kan ak m deneylerinde GG genotipini taş yan beş erkek ve üç kad n, kontrol Tablo 1. enos genotipi taranan bireylerde genotip dağ l m ve alel s kl ğ. Genotip dağılımı n (%) GG 45 (48.9) GT 40 (43.5) TT 7 (7.6) Alel sıklığı % G 70.6 T

4 Babaoğlu MÖ grubu olarak çal şmaya al nd (GG grubu). İki grup yaş, rk, beden kitle indeksi, sistolik, diyastolik ve ortalama kan bas nçlar, açl k serum glikoz ve kolesterol düzeyleri ve ön kol hacimleri aç s ndan birbirine benzerdi (Tablo 2). Her iki grupta da ön kol damar yan tlar n n değerlendirildiği kol ile diğer kol bazal kan ak m aras nda bir fark yoktu. Her iki vazodilatör ilac n artan dozlarda arter içi infüzyonu s ras nda her iki deney grubunda ön kol ak mlar nda doza bağ ml art şlar gözlendi. TT grubunda maksimum dozda ACh infüzyonu ile al nan yan t (11.5 ± 0.5 ml/dakika/100 ml doku hacmi), kontrol grubuna göre (27.1 ± 4.1 ml/dakika/100 ml doku hacmi) anlaml olarak düşüktü (p< 0.01). Buna karş n, iki grupta maksimum dozda SNP infüzyonu ile al nan yan tlar benzerdi (TT grubunda 14.9 ± 1.2, GG grubunda 17.7 ± 1.4 ml/dakika/100 ml doku hacmi, p> 0.05) (Şekil 1). Benzer şekilde, ACh infüzyonu s ras nda ön kol damar direncindeki düşüşe bağl olarak hesaplanan ED 50 değerleri homozigot mutasyonlu grupta kontrol grubuna göre anlaml olarak daha yüksek (13.2 ± 3.3 ve 3.0 ± 0.6 µg/dakika, p< 0.01) iken, SNP için benzerdi (Tablo 3). Trombositlerden İn Vitro NO Sal verilmesi Bu deneylerde, genotipleri farkl her üç gruptaki (GG, GT, TT) bireylerden elde edilen trombositlerin ADP (5 µm) varl ğ nda agregasyon miktarlar birbirine benzerdi. Trombositlerin in vitro koşullarda agregasyonu s ras nda aç ğa ç kan NO miktar (pmol/10 8 hücre), homozigot (TT, 3.1 ± 2.0, n= 6) veya heterozigot mutant bireylerde (GT, 5.6 ± 2.1, n= 17) kontrol grubuna (GG, 7.8 ± 2.2, n= 15) göre düşük bulundu. Homozigot mutant bireylerde NO sa- Tablo 2. Ön kol kan ak m deneylerinde gönüllülerin demografik özellikleri ve ölçülen fizyolojik parametreler. Genotip GG TT Birey sayısı (n) 8 4 Yaş 25.9 ± ± 1.9 Beden kitle indeksi (kg/m 2 ) 23.1 ± ± 0.8 Açlık serum glikozu (mg/dl) 91 ± 3 90 ± 2 Açlık serum kolesterolü (mg/dl) 180 ± ± 17 Sistolik kan basıncı (mmhg) 96.8 ± ± 2.5 Diyastolik kan basıncı (mmhg) 59.6 ± ± 4.8 Ortalama kan basıncı (mmhg) 72.0 ± ± 3.8 Ön kol hacmi (ml) 978 ± ± 64 Ak m (ml/dakika/100 ml doku) Şekil 1. Mutasyonsuz (GG, siyah kutular, n= 8) ve homozigot mutant (TT, beyaz kutular, n= 4) bireylerde ACh (100.0 µg/dakika) ve SNP (25.0 µg/dakika) maksimum dozlar n n infüzyonu ile elde edilen maksimum ak m değerleri. * GG ve TT gruplar aras ndaki anlaml farkl l ğ göstermektedir (p< 0.01). Tablo 3. ACh ve SNP infüzyonu s ras nda ön kol damar direncinde görülen düşüş üzerinden hesaplanan ED 50 (µg/dakika) değerleri. ED 50 değerleri (µg/dakika) Asetilkolin Sodyum nitroprussid GG TT GG TT 3.0 ± ± 3.3* 0.64 ± ± 0.18 * TT grubunda kontrol grubuna göre istatistiksel anlamlılığı göstermektedir (p< 0.01). l verilmesindeki azalma istatistiksel olarak anlaml idi (p< 0.05, Şekil 2). Aç ğa ç kan SO miktar nda (eğri alt nda kalan alan, ünite) ise mutasyonu taş yan her iki grupta (TT, 10.3 ± 0.7 ve GT, 5.3 ± 3.3) kontrol grubuna göre (GG, 3.1 ± 3.3) art ş vard (Şekil 2). TT grubunda SO düzeyindeki art ş kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlaml idi (p< 0.05). TARTIŞMA enos işlevinin diğer birçok organizma gibi insanda da kalp-damar sistemi homeostaz n n sağlanmas ndaki önemli rolü bilinmektedir (5). Bu çal şma, enos geninde bir nokta mutasyonuna bağl olarak sağl kl bireylerde in vivo işlevsel bozukluğu göstermesi bak m ndan önemlidir. E298D polimorfik varyant n taş yan bireylerde hem asetilkoline karş al - nan endotele-bağ ml in vivo damar yan tlar nda hem de in vitro koşullarda trombosit agregasyonu s ras nda ortama sal verilen NO miktar nda mutasyonsuz * Bazal ACh SNP 112

