ENSTRÜMENTAL ANALİZ. Gaz Kromatografisi Dedektörleri ) Alev iyonizasyon dedektörü Flame Ionization Detector (FID)

Transkript

1 ENSTRÜMENTAL ANALİZ Gaz kromatografisi Dedektörler HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) 1 2 Gaz Kromatografisi Dedektörleri Bir GC detektörü taşıyıcı gazdan farklı bir maddenin varlığını algılayan ve bu bilgiyi elektrik sinyaline dönüştüren bir araçtır. Kolonda ayrılmış bileşenler, dedektör yardımıyla kantitatif olarak ölçülebilirler. Dedektörler analizi yapılacak örneğe göre farklılık gösterirler. Analizde kullanılacak dedektörler; taşıyıcı gaza cevap vermemeli, sadece örnek bileşenlerine duyarlılık göstermelidir. Ayrıca, dedektörün verdiği cevap yani sinyal ve buna bağlı olarak pik, örnek bileşenlerinin konsantrasyonlarıyla doğru orantılı olmalıdır. Dedektör bloku cihaz üzerinde ısıtılan bölgelerden biridir. Dedektör blokunun sıcaklığı iyi kontrol edilmeli, sabit olmalı ve voltajdan etkilenmemelidir. Gıda analizlerinde genellikle kullanılan dedektörler 1) Alev iyonizasyon dedektörü (FID) 2) Alkali alev iyonizasyon dedektörü (Alkali FID) 3) Isıl iletkenlik dedektörü (TCD) 4) Elektron yakalama dedektörü (ECD) 5) Alev fotometrik dedektör (FPD) 3 4 1) Alev iyonizasyon dedektörü Flame Ionization Detector (FID) GC de en çok kullanılan dedektörlerdir. Prensibi :Organik maddelerin, hidrojen+hava alevi sıcaklığında bozunurak iyonlaşması ve alev ortamı akımın ölçülmesidir. Gazların elektrik geçirgenliği gaz ortamındaki yüklü taneciklerin miktarıyla orantılıdır. Bu dedektörün çalışması için dedektöre kolondan gelen taşıyıcı gazdan başka hidrojen ve hava da verilir. Kolonda ayrılarak taşıyıcı gazla birlikte kolonu terkeden bileşikler dedektörde H ve hava karışımı ile yakılır ve iyonlaşırlar. Bu bileşiklerin iyonlaşması ile elektrik akımı oluşur ve oluşan akım ölçülür. Böylece alev ortamından iyonlaşan tanecik miktarıyla orantılı bir akım geçer. Akımdaki bu değişim madde miktarı olarak yorumlanır. FID yüksek hassasiyete sahiptir. 5 Dezavantajı kolonda ayrılan bileşenlerin parçalanması 6 1