5 NO (pmol/10 8 hücre) GG GT TT SO (EAA, ünite) Şekil 2. İnsan trombositlerinden agregasyon s ras nda aç ğa ç kan NO (siyah sütunlar) ve SO (beyaz sütunlar) miktarlar. * Hem NO hem de SO düzeylerinde GG grubuna göre istatistiksel anlaml l ğ göstermektedir (p< 0.01). * * 10 5 kontrol bireylere göre anlaml bir azalma saptanmas birbirini destekleyen iki bulgudur. Ön kol damar yan tlar n n incelendiği deneylerde endotelden-bağ ms z damar gevşemesini ölçmek amac ile kullan lan sodyum nitroprussid, mutasyonu taş - yan ve taş mayan gruplar n her ikisinde de benzer yan tlar oluşturmuştur. Bu iki grubun sağl kl bireylerden oluştuğu ve demografik bulgular n n da benzer olduğu dikkate al n rsa, homozigot mutant TT grubunda brakiyel arterde asetilkolin ile al nan yan tlarda görülen azalman n enos da işlev kayb ndan dolay olduğu yorumu yap labilir. Benzer şekilde, izole insan trombositleriyle yap lan in vitro deneylerde her iki grupta ortalama agregasyon miktarlar n n benzer olmas na karş n sal verilen NO miktar n n TT grubunda azalm ş bulunmas da enos işlevinde bir bozukluk olduğu sav n desteklemektedir. Sağl kl ve hasta bireylerde mutasyon s kl ğ n saptamaya yönelik yap lan önceki çal şmalarda hipertansiyon veya akut miyokard infarktüsü gibi hastal klar n görülmesi ile E298D polimorfik varyant aras nda bir ilişki olduğu ileri sürülmüştür (22,24,25). Ancak sözü edilen araşt rmalarda sadece alel frekanslar incelendiği halde işlevsel bir parametre ölçülmediği için doğrudan bir neden-sonuç bağlant s ndan söz etmek zordur. Bu çal şmada endotele-bağ ml in vivo damar yan tlar nda enos mutasyonuna bağl işlevsel bir bozukluk gösterildiği için, baz kalp-damar hastal klar nda bu tür bir neden-sonuç ilişkisinin varl ğ n ileri sürmek daha olas d r. Hipertansiyon ve miyokard infarktüsünde bulunan ilişkinin aksine serebrovasküler hastal klar ile E298D varyant n n görülme s kl ğ aras nda ise herhangi bir ilişki kurulamam şt r (31,32). Bu fark, hastal klar n patogenezindeki farkl l ktan kaynaklanabileceği gibi araşt rman n yap ld - ğ etnik gruplar n farkl genetik yap lar ndan da kaynaklanabilir. Bu tür çal şmalarda neden-sonuç ilişkilerinin ortaya konabilmesi için fonksiyonel çal şmalar n yan s ra, farkl etnik gruplar kapsayan geniş kat l ml araşt rmalara gereksinim vard r. E298D yer değişiminin enzim yap s nda ne tür bir bozukluğa yol açarak işlev kayb na yol açt ğ henüz bilinmemektedir. enos, diğer NOS izoformlar gibi, bir yar s nda oksijenaz diğer yar s nda ise redüktaz bölgeleri içeren bir yap dad r ve ancak homodimer halinde aktiftir (33). İnsan enos yap s nda substrat bağlanmas için kritik pozisyonda olan aminoasitlerin (E361, D369 ve R372) işlevsel önemi önceki çal şmalarda gösterilmiştir (34-36). Tesauro ve arkadaşlar taraf ndan yap lan bir çal şma, E298D polimorfik varyant nda protein yap s na ilişkin ilk ipuçlar n sağlam şt r (37). Sözü edilen çal