2 2) Alkali alev iyonizasyon dedektörü veya termiyonik dedektör (Alkali-FID) FID ler organik maddelere duyarlı olup, inorganik maddelere duyarlı değildirler. FID bir modifikasyonudur. Termiyonik dedektör olarak da bilinir. Ayrıca, He, Ar, N 2 gibi inert gazlara da duyarlık göstermezler. Bu nedenle bu dedektörle yapılan çalışmalarda bu gazlar taşıyıcı olarak kullanılır. Bu dedektörler fosfor ve azot içeren bileşiklere karşı seçicidir. FID e göre P lu bileşiklere 500 kat, N lu bileşiklere karşı 50 kat daha hassastır. Taşıyıcı gazın hızı genellikle 2 mm iç çaplı kolonlarda için 30 ml/dak, H2 hızı bunun %10 fazlası ve havanın hızı da H2 nin hızının 10 katı olduğunda iyi sonuç alınır g/ml P ve g/ml N ölçülebilir. Daha çok P içeren pestisitlerin tayininde kullanılır ) Isıl iletkenlik dedektörü (TCD) Thermal Conductivity Detector Rubidyum silikat uc vardır. Elektriksel olarak ısıtılır ve ısıtılınca bu uçta bir plazma oluşur. Bu plazma P ve N için iyonlar oluşturur. Taşıyıcı gaz olarak He kullanılır Bu dedektör, ilk kullanılan dedektörlerden biridir. Katarometre de denir Kolondan çıkan taşıyıcı gazın elektrik iletkenliğinin ölçümüne dayanır. Taşıyıcı gazın içerdiği bileşenlerin miktarına göre iletkenlik de değişecektir. Bu değişim farkından bileşen miktarı belirlenir. Bu dedektörde flamentlerden akım geçirilerek flament ısıtılır. Sadece taşıyıcı gaz geçerken temel hat çizgisi (baseline) düz bir hat şeklinde olur Taşıyıcı gaz ile birlikte dedektörden örnek bileşenleri geçtiğinde ise flament sıcaklığı değişecektir Böylece flamentin direnci değişeceğinden flamentlerin dengesi bozulacaktır. Bu denge değişikliği örnek bileşeninin konsantrasyonuna bağlıdır Avantajları Hem organik hem de inorganik bileşiklere cevap verir. Kullanımı kolaydır Örnek bileşenlerini parçalamaz. Ayrılan örnek bileşikleri geri kazanılabilir

3 4) Elektron yakalama dedektörü Electron Capture Detector Bu dedektörler yüksek duyarlılığa sahiptir. FID in aksine yeniden birleşme sebebiyle sinyal kaybı görülür. Prensibi: serbest elektronları yakalama eğilimine sahip bileşikler tarafından elektron absorbsiyonuna dayanır. Bu dedektörde düşük enerjili β-ışınları kaynağı kullanılır. Yaygın bir şekilde kullanılan kaynaklar: adsorbe edilmiş trityum, Nikel-63, stronsiyum- 90 gibi radyasyon materyali içeren titanyum plakalardır. Kolondan gelen gaz ilk olarak iyonizasyon odasına girer. Burada beta radyasyon kaynağından gelen elektronlara maruz kalır. Beta partikülleri, taşıyıcı gaz moleküllerini iyonize eder ve elektronlar yavaşlar. Elektron yakalayan bir madde dedektöre geldiğinde, düşük enerjili serbest elektronlarla karşılaşır ve elektronla reaksiyona girer Sonuç olarak mekanizma sistemden bir elektronun kaldırılması veya daha büyük kütleli negatif bir iyonun oluşmasıdır. Maddenin dedektör hücresine girmesi sonucu elektron konsantrasyonundaki azalma kaydedicide negatif bir değer olarak görülür. Azot ECD için bilinen en iyi taşıyıcı gazdır. ECD, pikogram seviyesinde hassasiyete sahiptir. TCD den 100 kat daha duyarlıdır. Bu dedektor ile, halojenik pestisitler, steroidler, biyojen aminler, amino asitler, ilaç türevleri, çeşitli kanserojenler, nitril ve nitratlar, peroksitler, ozon ve kükürtlü bileşiklerin analizi yapılabilir. 5) Alev Fotometrik dedektör (FPD) Flame Photometric Detector Biyokimya, gıda ve çevre konularında kükürt ve fosfor içeren bileşiklere duyarlıdır. FDP, kükürt ve fosfor içeren bileşiklerin alevde yandığında kimyasal olarak ışıldayan türler oluşturması prensibine dayanmaktadır. Bu bileşikler karakteristik dalga boyunda ışıma yaparlar. Optik filtre ile belli boyunda ışın dedektöre gönderilir ve böylece sinyal elde edilir. Kükürtlü bileşiklerin analizinde 393 nm, fosforlu bileşiklerin analizinde ise 526 nm lik interferens filtreleri kullanılır Kaydedici/integratör/bilgisayar Alevde oluşan kimyasal reaksiyonlar ve emisyon, gaz akışlarına ve dedektör sıcaklığına sıkıca bağlıdır. Hidrojen/hava veya hidrojen/oksijen oranı kritiktir. Dedektörde oluşan sinyalin, yani kromatogramın kağıt üzerine aktarıldığı bölüme kaydedici denir. Bilgisayar kullanıldığında, bilgisayar monitöründe kromatogram görüleceği için kaydediciye ve integratöre gerek kalmaz. Bilgisayara yüklenmiş özel bir yazılım programı ile kromatogram alınır ve değerlendirilir. Çeşitli firmaların özel yazılım programları bulunmaktadır. Kükürtün cevabı artan dedektör sıcaklığı ile azaldığı halde aksine fosfor cevabında ters bir ilişki vardır

4 Kalitatif ve Kantitatif analiz Kalitatif analiz: bileşenlerinin belirlenmesi için bir örnek hakkındaki bütün bilgileri içerir. Aynı anda pek çok bilgiyi verdiği için GC çok yararlıdır. Bir kromatogramın görünüşü örneğin kompleksliliği hakkında hemen bilgi verir. Alıkonma zamanları uçuculuklarına göre çeşitli bileşikleri sınıflandırmaya yarar. Günümüzde geliştirilen modern GC cihazları ile tekrarlanan enjeksiyonlarda alıkonma zamanları arasındaki standart sapma 30 milisaniyeye kadar düşmüştür. Örnek bileşenlerinin alıkonma zamanlarını aynı şartlar altında standardın alıkonma zamanı ile karşılaştırarak bileşikleri belirlemek her zaman başvurulan bir yoldur Kantitatif analiz GC pik alanı kolona verilen maddenin miktarıyla doğrudan ilişkilidir. Bu yüzden saf standartla örnek aynı şartlar altında analiz edilerek örnekteki bileşiğin miktarı, standart kalibrasyon grafiğinden bulunur. Kantitatif analizin başarılı olması için dedektörün maksimum duyarlılıkta olması ve taşıyıcı gaz hızının sabit olması gerekmektedir Kapiler kolonların, dolgulu kolonlara göre daha kantitatif sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Günümüzde kantitatif analizde en doğru sonuç bilgisayar kullanılarak alınmaktadır. Bilgisayar, pik yüksekliği, pik alanı, pik şekli, % oran gibi bilgileri verip rakamlar otomatik olarak işlenmekte ve sonuç raporu alınabilmektedir Dış standart yöntemi Analitik sonuçlar elde etmek için pik ölçüm bilgilerinin değerlendirilmesinde değişik yöntemler uygulanabilmektedir. En önemlileri dış standart ve iç standart yöntemleridir. Örnekte ilgilenilen pikin alanı nın standart kromatogramdaki o bileşiğin miktarının pik alanıyla karşılaştırılmasına dayanır. Standart maddenin değişik konsantrasyonlarına karşı elde edilen piklerin alanları grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafiği oluşturulur. Örnekteki pik alanına karşılık gelen konsantrasyon kalibrasyon grafiğinden bulunur. Seyreltme faktörleri de dikkate alınarak hesaplama yapılır. Pratikte uygulaması basittir