şmada, aspartat glutamat n yerini ald ğ nda 135 kda büyüklüğündeki proteinin, hücre içinde 100 ve 35 kda luk iki parçaya kesildiği gösterilmiş ve buna dayanarak bu noktadaki aminoasit değişiminin hücre içi baz peptidazlar için yeni bir tan ma noktas oluşturduğu ileri sürülmüştür. Hücre içinde enos un işlevi protein sentezi sonras modifikasyonlar ile de değiştirilir. Miristoilasyon sonucunda enos, oksijenaz bölgesinin ucu ile hücre zar girintileri olan kaveolalara bağlanarak aktif duruma geçmekten korunur (38,39). E298D yer değişiminin protein yap m ndan sonraki modifikasyonlar etkileyip etkilemediği de henüz araşt r lmam ş bir konudur. Mutasyonu taş yan bireylerde trombosit agregasyonu s ras nda NO sal verilmesinde görülen azalmaya karş n, aç ğa ç kan SO miktar ndaki art ş, mutant proteinde substrat veya kofaktör bağlama yeteneğinde bir değişme olduğunu düşündürmektedir. Daha önce yap lan in vitro çal şmalarda, saflaşt r lm ş nnos veya inos izotiplerinin deney ortam nda L-arjinin yokluğunda; enos un ise BH 4 k s tlamas durumunda NO yerine daha çok SO ürettiği gösterilmiştir (40-43). Bu yüzden, aspartat n glutamat 298 in yerini almas substrat veya kofaktör bağlanmas nda bir bozukluğa yol açarak SO üretimini artt r yor olabilir. Agregasyon s ras nda SO sal verilmesinin in vivo koşullarda artmas durumunda miyokard infarktüsü geçiren hastalarda koroner damarlardaki trombus çevresinde oksidatif hasar da artacakt r. Bu nedenle, daha geniş kat l ml araşt rmalarla bu mutasyonu taş man n miyokard infarktüsü geçiren hastalarda kötü prognoza yol açan faktörlerden biri olup olmad ğ araşt r lmal d r. 113

6 Babaoğlu MÖ Sonuç olarak, bu çal şmada enos geni yedinci ekzonunda 894G > T mutasyonuna bağl E298D varyant n taş yan sağl kl bireylerde endotele-bağ ml damar gevşeme yan t nda anlaml bir azalma saptanm şt r. Mutant bireylerde trombosit agregasyonu s - ras nda ortama sal verilen enos kaynakl NO miktar nda görülen düşüş de mutasyonun protein yap ve işlevini olumsuz yönde etkilediğini göstermiştir. Aminoasit diziminde E298D yer değişiminin enzim yap ve kinetiğinde yapt ğ değişiklik ve substrat veya kofaktör bağlanmas ndaki olas etkileri sonraki çal şmalarla incelenmelidir. Teşekkür Bu çal şma, T bbi Farmakoloji Uzmanl k tezi olarak y llar aras nda Georgetown Üniversitesi T p Merkezi (Washington D.C., Amerika Birleşik Devletleri), Farmakoloji Bölümü Klinik Farmakoloji Birimi nde, Merck Sharp & Dohme International Fellowship in Clinical Pharmacology desteği ile yap lm şt r. Yazar, Tez Dan şman olan Prof. Dr. Mustafa İlhan a ve Prof. Dr. Darrell R. Abernethy e teşekkür eder. Bu çal şman n ön bulgular American Society for Clinical Pharmacology and Therapeutics 2000 y l (Los angelos, ABD) toplant s nda sözlü sunum ve IUPHAR VII. World Conference on Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2000 y l (Floransa, İtalya) toplant s nda poster olarak sunulmuştur. KAYNAKLAR 1. Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 1980; 288: Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, et al. Endotheliumderived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: Murad F. Nitric oxide signaling: Would you believe that a simple free radical could be a second messenger, autacoid, paracrine substance, neurotransmitter, and hormone? Recent Prog Horm Res 1998; 53: Forstermann U, Closs EI, Pollock JS, et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension 1994; 23: Vanhoutte PM. Endothelium and control of vascular function. State of the Art Lecture. Hypertension 1989; 13: Buga GM, Gold ME, Fukuto JM, et al. Shear stressinduced release of nitric oxide from endothelial cells grown on beads. Hypertension 1991; 17: Rubanyi GM, Romero JC, Vanhoutte PM. Flow-induced release of endothelium-derived relaxing factor. Am J Physiol 1986; 250: Amezcua JL, Dusting GJ, Palmer RM, et al. Acetylcholine induces vasodilatation in the rabbit isolated heart through the release of nitric oxide, the endogenous nitrovasodilator. Br J Pharmacol 1988; 95: Newby DE, Boon NA, Webb DJ. Comparison of forearm vasodilatation to substance P and acetylcholine: Contribution of nitric oxide. Clin Sci (Colch) 1997; 92: Bogle RG, Coade SB, Moncada S, et al. Bradykinin and ATP stimulate L-arginine uptake and nitric oxide release in vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1991; 180: Kuga T, Mohri M, Egashira K, et al. Bradykinin-induced vasodilation of human coronary arteries in vivo: Role of nitric oxide and angiotensin-converting enzyme. J Am Coll Cardiol 1997; 30: Namiki A, Hirata Y, Ishikawa M, et al. Endothelin-1- and endothelin-3-induced vasorelaxation via common generation of endothelium-derived nitric oxide. Life Sci 1992; 50: Pollock DM. Chronic studies on the interaction between nitric oxide and endothelin in cardiovascular and renal function. Clin Exp Pharmacol Physiol 1999; 26: Whittle BJ, Lopez-Belmonte J, Rees DD. Modulation of the vasodepressor actions of acetylcholine, bradykinin, substance P and endothelin in the rat by a specific inhibitor of nitric oxide formation. Br J Pharmacol 1989; 98: Kelm M, Feelisch M, Krebber T, et al. Mechanisms of histamine-induced coronary vasodilatation: H1-receptor-mediated release of endothelium-derived nitric oxide. J Vasc Res 1993; 30: Lantoine F, Iouzalen L, Devynck MA, et al. Nitric oxide production in human endothelial cells stimulated by histamine requires Ca 2+ influx. Biochem J 1998; 330: Russ RD, Walker BR. Role of nitric oxide in vasopressinergic pulmonary vasodilatation. Am J Physiol 1992; 262: Tagawa T, Imaizumi T, Endo T, et al. Vasodilatory effect of arginine vasopressin is mediated by nitric oxide in human forearm vessels. J Clin Invest 1993; 92: Chen LY, Mehta JL. Further evidence of the presence of constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms in human platelets. J Cardiovasc Pharmacol 1996; 27: Radomski MW, Palmer RM, Moncada S. An L-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:

7 21. Nadaud S, Bonnardeaux A, Lathrop M, et al. Gene structure, polymorphism and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase gene. Biochem Biophys Res Commun 1994; 198: Miyamoto Y, Saito Y, Kajiyama N, et al. Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension. Hypertension 1998; 32: Yoshimura M, Yasue H, Nakayama M, et al. A missense Glu298Asp variant in the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm in the Japanese. Hum Genet 1998; 103: Shimasaki Y, Yasue H, Yoshimura M, et al. Association of the missense Glu298Asp variant of the endothelial nitric oxide synthase gene with myocardial infarction. J Am Coll Cardiol 1998; 31: Hibi K, Ishigami T, Tamura K, et al. Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism and acute myocardial infarction. Hypertension 1998; 32: Jones DS, Andrawis NS, Abernethy DR. Impaired endothelial-dependent forearm vascular relaxation in black Americans. Clin Pharmacol Ther 1999; 65: Lang CC, Stein CM, Brown RM, et al. Attenuation of isoproterenol-mediated vasodilatation in blacks. N Engl J Med 1995; 333: Hokanson DE, Sumner DS, Strandness DE. An electrically calibrated plethysmograph for direct measurement of limb blood flow. IEEE Trans Biomed Engl 1975; 22: Andrawis NS, Craft N, Abernethy DR. Calcium antagonists block angiotensin II-mediated vasoconstriction in humans: Comparison with their effect on phenylephrine-induced vasoconstriction. J Pharmacol Exp Ther 1992; 261: Freedman JE, Keaney JF. Nitric oxide and superoxide detection in human platelets. Methods Enzymol 1999; 301: Markus HS, Ruigrok Y, Ali N, et al. Endothelial nitric oxide synthase exon 7 polymorphism, ischemic cerebrovascular disease, and carotid atheroma. Stroke 1998; 29: MacLeod MJ, Dahiyat MT, Cumming A, et al. No association between Glu/Asp polymorphism of NOS3 gene and ischemic stroke. Neurology 1999; 53: Stuehr DJ. Structure-function aspects in the nitric oxide synthases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1997; 37: Chen PF, Tsai AL, Berka V, et al. Mutation of Glu- 361 in human endothelial nitric-oxide synthase selectively abolishes L-arginine binding without perturbing the behavior of heme and other redox centers. J Biol Chem 1997; 272: Chen PF, Berka V, Tsai AL, et al. Effects of Asp-369 and Arg-372 mutations on heme environment and function in human endothelial nitric-oxide synthase. J Biol Chem 1998; 273: Fischmann TO, Hruza A, Niu XD, et al. Structural characterization of nitric oxide synthase isoforms reveals striking active-site conservation. Nat Struct Biol 1999; 6: Tesauro M, Thompson WC, Rogliani P, et al. Intracellular processing of endothelial nitric oxide synthase isoforms associated with differences in severity of cardiopulmonary diseases: Cleavage of proteins with aspartate vs. glutamate at position 298. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: Feron O, Belhassen L, Kobzik L, et al. Endothelial nitric oxide synthase targeting to caveolae. Specific interactions with caveolin isoforms in cardiac myocytes and endothelial cells. J Biol Chem 1996; 271: Ghosh S, Gachhui R, Crooks C, et al. Interaction between caveolin-1 and the reductase domain of endothelial nitric-oxide synthase. Consequences for catalysis. J Biol Chem 1998; 273: Xia Y, Dawson VL, Dawson TM, et al. Nitric oxide synthase generates superoxide and nitric oxide in arginine-depleted cells leading to peroxynitrite-mediated cellular injury. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: Xia Y, Zweier JL. Superoxide and peroxynitrite generation from inducible nitric oxide synthase in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: Xia Y, Tsai AL, Berka V, et al. Superoxide generation from endothelial nitric-oxide synthase. A Ca 2+ /calmodulin-dependent and tetrahydrobiopterin regulatory process. J Biol Chem 1998; 273: Vasquez-Vivar J, Kalyanaraman B, Martasek P, et al. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: The influence of cofactors. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: YAZIŞMA ADRESİ Dr. Melih Önder BABAOĞLU Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dal 06100, S hhiye-ankara babaoglu@hacettepe.edu.tr 115