5 İç standart yöntemi Örnekte mevcut olmayan bir bileşiğin bilinen miktarı örneğe verilir. Kantifikasyon, o standardın pikinin ilgilenilen pike oranına dayandırılır. İç standart analiz edilen bileşiğe mümkün olduğu kadar benzer olmalıdır fakat tamamen ondan ayrılmalıdır. İç standart analizin başında örneğe ilave edilmelidir. 2,6-Dimethoxyphenol Internal Standard Türev oluşturma Doğrudan analizleri mümkün olmayan bazı bileşiklerin GC analizleri için uygun türevlerinin hazırlanması gerekir. Yağ asitleri, steroidler, birçok ilaçlar, aminler, fenoller gibi polar bileşiklerin GC analizi için türevlerinin hazırlanması, yani kimyasal reaksiyonlarla başka bir bileşik haline dönüştürülmesi gerekmektedir Örn yağ asitleri, metil esterlerine dönüştürülürler. Türevlendirme kromatografik analizlerde önemli bir basamaktır. Yararları: Polar bileşiği daha az polar yapar Kantitasyonu düzeltir. Çalışılan dedektörün duyarlı olacağı bileşik elde edilmiştir. Yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerin uçuculuğunu arttırır. Seperasyon etkinliğini düzeltir Analizde daha az örnek ekstraktına ihtiyaç duyulur Sıcaklığa dayanıklı bileşikler içerir GC nin gıda analizlerindeki uygulamaları Aroma maddelerinin analizinde Tarımsal ilaç kalıntılarının (pestisit) analizinde en başarılı teknik GC dir. Taze meyve ve sebzelerde koruyucu olarak kullanılan sülfit ajanları (potansiyel zehir) kapiler GC ile analiz edilebilmektedir. Yağların yağ asidi kompozisyonlarının belirlenmesinde kullanılır. Gıdaların orijinlerinin bilinmesi için o gıdada bulunan özel bileşenleri analizi için GC kullanılabilir. İçkilerdeki alkolerin, özellikle göz sağlığı için son derece zararlı olan metanolün varlığının kanıtlanması için GC kullanılır. Et yağının ekstraksiyonundan sonra yağ asitleri metillendirilerek GC ye verilir. Böylece etin sığır ve domuz eti olup olmadığı anlaşılabilir. Sterol analizi ile bitkisel ve hayvansal yağların tağşişi ortaya konabilir. Kolesterol sadece hayvansal yağlarda bulunmaktadır. Ambalaj maddelerinde gıdalara geçen maddeler de GC ile analiz edilebilir. Örneğin PVC şişeden ayçiçek yağına geçen (VCM) vinil klorür monomeri GC ile analiz edilebilir

6 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) High Performance Liquid Chromatography Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), en yaygın olarak kullanılan analitik tekniklerden bir tanesidir. HPLC, bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasında sıvı hareketli fazı kullanır. Bu bileşenler, ilk olarak çözgende çözünürleştirilir ve daha sonra yüksek basınç altında kromatografi kolonundan geçmeye zorlanırlar. Modern sıvı kromatografisinin temel kriterinin basınç olduğu düşünülmekteydi ve bu nedenle yüksek basınçlı sıvı kromatografi olarak adlandırılmaktaydı. Yüksek performans sadece basıncın değil bir çok faktörün birleşmesiyle oluşturulduğundan günümüzde yüksek performanslı sıvı kromatografi adlandırılması kullanılmaktadır Sıvı kr nin özel bir uygulamasıdır. Çok küçük boyutlarda partiküllerden (5µm) oluşan sabit faz kullanılır. Küçük partiküller daha geniş yüzey alanı oluşturur ve böylece daha iyi ayırım gerçekleşir. HPLC de kolonlar çok sıkı bir şekilde doldurulmuş olduğundan kolondan örnek ve hareketli fazı geçirebilmek için basınç uygulanması gerekir. Bunun içinde pompalar kullanılır. 400 atm kadar basınç uygulanabilir. HPLC nin avantajları HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez kullanılabilir. HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirlik daha yüksektir. Kalitatif analiz kullanılabilir. Analiz süresi kısadır. Duyarlık yüksektir HPLC nin bölümleri Hareketli faz Rezevuarı: Hareketli fazın konulduğu kap. Kullanımdan önce hareketli fazda gazın alınması gerekir (degassing) bunun için vakum, ultrason veya ortamdan inert bir gaz geçirilebilir. Hareketli faz iyi bir şekilde degas edilmezse pompada hava cebi oluşabilir ve giderek akış hızı azalır, sonunda akış durur. Solvent rezervuarının çalışma sırasında ağzının kapalı olmasına dikkat edilmelidir. Buharlaşmadan dolayı hareketli fazın kompozisyonu değişir

7 Pompalar Emme-basma pompalar kullanılır. İki pistona sahiptirler. Biri emiş yaparken diğeri basma yapacak şekilde 180 farkla çalışırlar. Pompanın gücü kullanılan kolonun boyut ve tipine ve hareketli fazın vizkozitesine bağlıdır. Örn: 5mm iç çaplı kolonlarda akış hızı 1-2 ml/dak ve bunun için gerekli basınçta 60 bardır. Basınç kolon boyuna, partikül büyüklüğüne ve çözgene bağlıdır. Kolon ne kadar dar olursa akış hızı da o kadar düşecektir. Enjeksiyon sistemi İdeal enjektör örneği, kolonun başına solvent akışına zarar vermeden verebilmelidir Yaygın olarak örneğin bir tüpe (loop) injeksiyonunu içeren enjeksiyon valfi sistemi kullanılmaktadır. Pompadan gelen çözücü akışı, kolonun üst kısmına örneği itmek için loop kısmına yönlendirilir. Böylece pompadan gelen çözücü daha önceden enjekte edilmiş örneği süpürerek kolona taşır Kolonlar HPLC de kullanılan kolonlar mm iç çaplı ve cm uzunluğunda, 5-10 µm sabit faz partikülleriyle paketlenmiştir. Paslanmaz çelikten yapılırlar. Pek çok durumda kolonun baş kısmına takılan koruyucu (guard) bir kolona ihtiyaç duyulur. Bununla analitik kolon kısa zamanda kirlenmekten korunur. Kromatografik kolonda partikül büyüklüğü önemlidir. Partikül çapı küçüldükçe teorik plaka sayısı artar. Ancak solvent akışına direnç de o oranda yükselir. Kısa etkili kolonların kullanımıyla (örn. 3.3 cm boyutunda) çok hızlı ayırımlar elde edilebilmektedir. Ancak, böyle kolonlara küçük hacimde örnek verilebilir mm iç çaplı kolonlar kullanımda daha yaygındır. Bu kolonlarda 40 µl/dak lık bir akış hızı 5 mm çaplı kolonlarda 1 ml/dak akış hızına denk gelir. Böylece mobil fazdan tasarruf sağlanır. Küçük iç çaplı kolonlar teşhis duyarlılığında artışa neden olur. Pek çok HPLC ayırmaları oda sıcaklığındaki kolonlarda gerçekleştirilir. Ancak tekrarlanabilir sonuçlar sadece kolon sıcaklığı sabit olduğu zaman alınabilmektedir. Bunun için su ceketiyle, fırınla veya ısıtılmış metal blokla sabit sıcaklık sağlanabilir

8 Kolon dolgu maddeleri: Genellikle silika ve alümina esaslıdır. Kolon dolgu maddeleri tip olarak Gözenekli Küresel Düzensiz Pelliküler ve Mikro tiplerinde olabilir. Dolgu maddesinin seçiminde tanecik biçimi, büyüklüğü, tanecik büyüklüğünün dağılımı, gözenek hacmi ve yüzey alanı gibi özellikler rol oynar. Yüzey alanı: Örneğin alıkonma hacmi ve tutulma kapasitesi dolgu maddesinin yüzey alanı ile orantılıdır. Dolgu maddesinin yüzey alanı m2/g arasında değişir. Küçük tanecikler büyük yüzey alanına dahiptir. Pelliküler tipte inert bir cam taneciğinin üzerinde 1-2 µm kalınlıkta gözenekli silika tabaka içeren dolgu maddesi sıvanmıştır Gözenek hacmi: gözenekli bir dolgu maddesinde örnek moleküllerinin tanecik merkezine ulaşması ve sonra geriye dönmesi için ideal difüzyon oranı olmalıdır. Dünyada hergün yeni bir HPLC kolonu uygulamaya girmektedir. Firmaların kataloglarından istenilen özellikte kolon seçimi yapılabilir. Kısa difüzyon mesafesi teorik plaka sayısını arttırmakta ve alıkonma süresini kısaltmaktadır